Summary
Описаны методы исследования TGF-β2-индуцированного EndMT в эндотелиальных клетках путем наблюдения за изменениями морфологии клеток и изучения экспрессии endMT-связанных с изменениями маркеров с использованием иммунофлуоресцентного окрашивания. Редактирование гена CRISPR/Cas9 было описано и использовано для истощения гена, кодируя Snail, для исследования его роли в TGF-β2-индуцированном EndMT.
Abstract
В ответ на специфические внешние сигналы и активацию определенных факторов транскрипции эндотелиальные клетки могут дифференцироваться в мезенхимально-подобный фенотип, процесс, который называется эндотелиальным переходом в мезенхимальный (EndMT). Новые результаты показали, что EndMT причинно связан с несколькими заболеваниями человека, такими как фиброз и рак. Кроме того, эндотелиальные мезенхимальные клетки могут применяться в процедурах регенерации тканей, поскольку они могут быть дополнительно дифференцированы в различные типы клеток (например, остеобласты и хондроциты). Таким образом, селективные манипуляции с ЭндМТ могут иметь клинический потенциал. Как и эпителиально-мезенхимальный переход (EMT), EndMT может быть сильно индуцирован секретируемым цитокиновым трансформулирующий фактор роста-бета (TGF-β), который стимулирует экспрессию так называемых факторов транскрипции EndMT (EndMT-TFs), включая Улитку и Слизняк. Эти EndMT-TFs затем повыняют и опускают уровни мезенхимальных и эндотелиальных белков соответственно. Здесь мы описываем методы исследования TGF-β-индуцированного EndMT in vitro, включая протокол для изучения роли конкретных TF в TGF-β-индуцированном EndMT. Используя эти методы, мы предоставляем доказательства того, что TGF-β2 стимулирует EndMT в микрососудистых эндотелиальных клетках поджелудочной железы мыша (клетки MS-1) и что генетическое истощение Улитки с использованием кластеризованных регулярно интерпространственных коротких палиндромных повторов (CRISPR) / CRISPR-ассоциированный белок 9 (Cas9) -опосредованное редактирование генов, отменяет это явление. Этот подход может служить моделью для опроса потенциальных модуляторов эндотелиальной биологии и может быть использован для выполнения генетических или фармакологических скринингов с целью выявления новых регуляторов EndMT с потенциальным применением при заболеваниях человека.
Introduction
Эндотелиальный переход в мезенхимальный (ЭндМТ) представляет собой многоступенчатое и динамическое биологическое явление, которое связано с разнообразными физиологическими и патологическими процессами1,2. При эндомт эндотелиальных клетках постепенно теряют свои эндотелиальные признаки, приобретая при этом мезенхимальные свойства3; таким образом, плотно уплотненные и хорошо организованные эндотелиальные клетки дифференцируются в вытянутые мезенхимально-подобные клетки. Морфологические изменения в EndMT совпадают с изменениями в экспрессии определенных генов и белков. В целом, экспрессия белков, которые поддерживают эндотелиальные характеристики, включая эндотелиальный (VE)-кадгерин сосудов, молекулу адгезии тромбоцитов / EC-1 (CD31 / Pecam-1), снижается. Одновременно накапливаются белки, связанные с мезенхимальными функциями, такие как актин α гладкой мускулатуры (α-Sma) и белок гладких мышц 22α (Sm22α). Новые результаты показали, что постнатальный эндМТ способствует развитию заболеваний человека, таких как рак, сердечный фиброз, легочная артериальная гипертензия (ЛАГ), атеросклероз (АС), фиброз органов и т.д.2,4,5,6,7. Более глубокое понимание основных механизмов EndMT и того, как направлять процесс EndMT, обеспечит новые терапевтические методы для заболеваний, связанных с EndMT, и регенеративной медицины.
TGF-β является одним из основных индукторов EndMT, и другие известные вовлеченные факторы включают Wnt / β-катенин, Notch и некоторые воспалительные цитокины1. Поскольку клеточный контекст является ключевым для ответов, вызванных TGF-β, взаимодействие TGF-β с другими сигналами, способствующими EndMT, имеет значение для TGF-β, чтобы вызвать ответ EndMT. При активации TGF-β рецепторов серин/треонинкиназы типа II и типа II активируется внутриклеточный канонический путь Smad. TGF-β рецептор-опосредованный фосфорилированный Smad2/3 образуют гетеромерные комплексы со Smad4, которые транслоцируются в ядро, где они усиливают экспрессию факторов транскрипции, связанных с EndMT. Подобно эпителиально-мезенхимальному переходу (EMT), факторы транскрипции, такие как Snail, Slug, Twist, Zeb1 и Zeb2, индуцируются передачой сигналов TGF-β и способствуют перепрограммированию генов в EndMT8.
Улитка часто определяется как ключевой фактор в EndMT. Улитка связывается с промотором генов, кодирующих белки клеточно-клеточной адгезии и подавляет их транскрипцию, что уравновешивается усилением экспрессии мезенхимальных белков9. Эндотелиальные клетки составляют очень гетерогенную популяцию, и относительное влияние различных внеклеточных стимулов на ЭндМТ может различаться между эндотелиальными клеточными контекстами или типами клеток10. Из-за сходства с EMT некоторые методологии полезны для исследования обоих механизмов EMT и EndMT8. В этой связи Международная ассоциация EMT (TEMTIA) решительно подчеркивает необходимость дополнительных методов для того, чтобы в конечном итоге продемонстрировать возникновение EMT/EndMT11.
Здесь мы описываем метод мониторинга и визуализации процесса EndMT, индуцированного TGF-β. Иммунофлуоресцентное окрашивание предоставляет основную информацию об изменениях экспрессии в целевых белках/маркерах, которые используются в качестве индикаторов того, происходит ли процесс EndMT. Кроме того, иммунофлуоресцентное окрашивание может визуализировать локализацию белков/маркеров и морфологию клеток. Чтобы изучить потенциальную активность конкретных TF (или других регуляторов восходящего или нисходящего потока), участвующих в TGF-β опосредованном EndMT, мы описываем протокол, использующий кластеризованные регулярно интерширизованные короткие палиндромные повторы (CRISPR) / CRISPR-ассоциированный белок 9 (Cas9) для истощения определенных генов из клеток, используя TF Snail в качестве примера. Cas9 представляет собой двойную эндонуклеазу ДНК, управляемую РНК, которая распознает и расщепляет последовательности, комплементарные последовательностям CRISPR у бактерий12. Система CRISPR/Cas9 в настоящее время широко используется, поскольку она облегчает генную инженерию in vitro и in vivo13. Направленный одной направляющей РНК (sgRNA), эктопически экспрессируемый Cas9 генерирует разрыв двойной цепи в заранее выбранной целевой последовательности в определенном локусе гена. Негомологичное соединение концов (NHEJ) происходит для восстановления Cas9-индуцированных разрывов нитей, посредством случайных нуклеотидных вставок или делеций, что приводит к нарушению и инактивации целевого гена. Подробно описаны методы проектирования селективных sgRNAs и генерации лентивирус-совместимых векторов, содержащих разработанные sgRNAs. В результате стабильные эндотелиальные клетки, истощенные генами, могут генерироваться эффективным и надежным образом.
В этом исследовании мы использовали микрососудистые эндотелиальные клетки поджелудочной железы мышм (MS-1)14 в качестве модельной системы для изучения процесса ЭндМТ, индуцированного TGF-β2. Наше предыдущее исследование показало, что улитка является основным фактором транскрипции, увеличенным TGF-β2, с помощью которого EndMT индуцируется в клетках MS-115. После редактирования гена CRISPR/Cas9 для отмены экспрессии улиток в клетках MS-1 TGF-β2 не смог опосредовать EndMT. Этот рабочий процесс может быть применен для изучения других (подозреваемых) генов, связанных с EndMT.
Protocol
1. Индукция EndMT по TGF-β2
- Клетки MS-1 в модифицированной среде Dulbecco Eagle (DMEM), содержащей 10% фетальной бычий сыворотки (FBS) и 100 Ед/мл пенициллина/стрептомицина в инкубаторе (5% CO2,37 °C). Покрываем все блюда/тарелки для культивирований 0,1% мас./в желатина в течение 10 мин перед употреблением.
- Аккуратно промыть клетки MS-1 1 1x фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS), добавить 2 мл раствора трипсина-ЭДТА (0,25% трипсина и 0,02% ЭДТА) в посуду с 10 см и инкубировать в течение 2 мин при 37 °C для их отсоединения. Затем добавляют 5 мл полной культурально-питательной среды для гашения реакции.
- Переложите клеточную суспензию в трубку 15 мл и центрифугу при 200 х г в течение 3 мин при комнатной температуре.
- Откажитесь от супернатанта и повторно суспендировали клетки в 4 мл свежей среды, содержащей FBS и пенициллин/стрептомицин. Подсчитайте ячейки с помощью автоматического счетчика ячеек.
- Семена 1 х 103 клетки насм2 для дальнейшего культивя. Например, семена 9,5 х 103 ячейки / скважина для плит с 6 скважинами или 1,9 х 103 ячейки / скважина для плит с 24 скважинами.
- Инкубируйте клетки в течение ночи, чтобы они могли прилипать и восстанавливаться, затем стимулируйте клетки MS-1 TGF-β2 в течение 3 дней. Добавьте ингибитор киназы рецепторов TGF-β SB431542 (5 мкМ) за 30 мин до стимуляции TGF-β2. Обрабатывают другие клетки транспортным средством (ДМСО).
ПРИМЕЧАНИЕ: Растворить TGF-β2 в 4 мМ HCl, содержащем 0,1% человеческого быжьего сывороточного альбумина (BSA). Добавьте такое же количество лигандного буфера без TGF-β2 в контрольную группу. Концентрация TGF-β2 может быть адаптирована к 0,1-1 нг/мл для конкретных анализов. Смотрите показания на соответствующих рисунках. - Через 3 дня исследуйте морфологию клеток с помощью визуализации яркого поля (с помощью инвертированного микроскопа) и выполните иммунофлуоресцентное окрашивание (см. шаг 2) для оценки изменений маркеров, связанных с EndMT. Выполните не менее трех независимых экспериментов для получения биологических трипликатов.
2. Иммунофлуоресцентное окрашивание
- Трипсинизируют культивируемые клетки MS-1 (этап 1.2), а затем повторно сеют 1,9 х 103 клетки на 12-миллиметровом круглом покровном стекле с желатиновым покрытием, помещенном на дно 24-колодезной пластины.
- После культивирования клеток в течение ночи добавляют TGF-β2 (конечная концентрация 1 нг/мл) в клетки в течение 3 дней. Используйте среду, содержащую буфер лигандов, в качестве отрицательного элемента управления.
- Выполните окрашивание Pecam-1 и Sm22α.
- После стимуляции клеток TGF-β2 (или Control) в течение 3 дней удалите среду и промыте клетки 1x PBS.
- Добавьте 300 мкл 4% формальдегида в каждую скважину и инкубируйте в течение 10 мин при комнатной температуре, чтобы зафиксировать клетки. Промыть 3x с 1x PBS после инкубации.
- Добавьте 300 мкл 0,1% Тритона X-100 в 1x PBS в каждую скважину и инкубируйте в течение 10 мин при комнатной температуре для проницаемости клеток. После инкубации удаляют раствор Тритона Х-100 и промывают клетки 3x 1x PBS.
- Блокируйте клетки 3% бытовым сывороточным альбумином (BSA) в 1x PBS в течение 45 мин при комнатной температуре.
- Разбавьте первичные антитела Pecam-1 и Sm22α, которые распознают мышиные белки 1:500 с 1x PBS. Затем инкубируют неподвижные клетки с первичными антителами в течение 45 мин при комнатной температуре.
- После промывки 3x 1x PBS, инкубируют клетки с 1000x разбавленных вторичными антителами, включая ослиную анти-крысу Alexa 488 и козью анти-кролик Alexa 594, в течение 45 мин при комнатной температуре.
ПРИМЕЧАНИЕ: Защитите образцы от света во время окрашивания. - После промывки 3x 1x PBS поместите покровное стекло, засеянное клетками лицом вниз, на каплю монтажной среды, содержащей 4',6-диамидин-2-фенилиндол (DAPI), на слайд, чтобы окрасить ядра.
- Зафиксируйте периферию покровного стекла прозрачным лаком для ногтей и храните его при 4 °C.
- Получайте репрезентативные изображения с помощью конфокального микроскопа. Установите длины волн лазера на 405 нм, 488 нм и 552 нм для обнаружения DAPI, Pecam-1 и Sm22α соответственно. Для каждого канала все снимки были сделаны с одинаковыми настройками и временем экспозиции. Выполните не менее трех независимых экспериментов для получения биологических трипликатов.
3. Нокаут из Улитки с помощью редактирования CRISPR/Cas9
- Разработайте две независимые sgRNAs, нацеленные на мышиную улитку.
- Проектирование sgRNAs с использованием онлайн-инструментов CHOPCHOP (https://chopchop.cbu.uib.no/) и Cas-OFFinder (http://www.rgenome.net/cas-offinder/) в соответствии с целевым названием гена и видами.
- Прогнозирование нецелевой активности разработанных sgRNAs, нацеленных на Snail, с помощью двух независимых алгоритмов, включая Cas-OFFinder (http://www.rgenome.net/cas-offinder/) и CHOPCHOP (http://chopchop.cbu.uib.no/).
- Выберите две sgRNAs с наименьшей неактивности. Разработайте два комплементарных олиго сгРНК с сайтом разреза BveI. Олиго начинается с 5'-ACCG-3', а антисмысловое олиго начинается с 5'-AAAC-3'.
- Закажите коммерчески синтезировать олиго для дальнейшего использования.
- Клонирование комплементарной направляющей РНК-олиго в BveI-переваренный AA19 pLKO.1-puro.U6.sgRNA. Бве I-начинка Лентивирусной векторной плазмиды для генерации AA19 pLKO.1-Snail-sgRNA16.
- Вырежьте AA19 pLKO.1-puro.U6.sgRNA. Бве I-начинка плазмида с ферментом BveI16. Смешать 2 мкг АА19 пЛКО.1-пуро.U6.sgRNA. Бве Плазмида I-начинки, 5 мкл 10x Buffer O и 5 мкл фермента BveI и добавляют стерильную воду для достижения общего объема 50 мкл.
- Вихрь и ненадолго раскрутите реакционную смесь. Инкубируют реакцию при 37 °C в течение 1 ч.
- Загрузите реакционную смесь на 1% агарозный гель и запустите в 1x Tris-ацетат-ЭДТА (TAE, 50x TAE запас: 242 г основания Tris, растворенного в воде, 57,1 мл ледниковой уксусной кислоты, 100 мл 500 мМ раствора ЭДТА (рН 8,0) и добавьте воду в общий буфер 1 л до достижения хорошего разделения.
- Отрежьте фрагмент позвоночника из геля, изолируйте его с помощью набора для экстракции геля в соответствии с протоколом производителя (см. Таблицу материалов)и элюируйте позвоночник в буфере элюдения 40 мкл (EB).
- Смешайте 5 мкл 100 пмоль/мкл олиго и 5 мкл 100 пмоль/мкл антисмыслового олиго с 1 мкл 1 М Трис-HCl (рН 8,0) и добавьте стерильную воду, чтобы достичь в общей сложности 100 мкл для отжига олиго гРНК. Инкубировать смесь в течение 5 мин при 100 °C, а затем накрыть тубы алюминиевой фольгой. После этого медленно охладите раствор до комнатной температуры для дальнейшего использования в качестве вкладыша.
- Чтобы склеить комплементарные олиго гРНК и BveI-переваренный позвоночник, смешайте 1 мкл выделенного BveI разреза aA19 pLKO.1-puro.U6.sgRNA.BveI-зародыш и 2 мкл вставки (разбавленной 1:300) с 2 мкл 10x T4 ДНК-лигазного буфера и 1 мкл Т4-лигазы ДНК и добавляют стерильную воду, чтобы достичь в общей сложности 20 мкл. Кратковременно раскрутите трубку и инкубируйте ее в течение 4 ч при комнатной температуре для дальнейшего использования.
ПРИМЕЧАНИЕ: При выполнении лигирования убедитесь, что включены две контрольные группы. Для одной контрольной группы смешайте 1 мкл изолированной основы, 2 мкл 10x буфера ДНК-лигазы Т4 и 1 мкл ДНК-лигазы Т4 и добавьте стерильную воду, чтобы достичь в общей сложности 20 мкл, но без олиго-ДНК. Для другой контрольной группы смешайте 1 мкл изолированной основы и 2 мкл 10x буфера ДНК-лигазы Т4 и добавьте стерильную воду, чтобы достичь в общей сложности 20 мкл, но без отожженных олиго и Т4-лигазы. Эти две контрольные лигии используются для определения фона реакции на следующем этапе трансформации и указывают на то, насколько эффективно лигирование.
- Превратите реакционную смесь в компетентную TOP10 E. coli.
- Соберите грамотный ТОП10 Кишечной палочки. ячейки из морозильной камеры -80 °C и разморозить их на льду.
- Добавьте 2 мкл лигационной смеси к 50 мкл компетентных клеток и держите трубку на льду в течение 30 минут.
- Тепловой удар по трубе при 42 °C в течение 30 с. Положите трубку на лед на 2 мин.
- Добавьте в смесь 950 мкл свежего лизогенного бульона (LB) и энергично встряхните при 37 °C в течение 60 мин.
- Вращайте вниз и обкладывайте клетки на теплой ампициллиновой (100 мкг/мл) пластине сопротивления LB. Инкубировать пластину при 37 °C в течение ночи.
- Убедитесь в успешном введении олиго гРНК в плазмиду.
- Наберите 3-5 колоний на пластине в 1 мл ампициллина (100 мкг/мл), содержащего среду LB, и встряхните на ночь при 30 °C.
- Изолируют плазмидную ДНК с помощью плазмидного набора в соответствии с протоколом производителя(Таблица материалов)и секвенируют ее с помощью промоторного праймера U6 5'-GAGGGCCTATTTCCCATGATT -3' для проверки успешной вставки олиго гРНК.
4. Генерация нокаутных клеток Улитки MS-1
- Производят лентивирусные частицы, несущие Cas9 или гРНК, нацеленные на улиток.
- Культивирует клетки HEK 293T в ДМЭМ, содержащие 10% фетальной бычий сыворотки и 100 ЕД/мл пенициллина/стрептомицина в посуде по 14,5 см (или колбах Т75) в инкубаторе (5%СО2,37 °С).
- Смешайте 9,9 мкг плазмиды гена-мишени, AA19 pLKO.1-Snail-sgRNA или pLV-Cas917 плазмиды вместе с плазмидами-помощниками 3,5 мкг pCMV-VSVG (кодирующих G-белок вируса везикулярного стоматита, VSV-G), 6,6 мкг плазмиды rev-реагирующего элемента pMDLg-RRE (кодирование Gag и Pol) и 5,0 мкг pRSV-REV (кодирование Rev) в 500 мкл свободной среды сыворотки. Повторное суспендирование 50 мкл полиэтиленимина (PEI) (2,5 мг/мл) в 500 мкл свободной среды сыворотки. Осторожно смешайте плазмиды и препараты PEI путем пипетирования вверх и вниз. Инкубировать смесь в течение 20 мин при комнатной температуре.
- Трансфектировать клетки HEK 293T путем добавления смеси среды со ступени 4.1.2 до 80% конфлюентных клеток в тарелки 14,5 см (или колбы T75), которые содержат среду DMEM с 10% FBS и 100 ЕД/мл пенициллина/стрептомицина. Клетки HEK293T используются, потому что они легко трансфектируются и генерируют высокие уровни вируса18.
- Перенос трансфектированных клеток HEK 293T в биобезопасность в микробиологической и биомедицинской лаборатории (BMBL) для их культивирования в течение 24 ч.
- В лаборатории BMBL замените трансфекционную среду из клеток HEK 293T 12 мл свежего полного DMEM, содержащего FBS и пенициллин/стрептомицин. Инкубировать клетки в течение 24 ч.
- Соберите и отфильтруйте среду с помощью шприца 20 мл и фильтра 0,45 мкм. Переложите кондиционированную среду в полипропиленовую трубку 15 мл.
- Добавьте 12 мл свежего полного DMEM, содержащего FBS и пенициллин/стрептомицин, в культурную чашку и культуру HEK 293T в течение дополнительных 24 ч.
- Соберите и отфильтруйте среду с помощью шприца 20 мл и фильтра 0,45 мкм. Переложите кондиционированную среду в полипропиленовую трубку 15 мл. Храните среду, содержащую лентивирусные частицы, в виде 1 мл аликвоты при -80 °C для дальнейшего использования.
- Инфицировать клетки MS-1 вирусом pLV-Cas9.
- Семена 1 х 105 клеток МС-1 на скважину в 6-ю скважинной пластине в течение 24 ч до лентивирусной инфекции.
- Разморозить замороженные аликвоты вируса pLV-Cas9 на водяной бане с 37 °C.
- Смешайте 1 мл вирусной среды с 1 мл свежей среды DMEM, содержащей FBS и пенициллин/стрептомицин. Добавляют полибрен в среду (конечная концентрация 10 мкг/мл) для повышения эффективности инфекции.
- Извлеките среду из 6-скважинной пластины и замените ее средой для смешивания вируса/полибрена и культивирование клеток в инкубаторе в течение 24 ч. 24 ч после заражения, замените среду свежей средой и культивирование клеток еще 24 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда держите неинфицированного колодца в качестве контрольной группы. - Аспирировать среду из инфицированной группы и контрольной группы и заменить ее средой DMEM с 4 мкг/мл бламицидина.
- Верните пластину в инкубатор при 37 °C и культивировать клетки в течение 1 недели. Неинфицированные клетки погибнут из-за действия бластицидина. Расщепляет выжившие клетки, когда они достигают 80% клеточной конфлюентности и продолжают отбор бластицидина.
- Подтвердить экспрессию Cas9 в клетках MS-1 методом западного блоттинга с использованием антитела против Cas9 (молекулярная масса Cas9 составляет примерно 160 кДа).
- Отдельно заражают клетки pLV-Cas9 MS-1 двумя независимыми лентивирусами гРНК.
- Семена 1 х 105 pLV-Cas9 MS-1 клеток на скважину в 6-ю скважинной пластине в течение 24 ч до заражения.
- Следуйте тому же протоколу, что описано в 4.2, чтобы отдельно заражать клетки двумя лентивирусами гРНК.
- После 24 ч заражения вирусом гРНК освежите среду и культивяйте клетки еще 24 ч.
- Замените среду DMEM 1 мкг/мл пуромицина. Верните пластину в инкубатор при 37 °C и культивировать клетки в течение 1 недели. Убедитесь, что неинфицированные клетки полностью мертвы. Расщепляйте клетки, когда они достигают 80% конфлюентности и продолжают выделение пуромицина.
- Подтвердить выведение Улитки в клетках MS-1 путем вестерн-блоттинга с использованием антитела против Улитки (молекулярная масса Улитки составляет примерно 35 кДа).
Representative Results
TGF-β2 индуцирует ЭндМТ и стимулирует экспрессию улиток в эндотелиальных клетках MS-1
TGF-β является одним из цитокинов с наибольшим потенциалом индуцировать EndMT. После обработки клеток MS-1 TGF-β2 (1 нг/мл) в течение 3 дней эндотелиальные клетки MS-1 теряют свою булыжную структуру и дифференцируются в веретенообразные мезенхимоподобные клетки(Рисунок 1А)15. Чтобы дополнительно проверить роль TGF-β2 в индуцировании клеточных фенотипических изменений, мы предварительно обработали клетки ингибитором маломолекулярной активин-рецептор-подобной киназы (ALK)4/ ALK5/ALK7 SB431542 перед стимуляцией TGF-β219. SB431542 полностью отменил TGF-β2-индуцированные изменения морфологии клеток(рисунок 1A). Процесс ЭндМТ, индуцированный TGF-β2, был дополнительно исследован путем изучения изменений в экспрессии маркеров, связанных с ЭндМТ. Как показано на рисунке 1B,эндотелиальный белок Pecam-1 был сильно снижен после стимуляции TGF-β2, в то время как мезенхимальный фактор Sm22α был глубоко упрежден TGF-β215. Эти данные согласуются с представлением о том, что TGF-β2 вызывал EndMT в клетках MS-1. Затем мы исследовали влияние TGF-β2 на экспрессию улиток и слизней. Как показано на рисунке 1C,Улитка была заметно урегулируема TGF-β2, в то время как экспрессия Slug не зависела от TGF-β2 в клетках MS-115. Количественная оценка экспрессии улитки из трех независимых экспериментов показана на рисунке 1D.
Истощение улитки CRISPR/Cas9 в эндотелиальных клетках MS-1
Поскольку Улитка была индуцирована TGF-β2 и, вероятно, участвовала в TGF-β2-опосредованном EndMT, мы выполнили редактирование гена CRISPR / Cas9, чтобы генетически истощить экспрессию улитки в клетках MS-1. Мы предположили, что истощение Улитки будет достаточным для ингибирования TGF-β2-индуцированного EndMT. Как показано на рисунке 2A,мы сгенерировали нокаутирующие клетки Улитки в два этапа. Во-первых, Cas9 был эктопически экспрессирован путем заражения клеток MS-1 экспрессирующим лентивирусом Cas9. Поскольку в конструкции pLV-Cas9 есть кассета сопротивления бластицидину, мы проверили экспрессию Cas9 методом анализа вестерн-блот в бластицидин-резистентных ячейках(рисунок 2D). Впоследствии мы ввели sgRNAs, которые специально нацеливались на Улитку, чтобы нарушить экспрессию белка. Эта процедура также выполнялась путем заражения лентивирусными частицами, несущих конструкцию AA19 pLKO.1-Snail-sgRNA, которая включает кассету экспрессии пуромицина. Cas9-экспрессирующие клетки снова заражались гРНК, содержащей лентивирус, и дополнительно отбирали пуромицином. Два комплементарных олиго сгРНК, нацеленных на мыщную улитку, были разработаны с прогнозируемой низкой внецелевой активностью(рисунок 2B, C). После введения двух независимых sgRNAs улитки в Cas9, экспрессивляющих клетки MS-1, экспрессия белка улитки была отменена(Рисунок 2D)15.
Дефицит улитки ингибирует TGF-β2-индуцированный EndMT в клетках MS-1
Чтобы продемонстрировать функцию улитки в TGF-β2-опосредованном EndMT, мы провели анализ EndMT в клетках, обедненных улитками, и сравнили его с родительскими клетками MS-1. Как показано на рисунке 3А,нокаут улитки был достаточным для ингибирования фибробластоподобной морфологии клеток, обусловленной TGF-β2 в клетках MS-115. Кроме того, TGF-β2-опосредованное снижение Pecam-1 и усиление Sm22α были полностью заблокированы в истощенных улитами клетках MS-1. Таким образом, мы продемонстрировали, что Улитка критически важна для TGF-β2-опосредованного EndMT в ячейках MS-1(Рисунок 3B)15.
Рисунок 1. TGF-β2 индуцирует экспрессию EndMT и Улитки в клетках MS-1. А. Влияние ингибитора киназы рецепторов TGF-β2 и/или TGF-β типа I SB-431542 на морфологию клеток. Снимки Брайтфилда клеток MS-1 при лечении TGF-β2 (1 нг/мл) и/или SB-431542 (SB, 5 мкМ, вводимые за 30 мин до TGF-β2) в течение 2 дней. Шкала представляет собой 200 мкм. B. Иммунофлуоресцентное окрашивание Pecam-1 (зеленый) и Sm22α (красный) в клетках MS-1, культивированных в среде, содержащей TGF-β2 (1 нг/мл) в течение 3 дней. Ядра визуализируются синим цветом (DAPI). Шкала бара: 50 мкм. C. Вестерн-блот с цельноклеточным лисатом TGF-β2 стимулировал клетки MS-1. Экспрессия Улитки, но не Слизняка, была усилена стимуляцией TGF-β2, как сообщалось ранее в Ma et al15. Д. Количественная оценка экспрессии улитки путем интеграции результатов трех независимых экспериментов с западным пятном. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2. Истощение улитки путем редактирования гена CRISPR-Cas9. А. Схема, изображающая, как генерировать нокаутирующие клетки Улитки. Bsd: Бластицидин. Пуро: Пуромицин. В. Олигонуклеотиды двух независимых sgRNAs, нацеленных на Улитку с использованием CHOPCHOP (http://chopchop.cbu.uib.no/) и Cas-OFFinder (http://www.rgenome.net/cas-offinder/). С. Прогнозируемая нецелевая активность двух гРНК для Улитки с использованием Cas-OFFinder (http://www.rgenome.net/cas-offinder/). Д. Cas9 и экспрессия улитки в диком типе (WT) и Cas9-сверхэкспрессированный MS-1, измеренный с помощью анализа вестерн-блот. Э. Нокаут улитки с двумя независимыми гРНК в клетках MS-1, измеренный анализом вестерн-блот. Мы сообщили о подобных результатах в Ma et al15. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3. Генетическое истощение улитки ингибирует TGF-β2-индуцированный EndMT в клетках MS-1. А. Снимки Брайтфилда клеток MS-1 при лечении TGF-β2 (0,1 нг/мл) в течение 3 дней в клетках дикого типа (WT, верхняя панель) и выбитых улиток (нижняя панель). Шкала представляет собой 200 мкм. Б. Иммунофлуоресцентное окрашивание для Пекама-1 (зеленый), Sm22α (красный) и ядер (синий) клеток MS-1 культивируют в среде, содержащей TGF-β2 (1 нг/мл) в течение 3 дней. Истощение улитки отменило TGF-β2-индуцированное снижение Pecam-1 и увеличение экспрессии Sm22α. Шкала представляет собой 50 мкм. С. Схематическое изображение влияния нокаута улитки на TGF-β-индуцированный EndMT в клетках MS-1. TGF-β стимулирует экспрессию улитки по пути Smad путем фосфорилирования Smad2/3 и далее стимулирует EndMT. Нокаут Snail с помощью редактирования генов на основе CRISPR / Cas9 отменил TGF-β-опосредованный EndMT. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Discussion
Понимание механизма EndMT имеет решающее значение для модуляции этого процесса и нацеливания на заболевания, связанные с EndMT. Здесь мы описали методы выполнения анализа EndMT, индуцированного TGF-β, и опроса о роли улитки EndMT-TF в EndMT, запускаемом TGF-β, путем выполнения СТАБИЛЬНОГО истощения генов Улитки из клеток, опосредованного CRISPR / Cas9. Истощение Улитки с использованием подхода CRISPR/Cas9 успешно отменило TGF-β2 управляемый EndMT в ячейках MS-1(рисунок 3C). Для изучения влияния любых цитокинов, таких как TGF-β, на EndMT, ЭК подвергались воздействию цитокинов, а затем встречаемость EndMT оценивали в соответствии с морфологическими изменениями и изменениями экспрессии эндотелиальных и мезенхимальных маркеров в клетках. TGF-β2 сильно индуцирован EndMT в клетках MS-1 сопровождается сильным увеличением экспрессии транскрипционного фактора Улитки. EndMT-TFs, индуцированные TGF-β, могут различаться в зависимости от вида или тканеспецифического типа эндотелиальных клеток. Например, мы наблюдали, что Улитка, но не Слизняк был значительно повышен TGF-β в клетках MS-1, в то время как в эндотелиальных клетках пупочных вен человека (HUVECs) как улитка, так и Слизняк увеличиваются после воздействия TGF-β20.
Мы оценили степень процесса EndMT двумя способами, изучив изменения морфологии клеток, а затем изучив изменения в экспрессии маркеров, связанных с EndMT. После воздействия TGF-β в течение 3 дней клетки подвергались EndMT с последовательными морфологическими вариациями и изменениями в экспрессии маркеров, связанных с EndMT. В дополнение к иммунофлуоресцентным окрашиванию, которое мы выполнили здесь, вариации маркеров также могут контролироваться западным блоттингом на уровне экспрессии белка или qRT-PCR (Real-Time Quantitative Reverse Transcription PCR) на уровнях генов21. В дополнение к этим двум методам экономии времени и затрат, которые мы показали в этом протоколе, существуют и другие методы изучения EndMT. Например, выполнение анализа транскриптома (путем секвенирования РНК или qPCR) для сравнения уровней экспрессии эндотелиальных и мезенхимальных генов между обработанными и контрольными клетками может точно оценить EndMT22,23. Кроме того, EndMT часто включает в себя стабильную потерю барьерной функции, которая может быть оценена с помощью импедансной спектроскопии24. Кроме того, может быть изучено дополнительное доказательство приобретения стволовыми клетками, подобных свойствам, клетками, полученными из EndMT. Например, при определенных условиях культивации мезенхимоподобные клетки EndMT могут быть дополнительно дифференцированы в остеобласты, хондроциты, адипоциты или (мио)фибробласты. Поэтому дополнительный анализ для подтверждения дифференцировки в различные типы клеток, принадлежащих к линии мезодермы (т.е. экспрессия генов и окрашивание матрицы), полезен для демонстрации мультипотентной природы клеток, полученных из EndMT. Наконец, методы оценки EndMT не ограничиваются исследованиями in vitro, но могут быть экстраполированы для изучения связи между EndMT и некоторыми заболеваниями in vivo или in vivo органов. В этом смысле использование стратегий отслеживания родословных, специфичных для эндотелия, широко распространяется на исследования, связанные с EndMT25.
Чтобы исследовать роль улитки во время EndMT, в этом исследовании редактирование гена CRISPR / Cas9 было использовано для выбивания этого гена. Данные показали, что TGF-β2 не смог опосредовать EndMT в клетках MS-1 с дефицитом улиток. Это наблюдение показало, что улитка необходима для TGF-β2-индуцированного EndMT в клетках MS-1. Мы использовали независимую кассету экспрессии sgRNA, управляемую U6, чтобы представить конкретные sgRNAs для Cas9 для нацеливания на Snail. В дополнение к этому методу, Ran et al.26 описали другую стратегию клонирования последовательности олигоса sgRNA в каркас Cas9 для создания конструкции, содержащей как Cas9, так и gRNAs. Новые подходы позволяют CRISPR/Cas включать дополнительные функции. Например, двойные или тройные нокауты могут быть достигнуты путем доставки большего количества sgRNAs в клетки, экспрессирующие Cas927. Спроектированный белок Cas13 нацелен и переваривает молекулы РНК, не нарушая эндогенную ДНК28. Помимо выбивания генов с помощью CRISPR/Cas, короткие шпильки РНК (шРНК) могут быть использованы в качестве альтернативы стабильному снижению целевой экспрессии генов29. Для всех методов редактирования генов CRISPR /Cas всегда следует принимать во внимание нецелевое расщепление. Кроме того, малые интерферионные РНК (siRNAs) временно заглушляют экспрессию генов, и концентрация siRNA разбавляется делением клеток30. Оба эти метода частично подавляют целевую экспрессию генов. Напротив, эктопическая экспрессия генов также используется для проверки функции генов во время EndMT / EMT31. Этот подход может определить, является ли регуляция гена достаточной для получения ответа EndMT. Поэтому в настоящее время существует множество технических стратегий, которые могут быть использованы для выявления и проверки потенциальных регуляторов EndMT. Кроме того, транскриптомный анализ может быть хорошим вариантом в идентификации и всестороннем анализе регуляторов, связанных с EndMT. Мы рекомендуем использовать различные дополнительные подходы для исследования модуляции EndMT.
Таким образом, мы ввели рабочий процесс для определения факторов, которые могут играть функциональную роль во время EndMT, вызванного TGF-β. Этот метод также может быть использован для изучения того, могут ли другие стимулы (например, цитокины, факторы роста, механические стимулы, клеточно-клеточные взаимодействия) модулировать EndMT и взаимодействие TGF-β с другими стимулами. Кроме того, мы выделили подход, использующий редактирование генов CRIPSR / Cas, чтобы выяснить, требуется ли определенный ген для TGF-β-индуцированного EndMT. Чтобы проиллюстрировать эту методологию, мы использовали сильный индуктор EndMT TGF-β2 в клетках MS-1, но протоколы могут быть адаптированы к другим цитокинам и другим типам клеток. Мы ожидаем, что этот подробный описанный протокол послужит ступенькой для будущих исследований, связанных с EndMT.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Исследование было поддержано CGC.NL и Нидерландской инициативой по исследованию сердечно-сосудистых заболеваний: Голландским фондом сердца, Голландской федерацией университетских медицинских центров, Нидерландской организацией исследований и разработок в области здравоохранения и грантом Королевской академии наук Нидерландов, присужденным Phaedra-Impact (http://www.phaedraresearch.nl). JM поддерживается Китайским советом по стипендиям. GSD поддерживается грантом на батуте от AFM-Telethon [22379], FOP Italia и грантом от La Fundació La Marató de TV3 (#202038).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.45 μm filter | Pall Corporation, USA | 4614 | |
| 10× T4 DNA ligase buffer | Thermofisher Scientific, USA | B69 | |
| 12 mm round glass slice | Knittel Glass,Germany | VD10012Y1A.01 | |
| 20 mL syringe | BD Eclipse, USA | 300629 | |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Vector Laboratories, USA | H-1200 | VECTASHIELD Antifade Mounting Media |
| AA19_PLKO vector | Dr. M Gonçalves, Leiden University Medical Center, Netherlands | Gift | |
| Ampicillin | Serva Electrophoresis, USA | 1339903 | |
| Anti-Mouse IgG | GE Healthcare, USA | NA931 | |
| Anti-Rabbit IgG | Cell signaling, USA | 7074 | |
| Agarose | Roche, Switzerland | 11388991001 | |
| Blasticidin | Invitrogen, USA | R21001 | |
| Buffer O (10X) | Thermofisher Scientific, USA | BO5 | |
| BveI (Bspm1) | Thermofisher Scientific, USA | ER 1741 | |
| Confocal microscope | Leica Microsystems, Germany | SP8 | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific, USA | 11965092 | |
| Donkey anti-rat Alexa 488 | Invitrogen, USA | A21208 | |
| FBS | Thermo Fisher Scientific, USA | 16000044 | |
| Formaldehyde | Thermo Fisher Scientific, USA | 28908 | |
| Inverted microscope | Leica Microsystems, Germany | DMi8 | |
| Goat anti-rabbit Alexa 594 | Invitrogen,USA | A11012 | |
| LabNed Plasmid kit | LabNed, USA | LN2400004 | |
| MS-1 cell line | American Type Culture Collection (ATCC) | ||
| Nail polish | HEMA, Netherlands | Transparent | |
| Pecam-1 antibody | Becton Dickinson,USA | 553370 | |
| PEI | Polysciences, USA | 23966-1 | |
| PLV-Cas9 plasmid | Sigma-Aldrich, USA | Cas9BST-1EA | |
| Puromycin | Sigma-Aldrich, USA | P9620 | |
| QIAquick gel extraction kit | Qiagen, Germany | 28706 | |
| Sm22a antibody | Abcam, UK | ab14106 | |
| Snail | Cell signaling, USA | 3879 | |
| T4 DNA ligase | Thermofisher Scientific, USA | EL 0014 | |
| TC20 automated Cell Counter | Bio-Rad, USA | 1450102 | |
| Human TGF-β2 | Joachim Nickel, University of Wurzburg | Gift | Other commercial recommendation: 302-B2, R&D systems |
| Triton X-100 | Merck, USA | 1086031000 | |
| SB431542 | Tocris Bioscience, UK | 1614 | |
| Tris | Roche, Switzerland | 11814273001 |
References
- Ma, J., Sanchez-Duffhues, G., Goumans, M. -J., Ten Dijke, P. TGF-β-induced endothelial to mesenchymal transition in disease and tissue engineering. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, (2020).
- Piera-Velazquez, S., Jimenez, S. A. Endothelial to mesenchymal transition: role in physiology and in the pathogenesis of human diseases. Physiological Reviews. 99 (2), 1281-1324 (2019).
- Sánchez-Duffhues, G., de Vinuesa, G. A., ten Dijke, P. Endothelial-to-mesenchymal transition in cardiovascular diseases: developmental signaling pathways gone awry. Developmental Dynamics. 247 (3), 492-508 (2018).
- Evrard, S. M., et al. Endothelial to mesenchymal transition is common in atherosclerotic lesions and is associated with plaque instability. Nature Communications. 7 (1), 1-16 (2016).
- Qiao, L., et al. Endothelial fate mapping in mice with pulmonary hypertension. Circulation. 129 (6), 692-703 (2014).
- Zeisberg, E. M., et al. Endothelial-to-mesenchymal transition contributes to cardiac fibrosis. Nature Medicine. 13 (8), 952-961 (2007).
- Clere, N., Renault, S., Corre, I.
- Saito, A. EMT and EndMT: regulated in similar ways. The Journal of Biochemistry. 153 (6), 493-495 (2013).
- Bolós, V., et al. The transcription factor Slug represses E-cadherin expression and induces epithelial to mesenchymal transitions: a comparison with Snail and E47 repressors. Journal of Cell Science. 116 (3), 499-511 (2003).
- Aird, W. C.
- Yang, J., et al. Guidelines and definitions for research on epithelial-mesenchymal transition. Nature Reviews Molecular Cell Biology. , 1-12 (2020).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), (2014).
- Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
- Arbiser, J. L., et al. Oncogenic H-ras stimulates tumor angiogenesis by two distinct pathways. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 94 (3), 861-866 (1997).
- MA, J., et al. TGF-?-induced endothelial to mesenchymal transition results from a balance between SNAIL and ID factors. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 182 (9), (2021).
- Chen, X., et al. Probing the impact of chromatin conformation on genome editing tools. Nucleic Acids Research. 44 (13), 6482-6492 (2016).
- Hunter, F. W., et al. Functional CRISPR and shRNA screens identify involvement of mitochondrial electron transport in the activation of evofosfamide. Molecular Pharmacology. 95 (6), 638-651 (2019).
- Mao, Y., et al. Lentiviral vectors mediate long-term and high efficiency transgene expression in HEK 293T cells. International Journal of Medical Sciences. 12 (5), 407 (2015).
- Liu, S., et al. Deubiquitinase activity profiling identifies UCHL1 as a candidate oncoprotein that promotes TGFβ-induced breast cancer metastasis. Clinical Cancer Research. 26 (6), 1460-1473 (2020).
- Medici, D., et al. Conversion of vascular endothelial cells into multipotent stem-like cells. Nature Medicine. 16 (12), 1400 (2010).
- Kokudo, T., et al. Snail is required for TGFβ-induced endothelial-mesenchymal transition of embryonic stem cell-derived endothelial cells. Journal of Cell Science. 121 (20), 3317-3324 (2008).
- Dong, J., et al. Single-cell RNA-seq analysis unveils a prevalent epithelial/mesenchymal hybrid state during mouse organogenesis. Genome Biology. 19 (1), 1-20 (2018).
- Oatley, M., et al. Single-cell transcriptomics identifies CD44 as a marker and regulator of endothelial to haematopoietic transition. Nature communications. 11 (1), 1-18 (2020).
- Halaidych, V., et al. Inflammatory responses and barrier function of endothelial cells derived from human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 10 (5), 1642-1656 (2018).
- Li, Y., Lui, K. O., Zhou, B. Reassessing endothelial-to-mesenchymal transition in cardiovascular diseases. Nature Reviews Cardiology. 15 (8), 445-456 (2018).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Grav, L. M., et al. One-step generation of triple knockout CHO cell lines using CRISPR/Cas9 and fluorescent enrichment. Biotechnology Journal. 10 (9), 1446-1456 (2015).
- Abudayyeh, O. O., et al.
- Paddison, P. J., et al. Cloning of short hairpin RNAs for gene knockdown in mammalian cells. Nature Methods. 1 (2), 163-167 (2004).
- Reynolds, A., et al. Rational siRNA design for RNA interference. Nature Biotechnology. 22 (3), 326-330 (2004).
- Lourenço, A. R., et al. C/EBPɑ is crucial determinant of epithelial maintenance by preventing epithelial-to-mesenchymal transition. Nature Communications. 11 (1), 1-18 (2020).
