Summary
Цель этого исследования состояла в том, чтобы определить, может ли анализ отслеживания наночастиц (NTA) обнаружить и количественно оценить мочевой кальций, содержащий нанокристалл, у здоровых взрослых. Результаты текущего исследования показывают, что NTA может быть потенциальным инструментом для оценки нанокристаллов мочи при почечнокаменной болезни.
Abstract
Камни в почках становятся все более распространенными во всем мире у взрослых и детей. Наиболее распространенный тип камней в почках состоит из кристаллов оксалата кальция (CaOx). Кристаллурия возникает, когда моча перенасыщена минералами (например, кальцием, оксалатом, фосфатом) и предшествует образованию камней в почках. Стандартные методы оценки кристаллурии в камнеобмениках включают микроскопию, фильтрацию и центрифугирование. Однако эти методы в первую очередь обнаруживают микрокристалл, а не нанокристалл. Было высказано предположение, что нанокристаллы более вредны для эпителиальных клеток почек, чем микрокристаллы in vitro. Здесь мы описываем способность анализа отслеживания наночастиц (NTA) обнаруживать нанокристаллы мочи человека. Здоровых взрослых кормили контролируемой оксалатной диетой перед употреблением оксалатной нагрузки для стимуляции мочевых нанокристаллов. Моча собиралась в течение 24 часов до и после оксалатной нагрузки. Образцы обрабатывали и промывали этанолом для очистки образцов. Мочевые нанокристаллы окрашивали кальцийсвязывающим флуорофором Fluo-4 AM. После окрашивания размер и количество нанокристаллов определяли с помощью NTA. Результаты этого исследования показывают, что NTA может эффективно обнаруживать нанокристаллурию у здоровых взрослых. Эти данные свидетельствуют о том, что NTA может быть ценным методом раннего выявления нанокристаллурии у пациентов с почечнокаменной болезнью.
Introduction
Мочевые кристаллы образуются, когда моча становится перенасыщенной минералами. Это может произойти у здоровых людей, но чаще встречается у людей с камнями в почках1. Наличие и накопление кристаллов в моче может увеличить риск развития камня в почках. В частности, это происходит, когда кристаллы связываются с бляшкой Рэндалла, нуклеат, накапливаются и растут с течениемвремени 2,3,4. Кристаллурия предшествует образованию камней в почках и оценка кристаллурии может иметь прогностическое значение у камнеобразовательных почек3,5. В частности, было предложено, чтобы кристаллурия была полезна для прогнозирования риска рецидива камней у пациентов с анамнезом оксалата кальция, содержащего камни6,7.
Сообщалось, что кристаллы негативно влияют на функцию почечных эпителиальных и циркулирующих иммунных клеток8,9,10,11,12,13. Ранее сообщалось, что циркулирующие моноциты из камнеуловителей оксалата кальция (CaOx) подавляют клеточную биоэнергетику по сравнению со здоровыми людьми14. Кроме того, кристаллы CaOx снижают клеточную биоэнергетику и нарушают окислительно-восстановительный гомеостаз в моноцитах8. Потребление пищи, богатой оксалатами, может вызвать кристаллурию, которая может привести к повреждению почечных канальцев и изменить выработку и функцию макромолекул в моче, которые защищают от образования камней в почках15,16. Несколько исследований показали, что мочевые кристаллы могут различаться по форме и размеру в зависимости от рН и температуры мочи17,18,19. Кроме того, было показано, что мочевые белки модулируют поведение кристаллов20. Daudon et al.19предположили, что анализ кристаллурии может быть полезен в ведении пациентов с почечнокаменной болезнью и в оценке их реакции на терапию. Несколько традиционных методов, доступных в настоящее время для оценки присутствиякристаллов,включают поляризованную микроскопию21,22, электроннуюмикроскопию23,счетчики частиц3,фильтрацию мочи24,испарение3,5 или центрифугирование21. Эти исследования дали ценную информацию о области камней в почках относительно кристаллурии. Однако ограничением этих методов была неспособность визуализировать и количественно оценивать кристаллы размером менее 1 мкм. Кристаллы такого размера могут влиять на рост камней CaOx, прикрепляясь к бляшке Рэндалла.
Было показано, что нанокристаллы вызывают обширное повреждение почечных клеток по сравнению с более крупными микрокристаллами25. Сообщалось о присутствии нанокристаллов в моче с использованием анализатора наночастиц26,27. Недавние исследования использовали флуоресцентно меченые бисфосфатные зонды (алендронат-флуоресцеин/алендронат-Cy5) для изучения нанокристаллов с использованием наноразмерной проточной цитометрии28. Ограничение этого красителя заключается в том, что он не является специфическим и будет связываться практически со всеми типами камней, кроме цистеина. Таким образом, точная оценка присутствия нанокристаллов у людей может быть эффективным инструментом для диагностики кристаллурии и/или прогнозирования риска камней. Целью этого исследования было обнаружение и количественная оценка нанокристаллов кальция (размером <1 мкм) с использованием анализа отслеживания наночастиц (NTA). Для достижения этой цели технология NTA использовалась в сочетании с кальцийсвязывающим флуорофором Fluo-4 AM для обнаружения и количественной оценки нанокристаллов кальция, содержащих в моче здоровых взрослых.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты, описанные в этой работе, были одобрены Советом по институциональному обзору Университета Алабамы в Бирмингеме (UAB). Здоровые взрослые (33,6 ± 3,3 года; n = 10) были включены в исследование, если у них была нормальная комплексная метаболическая панель крови, не употребляли табак, не беременные, ИМТ между 20-30 кг /м2и без хронических заболеваний или острых заболеваний. Здоровые участники подписали письменную форму информированного согласия до начала исследования.
1. Клинический протокол и сбор мочи
- Запрочем участникам потреблять диету с низким содержанием оксалатов, подготовленную Центром клинических и трансляционных наук UAB Bionutrition Core в течение 3 дней и голодать на ночь, прежде чем собирать мочу (24-часовой образец).
- На следующий день участники должны вернуть свой 24-часовой образец мочи (преоксалат) перед употреблением оксалатной нагрузки (смузи, содержащий фрукты и овощи, ~ 8 мМ оксалата). Впоследствии участники собирали мочу в течение 24 часов (образец после оксалата) и возвращали свою мочу на следующий день.
- Поддерживайте все образцы мочи при комнатной температуре (RT) перед обработкой, как описано ниже и показано на рисунке 1.
2. Обработка мочи
ПРИМЕЧАНИЕ: Все используемые материалы и оборудование перечислены в Таблице материалов.
ВНИМАНИЕ: Носите средства индивидуальной защиты в любое время при обращении с клиническими образцами и реагентами. В частности, перчатки, щитки для лица и глаз, защита органов дыхания и защитная одежда.
- Измерьте и запишите рН и объем мочи. Тщательно перемешайте перед добавлением 50 мл мочи в меченую стерильную коническую трубку 50 мл.
- Образец центрифуги при 1200 х г в течение 10 мин при РТ с использованием настольная центрифуга.
ПРИМЕЧАНИЕ: Держите образец на rt, чтобы предотвратить дальнейшее образование кристаллов, так как более низкие температуры могут способствовать кристаллизации. - Выбросьте супернатант, промыть и снова суспендировали гранулу 5 мл 100% этанола. Центрифугировать образец при 1200 х г в течение 10 минут на RT с помощью настольная центрифуга.
- Выбросьте супернатант и повторно суспендьте гранулу в 1 мл 100% этанола. Храните образец при -20 °C для последующей обработки ИЛИ окрашивайте образец, как описано ниже.
ПРИМЕЧАНИЕ: Между сохраненными или свежеокрашенными образцами не существует существенной разницы в точках данных (т.е. размере/концентрации частиц).
3. Анализ отслеживания наночастиц (NTA)
- Пробоподготовка
- Наночастицы золота: используйте наночастицы золота для оптимизации настроек на приборе. Разбавьте наночастицы золота размером 100 нм 1:1000 в сверхчистой воде.
- Человеческая моча: Разбавьте образцы мочи 20 раз в воде перед окрашиванием 5 мМ Fluo-4 AM (краситель флуоресценции кальция) в течение 30 мин в темноте. Анализируйте образцы с помощью NTA.
- Готовят кристаллы оксалата кальция (CaOx), какописано ранее 29. Разбавляют 10 мМ запасного раствора (14,6 мг в 10 мл воды) до 50 мкМ в воде и окрашивают разбавленные образцы с использованием 5 мМ Fluo-4 AM в течение 30 мин в темноте перед анализом.
- Кристаллы фосфата кальция (CaP): Разбавить 10 мМ раствора (50,4 мг в 10 мл воды) до 50 мкМ в воде и окрашивать разбавленные образцы с использованием 5 мМ Fluo-4 AM в течение 30 мин в темноте перед анализом NTA.
- Настройка приборов, настройки камеры и сбор данных
ПРИМЕЧАНИЕ: Компьютер и прибор, используемые для этого метода, показаны на рисунке 2.- Включите компьютер, а затем инструмент. Откройте программное обеспечение и включите камеру.
- Открыв окно программного обеспечения, щелкните значок захвата в левом верхнем углу окна, чтобы запустить режим захвата. Инициализация камеры занимает несколько секунд.
- Очистите платформу, сначала закачивая в нее воздух с помощью шприца 1 мл, пока платформа не появится чистой. Осторожно добавьте воду в аппарат 2-3 раза, используя еще шприц 1 мл, чтобы удалить пузырьки воздуха.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ищите любые пузырьки воздуха в платформе, а также в трубке. Важно, чтобы во всем аппарате не было пузырьков до и во время запуска образцов. Если пузырьки присутствуют, снова очистите платформу воздухом и водой. - Как только платформа будет чистой, добавьте воду, чтобы проверить наличие загрязнений на поверхности, просмотрев камеру. Затем добавьте наночастицы золота в качестве элемента управления в инжектор насоса загрузки образцов для настройки инструмента.
- Отрегулируйте уровень камеры на экране или на ручке в правой части инструмента, пока изображение не начнет отображать цветные пиксели, а затем уменьшите уровень камеры.
- Затем настройте экран, чтобы оптимизировать изображение. Щелкните левой кнопкой мыши на видеоизоблике. Удерживайте левую кнопку мыши и перетаскивайте изображение вверх и вниз, чтобы получить весь вид.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обычный объектив камеры и фильтр используются для оценки наночастиц золота и неокрашаемых образцов. - Настройте скорость инфузии и сфокусировать камеру так, чтобы наночастицы золота были видны на экране камеры. Установите высокую скорость инфузии (т.е. 500 мкл/мин) для первоначальной настройки, чтобы обеспечить обнаружение наночастиц золота. После обнаружения уменьшите скорость до 50 мкл/мин.
- Отрегулируйте уровень камеры, чтобы визуализировать частицы. Для неокрашированных образцов отрегулируйте коэффициент усиления экрана на уровне 5, чтобы достичь фокусировки камеры, и установите уровень камеры на 8. Как только фокус установлен, запишите образец (т.е. 1 измерение только в течение 60 секунд).
ПРИМЕЧАНИЕ: Фокусировка и непрерывная скорость потока важны для получения четких и четких изображений частиц для подсчета. - После оптимизации снова очистите аппарат водой перед оценкой образцов. Посмотрите на камеру, чтобы убедиться, что трубка чистая и частицы отсутствуют.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мойте камеру между каждым образцом до тех пор, пока камера не обнаружит частицы. - Чтобы проанализировать окрашенные образцы, отрегулируйте камеру в положение фильтра, содержащего подходящий флуоресцентный фильтр. Загрузите разбавленные и окрашенные образцы в инжектор насоса загрузки образцов и уменьшите скорость до 20 мкл/мин для анализа образца.
- Затем отрегулируйте коэффициент усиления экрана и уровень камеры, так как это важные параметры. Для окрашенных (флуоресцентных) образцов установите коэффициент усиления экрана равным 5, а уровень камеры — 13.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эти параметры будут варьироваться в зависимости от типа выборки, и каждый образец должен быть оптимизирован для получения фокуса. - Используйте стандартное измерение для измерения образцов в течение 5 захватов на образец, где одна продолжительность захвата составляет 60 секунд.
- Сохраняйте и храните данные после каждого измерения. Программа сохранит изображения и видео файлы для каждого измерения. Программное обеспечение предоставляет выходные данные (например, размер кристалла: 10 нМ - 1000 нМ и концентрацию) как в формате Excel, так и в формате pdf.
- Рассчитайте среднее количество наночастиц для всех 5 показаний для каждого отдельного образца. Анализируйте данные, используя стандартное отклонение или стандартную погрешность среднего значения и используйте t-тесты для парного анализа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Результаты этого исследования показывают, что NTA может эффективно обнаруживать средний размер и концентрацию кальция, содержащего нанокристаллы мочи в моче человека. Это было достигнуто с помощью анализа флуорофора, Fluo-4 AM и отслеживания наночастиц. Fluo-4 AM был способен связываться как с Кристаллами CaOx, так и с Кристаллами CaP. Как показано на рисунке 3A,кристаллы CaOx были определены как размер от 50 до 270 нм и средняя концентрация 1,26 х 109 частиц/мл. Кристаллы CaP имели размер от 30 до 225 нм и среднюю концентрацию 2,22 x 109 частиц/мл(рисунок 3B). Чтобы определить, может ли NTA оценить нанокристаллы в моче человека, здоровых взрослых попросили потреблять контролируемую оксалатную диету с последующей высокой оксалатной нагрузкой. Круглосуточные образцы мочи до и после нагрузки были собраны для оценки размера и концентрации нанокристаллов мочи. Образцы мочи дооксалата содержали некоторые нанокристаллы мочи (1,65 x 108 ± 3,29 x 107 частиц / мл) между 110-300 нм(рисунок 4). Напротив, наблюдалось значительное увеличение (p<0,0001) мочевых нанокристаллов, присутствующих в образцах постоксалата (7,05 x 108 ± 1,08 x 108 частиц/мл; 100-320 нм)(рисунок 4). Чтобы подтвердить воспроизводимость метода, образцы измеряли три раза и не было существенных изменений в технических репликах(рисунок 5).
Рисунок 1:Протокол выделения и окрашивания нанокристаллов мочи человека. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2:Описание анализа отслеживания наночастиц (NTA). (A) Компьютер и прибор, установленные для этих исследований. (B)Образцы впрыскиваются во впускную трубку с помощью шприцевого насоса с непрерывной скоростью до заполнения оптической поверхности. Затем образцы наблюдаются объективом и захватываются камерой, когда образцы проходят через платформу, прежде чем выйти через выходную трубку для выброса. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3:NTA обнаруживает Fluo-4 AM, меченые кристаллами оксалата кальция (CaOx) и фосфата кальция (CaP). Репрезентативные графики кристаллов(A)CaOx и(B)CaP, показывающие распределение и концентрацию по размерам. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4:NTA обнаруживает Fluo-4 AM, меченые 24-часовыми нанокристаллами мочеиспускания человека. Репрезентативный график меченых Fluo-4 AM мочевых нанокристаллов в 24-часовых образцах преоксалата и постоксалата от здорового взрослого человека на контролируемой оксалатной диете. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5:Технические реплики человеческих нанокристаллов в 24-часовом сборе мочи с использованием NTA. Технические реплики меченых Fluo-4 AM мочевых нанокристаллов в 24-часовых(A)преоксалатных и(B)постоксалатных образцах от здорового взрослого человека на контролируемой оксалатной диете. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
NTA был использован в настоящем исследовании для оценки нанокристаллов в моче человека с использованием кальцийсвязывающего зонда Fluo-4 AM. Не существует стандартного метода обнаружения нанокристаллов в моче. Некоторые исследовательские группы обнаружили нанокристалла в моче и полагались на использование обширных протоколов или методов, которые ограничены в своей способности количественно оценивать образцы27,28. Это исследование показывает специфический и чувствительный метод обнаружения кальцийсодержащих нанокристаллов в моче людей, которые участвовали в исследовании диетического питания, которое заключалось в проглатывании высокой оксалатной нагрузки. Количество потребляемого оксалата было эквивалентно реальному потреблению оксалата (например, 1/2 салата со шпинатом).
NTA - это хорошо охарактеризованный инструмент высокого разрешения, который использует броуновское движение для измерения частиц в растворе30. Он был использован для оценки биологических наночастиц в различных биологических образцах31,32,33. Кроме того, NTA может точно предсказать размер, а также концентрацию частиц в любом типе биологического образца. Этот метод не требует маркировки; однако маркировка может использоваться для обнаружения конкретных частиц. Fluo-4 AM был использован в этом исследовании для эффективного и конкретного обнаружения нанокристаллов кальция в образцах мочи. Флуоресцентные зонды кальция первоначально использовались для измерения свободного цитозольного кальция34. Fluo-4 является аналогом Fluo-3, флуоресценция которого увеличивается >100 раз при связывании со свободным кальцием35. Кроме того, было показано, что Fluo-4 оценивает частицы кальция в синовиальной жидкости пациентов с артритом с помощью проточной цитометрии36. Таким образом, мы использовали Fluo-4 AM для этих исследований.
Все образцы непрерывно вводились в платформу для точного обнаружения. Определение концентрации и размера частиц зависит от скорости потока, так как высокая скорость потока (т.е. 50 мкл/мин) может повлиять на точную оценку концентрации, а также на размер частиц по сравнению со статической настройкой и более низкий расход (т.е. 20 мкл/мин)37. Таким образом, устойчивый медленный расход обеспечивает точное измерение количества частиц, присутствующих в образцах. Другие важные параметры, которые могут повлиять на количество и размер частиц, включают уровень камеры, порог обнаружения ифокусировку 38,39,40. Последовательное измерение частиц в образцах (CV около 20%) наблюдалось в текущем исследовании, которое соответствовало выводам другого исследования39. Наконец, присутствие нанокристалл в моче человека было подтверждено с помощью электронной микроскопии29. Это исследование показывает, что NTA может успешно измерять мочевые нанокристалли от людей.
Одним из преимуществ этого протокола является использование Fluo-4 AM для оценки частиц кальция, содержащихся в растворе. Другим преимуществом является минимальная изменчивость, наблюдаемая при обнаружении нанокристаллов в образцах. Одним из ограничений NTA в этой обстановке является неспособность различать морфологию нанокристаллов. Тем не менее, этот метод может быть полезен для обнаружения кристаллурии для прогнозирования риска камней у людей с историей кальцийсодержащих камней в почках. Этот протокол не может заменить существующие методологии, но может дать новое представление о мочевых нанокристаллых. Использование NTA для оценки кристаллов кальция, содержащих мочевой, является новым подходом, который должен подчеркнуть важность нанокристаллурии за пределами стандартной микроскопии и методов, упомянутых выше. Необходимы дополнительные исследования для изучения надежности этого метода в популяции камней в почках.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Acknowledgments
Авторы благодарят всех участников исследования, а также UAB CCTS Bionutrition Core и UAB High Resolution Imaging Service Center за их вклад. Эта работа была поддержана грантами NIH DK106284 и DK123542 (TM), а также UL1TR003096 (Национальный центр развития трансляционных наук).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Benchtop Centrifuge | Jouan Centrifuge | CR3-12 | |
| Calcium Oxalate monohydrate | Synthesized in the lab as previously described29. | Store at RT; Stock 10 mM | |
| Calcium Phosphate crystals (hydroxyapatite nanopowder) | Sigma | 677418 | Store at RT; Stock 10 mM |
| Ethanol | Fischer Scientific | AC615095000 | Store at RT; Stock 100% |
| Fluo-4 AM* | AAT Bioquest, Inc. | 20550 | Store at Freezer (-20°C); Stock 5 mM |
| Gold Nanoparticles | Sigma | 742031 | Store at 2-8°C |
| NanoSight Instrument | Malvern Instruments, UK | NS300 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 98-4730 | |
| Virkon Disinfectant | LanXESS Energizing Company, Germany | LSP | |
| *Fluorescence dyes are light sensitive; stock and aliquots should be stored in the dark at -20°C. |
References
- Fogazzi, G. B. Crystalluria: a neglected aspect of urinary sediment analysis. Nephrology, Dialysis, Transplantation. 11 (2), 379-387 (1996).
- Kuo, R. L. Urine calcium and volume predict coverage of renal papilla by Randall's plaque. Kidney International. 64 (6), 2150-2154 (2003).
- Robertson, W. G., Peacock, M., Nordin, B. E. Calcium crystalluria in recurrent renal-stone formers. Lancet. 2 (7610), 21-24 (1969).
- Robertson, W. G., Peacock, M. Calcium oxalate crystalluria and inhibitors of crystallization in recurrent renal stone-formers. Clinical Science. 43 (4), 499-506 (1972).
- Hallson, P. C., Rose, G. A. A new urinary test for stone "activity". British Journal of Urology. 50 (7), 442-448 (1978).
- Daudon, M., Hennequin, C., Boujelben, G., Lacour, B., Jungers, P. Serial crystalluria determination and the risk of recurrence in calcium stone formers. Kidney International. 67 (5), 1934-1943 (2005).
- Baumann, J. M., Affolter, B. From crystalluria to kidney stones, some physicochemical aspects of calcium nephrolithiasis. World Journal of Nephrology. 3 (4), 256-267 (2014).
- Patel, M., et al. Oxalate induces mitochondrial dysfunction and disrupts redox homeostasis in a human monocyte derived cell line. Redox Biology. 15, 207-215 (2018).
- Khan, S. R. Role of renal epithelial cells in the initiation of calcium oxalate stones. Nephron Experimental Nephrology. 98 (2), 55-60 (2004).
- Mulay, S. R., et al. Calcium oxalate crystals induce renal inflammation by NLRP3-mediated IL-1beta secretion. Journal of Clinical Investigation. 123 (1), 236-246 (2013).
- Umekawa, T., Chegini, N., Khan, S. R. Oxalate ions and calcium oxalate crystals stimulate MCP-1 expression by renal epithelial cells. Kidney International. 61 (1), 105-112 (2002).
- Huang, M. Y., Chaturvedi, L. S., Koul, S., Koul, H. K. Oxalate stimulates IL-6 production in HK-2 cells, a line of human renal proximal tubular epithelial cells. Kidney International. 68 (2), 497-503 (2005).
- Lu, X. Renal tubular epithelial cell injury, apoptosis and inflammation are involved in melamine-related kidney stone formation. Urological Research. 40 (6), 717-723 (2012).
- Williams, J., Holmes, R. P., Assimos, D. G., Mitchell, T. Monocyte Mitochondrial Function in Calcium Oxalate Stone Formers. Urology. 93, 221-226 (2016).
- Balcke, P., et al. Transient hyperoxaluria after ingestion of chocolate as a high risk factor for calcium oxalate calculi. Nephron. 51 (1), 32-34 (1989).
- Khan, S. R., Kok, D. J.
- Rodgers, A., Allie-Hamdulay, S., Jackson, G. Therapeutic action of citrate in urolithiasis explained by chemical speciation: increase in pH is the determinant factor. Nephrology, Dialysis, Transplantation. 21 (2), 361-369 (2006).
- Verplaetse, H., Verbeeck, R. M., Minnaert, H., Oosterlinck, W. Solubility of inorganic kidney stone components in the presence of acid-base sensitive complexing agents. European Urology. 11 (1), 44-51 (1985).
- Frochot, V., Daudon, M. Clinical value of crystalluria and quantitative morphoconstitutional analysis of urinary calculi. International Journal of Surgery. 36, London, England. Pt D 624-632 (2016).
- Grover, P. K., Thurgood, L. A., Wang, T., Ryall, R. L. The effects of intracrystalline and surface-bound proteins on the attachment of calcium oxalate monohydrate crystals to renal cells in undiluted human urine. BJU International. 105, 708-715 (2010).
- Bader, C. A., Chevalier, A., Hennequin, C., Jungers, P., Daudon, M. Methodological aspects of spontaneous crystalluria studies in calcium stone formers. Scanning Microscopy. 8 (2), 215-231 (1994).
- Daudon, M., Cohen-Solal, F., Jungers, P. Eurolithiasis. 9th European Symposium on Urolithiasis. , Shaker Publishing. Maastricht. 261-263 (2001).
- Werness, P. G., Bergert, J. H., Smith, L. H.
- Fan, J., Chandhoke, P. S. Examination of crystalluria in freshly voided urines of recurrent calcium stone formers and normal individuals using a new filter technique. Journal of Urology. 161 (5), 1685-1688 (1999).
- Sun, X. Y., Ouyang, J. M., Yu, K. Shape-dependent cellular toxicity on renal epithelial cells and stone risk of calcium oxalate dihydrate crystals. Scientific Reports. 7 (1), 7250 (2017).
- He, J. Y., Deng, S. P., Ouyang, J. M. Morphology, particle size distribution, aggregation, and crystal phase of nanocrystallites in the urine of healthy persons and lithogenic patients. IEEE Trans Nanobioscience. 9 (2), 156-163 (2010).
- Gao, J., et al. Comparison of Physicochemical Properties of Nano- and Microsized Crystals in the Urine of Calcium Oxalate Stone Patients and Control Subjects. Journal of Nanomaterials. 2014, 9 (2014).
- Gavin, C. T., et al. Novel Methods of Determining Urinary Calculi Composition: Petrographic Thin Sectioning of Calculi and Nanoscale Flow Cytometry Urinalysis. Scientific Reports. 6, 19328 (2016).
- Kumar, P., et al. Dietary Oxalate Induces Urinary Nanocrystals in Humans. Kidney International Reports. 5 (7), 1040-1051 (2020).
- Carr, B., Hole, P., Malloy, A., Nelson, P., Smith, J. Applications of nanoparticle tracking analysis in nanoparticle research--A mini-review. European Journal of Parenteral Sciences and Pharmaceutical Sciences. 14 (2), 45 (2009).
- Dragovic, R. A., et al. Sizing and phenotyping of cellular vesicles using Nanoparticle Tracking Analysis. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 7 (6), 780-788 (2011).
- Dragovic, R. A., et al. Isolation of syncytiotrophoblast microvesicles and exosomes and their characterisation by multicolour flow cytometry and fluorescence Nanoparticle Tracking Analysis. Methods. 87, 64-74 (2015).
- Gercel-Taylor, C., Atay, S., Tullis, R. H., Kesimer, M., Taylor, D. D. Nanoparticle analysis of circulating cell-derived vesicles in ovarian cancer patients. Analytical Biochemistry. 428 (1), 44-53 (2012).
- Minta, A., Kao, J. P., Tsien, R. Y. Fluorescent indicators for cytosolic calcium based on rhodamine and fluorescein chromophores. Journal of Biological Chemistry. 264 (14), 8171-8178 (1989).
- Harkins, A. B., Kurebayashi, N., Baylor, S. M. Resting myoplasmic free calcium in frog skeletal muscle fibers estimated with fluo-3. Biophysical Journal. 65 (2), 865-881 (1993).
- Hernandez-Santana, A., Yavorskyy, A., Loughran, S. T., McCarthy, G. M., McMahon, G. P. New approaches in the detection of calcium-containing microcrystals in synovial fluid. Bioanalysis. 3 (10), 1085-1091 (2011).
- Tong, M., Brown, O. S., Stone, P. R., Cree, L. M., Chamley, L. W. Flow speed alters the apparent size and concentration of particles measured using NanoSight nanoparticle tracking analysis. Placenta. 38, 29-32 (2016).
- Maas, S. L., et al. Possibilities and limitations of current technologies for quantification of biological extracellular vesicles and synthetic mimics. Journal of Controlled Release. 200, 87-96 (2015).
- Hole, P., et al. Interlaboratory comparison of size measurements on nanoparticles using nanoparticle tracking analysis (NTA). Journal of Nanoparticle Research. 15, 2101 (2013).
- Tomlinson, P. R., et al. Identification of distinct circulating exosomes in Parkinson's disease. Annals of Clinical and Translational Neurology. 2 (4), 353-361 (2015).
