Summary
Syftet med denna studie var att avgöra om nanopartikelspårningsanalys (NTA) kunde upptäcka och kvantifiera urinkalcium som innehåller nanokristaler från friska vuxna. Resultaten från den aktuella studien tyder på nta kan vara ett potentiellt verktyg för att uppskatta urinarie nanokristaler under njursten sjukdom.
Abstract
Njurstenar blir allt vanligare i hela världen hos vuxna och barn. Den vanligaste typen av njursten består av kalciumoxalatkristaller (CaOx). Crystalluria uppstår när urin blir övermättad med mineraler (t.ex. kalcium, oxalat, fosfat) och föregår njurstensbildning. Standardmetoder för att bedöma kristallluri i sten tidigare inkluderar mikroskopi, filtrering och centrifugering. Dessa metoder detekterar dock främst mikrokristaler och inte nanokristaler. Nanokristaler har föreslagits vara mer skadliga för njure epitelceller än microcrystals in vitro. Här beskriver vi nanopartikelspårningsanalysens (NTA) förmåga att upptäcka humana urinnanokristaler. Friska vuxna matades en kontrollerad oxalat diet innan du dricker en oxalat belastning för att stimulera urinvägarna nanokristaler. Urin samlades in i 24 timmar före och efter oxalatbelastningen. Prover bearbetades och tvättades med etanol för att rena prover. Urin nanokristaler var färgade med kalcium bindande fluorfor, Fluo-4 AM. Efter färgning fastställdes storleken och antalet nanokristaler med NTA. Resultaten från denna studie visar NTA kan effektivt upptäcka nanokristalluri hos friska vuxna. Dessa resultat tyder NTA kan vara en värdefull tidig upptäckt metod för nanocrystalluria hos patienter med njursten sjukdom.
Introduction
Urinkristaller bildas när urinen blir övermättad med mineraler. Detta kan förekomma hos friska individer men är vanligare hos individer med njursten1. Närvaron och ackumuleringen av urinkristaller kan öka risken för att utveckla en njursten. Specifikt inträffar detta när kristaller binder till Randalls plack, kärna, ackumuleras och växer övertid 2,3,4. Crystalluria föregår njurstensbildning och bedömning av kristallluri kan ha prediktivt värde i njursten tidigare3,5. Specifikt har crystalluria föreslagits vara användbart för att förutsäga risken för sten återkommer hos patienter med en historia av kalciumoxalat som innehåller stenar6,7.
Kristaller har rapporterats ha en negativ inverkan på njurepitela och cirkulerande immuncellsfunktion8,9,10,11,12,13. Det har tidigare rapporterats att cirkulerande monocyter från kalciumoxalat (CaOx) njursten tidigare har undertryckt cellulära bioenergiergetika jämfört med friska individer14. Dessutom minskar CaOx kristaller cellulära bioenergetics och stör redox homeostas i monocyter8. Konsumtion av måltider rik på oxalat kan orsaka kristallluri som kan leda till njurmedicinska tubuleskador och ändra produktionen och funktionen hos urinerande makromolekyler som skyddar mot njurstensbildning15,16. Flera studier har visat att urinkristaller kan variera i form och storlek beroende på pH och temperatur påurinen 17,18,19. Vidare har urinproteiner visat sig modulera kristallbeteende20. Daudon et al.19, föreslog att crystalluria analys kan vara till hjälp i förvaltningen av patienter med njursten sjukdom och vid bedömning av deras svar på terapier. Några konventionella metoder som för närvarande finns tillgängliga för att utvärdera förekomsten av kristaller inkluderar polariserad mikroskopi21,22, elektronmikroskopi23, partikelräknare3, urinfiltrering24, avdunstning3,5 eller centrifugation21. Dessa studier har gett värdefull inblick i njurstensfältet när det gäller kristallluri. En begränsning av dessa metoder har dock varit oförmågan att visualisera och kvantifiera kristaller som är mindre än 1 μm stora. Kristaller av denna storlek kan påverka tillväxten av CaOx stenar genom att fästa på Randalls plakett.
Nanokristaler har visat sig orsaka omfattande skador på njurceller jämfört med större mikrokristaler25. Förekomsten av nanokristaler har rapporterats i urin med hjälp av en nanopartikelanalysator26,27. Nyligen genomförda studier har använt fluorescerande märkta bisfosfatsonder (alendronat-fluorescein/alendronate-Cy5) för att undersöka nanokritertaler med hjälp av nanoflödescytometri28. Begränsningen av detta färgämne är att det inte är specifikt och kommer att binda till nästan alla typer av stenar utom cystein. Således, noggrant bedöma förekomsten av nanokristaller hos individer kan vara ett effektivt verktyg för att diagnostisera crystalluria och/eller förutsäga stenrisk. Syftet med denna studie var att upptäcka och kvantifiera kalcium som innehåller nanokristaler (<1 μm i storlek) med hjälp av nanopartikelspårningsanalys (NTA). För att uppnå detta användes NTA-tekniken i kombination med en kalciumbindande fluorfor, Fluo-4 AM för att upptäcka och kvantifiera kalcium som innehåller nanokristaler i urinen hos friska vuxna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experiment som beskrivs i detta arbete godkändes av University of Alabama at Birmingham (UAB) Institutional Review Board. Friska vuxna (33,6 ± 3,3 år gamla; n=10) inkluderades i studien om de hade en normal blod omfattande metabolisk panel, icke-tobaksanvändare, icke-gravida, ett BMI mellan 20-30 kg/m2, och fria från kroniska medicinska tillstånd eller akuta sjukdomar. Friska deltagare undertecknade ett skriftligt informerat samtyckesformulär innan studien började.
1. Kliniskt protokoll och urininsamling
- Få deltagarna att konsumera en låg oxalatdiet som utarbetats av UAB Center for Clinical and Translational Sciences Bionutrition Core i 3 dagar och snabbt över natten innan de samlar in sin urin (24-timmarsprov).
- Följande dag, låt deltagarna returnera sitt 24-timmars urinprov (pre-oxalat) innan de konsumerar en oxalatbelastning (smoothie som innehåller frukt och grönsaker, ~ 8 mM oxalat). Få deltagarna därefter att samla in urinen i 24 timmar (postoxalatprov) och lämna tillbaka urinen dagen efter.
- Håll alla urinprover i rumstemperatur (RT) före bearbetning enligt beskrivningen nedan och visas i figur 1.
2. Urinbehandling
OBS: Alla material och all utrustning som används anges i materialförteckningen.
VARNING: Använd alltid personlig skyddsutrustning när du hanterar kliniska prover och reagenser. Specifikt handskar, ansikts- och ögonsköldar, andningsskydd och skyddskläder.
- Mät och registrera urin pH och volym. Blanda noggrant innan du tillsätter 50 ml urin i ett märkt sterilt 50 ml koniskt rör.
- Centrifugeringsprov vid 1200 x g i 10 min på RT med hjälp av en centrifug på bänkskivan.
OBS: Förvara provet på RT för att förhindra ytterligare kristallbildning eftersom svalare temperaturer kan främja kristallisering. - Kassera supernatanten och tvätta och återanvänd pelleten igen med 5 ml 100% etanol. Centrifugera provet vid 1200 x g i 10 minuter på RT med hjälp av en centrifuge på bänkskivan.
- Kassera supernatanten och återanvänd pelleten i 1 ml 100% etanol. Förvara provet vid -20 °C för senare bearbetning ELLER färga provet enligt beskrivningen nedan.
OBS: Det finns ingen signifikant skillnad i datapunkter (dvs. partikelstorlek/koncentration) mellan lagrade eller nyfärgade prover.
3. Nanopartikelspårningsanalys (NTA)
- Provberedning
- Guldnanopartiklar: Använd guldnanopartiklar för att optimera inställningarna på instrumentet. Späd 100 nm guldnanopartiklar 1:1000 i ultrapurevatten.
- Human urin: Späd urinprover 20 gånger i vatten före färgning med 5 mM Fluo-4 AM (ett kalciumfluorescensfärg) i 30 min i mörker. Analysera exemplen med NTA.
- Förbered kalciumoxalatkristaller (CaOx) enligt tidigare beskrivna29. Späd 10 mM stamlösning (14,6 mg i 10 ml vatten) till 50 μM i vatten och färga de utspädda proverna med 5 mM Fluo-4 AM i 30 min i mörker före analys.
- Kalciumfosfatkristaller (CaP): Späd 10 mM stamlösning (50,4 mg i 10 ml vatten) till 50 μM i vatten och färga de utspädda proverna med 5 mM Fluo-4 AM i 30 min i mörker före NTA-analys.
- Instrumentinsamling, kamerainställningar och datainsamling
Obs: Den dator- och instrumentinställning som används för den här metoden visas i figur 2.- Slå på datorn och sedan instrumentet. Öppna programvaran och slå på kameran.
- När programfönstret är öppet klickar du på fångstikonen i det övre vänstra hörnet i fönstret för att starta fångstläget. Kamerans initiering tar några sekunder.
- Rengör plattformen genom att först pumpa in luft i den med en 1 ml spruta tills plattformen verkar ren. Tillsätt försiktigt vatten till apparaten 2-3 gånger med en annan 1 ml spruta för att avlägsna eventuella luftbubblor.
OBS: Leta efter eventuella luftbubblor i plattformen såväl som i slangen. Det är viktigt att inte ha bubblor i hela apparaten före och under provtagning. Om bubblor finns, rengör plattformen igen med luft och vatten. - När plattformen är ren, tillsätt vatten för att kontrollera om det finns någon förorening på ytan genom att titta på kameran. Lägg sedan till guldnanopartiklar som en kontroll till provbelastningspumpinjektorn för att ställa in instrumentet.
- Justera kameranivån på skärmen eller på ratten till höger om instrumentet tills bilden börjar visa färgade pixlar och sedan minska kameranivån.
- Justera sedan skärmen för att optimera bilden. Vänsterklicka på musknappen på videobilden. Håll ned vänster musknapp och dra bilden uppåt och nedåt för att få hela vyn.
OBS: Den normala kameralinsen och filtret används för att bedöma guldnanopartiklar och obekreade prover. - Ställ in infusionshastigheten och fokusera kameran så att guldnanopartiklarna syns på kameraskärmen. Ställ infusionshastigheten på hög (dvs. 500 μL/min) för att först ställa in för att säkerställa att guldnanopartiklarna detekteras. När den har detekterats, sänk hastigheten till 50 μL/min.
- Justera kameranivån för att visualisera partiklarna. För obekänkade prover justerar du skärmökningen på nivå 5 för att uppnå kamerafokus och ställer in kameranivån på 8. När fokus har ställts in registrerar du provet (dvs. 1 mätning i endast 60 sekunder).
OBS: Fokus och kontinuerlig flödeshastighet är viktiga för att få tydliga och skarpa bilder av partiklarna för räkning. - Rengör apparaten igen med vatten efter optimering innan du bedömer proverna. Visa kameran för att säkerställa att slangen är ren och att partiklar inte finns.
OBS: Tvätta kammaren mellan varje prov tills inga partiklar detekteras av kameran. - För att analysera färgade prover, justera kameran till filterpositionen som innehåller lämpligt fluorescerande filter. Belastningsutspädda och färgade prover på provinjektorn och sänk hastigheten till 20 μL/min för analys av provet.
- Justera sedan skärmökningen och kameranivån eftersom det här är viktiga parametrar. För färgade (fluorescerande) prover ställer du in skärmökningen på 5 och kameranivån på nivå 13.
Obs: Dessa parametrar varierar beroende på provtypen och varje prov måste optimeras för att få fokus. - Använd standardmätning för att mäta proverna för 5 fångster per prov där en fångsttid är i 60 sekunder.
- Spara och lagra data efter varje mätning. Programvaran sparar bild- och videofiler för varje mätning. Programvaran tillhandahåller utgångsdata (t.ex. kristallstorlek: 10 nM - 1000 nM och koncentration) i både excel- och pdf-format.
- Beräkna det genomsnittliga antalet nanopartiklar för alla 5 avläsningarna för varje enskilt prov. Analysera data med standardavvikelse eller standardfel för medelvärdet och använd t-tester för ihopparad analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resultaten från denna studie visar nta kan effektivt upptäcka den genomsnittliga storleken och koncentrationen av kalcium som innehåller urin nanokristaler i mänsklig urin. Detta uppnåddes genom att använda fluorfor, Fluo-4 AM och nanopartiklar spårning analys. Fluo-4 AM kunde binda till både CaOx och CaP kristaller. Som visas i figur 3Afastställdes CaOx-kristaller vara mellan 50-270 nm stora och ha en genomsnittlig koncentration på 1,26 x 109 partiklar/ml. CaP-kristaller var mellan 30-225 nm stora och hade en genomsnittlig koncentration på 2,22 x 109 partiklar/ml (figur 3B). För att avgöra om NTA kunde bedöma nanokristaler i mänsklig urin ombads friska vuxna att konsumera en kontrollerad oxalatdiet följt av en hög oxalatbelastning. Tjugofyra timmars urinprov före och efter belastningen samlades in för att bedöma urin nanokristal storlek och koncentration. Urinprover före oxalat innehöll vissa urinnanokristaler (1,65 x 108 ± 3,29 x 107 partiklar/ml) mellan 110–300 nm (figur 4). Däremot föreskrevuppdes en betydande ökning (p<0,0001) av urinnanokristaler i postoxalatprover (7,05 x 108 ± 1,08 x 108 partiklar/ml, 100–320 nm) (figur 4). För att bekräfta metodens reproducerbarhet mättes proverna tre gånger och det fanns ingen signifikant variation i tekniska replikat (figur 5).
Bild 1: Protokoll för att isolera och färga mänskliga urinnanokristaler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Beskrivning av nanopartikelspårningsanalys (NTA). B)Proverna injiceras i ett inloppsrör med en sprutpump i kontinuerlig hastighet innan den optiska ytan fylls. Proverna observeras sedan av objektivet och fångas av kameran när proverna strömmar genom plattformen innan de går ut genom utloppsslangen för att kasseras. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3:NTA detekterar fluo-4 AM märkta kalciumoxalat (CaOx) och kalciumfosfat (CaP) kristaller. Representativa grafer över( A) CaOx och (B) CaP-kristaller som visar storleksfördelning och koncentration. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 4: NTA detekterar fluo-4 AM märkta 24-timmars mänskliga urinnanokristaler. Representativ graf av Fluo-4 AM märkta urinarienanopary nanokristaler i 24-timmars pre-oxalate och post-oxalate prover från en hälsosam vuxen på en kontrollerad oxalat diet. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 5: Tekniska replikat av humana nanokristaler i 24-timmars urinsamlingar med NTA. Tekniska replikat av Fluo-4 AM märkta urinnanokristaler i 24-timmars(A)preoxalat och (B) postoxalatprover från en frisk vuxen på en kontrollerad oxalatdiet. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
NTA har använts i denna studie för att bedöma nanokristaler i human urin med hjälp av en kalciumbindande sond, Fluo-4 AM. Det finns ingen standardmetod för att upptäcka nanokristaler i urinen. Vissa forskargrupper har upptäckt nanokristaler i urinen och förlitat sig på användningen av omfattande protokoll eller metoder som är begränsade i deras förmåga att kvantifieraproverna 27,28. Denna studie visar en specifik och känslig metod för att upptäcka kalcium som innehåller nanokristaler i urinen hos människor som deltog i en kostmatningsstudie som bestod i att inta en hög oxalatbelastning. Mängden oxalat som konsumerades motsvarade den verkliga konsumtionen av oxalat (t.ex. spenatsallad 1/2).
NTA är ett väl karakteriserat högupplöst verktyg som använder brownsk rörelse för att mäta partiklar i lösning30. Det har använts för att bedöma biologiska nanopartiklar i en mängd olika biologiska prover31,32,33. Dessutom kan NTA exakt förutsäga storleken och koncentrationen av partiklar i alla typer av biologiska prover. Den här metoden kräver ingen märkning. Märkning kan dock användas för att upptäcka specifika partiklar. Fluo-4 AM användes i denna studie för att effektivt och specifikt upptäcka kalcium som innehåller nanokristaler i urinprover. Kalcium fluorescerande sonder användes ursprungligen för att mäta fria cytosolic kalcium34. Fluo-4 är en analog till Fluo-3 vars fluorescens ökar >100 gånger vid bindning till fritt kalcium35. Dessutom har Fluo-4 visat sig bedöma kalciumpartiklar i synovialvätskan hos patienter med artrit med hjälp av flödescytometri36. Således använde vi Fluo-4 AM för dessa studier.
Alla prover injicerades kontinuerligt i plattformen för korrekt detektion. Hur koncentrationen och partikelstorleken är beroende av flödeshastigheten, eftersom ett högt flöde (dvs. 50 μL/min) kan påverka en korrekt bedömning av koncentrationen, liksom partikelstorleken jämfört med en statisk inställning och ett lägre flöde (dvs. 20 μL/min)37. Således ger ett stadigt långsamt flöde korrekt mätning av antalet partiklar som finns i prover. Andra viktiga parametrar som kan påverka partikelantalet och storleken är kameranivå, detekteringströskel ochfokus 38,39,40. En konsekvent partikelmätning i prover (CV ca 20%) observerades i den aktuella studien, vilket överensstämde med resultaten från en annan studie39. Slutligen har närvaron av nanokristaler i mänsklig urin bekräftats med hjälp av elektronmikroskopi29. Denna forskning visar nta kan framgångsrikt mäta urinvägsnanokristaler från människor.
En fördel med detta protokoll är användningen av Fluo-4 AM för att utvärdera kalciuminnehållande partiklar i lösningen. En annan fördel är den minimala variation som observerats vid detektering av nanokritertaler i prover. En begränsning av NTA i denna inställning är oförmågan att skilja morfologin hos nanokristaler. Denna metod kan dock vara fördelaktig att upptäcka kristallluria för att förutsäga stenrisk hos individer med en historia av kalcium som innehåller njurstenar. Detta protokoll kan inte ersätta nuvarande metoder men kan ge ny insikt om urinarie nanokristaler. Användningen av NTA för att bedöma urinkalcium som innehåller kristaller är ett nytt tillvägagångssätt som bör belysa vikten av nanokristalluri utöver standardmikroskopi och metoder som nämns ovan. Ytterligare undersökningar är motiverade att utforska tillförlitligheten hos denna metod i njurstenspopulationen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Författarna tackar alla studiedeltagare och UAB CCTS Bionutrition Core och UAB High Resolution Imaging Service Center för deras bidrag. Detta arbete stöddes av NIH-bidrag DK106284 och DK123542 (TM) och UL1TR003096 (National Center for Advanceing Translational Sciences).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Benchtop Centrifuge | Jouan Centrifuge | CR3-12 | |
| Calcium Oxalate monohydrate | Synthesized in the lab as previously described29. | Store at RT; Stock 10 mM | |
| Calcium Phosphate crystals (hydroxyapatite nanopowder) | Sigma | 677418 | Store at RT; Stock 10 mM |
| Ethanol | Fischer Scientific | AC615095000 | Store at RT; Stock 100% |
| Fluo-4 AM* | AAT Bioquest, Inc. | 20550 | Store at Freezer (-20°C); Stock 5 mM |
| Gold Nanoparticles | Sigma | 742031 | Store at 2-8°C |
| NanoSight Instrument | Malvern Instruments, UK | NS300 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 98-4730 | |
| Virkon Disinfectant | LanXESS Energizing Company, Germany | LSP | |
| *Fluorescence dyes are light sensitive; stock and aliquots should be stored in the dark at -20°C. |
References
- Fogazzi, G. B. Crystalluria: a neglected aspect of urinary sediment analysis. Nephrology, Dialysis, Transplantation. 11 (2), 379-387 (1996).
- Kuo, R. L. Urine calcium and volume predict coverage of renal papilla by Randall's plaque. Kidney International. 64 (6), 2150-2154 (2003).
- Robertson, W. G., Peacock, M., Nordin, B. E. Calcium crystalluria in recurrent renal-stone formers. Lancet. 2 (7610), 21-24 (1969).
- Robertson, W. G., Peacock, M. Calcium oxalate crystalluria and inhibitors of crystallization in recurrent renal stone-formers. Clinical Science. 43 (4), 499-506 (1972).
- Hallson, P. C., Rose, G. A. A new urinary test for stone "activity". British Journal of Urology. 50 (7), 442-448 (1978).
- Daudon, M., Hennequin, C., Boujelben, G., Lacour, B., Jungers, P. Serial crystalluria determination and the risk of recurrence in calcium stone formers. Kidney International. 67 (5), 1934-1943 (2005).
- Baumann, J. M., Affolter, B. From crystalluria to kidney stones, some physicochemical aspects of calcium nephrolithiasis. World Journal of Nephrology. 3 (4), 256-267 (2014).
- Patel, M., et al. Oxalate induces mitochondrial dysfunction and disrupts redox homeostasis in a human monocyte derived cell line. Redox Biology. 15, 207-215 (2018).
- Khan, S. R. Role of renal epithelial cells in the initiation of calcium oxalate stones. Nephron Experimental Nephrology. 98 (2), 55-60 (2004).
- Mulay, S. R., et al. Calcium oxalate crystals induce renal inflammation by NLRP3-mediated IL-1beta secretion. Journal of Clinical Investigation. 123 (1), 236-246 (2013).
- Umekawa, T., Chegini, N., Khan, S. R. Oxalate ions and calcium oxalate crystals stimulate MCP-1 expression by renal epithelial cells. Kidney International. 61 (1), 105-112 (2002).
- Huang, M. Y., Chaturvedi, L. S., Koul, S., Koul, H. K. Oxalate stimulates IL-6 production in HK-2 cells, a line of human renal proximal tubular epithelial cells. Kidney International. 68 (2), 497-503 (2005).
- Lu, X. Renal tubular epithelial cell injury, apoptosis and inflammation are involved in melamine-related kidney stone formation. Urological Research. 40 (6), 717-723 (2012).
- Williams, J., Holmes, R. P., Assimos, D. G., Mitchell, T. Monocyte Mitochondrial Function in Calcium Oxalate Stone Formers. Urology. 93, 221-226 (2016).
- Balcke, P., et al. Transient hyperoxaluria after ingestion of chocolate as a high risk factor for calcium oxalate calculi. Nephron. 51 (1), 32-34 (1989).
- Khan, S. R., Kok, D. J.
- Rodgers, A., Allie-Hamdulay, S., Jackson, G. Therapeutic action of citrate in urolithiasis explained by chemical speciation: increase in pH is the determinant factor. Nephrology, Dialysis, Transplantation. 21 (2), 361-369 (2006).
- Verplaetse, H., Verbeeck, R. M., Minnaert, H., Oosterlinck, W. Solubility of inorganic kidney stone components in the presence of acid-base sensitive complexing agents. European Urology. 11 (1), 44-51 (1985).
- Frochot, V., Daudon, M. Clinical value of crystalluria and quantitative morphoconstitutional analysis of urinary calculi. International Journal of Surgery. 36, London, England. Pt D 624-632 (2016).
- Grover, P. K., Thurgood, L. A., Wang, T., Ryall, R. L. The effects of intracrystalline and surface-bound proteins on the attachment of calcium oxalate monohydrate crystals to renal cells in undiluted human urine. BJU International. 105, 708-715 (2010).
- Bader, C. A., Chevalier, A., Hennequin, C., Jungers, P., Daudon, M. Methodological aspects of spontaneous crystalluria studies in calcium stone formers. Scanning Microscopy. 8 (2), 215-231 (1994).
- Daudon, M., Cohen-Solal, F., Jungers, P. Eurolithiasis. 9th European Symposium on Urolithiasis. , Shaker Publishing. Maastricht. 261-263 (2001).
- Werness, P. G., Bergert, J. H., Smith, L. H.
- Fan, J., Chandhoke, P. S. Examination of crystalluria in freshly voided urines of recurrent calcium stone formers and normal individuals using a new filter technique. Journal of Urology. 161 (5), 1685-1688 (1999).
- Sun, X. Y., Ouyang, J. M., Yu, K. Shape-dependent cellular toxicity on renal epithelial cells and stone risk of calcium oxalate dihydrate crystals. Scientific Reports. 7 (1), 7250 (2017).
- He, J. Y., Deng, S. P., Ouyang, J. M. Morphology, particle size distribution, aggregation, and crystal phase of nanocrystallites in the urine of healthy persons and lithogenic patients. IEEE Trans Nanobioscience. 9 (2), 156-163 (2010).
- Gao, J., et al. Comparison of Physicochemical Properties of Nano- and Microsized Crystals in the Urine of Calcium Oxalate Stone Patients and Control Subjects. Journal of Nanomaterials. 2014, 9 (2014).
- Gavin, C. T., et al. Novel Methods of Determining Urinary Calculi Composition: Petrographic Thin Sectioning of Calculi and Nanoscale Flow Cytometry Urinalysis. Scientific Reports. 6, 19328 (2016).
- Kumar, P., et al. Dietary Oxalate Induces Urinary Nanocrystals in Humans. Kidney International Reports. 5 (7), 1040-1051 (2020).
- Carr, B., Hole, P., Malloy, A., Nelson, P., Smith, J. Applications of nanoparticle tracking analysis in nanoparticle research--A mini-review. European Journal of Parenteral Sciences and Pharmaceutical Sciences. 14 (2), 45 (2009).
- Dragovic, R. A., et al. Sizing and phenotyping of cellular vesicles using Nanoparticle Tracking Analysis. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 7 (6), 780-788 (2011).
- Dragovic, R. A., et al. Isolation of syncytiotrophoblast microvesicles and exosomes and their characterisation by multicolour flow cytometry and fluorescence Nanoparticle Tracking Analysis. Methods. 87, 64-74 (2015).
- Gercel-Taylor, C., Atay, S., Tullis, R. H., Kesimer, M., Taylor, D. D. Nanoparticle analysis of circulating cell-derived vesicles in ovarian cancer patients. Analytical Biochemistry. 428 (1), 44-53 (2012).
- Minta, A., Kao, J. P., Tsien, R. Y. Fluorescent indicators for cytosolic calcium based on rhodamine and fluorescein chromophores. Journal of Biological Chemistry. 264 (14), 8171-8178 (1989).
- Harkins, A. B., Kurebayashi, N., Baylor, S. M. Resting myoplasmic free calcium in frog skeletal muscle fibers estimated with fluo-3. Biophysical Journal. 65 (2), 865-881 (1993).
- Hernandez-Santana, A., Yavorskyy, A., Loughran, S. T., McCarthy, G. M., McMahon, G. P. New approaches in the detection of calcium-containing microcrystals in synovial fluid. Bioanalysis. 3 (10), 1085-1091 (2011).
- Tong, M., Brown, O. S., Stone, P. R., Cree, L. M., Chamley, L. W. Flow speed alters the apparent size and concentration of particles measured using NanoSight nanoparticle tracking analysis. Placenta. 38, 29-32 (2016).
- Maas, S. L., et al. Possibilities and limitations of current technologies for quantification of biological extracellular vesicles and synthetic mimics. Journal of Controlled Release. 200, 87-96 (2015).
- Hole, P., et al. Interlaboratory comparison of size measurements on nanoparticles using nanoparticle tracking analysis (NTA). Journal of Nanoparticle Research. 15, 2101 (2013).
- Tomlinson, P. R., et al. Identification of distinct circulating exosomes in Parkinson's disease. Annals of Clinical and Translational Neurology. 2 (4), 353-361 (2015).
