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Biology

टीजीएफ-β-मध्यस्थता एंडोथेलियल से मेसेंचिमल ट्रांजिशन (एंडएमटी) और CRISPR/Cas9 जीन संपादन का उपयोग करके एंडएमटी प्रभावकर्ताओं का कार्यात्मक मूल्यांकन

Published: February 26, 2021 doi: 10.3791/62198
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1, 1,2
1Dept. Cell Chemical Biology, Leiden University Medical Center, 2Oncode Institute, Leiden University Medical Center

Summary

हम कोशिका आकृति विज्ञान परिवर्तन देख कर एंडोथेलियल कोशिकाओं में TGF-12-प्रेरित EndMT की जांच करने और इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला का उपयोग कर अभिव्यक्ति EndMT से संबंधित मार्कर परिवर्तन की जांच करने के तरीकों का वर्णन करते हैं । CRISPR/Cas9 जीन संपादन का वर्णन किया गया था और टीजीएफ-ο2-प्रेरित EndMT में अपनी भूमिका की जांच करने के लिए जीन एन्कोडिंग घोंघा को कम करने के लिए इस्तेमाल किया गया था ।

Abstract

विशिष्ट बाहरी संकेतों और कुछ ट्रांसक्रिप्शन कारकों की सक्रियता के जवाब में, एंडोथेलियल कोशिकाएं एक मेसेंचिमल जैसे फेनोटाइप में अंतर कर सकती हैं, एक प्रक्रिया जिसे मेसेंचिमल संक्रमण (एंडएमटी) के लिए एंडोथेलियल कहा जाता है। उभरते परिणामों ने सुझाव दिया है कि एंडएमटी फाइब्रोसिस और कैंसर जैसे कई मानव रोगों से जुड़ा हुआ है। इसके अलावा, एंडोथेलियल-व्युत्पन्न मेसेंचिमल कोशिकाओं को ऊतक पुनर्जनन प्रक्रियाओं में लागू किया जा सकता है, क्योंकि उन्हें विभिन्न कोशिका प्रकारों (जैसे, ऑस्टियोब्लास्ट और कोंड्रोसाइट्स) में और अलग किया जा सकता है। इस प्रकार, एंडएमटी के चयनात्मक हेरफेर में नैदानिक क्षमता हो सकती है। एपिथेलियल-मेसेंचिमल ट्रांजिशन (ईएमटी) की तरह, एंडएमटी को स्रावित साइटोकिन ट्रांसफॉर्मिंग ग्रोथ फैक्टर-बीटा (टीजीएफ-β) द्वारा दृढ़ता से प्रेरित किया जा सकता है, जो घोंघा और स्लग सहित तथाकथित एंडएमटी ट्रांसक्रिप्शन कारकों (एंडएमटी-टीएफ) की अभिव्यक्ति को उत्तेजित करता है। ये एंडएमटी-टीएफ क्रमशः मेसेंचिमल और एंडोथेलियल प्रोटीन के स्तर को बढ़ाते हैं। यहां, हम टीजीएफ-β-प्रेरित एंडएमटी इन विट्रो की जांच करने के तरीकों का वर्णन करते हैं, जिसमें टीजीएफ-β-प्रेरित एंडएमटी में विशेष टीएफएस की भूमिका का अध्ययन करने के लिए एक प्रोटोकॉल शामिल है। इन तकनीकों का उपयोग करके, हम इस बात का सबूत देते हैं कि टीजीएफ-ए2 मुरीन अग्नाशय माइक्रोवैस्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं (एमएस-1 कोशिकाओं) में एंडएमटी को उत्तेजित करता है, और यह कि संकुल का उपयोग करके घोंघा की आनुवंशिक कमी नियमित रूप से इंटरस्पेस्ड शॉर्ट पैलिंड्रोमिक रिपीट्स (CRISPR) / CRISPR-संबद्ध प्रोटीन 9 (Cas9) -मध्यस्थता जीन संपादन, इस घटना को निरस्त करती है। यह दृष्टिकोण एंडोथेलियल जीव विज्ञान के संभावित मॉड्यूलर से पूछताछ करने के लिए एक मॉडल के रूप में काम कर सकता है, और मानव रोग में संभावित अनुप्रयोग के साथ, एंडएमटी के उपन्यास नियामकों की पहचान करने के लिए आनुवंशिक या औषधीय स्क्रीन प्रदर्शन करने के लिए उपयोग किया जा सकता है।

Introduction

एंडोथेलियल टू मेसेंचिमल ट्रांजिशन (एंडएमटी) एक बहुस्टेप और गतिशील जैविक घटना है जिसे विविध शारीरिक और रोग प्रक्रियाओं से जोड़ा गया है1,2. एंडएमटी एंडोथेलियल कोशिकाओं पर धीरे-धीरे अपने एंडोथेलियल लक्षण खो देते हैं, जबकि मेसेंचिमल गुण प्राप्त करते हैं3; इस प्रकार, कसकर संकुचित और अच्छी तरह से संगठित एंडोथेलियल कोशिकाएं लम्बी मेसेंचिमल जैसी कोशिकाओं में अंतर करती हैं। एंडएमटी में रूपात्मक परिवर्तन कुछ जीन और प्रोटीन की अभिव्यक्ति में परिवर्तन के साथ मेल खाते हैं। सामान्य तौर पर, संवहनी एंडोथेलियल (वीई)-कैडेरिन, प्लेटलेट/ईसी आसंजन अणु-1 (सीडी 31/पेकैम-1) सहित एंडोथेलियल विशेषताओं को बनाए रखने वाले प्रोटीन की अभिव्यक्ति में गिरावट आती है । इसके साथ ही, मेसेंचिमल कार्यों से संबंधित प्रोटीन, जैसे α-चिकनी मांसपेशी ऐक्टिन (α-एसएमए) और चिकनी मांसपेशी प्रोटीन 22α (Sm22α) जमा होते हैं। उभरते परिणामों ने दिखा दिया है कि प्रसवोत्तर एंडएमटी मानव रोगों के विकास में योगदान देता है, जैसे कैंसर, कार्डियक फाइब्रोसिस, पल्मोनरी धमनी उच्च रक्तचाप (पीएएच), एथेरोस्क्लेरोसिस (एएस), अंग फाइब्रोसिस, आदि2,4,5,6,7। एंडएमटी के अंतर्निहित तंत्रों की गहरी समझ और एंडएमटी प्रक्रिया को कैसे निर्देशित किया जाए, एंडएमटी से संबंधित बीमारियों और पुनर्योजी दवा के लिए उपन्यास चिकित्सीय तरीके प्रदान करेंगे।

टीजीएफ-β मुख्य एंडएमटी प्रेरकों में से एक है, और अन्य ज्ञात शामिल कारकों में Wnt/β-catenin, पायदान, और कुछ भड़काऊ साइटोकिन्स1शामिल हैं । चूंकि सेलुलर संदर्भ टीजीएफ-β द्वारा ट्रिगर की गई प्रतिक्रियाओं के लिए महत्वपूर्ण है, इसलिए टीजीएफ-β का इंटरप्ले अन्य एंडएमटी को बढ़ावा देने वाले संकेतों के साथ एक एंडएमटी प्रतिक्रिया प्राप्त करने के लिए टीजीएफ-β के लिए प्रासंगिक है। टीजीएफ-β सेल सरफेस टाइप I और टाइप II सेरीन/थ्रेओनिन किनेज रिसेप्टर्स की सक्रियता पर, इंट्रासेल्युलर कैनोनिकल स्माड पाथवे सक्रिय है। टीजीएफ-β रिसेप्टर-मध्यस्थता वाले फॉस्फोरीलेटेड Smad2/3 Smad4 के साथ हेट्रोमेरिक कॉम्प्लेक्स बनाते हैं जो नाभिक में स्थानांतरित होते हैं, जहां वे एंडएमटी से संबंधित प्रतिलेखन कारकों की अभिव्यक्ति को बढ़ाते हैं। एपिथेलियल-मेसेन्चिमल ट्रांजिशन (ईएमटी) के समान, घोंघा, स्लग, ट्विस्ट, जेब1 और जेब2 जैसे ट्रांसक्रिप्शन कारक टीजीएफ-β सिग्नलिंग द्वारा प्रेरित होते हैं और एंडएमटी8में जीन रीप्रोग्रामिंग में योगदान देते हैं।

घोंघा अक्सर EndMT में एक महत्वपूर्ण कारक के रूप में पहचान की गई है । घोंघा जीन एन्कोडिंग सेल-सेल आसंजन प्रोटीन के प्रमोटर को बांधता है और उनके प्रतिलेखन को दबा देता है, जो मेसेंकिमल प्रोटीन9की अभिव्यक्ति की वृद्धि से प्रतिसंतुलित होता है। एंडोथेलियल कोशिकाओं में बहुत ही विषम आबादी होती है और एंडएमटी पर विविध बाहुलीय उत्तेजनाओं का सापेक्ष प्रभाव एंडोथेलियल सेलुलर संदर्भों या सेल प्रकार10के बीच भिन्न हो सकता है । ईएमटी के साथ इसकी समानताओं के कारण, कुछ तरीके तंत्र ईएमटी और एंडएमटी8दोनों की जांच करने के लिए उपयोगी हैं। इस संबंध में, ईएमटी इंटरनेशनल एसोसिएशन (टेमटिया) अंततः ईएमटी/एंडएमटी11की घटना को प्रदर्शित करने के लिए पूरक तकनीकों की आवश्यकता पर जोर देता है ।

यहां हम टीजीएफ-β-प्रेरित एंडएमटी प्रक्रिया की निगरानी और कल्पना करने के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं। इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग लक्षित प्रोटीन/मार्कर में अभिव्यक्ति परिवर्तन के बारे में बुनियादी जानकारी प्रदान करता है, जिसका उपयोग एंडएमटी प्रक्रिया के संकेतक के रूप में किया जाता है । इसके अतिरिक्त, इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग प्रोटीन/मार्कर और सेल आकृति विज्ञान के स्थानीयकरण की कल्पना कर सकते हैं । टीजीएफ-β मध्यस्थता एंडएमटी में शामिल विशिष्ट टीएफ (या अन्य अपस्ट्रीम या डाउनस्ट्रीम नियामकों) की संभावित गतिविधि का अध्ययन करने के लिए, हम एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जो एक उदाहरण के रूप में टीएफ घोंघे का उपयोग करके कोशिकाओं से विशिष्ट जीन को कम करने के लिए क्लस्टर नियमित रूप से इंटरस्पेस्ड शॉर्ट पैलिंड्रोमिक रिपीट्स (CRISPR) /CRISPR-संबद्ध प्रोटीन 9 (Cas9) जीन संपादन का उपयोग करके एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं । Cas9 एक दोहरी आरएनए-निर्देशित डीएनए एंडोन्यूक्लियेज है जो बैक्टीरिया12में CRISPR दृश्यों के पूरक दृश्यों को पहचानता है और क्लीव्स करता है। CRISPR/Cas9 प्रणाली वर्तमान में बड़े पैमाने पर उपयोग किया जाता है क्योंकि यह इन विट्रो और वीवो13में जेनेटिक इंजीनियरिंग की सुविधा प्रदान करता है । एक एकल गाइड आरएनए (sgRNA) द्वारा निर्देशित, एक्टोपिकल रूप से व्यक्त Cas9 एक विशिष्ट जीन लोकस में एक पूर्वचयनित लक्ष्यीकरण अनुक्रम पर एक डबल स्ट्रैंड ब्रेक उत्पन्न करता है। गैर-मुताबिक़ अंत में शामिल होने (एनएचईजे) Cas9-प्रेरित स्ट्रैंड ब्रेक की मरम्मत के लिए होता है, यादृच्छिक न्यूक्लियोटाइड सम्मिलन या विलोपन के माध्यम से जिससे लक्षित जीन में व्यवधान और निष्क्रियता होती है। हम चुनिंदा एसजीआरएनए डिजाइन करने और डिज़ाइन किए गए एसजीआरएनए वाले लेंटीविराल-संगत वैक्टर उत्पन्न करने के लिए विस्तार से तरीकों का वर्णन करते हैं। नतीजतन, स्थिर जीन-समाप्त एंडोथेलियल कोशिकाओं को कुशल और विश्वसनीय तरीके से उत्पन्न किया जा सकता है।

इस अध्ययन में, हमने टीजीएफ-2-प्रेरित एंडएमटी प्रक्रिया की जांच करने के लिए एक मॉडल प्रणाली के रूप में मुरीन अग्नाशय माइक्रोवैस्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं (एमएस-1)14 का उपयोग किया। हमारे पिछले अध्ययन से पता चला है कि घोंघा मुख्य प्रतिलेखन कारक TGF-12 द्वारा वृद्धि हुई है, जिसके द्वारा EndMT एमएस-1 कोशिकाओं15में प्रेरित किया जाता है । एमएस-1 कोशिकाओं में घोंघा अभिव्यक्ति को समाप्त करने के लिए CRISPR/Cas9 जीन संपादन पर, TGF-12 EndMT मध्यस्थता करने में विफल रहा । इस कार्यप्रवाह को अन्य (संदिग्ध) एंडएमटी से संबंधित जीन का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है।

Protocol

1. टीजीएफ-12 द्वारा एंडएमटी का इंडक्शन

  1. दुलबेको के संशोधित ईगल माध्यम (डीएमईएम) में एमएस-1 कोशिकाओं में 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) और 100 यू/एमएल पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन इन इनक्यूबेटर (5% सीओ2, 37डिग्री सेल्सियस) शामिल हैं। उपयोग से पहले 10 मिनट के लिए 0.1% w/v जिलेटिन के साथ सभी संस्कृति व्यंजन/प्लेटें कोट करें।
  2. 1x फॉस्फेट बफर नमकीन (पीबीएस) के साथ एमएस-1 कोशिकाओं को धीरे से धोएं, 2 मिलीएल ट्राइपसिन-ईडीटीए समाधान (0.25% ट्राइप्सिन और 0.02% ईडीटीए) को 10 सेमी डिश में जोड़ें, और उन्हें अलग करने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। इसके बाद, प्रतिक्रिया को बुझाने के लिए पूर्ण संस्कृति माध्यम के 5 एमएल जोड़ें।
  3. कक्ष के तापमान पर 3 मिनट के लिए 200 x ग्राम पर 15 एमएल ट्यूब और अपकेंद्रित्र पर सेल निलंबन स्थानांतरित करें।
  4. सुपरनेट को त्यागें और कोशिकाओं को एफबीएस और पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन युक्त ताजा माध्यम के 4 एमएल में फिर से खर्च करें। स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें।
  5. आगे की संस्कृति के लिए प्रति सेमी2 बीज 1 x 103 कोशिकाएं। उदाहरण के लिए, बीज ९.५ x 103 कोशिकाओं/अच्छी तरह से 6 अच्छी प्लेटों के लिए, या १.९ x 103 कोशिकाओं/अच्छी तरह से 24 अच्छी तरह से प्लेटों के लिए ।
  6. कोशिकाओं को रात भर इनक्यूबेट करने के लिए उन्हें पालन करने और ठीक करने की अनुमति है, तो 3 दिनों के लिए TGF-12 के साथ एमएस-1 कोशिकाओं को उत्तेजित । TGF-β रिसेप्टर kinase अवरोधक SB431542 (5 μM) 30 मिनट से पहले TGF-12 उत्तेजना जोड़ें । वाहन (डीएमएसओ) के साथ अन्य कोशिकाओं का इलाज करें।
    नोट: 4 एमएमएम एचसीएल में टीजीएफ-ए2 को भंग करें जिसमें 0.1% मानव गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए)। नियंत्रण समूह में टीजीएफ-12 के बिना लिगांड बफर की समान मात्रा जोड़ें। TGF-12 एकाग्रता विशिष्ट परख के लिए 0.1-1 एनजी/एमएल होने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । इसी आंकड़े में संकेत देखें ।
  7. 3 दिनों के बाद, उज्ज्वल क्षेत्र इमेजिंग (एक उल्टे माइक्रोस्कोप के साथ) के साथ सेल आकृति विज्ञान की जांच करें और एंडएमटी से संबंधित मार्कर परिवर्तनों का आकलन करने के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला (चरण 2 देखें) करें। जैविक ट्रिपलिट्स प्राप्त करने के लिए कम से कम तीन स्वतंत्र प्रयोग करें।

2. इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला

  1. ट्रिप्सिनाइज सुसंस्कृत एमएस-1 कोशिकाओं (चरण 1.2) और फिर 0.1% w/v जिलेटिन-लेपित 12 मिमी गोल कवर ग्लास पर 1.9 x 103 कोशिकाओं को फिर से 24-अच्छी प्लेट के तल पर रखा गया है।
  2. रातोंरात कोशिकाओं को खेती करने के बाद, 3 दिनों के लिए कोशिकाओं में TGF-ο2 (अंतिम एकाग्रता 1 एनजी/एमएल) जोड़ें । निगेटिव कंट्रोल के तौर पर लिगामेंट बफर युक्त मीडियम का इस्तेमाल करें।
  3. पेकैम-1 और Sm22α धुंधला प्रदर्शन करते हैं।
    1. 3 दिनों के लिए TGF-12 (या नियंत्रण) के साथ कोशिकाओं को उत्तेजित करने के बाद, माध्यम को हटा दें, और कोशिकाओं को 1x पीबीएस से धोएं।
    2. कोशिकाओं को ठीक करने के लिए कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से 4% फॉर्मलडिहाइड के 300 माइक्रोन जोड़ें और इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन के बाद 1x पीबीएस के साथ 3x धोएं।
    3. कोशिकाओं को पार करने के लिए कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से और 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करने के लिए 1x PBS में 0.1% ट्राइटन एक्स-100 के 300 μL जोड़ें। इनक्यूबेशन के बाद ट्राइटन एक्स-100 सॉल्यूशन निकालें और 1x पीबीएस के साथ 3x कोशिकाओं को धो लें।
    4. कमरे के तापमान पर 45 मिनट के लिए 1x पीबीएस में 3% गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) के साथ कोशिकाओं को ब्लॉक करें।
    5. प्राथमिक पेकैम-1 और Sm22α एंटीबॉडी को पतला करें जो 1x पीबीएस के साथ मुरीन प्रोटीन 1:500 को पहचानते हैं। फिर कमरे के तापमान पर 45 मिनट के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ तय कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
    6. 1x PBS के साथ 3x धोने के बाद, 1000x पतला माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट, गधा विरोधी चूहा Alexa ४८८ और बकरी विरोधी खरगोश Alexa ५९४ सहित, कमरे के तापमान पर ४५ मिनट के लिए ।
      नोट: धुंधला के दौरान प्रकाश से नमूनों की रक्षा करें।
    7. 1x PBS के साथ 3x को कुल्ला करने के बाद, कोशिकाओं के साथ वरीयता प्राप्त कवर ग्लास को नाभिक को दाग देने के लिए एक स्लाइड पर 4', 6-डायमिडिनो-2-फेनीलिंडोल (DAPI) वाले बढ़ते माध्यम की एक बूंद पर नीचे का सामना करें।
    8. कवर ग्लास की परिधि को पारदर्शी नेल पॉलिश के साथ ठीक करें और इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    9. एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के साथ प्रतिनिधि छवियों का अधिग्रहण करें। डीएपीआई, पेकैम-1 और Sm22α का पता लगाने के लिए क्रमशः 405 एनएम, 488 एनएम और 552 एनएम पर लेजर तरंगदैर्ध्य सेट करें। हर चैनल के लिए सभी तस्वीरें एक ही सेटिंग्स और एक्सपोजर टाइम के साथ ली गई थीं। जैविक ट्रिपलिट्स प्राप्त करने के लिए कम से कम तीन स्वतंत्र प्रयोग करें।

3. CRISPR/Cas9 संपादन का उपयोग कर घोंघा से बाहर दस्तक

  1. डिजाइन दो स्वतंत्र sgRNAs मुरीन घोंघालक्ष्यीकरण ।
    1. लक्षित जीन नाम और प्रजातियों के अनुसार ऑनलाइन टूल CHOPCHOP (https://chopchop.cbu.uib.no/) और कैस-ओफाइंडर (http://www.rgenome.net/cas-offinder/) का उपयोग करके डिजाइन sgRNAs।
    2. कैस-ओफ़फाइंडर (http://www.rgenome.net/cas-offinder/) और CHOPCHOP (http://chopchop.cbu.uib.no/) सहित दो स्वतंत्र एल्गोरिदम के साथ घोंघा को लक्षित डिजाइन किए गए एसजीआरएनए की ऑफ-टारगेट गतिविधि की भविष्यवाणी करें।
    3. सबसे कम ऑफ-एक्टिविटी के साथ दो एसजीआरएनए चुनें। BveI कट साइट के साथ दो पूरक sgRNA ओलिगो डिजाइन। सेंस ओलिगो 5 '-ACCG-3' के साथ शुरू होता है और एंटीसेंस ओलिगो 5'-AAAC-3' के साथ शुरू होता है।
    4. ओलिगोस को आगे के उपयोग के लिए व्यावसायिक रूप से संश्लेषित करने का आदेश देते हैं।
  2. बीवआई-डाइजेस्ट AA19 pLKO.1-puro.U6.sgRNA में पूरक गाइड आरएनए ओलिगोस क्लोन करें। बीव आई-स्टफर लेंटीविरायल वेक्टर प्लाज्मिड को उत्पन्न करने के लिएAA19 pLKO.1-घोंघा-sgRNA16।
    1. AA19 pLKO.1-puro.U6.sgRNA कटें । बीव मैं-स्टफर प्लाज्मिड BveI एंजाइम16के साथ । AA19 pLKO.1-puro.U6.sgRNA के 2 μg मिक्स । बीव आई-स्टफर प्लाज्मिड, 10x बफर ओ के 5 माइक्रोन, और 5 माइक्रोन बीईईडीएंजाइम और 50 माइक्रोन की कुल मात्रा तक पहुंचने के लिए बाँझ पानी जोड़ें।
    2. भंवर और संक्षेप में प्रतिक्रिया मिश्रण नीचे स्पिन। 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रिया को इनक्यूबेट करें।
    3. 1% एगर उठे जेल पर प्रतिक्रिया मिश्रण लोड करें और 1x ट्रिज़-एसीटेट-ईडीटीए (टीएई, में चलाएं 50x TAE स्टॉक: पानी में भंग ट्रिस बेस के 242 ग्राम, हिमनदों एसिटिक एसिड के 57.1 एमएल, 500 m EDTA (पीएच 8.0) समाधान के 100 मिलीएल, और एक अच्छा जुदाई प्राप्त होने तक कुल 1 एल बफर में पानी जोड़ें।
    4. जेल से रीढ़ के टुकड़े को काटें, निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार इसे जेल निष्कर्षण किट के साथ अलग करें (सामग्री की तालिकादेखें) और 40 माइक्रोन एल्यूशन बफर (ईबी) में रीढ़ की हड्डी को स्पष्ट करें।
    5. 100 पीएमओएल/माइक्रोन सेंस ओलिगो के 5 माइक्रोन और 100 पीएमओएल/μL एंटीसेंस ओलिगो के 1 माइक्रोन के साथ 1 एम ट्रिस-एचसीएल (पीएच 8.0) के 1 माइक्रोन के साथ मिलाएं और बाँझ पानी जोड़ें कुल 100 माइक्रोन तक पहुंचने के लिए ग्आरएनए ओलिगोस। मिश्रण को 100 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें, और फिर ट्यूबों को एल्यूमीनियम फॉयल से कवर करें। उसके बाद, धीरे-धीरे एक डालने के रूप में आगे के उपयोग के लिए कमरे के तापमान के समाधान को ठंडा करें।
    6. पूरक gRNA ओलिगोस और Bveमैं पचा रीढ़ की हड्डी को लिगेट करने के लिए, अलग Bveके 1 μL मिश्रण मैं AA19 pLKO.1-puro.U6.sgRNA.BveI-स्टफर बैकबोन और 2 μL डालने के 1:300) 10x T4 डीएनए ligase बफर और T4 liga dnase के 1 माइक्रोन के साथ, और कुल 20 माइक्रोल तक पहुंचने के लिए बाँझ पानी जोड़ें। संक्षेप में ट्यूब स्पिन, और आगे के उपयोग के लिए कमरे के तापमान पर 4 घंटे के लिए यह इनक्यूबेट ।
      नोट: लिगेशन करते समय, सुनिश्चित करें कि दो नियंत्रण समूह शामिल हैं। एक नियंत्रण समूह के लिए, अलग-थलग रीढ़ की 1 माइक्रोन, 10x T4 डीएनए लिगाज़ बफर के 2 माइक्रोन, और T4 डीएनए लिगाज़ के 1 माइक्रोन मिलाएं और कुल 20 माइक्रोन तक पहुंचने के लिए बाँझ पानी जोड़ें, लेकिन ओलिगो डीएनए के बिना। अन्य नियंत्रण समूह के लिए, अलग-अलग रीढ़ की 1 माइक्रोन और 10x T4 डीएनए लिगाज़ बफर के 2 माइक्रोन मिलाएं, और कुल 20 माइक्रोन तक पहुंचने के लिए बाँझ पानी जोड़ें, लेकिन एनील्ड ओलिगोस और T4 लिगाज़ के बिना। इन दोनों नियंत्रण बंधनों का उपयोग अगले परिवर्तन चरण में प्रतिक्रिया पृष्ठभूमि को निर्धारित करने के लिए किया जाता है और यह इंगित करता है कि लिगेशन कितना कुशल है।
  3. प्रतिक्रिया मिश्रण को सक्षम TOP10 ई. कोलाईमें बदल दें ।
    1. सक्षम TOP10 ई. कोलाईलीजिए । -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से कोशिकाओं, और उन्हें बर्फ पर गल.
    2. सक्षम कोशिकाओं के 50 माइक्रोन में 2 μl का लिगाशन मिश्रण जोड़ें और ट्यूब को 30 मिनट तक बर्फ पर रखें।
    3. गर्मी-30 एस के लिए 42 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूब शॉक। 2 मिनट के लिए बर्फ पर ट्यूब रखो।
    4. मिश्रण में ताजा lysogeny शोरबा (एलबी) माध्यम के 950 μL जोड़ें और 60 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर तेजी से हिला।
    5. नीचे स्पिन और एक गर्म एम्पीसिलिन (१०० μg/mL) प्रतिरोध पौंड प्लेट पर कोशिकाओं को थाली । रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर थाली को इनक्यूबेट करें।
  4. प्लाज्मिड में जीआरएनए ओलिगोस के सफल सम्मिलन को सत्यापित करें।
    1. एम्पीसिलिन (100 माइक्रोग्राम/एमएल) के 1 एमएल में प्लेट पर 3-5 कॉलोनियां चुनें जिसमें एलबी मीडियम होता है और 30 डिग्री सेल्सियस पर रात भर हिलाएं।
    2. निर्माता के प्रोटोकॉल(सामग्री की तालिका)के अनुसार प्लाज्मिड डीएनए को एक प्लाज्मिड किट के साथ अलग करें और इसे GRNA ओलिगो के सफल प्रविष्टि को सत्यापित करने के लिए U6 प्रमोटर प्राइमर 5'-GAGGGGGCCCCTTCCCATGATT-3 के साथ अनुक्रम करें।

4. घोंघा नॉकआउट एमएस-1 कोशिकाओं उत्पन्न

  1. Cas9 या घोंघा-लक्षित gRNAs ले जाने वाले लेंटीवायरल कणों का उत्पादन करें।
    1. डीएमईएम में कल्चर एचईके 293T कोशिकाओं में 10% भ्रूण गोजातीय सीरम और 100 यू/एमएल पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन में 14.5 सेमी व्यंजन (या T75 फ्लास्क) एक इनक्यूबेटर (5% सीओ2, 37सी डिग्री) में शामिल हैं।
    2. जीन प्लाज्मिड, AA19 pLKO.1-घोंघा-sgRNA या PLV-Cas9 17 प्लाज्मिड को लक्षित करने के9.9 माइक्रोग्राम मिलाएं, साथ में हेल्पर प्लाज्मिड 3.5 माइक्रोन पीसीएमवी-वीएसवीजी (वेसिकुलर स्टोमेटाइटिस वायरस के जी प्रोटीन को एन्कोडिंग करें, वीएसवी-जी), सीरम मुक्त माध्यम के 500 माइक्रोन में रेव-उत्तरदायी तत्व प्लाज्मिड पीएमडीएलजी-आरईआरई (एन्कोडिंग गैग एंड पोल) के 6.6 माइक्रोग्राम और पीआरएसवी-रेव (एन्कोडिंग रेव) के 5.0 माइक्रोग्राम। सीरम मुक्त माध्यम के 500 माइक्रोन में पॉलीथीनमाइन (पीई) (2.5 मिलीग्राम/एमएल) के 50 माइक्रोल को रेशेदार करें। धीरे-धीरे ऊपर और नीचे पाइपिंग करके प्लाज्मिड और पी तैयारी मिलाएं। कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए मिश्रण को इनक्यूबेट करें।
    3. ट्रांसफेक्ट एचईके 293T कोशिकाओं को 14.5 सेमी व्यंजन (या T75 फ्लैस्क) में चरण 4.1.2 से 80% कॉन्फ्ल्यूरेंट कोशिकाओं में जोड़कर, जिसमें 10% एफबीएस और 100 यू/एमएल पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टॉमीसिन के साथ डीएमईएम माध्यम होता है। HEK293T कोशिकाओं का उपयोग इसलिए किया जाता है क्योंकि वे आसानी से संक्रमित होते हैं औरवायरस 18के उच्च स्तर उत्पन्न करते हैं।
    4. संक्रमित एचईके 293T कोशिकाओं को माइक्रोबायोलॉजिकल और बायोमेडिकल प्रयोगशाला (बीएमबीएल) में जैवसेफ्टी में स्थानांतरित करने के लिए उन्हें 24 घंटे के लिए संस्कृति ।
    5. एक बीएमबीएल प्रयोगशाला में, एचईके 293T कोशिकाओं से ट्रांसफैक्शन माध्यम को 12 मिलीलीटर ताजा पूर्ण डीएमईएम के साथ प्रतिस्थापित करें जिसमें एफबीएस और पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन शामिल हैं। 24 घंटे के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
    6. 20 एमएल सिरिंज और 0.45 माइक्रोन फिल्टर के साथ माध्यम को इकट्ठा करें और फ़िल्टर करें। वातानुकूलित माध्यम को 15 एमएल पॉलीप्रोपाइलीन ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    7. एक अतिरिक्त 24 घंटे के लिए HEK 293T संस्कृति पकवान और संस्कृति के लिए FBS और पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन युक्त ताजा पूर्ण DMEM के 12 एमएल जोड़ें ।
    8. 20 एमएल सिरिंज और 0.45 माइक्रोन फिल्टर के साथ माध्यम को इकट्ठा करें और फ़िल्टर करें। वातानुकूलित माध्यम को 15 एमएल पॉलीप्रोपाइलीन ट्यूब में स्थानांतरित करें। आगे के उपयोग के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर 1 एमएल एलिकोट के रूप में लेंटीवायरल कणों युक्त मध्यम स्टोर करें।
  2. पीएलवी-Cas9 वायरस के साथ एमएस-1 कोशिकाओं को संक्रमित करें।
    1. बीज 1 x 105 एमएस-1 कोशिकाओं प्रति अच्छी तरह से एक 6 अच्छी तरह से थाली वायरस संक्रमण से पहले 24 घंटे के लिए थाली प्लेट में ।
    2. 37 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में पीएलवी-Cas9 वायरस के जमे हुए aliquots गल।
    3. ताजा डीएमईएम माध्यम के 1 मिलीलीटर के साथ वायरस माध्यम के 1 मिलीलीटर मिलाएं जिसमें एफबीएस और पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन शामिल हैं। संक्रमण दक्षता बढ़ाने के लिए माध्यम (10 μg/l के रूप में अंतिम एकाग्रता) में पॉलीब्रेन जोड़ें।
    4. माध्यम को 6-वेल प्लेट से निकालें और इसे वायरस/पॉलीब्रेन मिक्स मीडियम से बदलें और कल्चर 24 एच के लिए इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को 24 घंटे के बाद संक्रमण के लिए, माध्यम को ताजा माध्यम से प्रतिस्थापित करें और एक और 24 घंटे के लिए कोशिकाओं को संस्कृति ।
      नोट: हमेशा एक नियंत्रण समूह के रूप में एक असंक्रमित अच्छी तरह से रखें ।
    5. संक्रमित समूह और नियंत्रण समूह से माध्यम को एस्पिरेट करें और इसे डीएमईएम माध्यम से 4 μg/mL ब्लास्टिसिडिन के साथ प्रतिस्थापित करें ।
    6. प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर पर लौटाएं और कोशिकाओं को 1 सप्ताह तक संस्कृति दें। ब्लास्टिसिडिन के प्रभाव के कारण असंक्रमित कोशिकाएं मर जाएंगी। जीवित कोशिकाओं को विभाजित करें जब वे 80% सेल पूर्णता तक पहुंचते हैं और ब्लास्टिसिडिन चयन जारी रखते हैं।
    7. Cas9 के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग करके पश्चिमी ब्लॉटिंग द्वारा एमएस-1 कोशिकाओं में Cas9 की अभिव्यक्ति की पुष्टि करें (Cas9 का आणविक वजन लगभग 160 केडीए है)।
  3. दो स्वतंत्र जीआरएनए लेंटीवायरस के साथ पीएलवी-Cas9 एमएस-1 कोशिकाओं को अलग से संक्रमित करें।
    1. बीज 1 x 105 पीएलवी-Cas9 एमएस-1 कोशिकाओं को अच्छी तरह से संक्रमण से पहले 24 घंटे के लिए एक 6 अच्छी तरह से थाली में ।
    2. दो gRNA लेंटीवायरस के साथ कोशिकाओं को अलग से संक्रमित करने के लिए 4.2 में वर्णित के रूप में एक ही प्रोटोकॉल का पालन करें।
    3. GRNA वायरस के साथ संक्रमण के 24 घंटे के बाद, माध्यम और संस्कृति एक और 24 घंटे के लिए कोशिकाओं को ताज़ा ।
    4. माध्यम को डीएमईएम के साथ 1 μg/mL puromycin के साथ बदलें । प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर पर लौटाएं और कोशिकाओं को 1 सप्ताह तक संस्कृति दें। सुनिश्चित करें कि असंक्रमित कोशिकाएं पूरी तरह से मर चुकी हैं। कोशिकाओं को विभाजित करें जब वे 80% पूर्णता तक पहुंचते हैं और प्यूरोमाइसिन चयन जारी रखते हैं।
    5. घोंघा के खिलाफ एक एंटीबॉडी का उपयोग कर पश्चिमी दाग द्वारा एमएस-1 कोशिकाओं में घोंघा के नॉक आउट की पुष्टि करें (घोंघा का आणविक वजन लगभग 35 केडीए है)।

Representative Results

TGF-12 EndMT लाती है और एमएस-1 एंडोथेलियल कोशिकाओं में घोंघा अभिव्यक्ति को उत्तेजित करता है
टीजीएफ-β एंडएमटी को प्रेरित करने की सबसे बड़ी क्षमता के साथ साइटोकिन्स में से एक है। 3 दिनों के लिए TGF-ο2 (1 एनजी/एमएल) के साथ एमएस-1 कोशिकाओं के इलाज के बाद, एंडोथेलियल एमएस-1 कोशिकाओं को अपने कोबलस्टोन की तरह संरचना खो देते है और धुरी के आकार का mesenchymal की तरह कोशिकाओं में अंतर(चित्रा 1A)15। सेल फेनोटाइपिक परिवर्तनों को प्रेरित करने में TGF-ο2 की भूमिका को और सत्यापित करने के लिए, हमने टीजीएफ-2 उत्तेजना19से पहले छोटे अणु एक्टिविन रिसेप्टर-जैसे किनेज (ALK) 4/ALK5/ALK7 अवरोधक SB431542 के साथ कोशिकाओं का पूर्व-इलाज किया । SB431542 पूरी तरह से tGF-ο2-प्रेरित सेल आकृति विज्ञान परिवर्तन(चित्रा 1A)को निरस्त कर दिया। टीएमटीएस-2 प्रेरित एंडएमटी प्रक्रिया को एंडएमटी से संबंधित मार्कर की अभिव्यक्ति में परिवर्तनों का अध्ययन करके आगे की जांच की गई। जैसा कि चित्रा 1 Bमें दिखाया गया है, टीजीएफ-ए2 उत्तेजना के बाद एंडोथेलियल प्रोटीन पेकैम-1 में शक्तिशाली रूप से कमी आई थी, जबकि मेसेंचिमल कारक Sm22α को टीजीएफ-215द्वारा गहराई से उपनियमित किया गया था। ये डेटा इस धारणा के अनुरूप हैं कि TGF-12 ने एमएस-1 कोशिकाओं में एंडएमटी को ट्रिगर किया। इसके बाद, हमने घोंघा और स्लग अभिव्यक्ति पर टीजीएफ-2 के प्रभावों की जांच की। जैसा कि चित्रा 1Cमें दिखाया गया है, घोंघा को टीजीएफ-ए2 द्वारा स्पष्ट रूप से बढ़ाया गया था, जबकि स्लग अभिव्यक्ति एमएस-1 कोशिकाओं15में टीजीएफ-ए2 से प्रभावित नहीं थी। तीन स्वतंत्र प्रयोगों से घोंघा अभिव्यक्ति का मात्राकरण चित्र 1 डीमें दिखाया गया है ।

एमएस-1 एंडोथेलियल कोशिकाओं में CRISPR/Cas9 द्वारा घोंघा की कमी
के रूप में घोंघा TGF-12 द्वारा प्रेरित किया गया था और संभावना TGF-12 मध्यस्थता EndMT में शामिल है, हम CRISPR/Cas9 जीन संपादन का प्रदर्शन किया आनुवंशिक रूप से एमएस-1 कोशिकाओं में घोंघा अभिव्यक्ति समाप्त । हमने परिकल्पना की है कि घोंघा की कमी TGF-12-प्रेरित EndMT को बाधित करने के लिए पर्याप्त होगा । जैसा कि चित्रा 2 एमें दिखाया गया है, हमने दो चरणों में घोंघा नॉकआउट कोशिकाओं को उत्पन्न किया। सबसे पहले, Cas9 को एक Cas9 व्यक्त लेंटीवायरस के साथ एमएस-1 कोशिकाओं को संक्रमित करके व्यक्त किया गया था। चूंकि पीएलवी-Cas9 निर्माण में ब्लास्टिसिडिन प्रतिरोध कैसेट है, इसलिए हमने ब्लास्टिसिडिन प्रतिरोधी कोशिकाओं(चित्रा 2डी)में पश्चिमी दाग विश्लेषण द्वारा Cas9 की अभिव्यक्ति की जांच की। इसके बाद, हमने एसजीआरएन की शुरुआत की जिसने विशेष रूप से घोंघा को अपनी प्रोटीन अभिव्यक्ति को बाधित करने के लिए लक्षित किया । यह प्रक्रिया एए 19 पीएलको.1-घोंघा-एसजीआरएनए निर्माण को ले जाने वाले लेंटीवायरल कणों के साथ संक्रमण द्वारा भी की गई थी, जिसमें एक प्यूरोमाइसिन अभिव्यक्ति कैसेट शामिल है। Cas9-एक्सप्रेसिंग कोशिकाओं को फिर से जीएनए से संक्रमित किया गया था जिसमें लेंटीवायरस होता था और आगे प्यूरोमाइसिन के साथ चुना जाता था। मुरीन घोंघा को लक्षित करने वाले दो पूरक sgRNA ओलिगोस को अनुमानित कम ऑफ-टारगेट गतिविधि(चित्रा 2बी, सी)के साथ डिजाइन किया गया था। एमएस-1 कोशिकाओं को व्यक्त करते हुए Cas9 में दो स्वतंत्र घोंघा sgRNAs शुरू करने के बाद, घोंघा प्रोटीन अभिव्यक्ति(चित्रा 2D)15निरस्त किया गया था ।

घोंघा की कमी एमएस-1 कोशिकाओं में TGF-12-प्रेरित EndMT रोकता है
TGF-12-मध्यस्थता EndMT में घोंघा के समारोह का प्रदर्शन करने के लिए, हम घोंघा समाप्त कोशिकाओं में एक EndMT परख प्रदर्शन किया और यह माता पिता के एमएस-1 कोशिकाओं के साथ तुलना में । जैसा कि चित्रा 3 एमें दिखाया गया है, घोंघा का नॉकआउट एमएस-1 कोशिकाओं15में टीजीएफ-ए2 द्वारा संचालित फाइब्रोब्लास्ट जैसी सेल आकृति विज्ञान को बाधित करने के लिए पर्याप्त था। इसके अलावा, पेकैम-1 में टीजीएफ-ए2-मध्यस्थता गिरावट और Sm22α की वृद्धि पूरी तरह से घोंघा-समाप्त एमएस-1 कोशिकाओं में अवरुद्ध हो गई थी। संक्षेप में, हमने दिखा दिया कि एमएस-1 कोशिकाओं(चित्रा 3B)15में टीजीएफ-2-मध्यस्थता एंडएमटी के लिए घोंघा महत्वपूर्ण है।

Figure 1
चित्रा 1। TGF-12 एमएस-1 कोशिकाओं में EndMT और घोंघा अभिव्यक्ति लाती है। A. सेल आकृति विज्ञान पर टीजीएफ-ए2 और/या टीजीएफ-β प्रकार आई रिसेप्टर किनेज़ अवरोधक एसबी-४३१५४२ के प्रभाव । TGF-1 ng/mL) और/या एसबी-431542 (एसबी, 5 माइक्रोन, TGF-ο2 से पहले 30 मिनट प्रशासित) के साथ उपचार पर एमएस-1 कोशिकाओं के ब्राइटफील्ड छवियों 2 दिनों के लिए । स्केल बार 200 माइक्रोन बी का प्रतिनिधित्व करता है। एमएस-1 कोशिकाओं में पेकैम-1 (हरा) और Sm22α (लाल) का इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला 3 दिनों के लिए टीजीएफ-12 (1 एनजी/एमएल) युक्त मध्यम में सुसंस्कृत। नाभिक नीले रंग (DAPI) में कल्पना कर रहे हैं। स्केल बार: 50 माइक्रोन सी पश्चिमी दाग के साथ पूरे सेल lysate TGF-1 2 उत्तेजित एमएस-1 कोशिकाओं। घोंघा की अभिव्यक्ति, लेकिन स्लग नहीं, TGF-12 उत्तेजना द्वारा बढ़ाया गया था, जैसा कि पहले एमए एट अल15में रिपोर्ट किया गया था। डी. तीन स्वतंत्र पश्चिमी दाग प्रयोगों से परिणामों को एकीकृत करके घोंघा अभिव्यक्ति का मात्राकरण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2। CRISPR-Cas9 जीन संपादन द्वारा घोंघा की कमी। A. घोंघा नॉकआउट कोशिकाओं को उत्पन्न करने के तरीके को दर्शाती योजना। बीएसडी: ब्लास्टिसिडिन। पुरो: प्यूरोसिन। B. दो स्वतंत्र sgRNAs के ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स ने चोपचओपी (http://chopchop.cbu.uib.no/) और कैस-ओफइंडर (http://www.rgenome.net/cas-offinder/) का उपयोग करके घोंघा को लक्षित किया । सी. कैस-ओफ़इंडर (http://www.rgenome.net/cas-offinder/) का उपयोग करके घोंघा के लिए दो जीआरएएनए की भविष्यवाणी की गई ऑफ-टारगेट गतिविधि। डी. जंगली प्रकार (डब्ल्यूटी) और Cas9-overexpressed एमएस-1 में Cas9 और घोंघा अभिव्यक्ति पश्चिमी दाग विश्लेषण द्वारा मापा । ई. एमएस-1 कोशिकाओं में दो स्वतंत्र gRNAs के साथ घोंघा के नॉकआउट के रूप में पश्चिमी दाग विश्लेषण द्वारा मापा । हम एमए एट अल15में इसी तरह के परिणाम की सूचना दी । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3। घोंघा की आनुवंशिक कमी एमएस-1 कोशिकाओं में TGF-1-प्रेरित EndMT रोकता है । A. वाइल्डटाइप (डब्ल्यूटीई, अपर पैनल) और घोंघा (लोअर पैनल) कोशिकाओं में 3 दिनों के लिए TGF-1 (0.1 एनजी/एमएल) के साथ उपचार पर एमएस-1 कोशिकाओं की ब्राइटफील्ड छवियां। स्केल बार 3 दिनों के लिए टीजीएफ-ए2 (1 एनजी/एमएल) युक्त मध्यम में सुसंस्कृत एमएस-1 कोशिकाओं के पेकैम-1 (हरे), Sm22α (लाल) और नाभिक (नीला) के लिए 200 μm. बी इम्यूनोफ्लोरेसेंट धुंधला का प्रतिनिधित्व करता है। पेकैम-1 की घोंघा की कमी TGF-12-प्रेरित कमी और Sm22α अभिव्यक्ति की वृद्धि। स्केल बार एमएस-1 कोशिकाओं में टीजीएफ-β-प्रेरित एंडएमटी पर घोंघा नॉकआउट के प्रभाव का 50 माइक्रोन सी योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व का प्रतिनिधित्व करता है। टीजीएफ-β स्माड पाथवे के माध्यम से फॉस्फोरीटिंग Smad2/3 द्वारा घोंघा की अभिव्यक्ति को उत्तेजित करता है और आगे EndMT ड्राइव करता है। CRISPR/Cas9 आधारित जीन संपादन abrogated TGF-β-मध्यस्थता EndMT का उपयोग कर घोंघा दस्तक । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

इस प्रक्रिया को मॉडुलन करने और एंडएमटी से संबंधित बीमारियों को लक्षित करने के लिए एंडएमटी के तंत्र को समझना महत्वपूर्ण है। यहां, हमने कोशिकाओं से घोंघा के CRISPR/Cas9-मध्यस्थता स्थिर जीन की कमी का प्रदर्शन करके, टीजीएफ-β-प्रेरित एंडएमटी परख करने और टीजीएफ-β-ट्रिगर एंडएमटी में एंडएमटी-टीएफ घोंघा की भूमिका से पूछताछ करने के तरीकों का वर्णन किया । CRISPR/Cas9 दृष्टिकोण का उपयोग कर घोंघा की कमी सफलतापूर्वक एमएस-1 कोशिकाओं(चित्रा 3C)में TGF-12 संचालित EndMT निरस्त । एंडएमटी पर टीजीएफ-β जैसे किसी भी साइटोकिन्स के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए, ईसीएस को साइटोकिन्स के संपर्क में किया गया था और फिर एंडएमटी की घटना का आकलन रूपात्मक परिवर्तनों और एंडोथेलियल और मेसेन्चिमल मार्कर अभिव्यक्ति के अनुसार किया गया था। TGF-12 दृढ़ता से एमएस-1 कोशिकाओं में EndMT प्रेरित प्रतिलेखन कारक घोंघा की अभिव्यक्ति में एक मजबूत वृद्धि के साथ। टीजीएफ-β द्वारा प्रेरित एंडएमटी-टीएफएस प्रजातियों या ऊतक-विशिष्ट एंडोथेलियल सेल प्रकार के अनुसार भिन्न हो सकता है। उदाहरण के लिए, हमने देखा कि घोंघा लेकिन स्लग को एमएस-1 कोशिकाओं में टीजीएफ-β द्वारा काफी हद तक उपनियमित किया गया था, जबकि मानव गर्भनाल नस एंडोथेलियल कोशिकाओं (एचयूवीसी) में, टीजीएफ-β20के संपर्क में आने के बाद घोंघा और स्लग दोनों बढ़ जाते हैं।

हमने सेल आकृति विज्ञान परिवर्तनों की जांच करके और फिर एंडएमटी से संबंधित मार्कर अभिव्यक्ति में परिवर्तनों की जांच करके दो तरीकों से एंडएमटी प्रक्रिया की सीमा का आकलन किया। 3 दिनों के लिए टीजीएफ-β एक्सपोजर के बाद, कोशिकाओं को लगातार रूपात्मक विविधताओं और एंडएमटी से संबंधित मार्कर की अभिव्यक्ति में परिवर्तन के साथ एंडएमटी से गुजरना पड़ा। हम यहां प्रदर्शन इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला के अलावा, मार्कर विविधताओं को प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर पर पश्चिमी ब्लॉटिंग द्वारा या जीन स्तर21पर क्यूआरटी-पीसीआर (रीयल-टाइम क्वांटिटेटिव रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन पीसीआर) द्वारा भी निगरानी की जा सकती है। इस प्रोटोकॉल में हमने जो दो समय और लागत-बचत विधियों को दिखाया है, उसके अलावा, एंडएमटी की जांच करने के अन्य तरीके हैं। उदाहरण के लिए, इलाज और नियंत्रण कोशिकाओं के बीच एंडोथेलियल-और मेसेंचिमल से संबंधित जीन के अभिव्यक्ति स्तर की तुलना करने के लिए ट्रांसक्रिप्टोम विश्लेषण (आरएनए अनुक्रमण या क्यूपीसीआर द्वारा) प्रदर्शन करना एंडएमटी22, 23का सटीक आकलन कर सकता है। इसके अलावा, एंडएमटी में अक्सर बाधा कार्य का स्थिर नुकसान होता है, जिसका मूल्यांकन बाधा स्पेक्ट्रोस्कोपी24द्वारा किया जा सकता है। इसके अलावा, एंडएमटी-व्युत्पन्न कोशिकाओं द्वारा स्टेम सेल जैसी संपत्तियों के अधिग्रहण के अतिरिक्त प्रमाण की जांच की जा सकती है। उदाहरण के लिए, विशिष्ट संस्कृति स्थितियों के तहत, एंडएमटी मेसेनचिमल जैसी कोशिकाओं को ऑस्टियोब्लास्ट, कोंड्रोसाइट्स, एडिपोसाइट्स या (मायो) फाइब्रोब्लास्ट में और अलग किया जा सकता है। इसलिए, मेसोडर्म वंश (यानी, जीन अभिव्यक्ति और मैट्रिक्स धुंधला) से संबंधित विभिन्न कोशिका प्रकारों में भेदभाव की पुष्टि करने के लिए अतिरिक्त विश्लेषण एंडएमटी-व्युत्पन्न कोशिकाओं की बहुपेंट प्रकृति का प्रदर्शन करने के लिए उपयोगी है। अंत में, एंडएमटी मूल्यांकन विधियां इन विट्रो अध्ययनों तक सीमित नहीं हैं, लेकिन वीवो में या पूर्व वीवो अंगों में एंडएमटी और कुछ बीमारियों के बीच संबंध की जांच करने के लिए एक्सपेरिमेंट किया जा सकता है। इस अर्थ में, एंडोथेलियल-विशिष्ट वंश ट्रेसिंग रणनीतियों का उपयोग मोटे तौर पर एंडएमटी से संबंधित अनुसंधान25तक बढ़ाया गया है।

एंडएमटी के दौरान घोंघा की भूमिका की जांच करने के लिए, इस अध्ययन में CRISPR/Cas9 जीन संपादन का उपयोग इस जीन को खटखटाने के लिए किया गया था । आंकड़ों से पता चला है कि TGF-12 घोंघा कमी एमएस-1 कोशिकाओं में EndMT मध्यस्थता करने में विफल रहा है । इस अवलोकन से पता चला कि एमएस-1 कोशिकाओं में टीजीएफ-12 प्रेरित एंडएमटी के लिए घोंघा आवश्यक है। हमने घोंघा को लक्षित करने के लिए Cas9 के लिए विशिष्ट एसजीआरएनए शुरू करने के लिए एक स्वतंत्र U6-चालित sgRNA अभिव्यक्ति कैसेट का उपयोग किया। इस विधि के अलावा, भागा एट अल.26 ने Cas9 पाड़ में sgRNA ओलिगोस अनुक्रम क्लोनिंग के लिए एक और रणनीति का वर्णन किया ताकि Cas9 और gRNAs दोनों युक्त निर्माण उत्पन्न किया जा सके। उभरते उपन्यास दृष्टिकोण CRISPR/Cas के लिए अतिरिक्त कार्यों को शामिल करने की अनुमति देते हैं । उदाहरण के लिए, Cas927व्यक्त कोशिकाओं में अधिक sgRNAs वितरित करके डबल या ट्रिपल नॉकआउट प्राप्त किया जा सकता है । इंजीनियर Cas13 प्रोटीन लक्ष्य और अंतर्जात डीएनए28को बाधित किए बिना आरएनए अणुओं को पचा । CRISPR/Cas के साथ जीन बाहर दस्तक देने के अलावा, लघु हेयरपिन RNAs (shRNAs) विकल्प के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है नीचे स्थिर लक्षित जीन अभिव्यक्ति29दस्तक । सभी CRISPR/Cas जीन संपादन विधियों के लिए, ऑफ-टारगेट दरार को हमेशा ध्यान में रखा जाना चाहिए । इसके अलावा, छोटे हस्तक्षेप आरएनए (siRNAs) क्षणिक रूप से जीन अभिव्यक्ति मौन और सिरना एकाग्रता सेल डिवीजन30के साथ पतला है । ये दोनों तरीके आंशिक रूप से लक्षित जीन अभिव्यक्ति को दबाते हैं । इसके विपरीत, एंडएमटी/ईएमटी31के दौरान जीन फंक्शन को सत्यापित करने के लिए एक्टोपिक जीन एक्सप्रेशन का भी इस्तेमाल किया जाता है । यह दृष्टिकोण यह निर्धारित कर सकता है कि किसी जीन का अपरेगुलेशन एंडएमटी प्रतिक्रिया प्राप्त करने के लिए पर्याप्त है या नहीं। इसलिए, वर्तमान में कई तकनीकी रणनीतियां हैं जिनका उपयोग एंडएमटी के संभावित नियामकों की पहचान करने और सत्यापित करने के लिए किया जा सकता है। इसके अलावा, एंडएमटी से संबंधित नियामकों की पहचान और व्यापक विश्लेषण में ट्रांसक्रिप्टोमिक विश्लेषण एक अच्छा विकल्प हो सकता है। हम एंडएमटी के मॉड्यूलेशन की जांच करने के लिए विभिन्न पूरक दृष्टिकोणों का उपयोग करने की सलाह देते हैं।

संक्षेप में, हमने उन कारकों की पहचान करने के लिए एक कार्यप्रवाह पेश किया जो टीजीएफ-β-प्रेरित एंडएमटी के दौरान कार्यात्मक भूमिकाएं निभा सकते हैं। इस विधि का उपयोग यह अध्ययन करने के लिए भी किया जा सकता है कि क्या अन्य उत्तेजनाएं (यानी, साइटोकिन्स, विकास कारक, यांत्रिक उत्तेजनाएं, सेल-सेल इंटरैक्शन) एंडएमटी को संशोधित कर सकते हैं, और अन्य उत्तेजनाओं के साथ टीजीएफ-β का परस्पर क्रिया। इसके अलावा, हमने CRIPSR/Cas जीन संपादन का उपयोग करके एक दृष्टिकोण पर प्रकाश डाला ताकि यह स्पष्ट किया जा सके कि क्या टीजीएफ-β-प्रेरित एंडएमटी के लिए एक निश्चित जीन की आवश्यकता है । इस पद्धति को समझाने के लिए, हमने एमएस-1 कोशिकाओं में मजबूत एंडएमटी प्रेरक टीजीएफ-ए2 का उपयोग किया, लेकिन प्रोटोकॉल को अन्य साइटोकिन्स और अन्य सेल प्रकारों के अनुकूल बनाया जा सकता है। हम उम्मीद करते हैं कि वर्णित यह विस्तृत प्रोटोकॉल भविष्य के एंडएमटी से संबंधित अध्ययनों के लिए एक कदम पत्थर के रूप में काम करेगा।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

अनुसंधान CGC.NL और नीदरलैंड कार्डियो वैस्कुलर रिसर्च इनिशिएटिव द्वारा समर्थित किया गया था: डच हार्ट फाउंडेशन, डच फेडरेशन ऑफ यूनिवर्सिटी मेडिकल सेंटर्स, नीदरलैंड ऑर्गनाइजेशन फॉर हेल्थ रिसर्च एंड डेवलपमेंट, और रॉयल नीदरलैंड एकेडमी ऑफ साइंसेज ग्रांट को Phaedra-impact (http://www.phaedraresearch.nl) से सम्मानित किया गया । जेएम को चीनी छात्रवृत्ति परिषद द्वारा समर्थित किया जाता है । जीएसडी को एएफएम-टेलीथॉन [22379], एफओपी इटालिया से ट्रैम्पोलिन अनुदान और ला फंडासिओ ला मार्टो डी टीवी3 (#202038) से अनुदान द्वारा समर्थित किया जाता है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.45 μm filter Pall Corporation, USA 4614
10× T4 DNA ligase buffer Thermofisher Scientific, USA B69
12 mm round glass slice Knittel Glass,Germany VD10012Y1A.01
20 mL syringe BD Eclipse, USA 300629
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Vector Laboratories, USA H-1200 VECTASHIELD Antifade Mounting Media
AA19_PLKO vector Dr. M Gonçalves, Leiden University Medical Center, Netherlands Gift
Ampicillin Serva Electrophoresis, USA 1339903
Anti-Mouse IgG GE Healthcare, USA NA931
Anti-Rabbit IgG Cell signaling, USA 7074
Agarose Roche, Switzerland 11388991001
Blasticidin Invitrogen, USA R21001
Buffer O (10X) Thermofisher Scientific, USA BO5
BveI (Bspm1) Thermofisher Scientific, USA ER 1741
Confocal microscope Leica Microsystems, Germany SP8
DMEM  Thermo Fisher Scientific, USA 11965092
Donkey anti-rat Alexa 488  Invitrogen, USA A21208
FBS  Thermo Fisher Scientific, USA 16000044
Formaldehyde  Thermo Fisher Scientific, USA 28908
Inverted microscope Leica Microsystems, Germany DMi8
Goat anti-rabbit Alexa 594  Invitrogen,USA A11012
LabNed Plasmid kit LabNed, USA LN2400004
MS-1 cell line American Type Culture Collection (ATCC)
Nail polish HEMA, Netherlands Transparent
Pecam-1 antibody  Becton Dickinson,USA 553370
PEI Polysciences, USA 23966-1
PLV-Cas9 plasmid Sigma-Aldrich, USA Cas9BST-1EA
Puromycin Sigma-Aldrich, USA P9620
QIAquick gel extraction kit Qiagen, Germany 28706
Sm22a antibody  Abcam, UK ab14106
Snail Cell signaling, USA 3879
T4 DNA ligase Thermofisher Scientific, USA EL 0014
TC20 automated Cell Counter Bio-Rad, USA 1450102
Human TGF-β2 Joachim Nickel, University of Wurzburg Gift Other commercial recommendation: 302-B2, R&D systems
Triton X-100 Merck, USA 1086031000
SB431542 Tocris Bioscience, UK 1614
Tris Roche, Switzerland 11814273001

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References

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जीव विज्ञान अंक १६८ CRISPR/Cas9 नॉक आउट लेंटीवायरस इम्यूनोफ्लोरेसेंस एमएस-1 घोंघा स्लग
टीजीएफ-β-मध्यस्थता एंडोथेलियल से मेसेंचिमल ट्रांजिशन (एंडएमटी) और CRISPR/Cas9 जीन संपादन का उपयोग करके एंडएमटी प्रभावकर्ताओं का कार्यात्मक मूल्यांकन
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Ma, J., van der Zon, G.,… More

Ma, J., van der Zon, G., Sanchez-Duffhues, G., ten Dijke, P. TGF-β-mediated Endothelial to Mesenchymal Transition (EndMT) and the Functional Assessment of EndMT Effectors using CRISPR/Cas9 Gene Editing. J. Vis. Exp. (168), e62198, doi:10.3791/62198 (2021).

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