Summary
Здесь представлен протокол, описывающий этапы подготовки образцов и сбора данных, необходимые в криомягтерной рентгеновской томографии (SXT) для изображения ультраструктуры целых криосохраненных клеток с разрешением 25 нм половинного шага.
Abstract
Методы визуализации имеют основополагающее значение для понимания организации клеток и механизмов в биологических исследованиях и смежных областях. Среди этих методов криомягтерная рентгеновская томография (SXT) позволяет визуализировать целые криосохраненные клетки в диапазоне энергии рентгеновского излучения водного окна (284-543 эВ), в котором углеродные структуры имеют по своей сути более высокое поглощение, чем вода, что позволяет 3D-реконструкцию линейного коэффициента поглощения материала, содержащегося в каждом вокселе. Таким образом, достижима количественная структурная информация на уровне целых ячеек толщиной до 10 мкм с высокой пропускной способностью и пространственным разрешением до 25-30 нм половинного шага. Cryo-SXT доказал свою актуальность для текущих биомедицинских исследований, предоставляя 3D-информацию о процессах клеточной инфекции (вирус, бактерии или паразиты), морфологических изменениях, вызванных заболеваниями (такими как рецессивные генетические заболевания) и помогая нам понять действие лекарств на клеточном уровне или найти конкретные структуры в 3D-клеточной среде. Кроме того, используя преимущества перестраиваемой длины волны на синхротронных установках, спектромископия или ее 3D-аналог, спектромография, также может быть использована для изображения и количественной оценки конкретных элементов в клетке, таких как кальций в процессах биоминерализации. Cryo-SXT предоставляет дополнительную информацию к другим методам биологической визуализации, таким как электронная микроскопия, рентгеновская флуоресценция или флуоресценция видимого света, и обычно используется в качестве партнерского метода для 2D или 3D коррелятивной визуализации в криогенных условиях, чтобы связать функцию, местоположение и морфологию.
Introduction
Cryo-SXT может играть центральную роль в исследованиях биологической визуализации, поскольку он обеспечивает 3D-среднее разрешение (25-30 нм половинчатого шага) объемов гидратированных целых клеток 1,2,3,4,5,6. В диапазоне энергий водного окна, между краями поглощения углерода и кислорода K (4,4-2,3 нм), богатые углеродом клеточные структуры поглощают в 10 раз больше, чем богатая кислородом среда, которая пронизывает и окружает их. В этом энергетическом диапазоне остеклованные клетки толщиной до 10 мкм могут быть визуализированы без необходимости сечения или окрашивания, что приводит к количественным проекциям контраста с высоким поглощением, которые в сочетании с возможностями вращения образца позволяют проводить томографическую реконструкцию клеточной структуры. Cryo-SXT заполняет нишу с точки зрения размеров образцов и пространственного разрешения, которая недоступна для любого другого метода визуализации.
Вкратце, контраст поглощения крио-SXT является количественным, так как затухание фотонов через образец толщины t подчиняется закону Бира-Ламберта следующим образом: 
, где I0 представляет интенсивность падающего, а μl коэффициент линейного поглощения, который зависит от длины волны λ и воображаемой части β показателя преломления образца (
). Затухание является функцией биохимического состава и толщины изображаемых структур, причем каждый биохимический компонент имеет определенный коэффициент линейного поглощения рентгеновского излучения μl (LAC). Это означает, что значение вокселя каждой томографии зависит от химических элементов и их концентрации в этом вокселе7. Это позволяет естественным образом различать различные органеллы, такие как ядра, ядрышки, липидные тела или митохондрии, или различные состояния уплотнения хроматина исключительно на основе присущих им значений LAC, реконструированных 2,8,9.
Кроме того, крио-SXT - это высокопроизводительный метод, при котором томограммы собираются за несколько минут. Это, в частности, позволяет получать мезомасштабную визуализацию клеточных популяций, которые могут быть захвачены в ключевые моменты времени, такие как деление, дифференцировка и апоптоз, а также в различных состояниях ответа, таких как те, которые вызваны химическим воздействием конкретных лекарственных препаратов или патогенных инфекций. Данные, собранные в этих ключевых точках, обеспечат 3D-описание системы с точной записью пространственной организации различных клеточных органелл в эти конкретные моменты.
Обычно крио-SXT используется в сочетании с другими методами, следующими коррелятивным подходам, которые позволяют обнаруживать конкретные особенности, события или макромолекулы в 3D-клеточной среде 4,10,11,12,13,14,15,16, или жесткие рентгеновские флуоресцентные данные 17,18 . Корреляционные подходы в криогенных условиях имеют первостепенное значение для получения наиболее полной и ценной картины интересующей системы. Краткое описание типичного рабочего процесса на крио-SXT-линиях мистраля (Alba) и B24 (Diamond) приведено на рисунке 1.
Кроме того, используя возможности настройки длины волны на синхротронных установках, спектроскопическая информация может быть получена в дополнение к структурной с использованием специфического дифференциального поглощения конкретных элементов, содержащихся в образце. Примером этого может служить расположение кальция при изучении процессов биоминерализации в клетках 19,20,21. Делая 2D-изображения при различных энергиях фотонов (спектрах) или томограммах ниже и на интересующем краю поглощения рентгеновского излучения, можно идентифицировать пиксели или вокселы, содержащие выбранный элемент. Спектры также позволяют дифференцировать химические состояния (т.е. эволюцию аморфного кальция в гидроксиапатит, как в предыдущем примере биоминерализации20). Количественная оценка различных элементов возможна в 2D и 3D. Спектроскопическая визуализация остеклованных клеток обычно проводится в водном окне, но также возможна в других диапазонах энергии, если содержание воды достаточно низкое или если используются другие протоколы пробоподготовки, включая обезвоживание,22. Подробный пошаговый протокол спектроскопии находится за пределами фокуса протокола в настоящем документе.
В дальнейшем протокол фокусируется на кратком обобщении основных этапов подготовки образцов, хотя каждая система может нуждаться в индивидуальной доработке, за которой следует подробная пошаговая процедура сбора данных для криомягтерной рентгеновской томографии.
Protocol
1. Пробоподготовка
- Подготовка опоры сетки
- Облучите решетки УФ-излучением в течение 3 ч углеродной пленкой, обращенной вверх для стерилизации.
- Необязательно: В случае проблем с ячейками, не прикрепленными к сетке, выполните один из следующих шагов.
- Гидрофилизируйте углеродную поддерживающую фольгу путем плазменной обработки решеток для увеличения распространения образцов и улучшения адгезии клеток.
- Поместите решетки углерода стороной вверх в оборудование камеры тлеющего разряда и подвергайте сетку воздействию плазмы в течение 30-15 мин (с использованием Ar и/или O2) в зависимости от оборудования.
- Функционализация сеток с помощью поли-L-лизина (ФАПЧ)
- Добавьте отдельные капли ФАПЧ 60 мкл в чашку Петри и поместите сетку поверх капли ФАПЧ углеродной пленкой лицом вниз. Инкубировать в течение 30 мин при 37 °C и промокать ФАПЧ с помощью фильтровальной бумаги.
- Функционализируйте сетки с фетальной бычьей сывороткой (FBS).
- Погрузите сетки в FBS на ночь. Окуните сетки в буферный раствор для промывки и оставьте сетку на фильтровальной бумаге, чтобы удалить лишнюю жидкость.
- Гидрофилизируйте углеродную поддерживающую фольгу путем плазменной обработки решеток для увеличения распространения образцов и улучшения адгезии клеток.
- Выращивание адгезивных клеток на сетках
- Вырастите клетки в чашке для клеточной культуры 100 мм до достижения 80%-90% конфлюзии (рисунок 2А).
- Посейте 1-5 x 105 ячеек/мл (подстройте значение в соответствии с системой) поверх сеток Au в чашке P60 Петри (всего 3 мл).
ЗАМЕТКА: Добавление клеточной суспензии должно быть сделано очень осторожно с углеродной пленкой сетки, обращенной вверх в чашке для клеточной культуры 60 мм. Подготовьте несколько сеток для каждого условия, по одному условию на чашку Петри P60 (рисунок 2B). - Дайте ячейкам осесть до тех пор, пока слияние на сетке не достигнет нескольких ячеек (от 1 до 10 в зависимости от размера ячейки) в каждом квадрате сетки (в зависимости от клеточной линии это может занять до 24 ч).
ЗАМЕТКА: Перед замораживанием сетки должны быть проверены с помощью микроскопа видимого света (VLM), оценивая целостность углеродной пленки, а также слияние клеток в каждой сетке (рисунок 2C). Подождите, пока не будет достигнута правильная плотность ячеек в сетке. Если сетка слишком сливается или углеродная фольга сломана, начните сначала.
- Осаждение клеток в суспензии на сетках
- Выберите подготовленную сетку Au или Cu с помощью пинцета из погружной морозильной камеры (см. раздел 1.6).
- Подготовьте 1-5 х 105-клеточную суспензию (оптическая плотность поглощения 0,3 в случае бактерий) и добавьте в сетку 4 мкл подготовленной суспензии.
- Инкубируйте сетку с каплей в течение нескольких минут горизонтально, чтобы обеспечить осаждение ячеек, а затем поместите пинцет, удерживающий сетку, внутрь камеры витрификации с климат-контролем, установленной для соответствующих температурных и влажностных условий (этап 1.6.1).
- Дополнительно: флуоресцентная маркировка образцов
ЗАМЕТКА: Может быть полезно флуоресцентно маркировать некоторые органеллы образца. В зависимости от интереса могут быть использованы специфические флуорофоры или клетки, стабильно экспрессирующие флуоресцентный белок или трансфектированные для переходной экспрессии интересующего белка. Это позволяет легко обнаруживать клетки с помощью криоэпилюоресцентной микроскопии и помогает находить клетки, представляющие интерес для последующей рентгеновской визуализации. Далее в протоколе подробно описывается только использование флуорофоров.- Подготовьте рабочий раствор для флуорофора (см. рекомендацию производителя) и следуйте конкретному протоколу.
- Добавьте флуорофоры в чашку Петри, содержащую сетки, и аккуратно перемешайте.
- Оставьте для инкубации в темной среде и переходите непосредственно к шагу 1,6 после окончания инкубации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно быть готовым к остекливанию после завершения инкубации, чтобы избежать неспецифической маркировки и, следовательно, размытого флуоресцентного сигнала.
- Подготовка наночастиц Au (NP) к выравниванию проекции томограммы
- Возьмите одну аликвоту 1 мл раствора Au fiducial (100 нм на Mistral или 250 нм на B24) и центрифугу на низкой скорости (чтобы избежать агрегации) в течение 1 мин, чтобы позволить NP гранулировать.
ЗАМЕТКА: Если возможно, предпочтительно оставить фидуциалы, чтобы они поселились естественным образом на ночь или больше, чтобы избежать агрегации. - Удалите супернатант. Непосредственно перед замораживанием повторно суспендируют NP в 20 мкл свободной от сыворотки среде или буферном растворе для получения однородного раствора.
ЗАМЕТКА: Обработка ультразвуком и вихрь рекомендуются для гомогенизации раствора.
- Возьмите одну аликвоту 1 мл раствора Au fiducial (100 нм на Mistral или 250 нм на B24) и центрифугу на низкой скорости (чтобы избежать агрегации) в течение 1 мин, чтобы позволить NP гранулировать.
- Погружные морозильные решетки
ВНИМАНИЕ: Жидкий азот может вызвать холодные ожоги, и следует носить надлежащее защитное снаряжение (длинное лабораторное пальто, защитные очки, перчатки, длинные брюки и закрытую обувь). Этан очень взрывоопасен и должен храниться подальше от любых искр или открытого огня.- Следуйте инструкциям производителя, чтобы подготовить и использовать инструмент для погружной морозильной камеры.
ЗАМЕТКА: Влажность обычно устанавливается на уровне 80%-90%; температура будет зависеть от типа клеток (дрожжи максимум 30 °C, клетки млекопитающих 37 °C, клетки насекомых 28 °C и т. Д.). - Возьмите сетку с монтажным пинцетом от чашки Петри за ободок, стараясь не согнуть сетку и установите ее на морозильное устройство. Убедитесь, что клетки обращены в сторону от промокательной бумаги.
- Необязательно: трижды промыть сетку в буфере в случае прилипших ячеек.
- Добавьте 1,5 мкл Фидуциалов Au NP поверх клеток (через отверстие с правой стороны камеры) и оставьте, чтобы осесть на 30 с, прежде чем промокнуть и погрузить сетку.
ЗАМЕТКА: В случае ячеек в суспензии добавьте в сетку фидуциалы Au NP, пока она все еще находится в горизонтальном положении, перед установкой пинцета и дайте им остановиться в течение 30 с. Промокшивание имеет решающее значение для высококачественных сетей. Расстояние блоттинга должно быть откалибровано перед запуском; плоскостность промокательной бумаги важна для воспроизводимого блоттинга (следуйте инструкциям производителя). Время блоттинга должно быть оценено для каждого типа клеток. - Подготовьте несколько сеток для каждого условия. Перенесите сетку и храните при криогенных температурах для сохранения витрификации.
- Следуйте инструкциям производителя, чтобы подготовить и использовать инструмент для погружной морозильной камеры.
- Просеивающие сетки с криографической микроскопией видимого света
- Перенесите сетки под жидким азотом из криокочастков на стандартную криокакассету (три положения для 3 мм теаметрических решеток) внутри предварительно охлаждаемой криокаскады (см. инструкцию производителя).
- Криокакассета помещается на криоступенчатый мост, а криостепания монтируется на широкоугольный эпифлуоресцентный световой микроскоп.
- Изобразите сетки при -196,5 °C с помощью объектива большого рабочего расстояния (10x, 50x, 100x) для того, чтобы найти подходящие ячейки для крио-SXT визуализации и оценить качество сетки (наличие толстого льда, целостность углеродной опорной пленки, наличие флуоресцентного сигнала и т. Д.).
- Локализуйте интересующие клетки с помощью яркого поля и/или флуоресцентной визуализации.
ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе захватывайте изображения, если на микроскопе присутствует связанная камера. Используйте его для корреляции изображений. - После просеивания верните сетки в криококсы в хранилище жидкого азота дьюара.
ЗАМЕТКА: Если хорошие образцы не найдены, повторите шаги подготовки образца, изменив любой из параметров. Обычно параметрами, требующими модификации, являются время промокания, в случае, если лед слишком толстый или слияние, если на квадрат сетки слишком много ячеек.
2. Загрузка в трансмиссионный рентгеновский микроскоп (TXM)
- Охладите передаточную камеру жидким азотом до тех пор, пока она не достигнет <100 К, охладите рабочую станцию (рисунок 3А) и включите нагреватель обода рабочей станции. Подождите, пока он перестанет кипеть.
- Поместите необходимые криокробы, содержащие сетки, в соответствующие места на рабочей станции (рисунок 3A). Обратите внимание на безопасную передачу их в криокондициях.
- Загрузите выбранные сетки в ранее охлажденные держатели образцов (рисунок 3В); загрузите держатели на шаттл и защитите их крышками (рисунок 3C).
- Загрузите шаттл в передаточную камеру при <100 К и откачайте его до низкого вакуума (рисунок 3D).
- Прикрепите передаточную камеру к TXM (рисунок 4A) и загрузите шаттл из передаточной камеры в TXM после вакуумной процедуры на экране (рисунок 4B).
- Как только шаттл находится внутри с образцами, роботизированная рука TXM может доставлять один держатель образца за раз на стадию отбора проб (рисунок 4C).
3. Создание изображений с помощью программного обеспечения TXM
ПРИМЕЧАНИЕ: Сетки на стадии образца сначала визуализируются с помощью онлайн-микроскопа видимого света (VLM) для отображения сетки либо в режиме яркого поля и/или флуоресценции, прежде чем получить изображение с помощью рентгеновских лучей. Используйте значок джойстика, соответствующий вкладке Управление движением на верхней левой панели, чтобы открыть Элемент управления движением.
- Создание изображений сетки с помощью онлайн-VLM.
- Приобретение яркой полевой мозаики
- Выберите камеру VLM (увеличительный объектив > VLM) и включите светодиодный источник VLM для яркой полевой визуализации (микроскоп > > настройки сбора > настройки источника и выберите Передача).
- Поверните образец на -60 градусов, чтобы повернуться лицом к объективу VLM (Motion Control > Sample > Sample θ) и переместите образец в ожидаемые центрированные положения (Motion Control > Sample and change Sample X, Sample Y).
- При получении изображений с шагом от 20 до 50 мкм сначала приведите сетку примерно в фокус (микроскоп > настройки сбора > получения > режимы сбора > непрерывный запуск > ; Управление движением > Образец и изменение Образца Z).
- Уточните фокус с меньшими шагами до 5 мкм до тех пор, пока ячейки и/или отверстия углеродной опорной пленки не окажутся в фокусе (микроскоп > настройки сбора > настройки сбора > режимы сбора > непрерывный запуск >; Motion Control > Sample and change Sample Z) и начать получение полной мозаичной карты сетки в режиме яркого поля. Используйте значения по умолчанию для мозаики. (Настройки сбора > > получения микроскопа > > Mosaic > Start).
ЗАМЕТКА: Мозаичная карта состоит из отдельных изображений. Количество изображений (количество столбцов, строк и размер шага в X и Y) должно быть установлено для визуализации всей сетки. Размер шага зависит от размера поля зрения (FoV). Здесь используются значения по умолчанию. Если сетка плохо центрирована в плоскости X-Y относительно полной мозаики FoV, остановите сбор, исправьте координаты образца X и Y и повторите получение.
- Получение мозаики в режиме флуоресценции
- Выключите светодиодный источник VLM для получения изображений яркого поля (Microscope > Acquisition > Acquisition Settings > Source Settings и отмените выбор Transmission) и выберите светодиодный источник света, соответствующий желаемой длине волны возбуждения (красный, зеленый или синий) и соответствующий оптический фильтр вручную на настройке.
- Уточните фокус на флуоресцентном изображении (микроскоп > > настройки сбора > режимы сбора > непрерывного запуска >; Управление движением > Образец и изменение Образца Z), а затем получить мозаичную карту, сохраняющую позиционные параметры (X и Y) из мозаики яркого поля (Микроскоп > Настройки сбора > > Режимы получения > Мозаика > Пуск).
- Выключите светодиодный источник света
- Необязательно: на основе ярких полей и флуоресцентных мозаичных карт аннотируйте интересующие области (ROI), определенные ранее (шаг 1.7.4), или новые ROI (позиции X-Y на изображении).
- Приобретение яркой полевой мозаики
- Приобретение рентгеновской мозаики
- Выберите ПЗС-детектор рентгеновского излучения (увеличительная линза > выберите Pixis), доведите образец до поворота на 0 градусов (Motion Control > Sample and change Sample θ) и переместите рентгеновскую оптику (Конденсатор и Зональная пластина) в выровненные положения (Motion Control > Конденсатор > изменить Конденсатор z; Управление движением > пластину зоны и изменение зоны пластины Z).
ЗАМЕТКА: Охладите ПЗС-чип до -65 °C перед визуализацией (микроскоп > температуру камеры > Pixis и измените установленную температуру до -65 °C и нажмите «Применить»). - Переместите образец в центр квадрата сетки одного из выбранных ROI (Motion Control > Sample и change Sample X, Sample Y).
- Используйте биннинг 2 и выходную щель при 5 мкм, чтобы свести к минимуму облучение и экспозицию 1 с в Мистрале, и биннинг 1 и 60 мкм в B24, отрегулируйте фокус с помощью преобразования образца Z (микроскоп > > настройки сбора > настройки камеры и изменение биннинга; Управление движением > XS и изменение XS; Микроскоп > настройки сбора > сбора> режимы сбора > непрерывный запуск >; Управление движением > Образец и изменение Образца Z). Начните с шагов 5 мкм и уточните его до шагов 0,5 мкм, пока ячейка или отверстия углеродной фольги не будут хорошо сфокусированы.
- Получите мозаичную карту квадрата сетки (параметры сбора > > > захвата микроскопа > мозаика > начало).
ЗАМЕТКА: Параметры захвата мозаики могут быть определены так же, как и для мозаик VLM (раздел 3.1.1.4). Размер шага зависит от увеличения, предварительно выбранного персоналом линии луча. - Переместите образец в положение плоского поля (FF) (пустая область внутри сетки, предпочтительно отверстие в углеродной опоре) (Motion Control > Sample и change Sample X, Sample Y).
- Установите время экспозиции равным 1 с в Mistral и 0,5 с в B24 (микроскоп > настройки сбора > настройки сбора > настройки камеры и изменение времени экспозиции) и получите одно изображение (микроскоп > режимы сбора > > запуск с одним >).
- Нормализуйте (разделите) полученную мозаику на изображение FF для получения передачи (со значениями от 0 до 1) и сохраните нормализованную мозаику (щелкните значок первого правого верхнего угла в правой части изображения, чтобы открыть меню>выберите вкладку «Ссылка> нажмите «Одна ссылка» и просмотрите конкретный FF).
- Выберите ПЗС-детектор рентгеновского излучения (увеличительная линза > выберите Pixis), доведите образец до поворота на 0 градусов (Motion Control > Sample and change Sample θ) и переместите рентгеновскую оптику (Конденсатор и Зональная пластина) в выровненные положения (Motion Control > Конденсатор > изменить Конденсатор z; Управление движением > пластину зоны и изменение зоны пластины Z).
- Подготовка к сбору рентгеновского наклона серии
ЗАМЕТКА: Найдите ось поворота для каждой интересующей области изображения.- Сделайте выбор областей внутри мозаики для выполнения томографии, т.е. разместив квадратную форму (нажмите на Инструмент в левой части окна изображения) с размером FoV на карте рентгеновской мозаики.
ЗАМЕТКА: При выборе областей учитывайте расстояние от границы (≥10 мкм) и других ячеек, чтобы избежать перекрытия ячеек при вращении. Кроме того, проверяют состояние клетки (ожидаемая форма клетки, толщина льда, успешность витрификации, фидуциальное распространение и т.д.). - Выравнивание образца по оси поворота
ЗАМЕТКА: Указанная процедура является итеративной. Итерация сходится быстрее, используя ± углы 60° в качестве максимальных углов поворота (θM). Если они недоступны, используйте углы как можно ближе к ± 60°.- Установите камеру на биннинг 2, время экспозиции 1 с (микроскоп > настройки сбора > > настройки камеры и изменение времени экспозиции; изменение биннинга; Микроскоп > режимы сбора > получения > continuous > Start), установите выходную щель на 5 мкм.
ЗАМЕТКА: Максимально минимизируйте дозу, работая с минимальной диафрагмой выходной щели. - При повороте на 0° перейдите в ранее выбранную область с помощью образца X и образца Y трансляции и сосредоточьтесь на особенности ячейки, чтобы поместить в ось вращения с помощью образца Z трансляции (Motion Control > Sample и change Sample x; Образец y; Образец z).
- Поверните образец на + θM (Motion Control > Sample и change Sample θ) и нарисуйте линию (L+) (нажмите на кнопку инструмента «Линия» в правой части окна изображения) на объекте ячейки, чтобы поместить на ось вращения.
- Поверните на -θM (Motion Control > Sample и change Sample θ) и нарисуйте линию (L-) (нажмите на кнопку инструмента «Линия» в правой части окна изображения) на объекте ячейки, которую вы хотите поместить на ось вращения.
- При +θM или -θM используйте пример преобразования Z, чтобы переместить выбранный объект в центральное положение между обеими линиями (Motion Control > Sample и change Sample Z).
- Повторяйте процедуру с шага 3.3.2.3 итеративно до тех пор, пока не будет достигнуто минимальное расстояние от L+ до L-.
ЗАМЕТКА: Расстояние между двумя линиями L+ и L- должно быть меньше по отношению к предыдущей итерации. - При выборке θ = 0 (Управление движением > Выборка и изменение Образца θ) переместите образец X на расстояние, необходимое для размещения выбранного объекта в центре обеих линий (Управление движением > Выборка и изменение Образца X). Переместите пластину зоны (ZP) X, чтобы вернуть функцию в центр FoV (Motion Control > ZP и изменить ZP X). Выполните этот шаг только один раз для каждой сетки.
- Повторно оптимизируйте положение ZP Z по отношению к новой оси вращения путем записи Фокальной серии ZP Z (коллекции изображений в разных положениях ZP Z, обычно с шагом 0,3 мкм) (микроскоп > > настройки сбора > режимы сбора > Focal Series > Start) и переместите ZP Z в положение, в котором образец находится в фокусе (управление движением > зональную пластину и изменение зональной пластины z).
- Задайте параметры для получения серии наклона.
ЗАМЕТКА: Максимальный угловой диапазон в конечном итоге ограничен фокусным расстоянием ZP (±70 или ±65 градусов для 40 нм или 25 нм ZP для плоского образца соответственно). Оптимизируйте отношение сигнал/шум (S/N) и радиационное повреждение, чтобы определить время экспозиции. Для томографии используйте разное время воздействия в разных угловых диапазонах. - Определите самый высокий угловой диапазон вращения на случай, если затенение произойдет до достижения максимального угла поворота.
- Установите биннинг камеры на 1 (Микроскоп > Настройки сбора > Получения > Настройки камеры и измените Биннинг), откройте выходную щель до 15 мкм в Mistral (Управление движением > XS и изменение XS) и установите поворот на 0° (Управление движением > Образец и изменение Образца θ).
- Получите одно изображение со временем экспозиции 1 с (микроскоп > > настройки сбора > режимы получения > single > Start) и оцените время экспозиции, необходимое для каждого угла наклона томографии.
- Установите камеру на биннинг 2, время экспозиции 1 с (микроскоп > настройки сбора > > настройки камеры и изменение времени экспозиции; изменение биннинга; Микроскоп > режимы сбора > получения > continuous > Start), установите выходную щель на 5 мкм.
- Сделайте выбор областей внутри мозаики для выполнения томографии, т.е. разместив квадратную форму (нажмите на Инструмент в левой части окна изображения) с размером FoV на карте рентгеновской мозаики.
- Получение томографии
- Перейдите к отрицательному максимальному углу +0,1 (например, для ZP 25 нм перейдите к -65,1°) (Motion Control > Sample и change Sample θ).
- Установите количество изображений как общее количество углов (с учетом изображения под углом 0) и угловой диапазон (микроскоп > получение > настройки получения > режимы получения > томографии и изменение количества изображений; затем измените угол start и angle end).
- Установите определенное время экспозиции и начните сбор (Микроскоп > > Настройки сбора > Настройки камеры и измените Время экспозиции, а затем нажмите кнопку Пуск).
- Перейдите в положение FF (Управление движением > Образец и изменение Образца X; затем измените Образец Y) и получите 10 изображений FF (Микроскоп > Получение > Режимы получения > Среднее и измените количество изображений, а затем нажмите кнопку Пуск).
ЗАМЕТКА: В Mistral спектромикроскопия или энергозависимая микроскопия возможна при получении проекций при сканировании энергии через интересующую грань поглощения. Конечным выходом является стек 2D-проекций, которые будут содержать спектр поглощения рентгеновских лучей (XAS) в каждом пикселе, то есть изображения с химической информацией. Расширение до 3D совмещения спектроскопии с томографией в принципе возможно. Общая требуемая доза может быть ограничением, и тогда могут потребоваться конкретные стратегии, такие как дифференциальная абсорбционная визуализация.
4. Анализ данных
ПРИМЕЧАНИЕ: Весь анализ данных выполняется с помощью доступного открытого программного обеспечения и скриптов, разработанных с помощью автоматизированных конвейеров.
- На Мистрале
- Конвейер преобразует стеки томографии из расширения txrm (программное расширение TXM) в hdf5 (иерархический формат данных с открытым исходным кодом) со всеми необходимыми метаданными, затем нормализует стек по среднему значению FF и машинному току и, наконец, деконволюирует стеки по функции измеряемой точки распространения оптической системы для конкретной линзы зоны Френеля (ZP) и энергии23, 24. Для деконволюции найдите правильное значение k = 1/SNR (зависит от толщины образца). Для скрипта, разработанного в Mistral, введите команду: txrm2deconv "input tomo" "input FF" -zp="ZP used" - e= " energy " - dx= " pixel size " - k= " 1/SNR " - t=-1.
- Для скрипта, разработанного в Mistral для автоматического выравнивания, введите команду: ctalignxcorr "normalized deconvolved stack.mrc" "normalized stack.hdf5".
ПРИМЕЧАНИЕ: Ряд программных приложений может быть использован для выравнивания проекций к общей оси вращения с использованием Au NP fiducials25,26. Выравнивание проекций требует субпиксельной точности. Автоматическое выравнивание может быть удовлетворительным только тогда, когда фидуциалов Au NP достаточно (>7) и хорошо распределены в поле зрения. Ручное выравнивание часто требуется апостериори для коррекции автоматического выравнивания для достижения максимально возможной точности. - Чтобы восстановить выровненный нормализованный стек, используйте любой из нескольких доступных алгоритмов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выровненный стек может быть реконструирован с использованием взвешенной обратной проекции (WBP) или методов одновременной итеративной реконструкции (SIRT) за несколько минут. Однако, чтобы сохранить коэффициенты линейного поглощения (LAC), алгебраические методы реконструкции (ART) предпочтительны27. ART требует больше вычислительного времени, поэтому SIRT28 выполняется первым для быстрой автоматической реконструкции серии наклона (30 итераций за несколько минут). Как только выравнивание будет удовлетворительным, будет использоваться ART.
- В B24
- Пользовательский конвейер преобразует файлы данных txrm в стандартные Tiffs со всеми необходимыми метаданными, а затем отправляет их в рабочий процесс пакетного runtomo, который обрабатывает наборы данных тремя способами: WBP, SIRT и patch.
Representative Results
Подготовка образцов для крио-SXT может быть сложной задачей. Даже в пределах одной и той же сетки образцов можно иметь области, которые являются идеальными, и области, которые не идеальны, как видно на рисунке 5, где показаны два квадрата из одной и той же сетки Поиска Au. Идеальный образец должен иметь одиночные клетки в центре квадратной сетки, встроенные в тонкий слой льда и окруженные хорошо дисперсными маркерами Au fiducial, используемыми для выравнивания наклонных проекций перед реконструкцией томографии. На рисунке 5А показана фибробластоподобная клетка (NIH 3T3), которая соответствует многим из этих критериев. Один фрагмент из 3D-реконструкции с использованием ART27 области, отмеченной красным прямоугольником, указывающим поле зрения (FoV), показан на рисунке 5B. Многие различные органеллы, такие как митохондрии (M), эндоплазматический ретикулум (ER), везикулы (V) и ядро (N), могут быть различимы благодаря количественной реконструкции LAC. Кроме того, отношение сигнал/шум реконструкции очень высокое, что позволяет добиться высокой контрастности сотовых функций. С другой стороны, на рисунке 5C показан квадрат с более высокой плотностью клеток. Из-за этого пятно обычно менее эффективно, что приводит к более толстому слою льда или даже проблемам с витрификацией. В некоторых случаях это уже можно наблюдать при скрининге сетки с использованием эпифлуоресцентного картирования до рентгеновской визуализации, и этих сеток следует избегать любой ценой. На рисунке 5C можно наблюдать трещину внутри сетки и остеклованный лед, проходящий через весь квадрат сетки (отмеченный красными стрелками). Следует избегать любых изображений вблизи трещин из-за вероятной нестабильности сетки при воздействии луча. Кроме того, трещины могут быть признаком густого льда, как это было в этом районе. Серия наклона была зафиксирована в области, отмеченной красным прямоугольником. На рисунке 5D показан один срез из соответствующей 3D-реконструкции. Несмотря на то, что некоторые более крупные структуры могут быть распознаны, мелкие детали теряются в шуме и зернистой текстуре из-за плохого качества витрификации толстого льда, что можно увидеть, например, на верхних митохондриях, направленных стрелой.
Рисунок 1: Рабочий процесс. Схематический рабочий процесс, выполнявшийся до сбора данных cryo-SXT. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Растущие клетки на сетках. (A) Клетки, растущие в чашке Петри P100 со слиянием около 80%-90%. (B) Чашка Петри P60 с несколькими сетками после посева клеток. (C) Клетки, растущие поверх сетки через 24 ч. Шкала: 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Загрузка сеток на держатели образцов и в передаточную камеру. (А) Рабочее место заполнено жидким азотом с шаттлом и криобоксами, готовыми к загрузке сетей. (B) Держатель образца, вставленный в погрузчик с загруженной сеткой. (C) Челнок с держателем образца в положении 3 без крышки. (D) Рабочее место с прикрепленной передаточной камерой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Загрузка образцов в TXM (A) Присоединение передаточной камеры к TXM. (B) Шаттл внутри TXM. (C) Роботизированная манипулятор TXM, вставляющая держатель образца в стадию отбора проб. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Пример криомягтерных рентгеновских томограмм. Верхний ряд: идеальный образец, (А) 2D мозаичный вид квадрата сетки, показывающего изолированную ячейку в центре. (B) Один фрагмент из реконструированного 3D-тома, показывающий отмеченную область красным прямоугольником (A). По сравнению с (D) изображение намного более плавное, и видно больше деталей. Нижний ряд: неидеальные образцы, (C) 2D мозаичный вид квадрата сетки, показывающий слишком высокую слияние ячеек и трещины во льду и фольге сетки (красные стрелки). (D) Один фрагмент из реконструированного 3D-тома, показывающий область, отмеченную красным прямоугольником в (C). Плохая или неоптимальная витрификация может быть идентифицирована по зернистой текстуре изображения. N: Ядро; M: Митохондрии; ER: Эндоплазматический ретикулум; МВ: Мультивезикулярные тела; V: Вакуоль; Шкала стержней: A & C 20 мкм; B & D 2 μm.VПожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Discussion
Пробоподготовка является критическим этапом для получения высококачественных мягких рентгеновских томограмм, так как их качество напрямую зависит от качества витрификации образца и толщины слоя льда, в который встроена ячейка. Проекции с высоким отношением сигнал/шум будут собираться в регионах с тонким слоем льда, что позволит минимизировать дозу излучения, необходимую для достижения максимально возможного разрешения. Кроме того, слияние клеток также повлияет на качество конечной томограммы, так как следует избегать попадания соседних клеток в FoV при вращении. Наконец, правильная дисперсия маркеров Au fiducial определит точность выравнивания проекции, а затем в конечном итоге определит качество конечного 3D-реконструированного объема. Обратите внимание, что правильное распределение Au fiducials по сетке позволяет автоматизировать шаг выравнивания проекции, без которого необходима высокая квалификация для такого критического шага.
Протокол в настоящем документе описывает только одну возможную стратегию подготовки образцов, которая имеет сходство с теми, которые используются в криоэлектронной томографии (крио-ET). В обоих случаях протоколы, улучшающие требовательную подготовку образцов для лучшей воспроизводимости, будут иметь основополагающее значение для успеха этих методов, и предпринимаются усилия для достижения этой цели29. Стоит отметить, что в дополнение к визуализации изолированных клеток, участки ткани также могут быть визуализированы при условии, что сигнала передачи через участок будет достаточно при высоких углах наклона. Как правило, это подразумевает участки в несколько микрон (ниже 10 мкм).
Чтобы отобразить определенную структуру или событие внутри ячейки, необходимо убедиться, что эта конкретная функция находится внутри FoV серии наклона. Поскольку FoV в крио-SXT ограничен 10 x 10мкм2 до 15 x 15мкм2 в зависимости от объектива и с учетом пиксельной передискретизации разрешения по крайней мере до 2 раз, он часто меньше, чем полное расширение ячейки (см. красные квадраты, указанные на рисунке 5). Поэтому ROI должен быть найден и правильно маркирован. Обычно это делается с помощью флуоресцентных меток и корреляционных подходов видимого света. 2D-стратегии, сочетающие эпифлуоресценцию, просты, так как мягкий рентгеновский просвечивающий микроскоп имеет встроенный флуоресцентный микроскоп видимого света, но другие подходы для сигнала флуоресценции высокого разрешения 2D или 3D также доступны 4,12,13,15,16 . В этих случаях сетка должна быть сначала визуализирована в конкретных инструментах, таких как микроскопы со сверхвысоким разрешением. Обратите внимание, что наиболее эффективными корреляционными подходами являются подходы, связанные со сбором данных в криогенных условиях. Это связано с тем, что промежуток времени между комнатной температурой (RT), флуоресцентной визуализацией видимого света и витрификацией образца, например, будет препятствовать своевременному улавливанию правильного клеточного события; кроме того, процедура витрификации может отделить интересующую ячейку, которая была изображена в RT, от сетки. Даже если большинство корреляционных подходов к визуализации могут подразумевать, что сетками образцов необходимо манипулировать и транспортировать с одного инструмента на другой, и, несмотря на повышенный риск загрязнения сети или повреждения, которое это создает, награда ясна: иметь возможность точно определять конкретные события или молекулы в клеточном ландшафте.
Когда требуется визуализация целых клеток, возможно сшивание различных томограмм при условии, что общая применяемая доза не превышает предел радиационного повреждения. Обычно осажденная доза для сбора нескольких томограмм на одной и той же клетке значительно ниже предела достижимого разрешения (109 Гр) и, следовательно, не требуется никакой конкретной стратегии для снижения дозы, хотя это зависит от образца и эксперимента. В случае интенсивного сбора данных, такого как спектромография, действительно потребуется минимизация дозы и применение удобных стратегий сбора данных и их обработки.
Cryo-SXT имеет несколько ограничений, о которых следует упомянуть здесь. Первый - это хорошо известный отсутствующий клин, который присущ использованию плоских опор для образцов. Капиллярные опоры для образцов, позволяющие вращаться на 180 градусов, использовались в прошлом и до сих пор используются на некоторых объектах, но они также имеют недостатки, такие как обедненный контраст из-за поглощения стекла и ограничение использования ячеек в суспензии. Способ уменьшить эффект отсутствующего клина - выполнить томографию с двойным наклоном. Это действительно возможно на лучевой линии Мистраль в наши дни. Второе ограничение устанавливает пластинчатая линза Френеля, используемая в таких микроскопах. Этот объектив устанавливает максимально достижимое разрешение и глубину резкости (DoF), которые тесно связаны. Это означает, что увеличение разрешения уменьшит DoF, в то время как толщина ячейки часто будет больше. Например, объектив 40 нм теоретически будет иметь DoF 3 мкм и разрешение 24,4 нм половинного шага. Поэтому компромисс между разрешением и DoF является стратегическим, и выбор объектива будет зависеть от типа ячейки 30,31. Наконец, действующие TXM во всем мире далеки от идеальных микроскопов, и предпринимаются усилия по улучшению оптических систем для достижения теоретических ожиданий. Наконец, визуализация и сегментация реконструированных объемов может осуществляться с помощью специальных программных средств 25,32,33,34.
Таким образом, крио-SXT позволяет количественно визуализировать клетки при среднем разрешении (25-30 нм половинного шага) и в статистических цифрах (несколько десятков томограмм в день). Это позволяет получить организацию, распределение и размер органелл в конкретных условиях, например, во время патогенной инфекции или заболеваний, в точные моменты времени или после конкретных методов лечения. Таким образом, это полезный дополнительный метод биологической визуализации к более распространенным микроскопиям электронного и видимого света, каждая из которых охватывает определенный диапазон размеров и разрешения образца. Крио-SXT часто используется в коррелятивных подходах, включающих флуоресценцию видимого света, но возможны и другие криокоррелятивные стратегии.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Acknowledgments
Этот проект получил финансирование от проекта Европейской комиссии Horizon 2020 iNEXT-Discovery и исследовательской и инновационной программы Европейского союза Horizon 2020 в рамках грантового соглашения Марии Склодовской-Кюри No 75439.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amira | Thermo Fisher | Software for segmentation | |
| Au Holey Carbon Films finder grids | (Quantifoil Micro Tools Gmb | R 2/2 Au G200F1 | Au Holey Carbon Films finder grids |
| Au nanoparticles | BBI Group, Cardiff, UK | Au nanoparticles 100nm | 100 nm Au nanoparticles (NPs) at Mistral (Alba) |
| Au nanoparticles | BBI Group, Cardiff, UK | Au nanoparticles 250nm | 250 nm Au nanoparticles (NPs) at B24 (Diamond) |
| Axio Scope A1 | Zeiss | 430035 9060 | Fluorescence microscope |
| Blotting No.1 filter paper | Whatman | WHA10010155 | Blotting filter |
| Bsoft | Software for projection alignment, reconstruction and visualization (Heymann et al., 2008) | ||
| Chimera | Software for segmentation (Pettersen et al. 2004) | ||
| Cryo-EM Glow Discharge Set | PELCO easiGlow | 91000S | Glow Discharge Cleaning System |
| Cu Holey Carbon Films finder grids | (Quantifoil Micro Tools Gmb | R 2/2Cu G200F1 | Cu Holey Carbon Films finder grids |
| Fetal calf serum | Sigma | F9665 | Heat Inactivated, sterile-filtered, suitable for cell culture |
| ImageJ | Software for image processing and analysis in Java (NIH & LOCI University of Wisconsin) | ||
| IMOD | Software for projection alignment, reconstruction and visualization (Kremer et al., 1996) | ||
| Leica EM GP Grid Plunger | Leica | 16706401 | Automatic Plunge Freezer EM |
| LINKAM cryo-stage | Linkam Scientific Instruments | CMS 196 | Cryo-Correlative Microscopy Stage |
| MIB | Software for segmentation (Belevich et al. 2016) | ||
| P100 Petri dish | Sigma | P6106 | Treated for cell culture and sterile |
| P60 Petri dish | Sigma | D8054 | Treated for cell culture and sterile |
| Polylysin | Sigma | P4707 | Poly-L-lysine solution 0.01%, sterile-filtered |
| Soft X-Ray microscope 0.25-1.2keV | Xradia | NCT-SB | Transmission soft X-Ray microscope |
| SURVOS | Software for segmentation (Luengo et al. 2017) | ||
| Tomo3d | Software for reconstruction (SIRT, WBP) (Agulleiro et al. 2011) | ||
| TomoJ | Software for reconstruction (ART) (Messaoudi et al., 2007) | ||
| XM Data Explorer | Zeiss | TXM software |
References
- Carrascosa, J. L., et al. Cryo X-ray tomography of vaccinia virus membranes and inner compartments. Journal of Structural Biology. 168, 234-239 (2009).
- Uchida, M., et al. Soft X-ray tomography of phenotypic switching and the cellular response to antifungal peptoids in Candida albicans. PNAS. 106, 19375-19380 (2009).
- Schneider, G., et al. Three-dimensional cellular ultrastructure resolved by X-ray microscopy. Nature Methods. 10, 1-3 (2010).
- Chichón, F. J., et al. Cryo nano-tomography of vaccinia virus infected cells. Journal of Structural Biology. 177, 202-211 (2012).
- Groen, J., Conesa, J. J., Valcárcel, R., Pereiro, E. The cellular landscape by soft X-ray tomography. Biophysical Reviews. 11, 611-619 (2019).
- Kepsutlu, B., et al. Cells undergo major changes in the quantity of cytoplasmic organelles after uptake of gold nanoparticles with biologically relevant surface coatings. ACS Nano. 14, 2248-2264 (2020).
- Natterer, F. The mathematics of computerized tomography. , Wiley. New York. (1986).
- Weiss, D., et al. Computed tomography of cryogenic biological specimens based on X-ray microscopic images. Ultramicroscopy. 84, 185-197 (2000).
- Clowney, E. J., et al. Nuclear aggregation of olfactory receptor genes governs their monogenic expression. Cell. 151, 724-737 (2012).
- Duke, E. M. H., et al. Imaging endosomes and autophagosomes in whole mammalian cells using correlative cryo-fluorescence and cryo-soft X-ray microscopy (cryo-CLXM). Ultramicroscopy. 143, 77-87 (2014).
- Cinquin, B., et al.
- Hagen, C., et al. Multimodal nanoparticles as alignment and correlation markers in fluorescence/soft X-ray cryo-microscopy/tomography of nucleoplasmic reticulum and apoptosis in mammalian cells. Ultramicroscopy. 146, 46-54 (2014).
- Pérez-Berná, A. J., et al. Structural changes in cells images by soft X-ray cryo-tomography during Hepatitis C virus infection. ACS Nano. 10, 6597-6611 (2016).
- Chiappi, M., et al. Cryo-soft X-ray tomography as a quantitative three-dimensional tool to model nanoparticle:cell interaction. Journal of Nanobiotechnology. 14, 15 (2016).
- Varsano, N., et al. Development of correlative cryo-soft X-ray tomography and stochastic reconstruction microscopy. A study of cholesterol crystal early formation in cells. Journal of the American Chemical Society. 138, 14931-14940 (2016).
- Kounatidis, I., et al. Correlative cryo-structured illumination fluorescence microscopy and soft X-ray tomography elucidates reovirus intracellular release pathway. Cell. 182, 1-16 (2020).
- Kapishnikov, S., et al. Mode of action of quinoline antimalarial drugs in red blood cells infected by Plasmodium falciparum revealed in vivo. PNAS. 116 (46), 22946-22952 (2019).
- Conesa, J. J., et al. Unambiguous intracellular localization and quantification of a potent iridium anticancer compound by correlative 3D cryo X-ray imaging. Angewandte Chemie International Edition. 59, 1270-1278 (2020).
- Gal, A., et al. Native-state imaging of calcifying and noncalcifying microalgae reveals similarities in their calcium storage organelles. PNAS. 115 (43), 11000-11005 (2018).
- Procopio, A., et al. Chemical fingerprint of Zn-hydroxyapatite in the early stages of osteogenic differentiation. ACS Central Science. 5, 1449-1460 (2019).
- Kahil, K., et al. Cellular pathways of calcium transport and concentration toward mineral formation in sea urchin larvae. PNAS. 117 (49), 30957-30965 (2020).
- Conesa, J. J., et al. Intracellular nanoparticles mass quantification by near-edge absorption soft X-ray nanotomography. Scientific Reports. 6, 22354 (2016).
- Otón, J., Sorzano, C. O. S., Maribini, R., Pereiro, E., Carazo, J. M. Measurement of the modulation transfer function of an X-ray microscope based on multiple Fourier orders analysis of a Siemens star. Optics Express. 23 (8), 9567-9572 (2015).
- Otón, J., et al. Characterization of transfer function, resolution and depth of field of a soft X-ray microscope applied to tomography enhancement by Wiener deconvolution. Biomedical Optics Express. 7, 5092-5103 (2016).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of Structural Biology. 116, 71-76 (1996).
- Heymann, J. B., Cardone, G., Winkler, D. C., Steven, A. C. Computational resources for cryo-electron tomography in Bsoft. Journal of Structural Biology. 161, 232-242 (2008).
- Messaoudi, C., et al. Three-dimensional chemical mapping by EFTEM-TomoJ including improvement of SNR by PCA and ART reconstruction of volume by noise supression. Microscopy Microanalysis. 19, 1669-1677 (2013).
- Agulleiro, J. I., Fernández, J. J. Fast tomographic reconstruction on multicore computers. Bioinformatics. 27, 582-583 (2011).
- Toro-Nahuelpan, M., et al. Tailoring cryo-electron microscopy grids by photo-micropatterning for in-cell structural studies. Nature Methods. 17, 50-54 (2020).
- Attwood, D. Soft X-rays and Extreme Ultraviolet Radiation. Principles and Applications. , Cambridge University Press. Cambridge. (2000).
- Howells, M., Jacobsen, C., Warwick, T. Principles and Applications of Zone Plate X-ray. Microscopes. Science of Microscopy. , Springer. New York. (2007).
- Pettersen, E. F., et al. UCSF Chimera--a visualization system for exploratory research and analysis. Journal of Computational Chemistry. 25, 1605-1612 (2004).
- Belevich, I., Joensuu, M., Kumar, D., Vihinen, H., Jokitalo, E. Microscopy image browser: a platform for segmentation and analysis of multidimensional datasets. PLOS Biology. 14 (1), 1002340 (2016).
- Luengo, I., et al. SuRVoS: Super-region volume segmentation workbench. Journal of Structural Biology. 198, 43-53 (2017).
