Summary
We beschrijven methoden om TGF-β2-geïnduceerde EndMT in endotheelcellen te onderzoeken door celmorfologieveranderingen te observeren en de expressie EndMT-gerelateerde markerveranderingen te onderzoeken met behulp van immunofluorescentiekleuring. CRISPR/Cas9 genbewerking werd beschreven en gebruikt om het gen dat codeert voor Snail uit te putten om zijn rol in TGF-β2-geïnduceerde EndMT te onderzoeken.
Abstract
Als reactie op specifieke externe signalen en de activering van bepaalde transcriptiefactoren, kunnen endotheelcellen differentiëren in een mesenchymal-achtig fenotype, een proces dat endotheel wordt genoemd voor mesenchymale overgang (EndMT). Nieuwe resultaten hebben gesuggereerd dat EndMT oorzakelijk verband houdt met meerdere menselijke ziekten, zoals fibrose en kanker. Bovendien kunnen endotheliale mesenchymale cellen worden toegepast in weefselregeneratieprocedures, omdat ze verder kunnen worden onderscheiden in verschillende celtypen (bijv. osteoblasten en chondrocyten). De selectieve manipulatie van EndMT kan dus klinisch potentieel hebben. Net als epitheliaal-mesenchymale overgang (EMT), kan EndMT sterk worden geïnduceerd door de uitgescheiden cytokine transformerende groeifactor-bèta (TGF-β), die de expressie van zogenaamde EndMT transcriptiefactoren (EndMT-TFs), waaronder Snail and Slug, stimuleert. Deze EndMT-TF's vervolgens omhoog- en omlaagreguleren de niveaus van respectievelijk mesenchymale en endotheeleiwitten. Hier beschrijven we methoden om TGF-β-geïnduceerde EndMT in vitro te onderzoeken, inclusief een protocol om de rol van bepaalde TF's in TGF-β-geïnduceerde EndMT te bestuderen. Met behulp van deze technieken leveren we bewijs dat TGF-β2 EndMT stimuleert in muriene pancreasmicrovasculaire endotheelcellen (MS-1-cellen), en dat de genetische uitputting van Snail met behulp van geclusterde regelmatig interspaced korte palindromische herhalingen (CRISPR)/CRISPR-geassocieerd eiwit 9 (Cas9)-gemedieerde genbewerking dit fenomeen in de weg staat. Deze aanpak kan dienen als een model om potentiële modulatoren van endotheelbiologie te ondervragen en kan worden gebruikt om genetische of farmacologische schermen uit te voeren om nieuwe regulatoren van EndMT te identificeren, met mogelijke toepassing bij menselijke ziekten.
Introduction
Endotheel voor mesenchymale overgang (EndMT) is een multistep en dynamisch biologisch fenomeen dat is gekoppeld aan diverse fysiologische en pathologische processen1,2. Bij EndMT verliezen endotheelcellen geleidelijk hun endotheeleigenschappen, terwijl ze mesenchymale eigenschappen verwerven3; zo differentiëren strak verdichte en goed georganiseerde endotheelcellen zich in langwerpige mesenchymale cellen. Morfologische veranderingen in EndMT vallen samen met veranderingen in de expressie van bepaalde genen en eiwitten. Over het algemeen neemt de expressie van eiwitten die endotheelkenmerken behouden, waaronder vasculaire endotheel (VE)-cadherine, bloedplaatjes/EC adhesiemolecuul-1 (CD31/Pecam-1) af. Tegelijkertijd accumuleren eiwitten gerelateerd aan mesenchymale functies, zoals α-gladde spier actine (α-Sma) en gladde spiereiwit 22α (Sm22α). Nieuwe resultaten hebben aangetoond dat postnatale EndMT bijdraagt aan de ontwikkeling van menselijke ziekten, zoals kanker, hartfibrose, pulmonale arteriële hypertensie (PAH), atherosclerose(AS), orgaanfibrose,enz. Een dieper begrip van de onderliggende mechanismen van EndMT en hoe het EndMT-proces te sturen, zal nieuwe therapeutische methoden bieden voor EndMT-gerelateerde ziekten en regeneratieve geneeskunde.
TGF-β is een van de belangrijkste EndMT-inductoren, en andere bekende betrokken factoren zijn Wnt/β-catenine, Notch en sommige inflammatoire cytokines1. Aangezien de cellulaire context van cruciaal belang is voor reacties die worden geactiveerd door TGF-β, is het samenspel van TGF-β met andere EndMT-bevorderingssignalen relevant voor TGF-β om een EndMT-respons op te wekken. Bij de activering van TGF-β celoppervlak type I en type II serine/threonine kinase receptoren wordt de intracellulaire canonieke Smad-route geactiveerd. TGF-β receptorgemedieerde gefosforyleerde Smad2/3 vormen heteromere complexen met Smad4 die in de kern worden overgetranslogeerd, waar ze de expressie van EndMT-gerelateerde transcriptiefactoren upreguleren. Net als bij epitheliaal-mesenchymale overgang (EMT) worden transcriptiefactoren zoals Snail, Slug, Twist, Zeb1 en Zeb2 geïnduceerd door TGF-β signalering en dragen bij aan genherprogrammering in EndMT8.
Slak is vaak geïdentificeerd als een belangrijke factor in EndMT. Slak bindt zich aan de promotor van genen die coderen voor celceladhesie-eiwitten en onderdrukt hun transcriptie, wat wordt gecompenseerd door de verbetering van de expressie van mesenchymale eiwitten9. Endotheelcellen vormen een zeer heterogene populatie en de relatieve invloed van diverse extracellulaire stimuli op EndMT kan verschillen tussen endotheel cellulaire contexten of celtypen10. Vanwege de overeenkomsten met EMT zijn sommige methodologieën nuttig om beide mechanismen EMT en EndMT8te onderzoeken . In dit verband benadrukt de EMT International Association (TEMTIA) sterk de noodzaak van aanvullende technieken om uiteindelijk het optreden van EMT/EndMT11aan te tonen .
Hier beschrijven we een methode om het TGF-β-geïnduceerde EndMT-proces te monitoren en te visualiseren. Immunofluorescentiekleuring biedt de basisinformatie over expressieveranderingen in gerichte eiwitten/markers, die worden gebruikt als indicatoren voor de vraag of het EndMT-proces plaatsvindt. Bovendien kan de immunofluorescentiekleuring de lokalisatie van eiwitten/ markers en celmorfologie visualiseren. Om de potentiële activiteit van specifieke TF's (of andere upstream- of downstreamregulatoren) die betrokken zijn bij TGF-β gemedieerde EndMT te bestuderen, beschrijven we een protocol met behulp van geclusterde regelmatig interspaced korte palindromische repeats (CRISPR) / CRISPR-geassocieerde eiwit 9 (Cas9) genbewerking om specifieke genen uit cellen uit te putten, met behulp van de TF Snail als voorbeeld. Cas9 is een dual RNA-geleide DNA-endonuclease die sequenties herkent en splijt die complementair zijn aan CRISPR-sequenties in bacteriën12. Het CRISPR/Cas9-systeem wordt momenteel veel gebruikt omdat het genetische manipulatie in vitro en in vivo13vergemakkelijkt. Geleid door een enkele gids RNA (sgRNA), ectopisch uitgedrukt Cas9 genereert een dubbele streng break op een vooraf geselecteerde targeting volgorde in een specifieke gen locus. Niet-homologe eindvoeging (NHEJ) vindt plaats om cas9-geïnduceerde strengbreuken te repareren, via willekeurige nucleotide-inserties of deleties, wat leidt tot de verstoring en inactivatie van het beoogde gen. We beschrijven in detail methoden voor het ontwerpen van selectieve sgRNAs en het genereren van lentiviral-compatibele vectoren die de ontworpen sgRNAs bevatten. Als gevolg hiervan kunnen stabiele genarmde endotheelcellen op een efficiënte en betrouwbare manier worden gegenereerd.
In deze studie gebruikten we muriene pancreasmicrovasculaire endotheelcellen (MS-1)14 als modelsysteem om het TGF-β2-geïnduceerde EndMT-proces te onderzoeken. Onze vorige studie toonde aan dat Snail de belangrijkste transcriptiefactor is verhoogd met TGF-β2, waardoor EndMT wordt geïnduceerd in MS-1 cellen15. Bij CRISPR/Cas9 genbewerking om de slakkenexpressie in MS-1-cellen af te spoelen, slaagde TGF-β2 er niet in om EndMT te bemiddelen. Deze workflow kan worden toegepast om andere (vermoedelijke) EndMT-gerelateerde genen te bestuderen.
Protocol
1. Inductie van EndMT door TGF-β2
- MS-1 cellen in Dulbecco's gemodificeerde Eagle medium (DMEM) met 10% foetale runderserum (FBS) en 100 U/ml penicilline/streptomycine in een incubator (5% CO2, 37 °C). Bedek alle kweekgerechten/borden met 0,1% w/v gelatine gedurende 10 min voor gebruik.
- Was MS-1 cellen voorzichtig met 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), voeg 2 ml trypsine-EDTA-oplossing (0,25% trypsine en 0,02% EDTA) toe aan een schaal van 10 cm en incubeer gedurende 2 minuten bij 37 °C om ze los te maken. Voeg vervolgens 5 ml volledig kweekmedium toe om de reactie te doven.
- Breng de celsuspensie over op een buis van 15 ml en centrifugeer gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur op 200 x g.
- Gooi het supernatant weg en resuspendeer de cellen in 4 ml vers medium dat FBS en penicilline/streptomycine bevat. Tel de cellen met behulp van een automatische celteller.
- Zaad 1 x 103 cellen per cm2 voor verdere kweek. Bijvoorbeeld zaad 9,5 x 103 cellen/goed voor 6-put platen, of 1,9 x 103 cellen/goed voor 24-put platen.
- Incubeer de cellen 's nachts om ze te laten hechten en herstellen en stimuleer vervolgens MS-1-cellen met TGF-β2 gedurende 3 dagen. Voeg de TGF-β receptorkinaseremmer SB431542 (5 μM) 30 min toe voor TGF-β2 stimulatie. Behandel andere cellen met een voertuig (DMSO).
OPMERKING: Los TGF-β2 op in 4 mM HCl met 0,1% humaan runderserumalbumine (BSA). Voeg dezelfde hoeveelheid ligandbuffer zonder TGF-β2 toe aan de controlegroep. De TGF-β2-concentratie kan worden aangepast tot 0,1-1 ng/ml voor specifieke testtesten. Zie de aanwijzingen in de overeenkomstige cijfers. - Onderzoek na 3 dagen de celmorfologie met heldere veldbeeldvorming (met een omgekeerde microscoop) en voer immunofluorescentiekleuring uit (zie stap 2) om endmt-gerelateerde markerveranderingen te beoordelen. Voer ten minste drie onafhankelijke experimenten uit om biologische drievouden te verkrijgen.
2. Immunofluorescentiekleuring
- Probeer gekweekte MS-1 cellen (stap 1.2) te trypsiniseren en vervolgens 1,9 x 103 cellen opnieuw te inzonderen op een 0,1% met gelatine bedekt 12 mm rond afdekglas dat op de bodem van een 24-putplaat is geplaatst.
- Voeg na het cultiveren van de cellen 's nachts TGF-β2 (eindconcentratie 1 ng/ml) gedurende 3 dagen toe aan de cellen. Gebruik medium met ligandbuffer als negatieve controle.
- Voer Pecam-1 en Sm22α kleuring uit.
- Na het stimuleren van de cellen met TGF-β2 (of Control) gedurende 3 dagen, verwijdert u het medium en wast u de cellen met 1x PBS.
- Voeg 300 μL 4% formaldehyde toe aan elke put en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur om de cellen te fixeren. Was 3x met 1x PBS na incubatie.
- Voeg 300 μL 0,1% Triton X-100 in 1x PBS toe aan elke put en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur om de cellen te permeabiliseren. Verwijder na incubatie de Triton X-100 oplossing en was de cellen 3x met 1x PBS.
- Blokkeer de cellen met 3% runderserumalbumine (BSA) in 1x PBS gedurende 45 min bij kamertemperatuur.
- Verdun de primaire Pecam-1 en Sm22α antilichamen die muriene eiwitten herkennen 1:500 met 1x PBS. Incubeer vervolgens de vaste cellen met primaire antilichamen gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur.
- Na 3x wassen met 1x PBS, incubeer de cellen met 1000x verdunde secundaire antilichamen, waaronder ezel anti-rat Alexa 488 en geit anti-konijn Alexa 594, gedurende 45 min bij kamertemperatuur.
OPMERKING: Bescherm de monsters tegen licht tijdens het kleuren. - Na 3x spoelen met 1x PBS, plaatst u het afdekglas gezaaid met cellen naar beneden op een druppel montagemedium met 4',6-diamidino-2-fenylindole (DAPI) op een dia om de kernen te beitsen.
- Bevestig de omtrek van het afdekglas met transparante nagellak en bewaar het op 4 °C.
- Verkrijg representatieve beelden met een confocale microscoop. Stel de lasergolflengten in op respectievelijk 405 nm, 488 nm en 552 nm om DAPI, Pecam-1 en Sm22α te detecteren. Voor elk kanaal zijn alle foto's gemaakt met dezelfde instellingen en belichtingstijd. Voer ten minste drie onafhankelijke experimenten uit om biologische drievouden te verkrijgen.
3. Knock out van Snail met CRISPR / Cas9-bewerking
- Ontwerp twee onafhankelijke sgRNAs gericht op murine Snail.
- Ontwerp sgRNAs met behulp van de online tools CHOPCHOP (https://chopchop.cbu.uib.no/) en Cas-OFFinder (http://www.rgenome.net/cas-offinder/) volgens de beoogde gennaam en soorten.
- Voorspel de off-target activiteit van de ontworpen sgRNAs gericht op Snail met twee onafhankelijke algoritmen, waaronder Cas-OFFinder (http://www.rgenome.net/cas-offinder/) en CHOPCHOP (http://chopchop.cbu.uib.no/).
- Kies twee sgRNAs met de laagste off-activity. Ontwerp twee complementaire sgRNA oligo's met de BveI cut site. Het sense oligo begint met 5'-ACCG-3' en het antisense oligo begint met 5'-AAAC-3'.
- Bestel de oligo's om commercieel te worden gesynthetiseerd voor verder gebruik.
- Kloon de aanvullende gids RNA oligos in de BveI-digested AA19 pLKO.1-puro.U6.sgRNA. Bve I-stuffer Lentiviral vector plasmide te genererenAA19 pLKO.1-Snail-sgRNA16.
- Snijd de AA19 pLKO.1-puro.U6.sgRNA. Bve I-stuffer plasmide met het BveI enzym16. Meng 2 μg AA19 pLKO.1-puro.U6.sgRNA. Bve I-stuffer plasmide,5 μL 10x Buffer O en 5 μL Bve I enzym en voeg steriel water toe om een totaal volume van 50 μL te bereiken.
- Vortex en draai kort de reactiemix naar beneden. Incubeer de reactie bij 37 °C gedurende 1 uur.
- Laad de reactiemix op een 1% agarose gel en voer in 1x Tris-acetaat-EDTA (TAE, 50x TAE stam: 242 g Tris base opgelost in water, 57,1 ml ijsazijn, 100 ml 500 mM EDTA (pH 8,0) oplossing, en voeg water toe aan een totaal van 1 L) buffer.
- Snijd het ruggengraatfragment uit de gel, isoleer het met een gelextractiekit volgens het protocol van de fabrikant (zie de tabel met materialen)en eluteer de ruggengraat in 40 μL elutiebuffer (EB).
- Meng 5 μL 100 pmol/μL sense oligo en 5 μL van 100 pmol/μL antisense oligo met 1 μL tris-HCl (pH 8,0) en voeg steriel water toe om in totaal 100 μL te bereiken om de gRNA-oligo's te gloeien. Incubeer het mengsel gedurende 5 minuten op 100 °C en bedek de buizen vervolgens met aluminiumfolie. Koel daarna de oplossing langzaam af tot kamertemperatuur voor verder gebruik als inzetstuk.
- Om de complementaire gRNA oligo's en de BveI-digested backbone te ligateren, meng 1 μL geïsoleerde BveI cut AA19 pLKO.1-puro.U6.sgRNA.BveI-stuffer backbone en 2 μL insert (verdund 1:300) met 2 μL 10x T4 DNA ligase buffer en 1 μL T4 DNA ligase, en voeg steriel water toe om een totaal van 20 μL te bereiken.
OPMERKING: Let er bij het uitvoeren van de ligatie op dat er twee controlegroepen zijn opgenomen. Meng voor één controlegroep 1 μL geïsoleerde ruggengraat, 2 μL 10x T4 DNA-ligasebuffer en 1 μL T4 DNA-ligase en voeg steriel water toe om in totaal 20 μL te bereiken, maar zonder oligo-DNA. Meng voor de andere controlegroep 1 μL geïsoleerde ruggengraat en 2 μL 10x T4 DNA-ligasebuffer en voeg steriel water toe om in totaal 20 μL te bereiken, maar zonder de gegloeide oligo's en T4-ligase. Deze twee controleligaties worden gebruikt om de reactieachtergrond in de volgende transformatiestap te bepalen en aan te geven hoe efficiënt de ligatie is.
- Zet het reactiemengsel om in competente TOP10 E. coli.
- Verzamel de competente TOP10 E. coli. cellen uit de -80 °C vriezer, en ontdooi ze op ijs.
- Voeg 2 μL ligatiemengsel toe aan 50 μL competente cellen en houd de buis 30 minuten op ijs.
- Verwarm de buis gedurende 30 s bij 42 °C. Zet de buis 2 minuten op ijs.
- Voeg 950 μL verse lysogeney bouillon (LB) medium toe aan het mengsel en schud krachtig bij 37 °C gedurende 60 min.
- Draai de cellen naar beneden en plaat ze op een warme ampicilline (100 μg/ml) weerstand LB-plaat. Incubeer de plaat 's nachts bij 37 °C.
- Controleer of de gRNA-oligo's succesvol in de plasmide zijn ingebracht.
- Pluk 3-5 kolonies op de plaat in 1 ml ampicilline (100 μg/ml) met LB-medium en schud 's nachts bij 30 °C.
- Isoleer het plasmide-DNA met een plasmidekit volgens het protocol van de fabrikant (Tabel van materialen) en sequentieer het met de U6 promotorprimer 5'- GAGGGCCTATTTCCCATGATT -3' om de succesvolle invoeging van het gRNA-oligo te verifiëren.
4. Genereer Snail knock-out MS-1 cellen
- Produceer lentivirale deeltjes die Cas9 of Snail-targeting gRNAs dragen.
- Kweek HEK 293T cellen in DMEM met 10% foetale runderserum en 100 U/ml penicilline/streptomycine in 14,5 cm schotels (of T75 kolven) in een incubator (5% CO2, 37 °C).
- Meng 9,9 μg targeting genplasmide, AA19 pLKO.1-Snail-sgRNA of pLV-Cas917 plasmide, samen met de helper plasmiden 3,5 μg pCMV-VSVG (codering van het G-eiwit van het vesiculaire stomatitisvirus, VSV-G), 6,6 μg rev-responsief element plasmide pMDLg-RRE Resuspend 50 μL polyethyleenimine (PEI) (2,5 mg/ml) in 500 μL serumvrij medium. Meng plasmiden en PEI-preparaten voorzichtig door op en neer te pipetten. Incubeer het mengsel gedurende 20 minuten op kamertemperatuur.
- Transfect HEK 293T cellen door het mengsel medium toe te voegen van stap 4.1.2 tot 80% samenvloeiingscellen in 14,5 cm schalen (of T75 kolven) die DMEM medium bevatten met 10% FBS en 100 U/ml penicilline/streptomycine. HEK293T-cellen worden gebruikt omdat ze gemakkelijk kunnen worden getransfecteerd en hoge virusniveaus genereren18.
- Breng getransfecteerde HEK 293T-cellen over naar een bioveiligheid in microbiologisch en biomedisch laboratorium (BMBL) om ze gedurende 24 uur te kweeken.
- Vervang in een BMBL-laboratorium het transfectiemedium van HEK 293T-cellen door 12 ml verse volledige DMEM met FBS en penicilline/streptomycine. Incubeer de cellen gedurende 24 uur.
- Verzamel en filter het medium met een spuit van 20 ml en een filter van 0,45 μm. Breng het geconditioneerde medium over in een polypropyleen buis van 15 ml.
- Voeg 12 ml verse complete DMEM met FBS en penicilline/streptomycine toe aan de HEK 293T kweekschotel en -cultuur voor nog eens 24 uur.
- Verzamel en filter het medium met een spuit van 20 ml en een filter van 0,45 μm. Breng het geconditioneerde medium over in een polypropyleen buis van 15 ml. Bewaar het medium met lentivirale deeltjes als 1 ml aliquots bij -80 °C voor verder gebruik.
- Infecteer MS-1 cellen met het pLV-Cas9 virus.
- Zaai 1 x 105 MS-1 cellen per put in een 6-well plaat gedurende 24 uur voor lentivirus infectie.
- Ontdooi de bevroren aliquots van het pLV-Cas9-virus in een waterbad van 37 °C.
- Meng 1 ml virusmedium met 1 ml vers DMEM-medium dat FBS en penicilline/streptomycine bevat. Voeg polybreen toe aan het medium (eindconcentratie als 10 μg/ml) om de infectie-efficiëntie te verhogen.
- Verwijder het medium van de 6-well plaat en vervang het door het virus/polybreen mix medium en kweek de cellen in een incubator gedurende 24 uur. 24 uur na infectie, vervang het medium door vers medium en kweek de cellen nog eens 24 uur.
OPMERKING: Houd altijd een niet-geïnfecteerde en een controlegroep. - Aspireer het medium uit de geïnfecteerde groep en controlegroep en vervang het door DMEM-medium door 4 μg/ml blasticidine.
- Breng de plaat terug naar een incubator van 37 °C en kweek de cellen gedurende 1 week. Niet-geïnfecteerde cellen zullen sterven als gevolg van het effect van blasticidin. Splits de overlevende cellen wanneer ze 80% celconfluency bereiken en ga verder met blasticidin selectie.
- Bevestig de expressie van Cas9 in MS-1 cellen door western blotting met behulp van een antilichaam tegen Cas9 (moleculair gewicht van Cas9 is ongeveer 160 kDa).
- Infecteer afzonderlijk pLV-Cas9 MS-1 cellen met twee onafhankelijke gRNA lentivirussen.
- Zaai 1 x 105 pLV-Cas9 MS-1 cellen per put in een 6-well plaat gedurende 24 uur voor infectie.
- Volg hetzelfde protocol als beschreven in 4.2 om cellen afzonderlijk te infecteren met twee gRNA lentivirussen.
- Ververs na 24 uur infectie met het gRNA-virus het medium en kweek de cellen nog eens 24 uur.
- Vervang het medium door DMEM door 1 μg/ml puromycine. Breng de plaat terug naar een incubator van 37 °C en kweek de cellen gedurende 1 week. Zorg ervoor dat de niet-geïnfecteerde cellen volledig dood zijn. Splits de cellen wanneer ze 80% samenvloeiing bereiken en ga door met de selectie van puromycine.
- Bevestig de knock-out van Snail in MS-1 cellen door western blotting met behulp van een antilichaam tegen Snail (moleculair gewicht van Snail is ongeveer 35 kDa).
Representative Results
TGF-β2 induceert EndMT en stimuleert de expressie van slakken in MS-1 endotheelcellen
TGF-β is een van de cytokinen met het grootste potentieel om EndMT te induceren. Na de behandeling van MS-1-cellen met TGF-β2 (1 ng/ml) gedurende 3 dagen verliezen endotheel-MS-1-cellen hun kasseienachtige structuur en differentiëren ze in spindelvormige mesenchymale-achtige cellen (figuur 1A)15. Om de rol van TGF-β2 bij het induceren van celfenotypische veranderingen verder te verifiëren, hebben we de cellen voorbehandeld met het kleine molecuul activine receptor-achtige kinase (ALK)4/ALK5/ALK7 remmer SB431542 vóór TGF-β2 stimulatie19. SB431542 volledig ingebroken TGF-β2-geïnduceerde celmorfologieveranderingen (Figuur 1A). Het TGF-β2 geïnduceerde EndMT-proces werd verder onderzocht door veranderingen in de expressie van EndMT-gerelateerde markers te bestuderen. Zoals blijkt uit figuur 1B, werd het endotheeleiwit Pecam-1 krachtig verlaagd na TGF-β2-stimulatie, terwijl de mesenchymale factor Sm22α grondig werd geherreguleerd door TGF-β215. Deze gegevens komen overeen met het idee dat TGF-β2 EndMT in MS-1-cellen activeerde. Vervolgens onderzochten we de effecten van TGF-β2 op de Slakken- en Slakexpressie. Zoals weergegeven in figuur 1C, werd Snail duidelijk geherreguleerd door TGF-β2, terwijl slugexpressie niet werd beïnvloed door TGF-β2 in MS-1 cellen15. De kwantificering van de slakkenexpressie uit drie onafhankelijke experimenten is weergegeven in figuur 1D.
Uitputting van slak door CRISPR/Cas9 in MS-1 endotheelcellen
Omdat Snail werd geïnduceerd door TGF-β2 en waarschijnlijk betrokken was bij TGF-β2-gemedieerde EndMT, voerden we CRISPR/ Cas9 genbewerking uit om de slakkenexpressie genetisch uit te putten in MS-1-cellen. We veronderstelden dat de uitputting van Snail voldoende zou zijn om TGF-β2-geïnduceerde EndMT te remmen. Zoals getoond in figuur 2A,genereerden we slakken knock-out cellen in twee stappen. Ten eerste werd Cas9 ectopisch uitgedrukt door MS-1-cellen te infecteren met een Cas9-uitdrukkend lentivirus. Omdat er een blasticidin weerstand cassette in de pLV-Cas9 constructie, we controleerden de expressie van Cas9 door westerse vlek analyse in blasticidin resistente cellen (Figuur 2D). Vervolgens introduceerden we sgRNAs die specifiek gericht waren op Snail om zijn eiwitexpressie te verstoren. Deze procedure werd ook uitgevoerd door infectie met lentivirale deeltjes die de AA19 pLKO.1-Snail-sgRNA-constructie dragen, waaronder een puromycine-expressiecassette. Cas9-uitdrukkende cellen werden opnieuw geïnfecteerd met gRNA dat lentivirus bevatte en verder geselecteerd met puromycine. Twee complementaire sgRNA-oligo's gericht op muriene slak werden ontworpen met een voorspelde lage off-target activiteit (Figuur 2B,C). Na de introductie van twee onafhankelijke Slakken sgRNAs in Cas9 die MS-1 cellen uitdrukken, werd de expressie van slakkeneiwitten ingebroken (Figuur 2D)15.
Deficiëntie van slak remt TGF-β2-geïnduceerde EndMT in MS-1 cellen
Om de functie van Snail in TGF-β2-gemedieerde EndMT aan te tonen, voerden we een EndMT-test uit in slakkenarme cellen en vergeleken deze met ms-1-cellen van ouders. Zoals blijkt uit figuur 3A, was de knock-out van Snail voldoende om de fibroblastachtige celmorfologie aangedreven door TGF-β2 in MS-1 cellen15te remmen . Bovendien werden de TGF-β2-gemedieerde afname van Pecam-1 en de verbetering van Sm22α volledig geblokkeerd in Slakkenarme MS-1 cellen. Samengevat hebben we aangetoond dat Snail van cruciaal belang is voor TGF-β2-gemedieerde EndMT in MS-1 cellen (Figuur 3B)15.
Figuur 1. TGF-β2 induceert EndMT en Snail expressie in MS-1 cellen. A. Effecten van TGF-β2 en/of TGF-β type I receptorkinaseremmer SB-431542 op celmorfologie. Brightfield beelden van MS-1 cellen bij behandeling met TGF-β2 (1 ng/ml) en/of SB-431542 (SB, 5 μM, toegediend 30 min voorafgaand aan TGF-β2) gedurende 2 dagen. Schaalbalk vertegenwoordigt 200 μm. B. Immunofluorescentiekleuring van Pecam-1 (groen) en Sm22α (rood) in MS-1 cellen gekweekt in medium met TGF-β2 (1 ng/ml) gedurende 3 dagen. Kernen worden gevisualiseerd in blauw (DAPI). Schaalbalk: 50 μm. C. Westelijke vlek met hele cellysaat van TGF-β2 gestimuleerde MS-1 cellen. De expressie van Snail, maar niet Slug, werd versterkt door TGF-β2 stimulatie, zoals eerder gemeld in Ma et al15. D. Kwantificering van de uitdrukking van de Slak door de resultaten van drie onafhankelijke westelijke vlekexperimenten te integreren. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2. Uitputting van slak door CRISPR-Cas9 genbewerking. A. Schema dat afschildert hoe slakken knock-out cellen te genereren. Bsd: Blasticidin. Puro: Puromycine. B. Oligonucleotiden van twee onafhankelijke sgRNAs gericht op slak met behulp van CHOPCHOP (http://chopchop.cbu.uib.no/) en Cas-OFFinder (http://www.rgenome.net/cas-offinder/). C. De voorspelde off-target activiteit van de twee gRNAs voor Snail met behulp van Cas-OFFinder (http://www.rgenome.net/cas-offinder/). D. Cas9 en Snail expressie in wild type (WT) en Cas9-overexpressed MS-1 gemeten door Western blot analyse. E. Knock-out van slak met twee onafhankelijke gRNAs in MS-1 cellen zoals gemeten door westerse vlek analyse. We rapporteerden vergelijkbare resultaten in Ma et al15. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3. Genetische uitputting van slak remt TGF-β2-geïnduceerde EndMT in MS-1 cellen. A. Brightfield beelden van MS-1 cellen bij behandeling met TGF-β2 (0,1 ng/ml) gedurende 3 dagen in wildtype (WT, bovenste paneel) en Slak knock-out (onderste paneel) cellen. Schaalbalk vertegenwoordigt 200 μm. B. Immunofluorescente kleuring voor Pecam-1 (groen), Sm22α (rood) en kernen (blauw) van MS-1 cellen gekweekt in medium met TGF-β2 (1 ng/ml) gedurende 3 dagen. Uitputting van Slak ingebroken TGF-β2-geïnduceerde afname van Pecam-1 en toename van Sm22α expressie. Schaalbalk vertegenwoordigt 50 μm. C. Schematische weergave van het effect van slakken knock-out op TGF-β-geïnduceerde EndMT in MS-1 cellen. TGF-β stimuleert de expressie van Snail door Smad pathway door Smad2/3 te fosforyleren en drijft EndMT verder aan. Het uitschakelen van Snail met behulp van CRISPR / Cas9-gebaseerde genbewerking heeft TGF-β-gemedieerde EndMT in de steek. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Discussion
Het begrijpen van het mechanisme van EndMT is van cruciaal belang voor het moduleren van dit proces en het richten op EndMT-gerelateerde ziekten. Hier beschreven we methoden om een TGF-β-geïnduceerde EndMT-test uit te voeren en de rol van de EndMT-TF-slak in TGF-β-geactiveerde EndMT te ondervragen, door CRISPR / Cas9-gemedieerde stabiele gendepletie van Snail uit cellen uit te voeren. De uitputting van slak met behulp van CRISPR/Cas9 aanpak met succes ingebroken TGF-β2 aangedreven EndMT in MS-1 cellen (Figuur 3C). Om de effecten van cytokinen, zoals TGF-β, op EndMT te bestuderen, werden EC's blootgesteld aan cytokinen en vervolgens werd het optreden van EndMT beoordeeld op basis van morfologische veranderingen en endotheel- en mesenchymale markerexpressieveranderingen in cellen. TGF-β2 sterk geïnduceerde EndMT in MS-1 cellen vergezeld van een sterke toename van de expressie van de transcriptiefactor Snail. De EndMT-TF's geïnduceerd door TGF-β kunnen verschillen afhankelijk van de soort of weefselspecifiek endotheelceltype. We merkten bijvoorbeeld op dat Snail but not Slug significant werd geherreguleerd door TGF-β in MS-1-cellen, terwijl in menselijke navelstreng endotheelcellen (HUVECs), zowel Snail als Slug worden verhoogd na blootstelling aan TGF-β20.
We hebben de omvang van het EndMT-proces op twee manieren beoordeeld door celmorfologiewijzigingen te onderzoeken en vervolgens door veranderingen in endMT-gerelateerde markersexpressie te onderzoeken. Na blootstelling aan TGF-β gedurende 3 dagen ondergingen cellen EndMT met consistente morfologische variaties en veranderingen in de expressie van EndMT-gerelateerde markers. Naast de immunofluorescentiekleuring die we hier hebben uitgevoerd, kunnen markervariaties ook worden gecontroleerd door western blotting op het eiwitexpressieniveau of door qRT-PCR (Real-Time Quantitative Reverse Transcription PCR) op de genniveaus21. Naast deze twee tijd- en kostenbesparende methoden die we in dit protocol hebben laten zien, zijn er andere methoden om EndMT te onderzoeken. Het uitvoeren van transcriptoomanalyse (door RNA-sequencing of qPCR) om bijvoorbeeld de expressieniveaus van endotheel- en mesenchymale-gerelateerde genen tussen behandelde en controlecellen tevergelijken,kan EndMT22,23nauwkeurig beoordelen . Bovendien houdt EndMT vaak het stabiele verlies van barrièrefunctie in, dat kan worden beoordeeld door impedantiespectroscopie24. Bovendien kan aanvullend bewijs van de verwerving van stamcelachtige eigenschappen door endmt-afgeleide cellen worden onderzocht. Onder specifieke kweekomstandigheden kunnen EndMT mesenchymale cellen bijvoorbeeld verder worden gedifferentieerd in osteoblasten, chondrocyten, adipocyten of (myo)fibroblasten. Daarom is aanvullende analyse om de differentiatie in verschillende celtypen die tot de mesoderm-afstamming behoren (d.w.z. genexpressie en matrixkleuring) te bevestigen nuttig om de multipotente aard van endMT-afgeleide cellen aan te tonen. Ten slotte zijn de EndMT-beoordelingsmethoden niet beperkt tot in vitro studies, maar kunnen ze worden geëxtrapoleerd om de relatie tussen EndMT en sommige ziekten in vivo of in ex vivo organen te onderzoeken. In die zin wordt het gebruik van endotheelspecifieke afstammingstraceringsstrategieën in grote lijnen uitgebreid tot EndMT-gerelateerd onderzoek25.
Om de rol van Snail tijdens EndMT te onderzoeken, werd in deze studie CRISPR/Cas9 genbewerking gebruikt om dit gen uit te schakelen. De gegevens toonden aan dat TGF-β2 er niet in slaagde om EndMT te bemiddelen in Slakkendeficiënte MS-1 cellen. Deze observatie toonde aan dat Snail essentieel is voor TGF-β2 geïnduceerde EndMT in MS-1 cellen. We gebruikten een onafhankelijke U6-aangedreven sgRNA-expressiecassette om specifieke sgRNAs voor Cas9 te introduceren om Snail te targeten. Naast deze methode beschreven Ran et al.26 een andere strategie voor het klonen van de sgRNA oligos-sequentie in de Cas9-steiger om een constructie te genereren die zowel Cas9- als gRNAs bevat. Opkomende nieuwe benaderingen maken het mogelijk dat CRISPR/Cas extra functies bevat. Dubbele of drievoudige knock-outs kunnen bijvoorbeeld worden bereikt door meer sgRNAs te leveren in cellen die Cas927uitdrukken. Het ontworpen Cas13-eiwit richt zich op en verteert RNA-moleculen zonder endogene DNA28te verstoren. Naast het uitschakelen van genen met CRISPR/Cas, kunnen korte haarspeldbochten (shRNAs) worden gebruikt als alternatieven om gerichte genexpressie stabiel neer te halen29. Voor alle CRISPR/Cas genbewerkingsmethoden moet altijd rekening worden gehouden met off-target decolleté. Bovendien zwijgen kleine interfererende RNA's (siRNAs) tijdelijk de genexpressie en wordt de siRNA-concentratie verdund met celdeling30. Beide methoden onderdrukken gedeeltelijk gerichte genexpressie. Ectopische genexpressie wordt daarentegen ook gebruikt om de genfunctie te verifiëren tijdens EndMT/EMT31. Deze aanpak kan bepalen of de upregulatie van een gen voldoende is om een EndMT-respons uit te lokken. Daarom zijn er momenteel een groot aantal technische strategieën die kunnen worden gebruikt om potentiële regelgevers van EndMT te identificeren en te verifiëren. Bovendien kan transcriptomische analyse een goede optie zijn bij de identificatie en uitgebreide analyse van EndMT-gerelateerde regulatoren. We raden aan om verschillende complementaire benaderingen te gebruiken om de modulatie van EndMT te onderzoeken.
Samengevat hebben we een workflow geïntroduceerd om factoren te identificeren die functionele rollen kunnen spelen tijdens TGF-β-geïnduceerde EndMT. Deze methode kan ook worden gebruikt om te bestuderen of andere stimuli (d.w.z. cytokinen, groeifactoren, mechanische stimuli, celcelinteracties) EndMT kunnen moduleren en het samenspel van TGF-β met andere stimuli. Daarnaast hebben we een aanpak uitgelicht met behulp van CRIPSR/Cas genbewerking om uit te leggen of een bepaald gen nodig is voor TGF-β-geïnduceerde EndMT. Om deze methodologie te illustreren, gebruikten we de sterke EndMT-inductor TGF-β2 in MS-1-cellen, maar de protocollen kunnen worden aangepast aan andere cytokinen en andere celtypen. We verwachten dat dit beschreven gedetailleerde protocol zal dienen als opstapje voor toekomstige EndMT-gerelateerde studies.
Disclosures
De auteurs hebben niets bekend te maken.
Acknowledgments
Het onderzoek werd ondersteund door CGC.NL en het Netherlands Cardio Vascular Research Initiative: de Nederlandse Hartstichting, de Nederlandse Federatie van Universitair Medische Centra, de Nederlandse Organisatie voor Gezondheidsonderzoek en -Ontwikkeling en de Koninklijke Nederlandse Akademie van Wetenschappen Subsidie toegekend aan de Phaedra-Impact (http://www.phaedraresearch.nl). JM wordt ondersteund door de Chinese Scholarship Council. GSD wordt ondersteund door een Trampoline-subsidie van AFM-Telethon [22379], FOP Italia en een subsidie van La Fundació La Marató de TV3 (#202038).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.45 μm filter | Pall Corporation, USA | 4614 | |
| 10× T4 DNA ligase buffer | Thermofisher Scientific, USA | B69 | |
| 12 mm round glass slice | Knittel Glass,Germany | VD10012Y1A.01 | |
| 20 mL syringe | BD Eclipse, USA | 300629 | |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Vector Laboratories, USA | H-1200 | VECTASHIELD Antifade Mounting Media |
| AA19_PLKO vector | Dr. M Gonçalves, Leiden University Medical Center, Netherlands | Gift | |
| Ampicillin | Serva Electrophoresis, USA | 1339903 | |
| Anti-Mouse IgG | GE Healthcare, USA | NA931 | |
| Anti-Rabbit IgG | Cell signaling, USA | 7074 | |
| Agarose | Roche, Switzerland | 11388991001 | |
| Blasticidin | Invitrogen, USA | R21001 | |
| Buffer O (10X) | Thermofisher Scientific, USA | BO5 | |
| BveI (Bspm1) | Thermofisher Scientific, USA | ER 1741 | |
| Confocal microscope | Leica Microsystems, Germany | SP8 | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific, USA | 11965092 | |
| Donkey anti-rat Alexa 488 | Invitrogen, USA | A21208 | |
| FBS | Thermo Fisher Scientific, USA | 16000044 | |
| Formaldehyde | Thermo Fisher Scientific, USA | 28908 | |
| Inverted microscope | Leica Microsystems, Germany | DMi8 | |
| Goat anti-rabbit Alexa 594 | Invitrogen,USA | A11012 | |
| LabNed Plasmid kit | LabNed, USA | LN2400004 | |
| MS-1 cell line | American Type Culture Collection (ATCC) | ||
| Nail polish | HEMA, Netherlands | Transparent | |
| Pecam-1 antibody | Becton Dickinson,USA | 553370 | |
| PEI | Polysciences, USA | 23966-1 | |
| PLV-Cas9 plasmid | Sigma-Aldrich, USA | Cas9BST-1EA | |
| Puromycin | Sigma-Aldrich, USA | P9620 | |
| QIAquick gel extraction kit | Qiagen, Germany | 28706 | |
| Sm22a antibody | Abcam, UK | ab14106 | |
| Snail | Cell signaling, USA | 3879 | |
| T4 DNA ligase | Thermofisher Scientific, USA | EL 0014 | |
| TC20 automated Cell Counter | Bio-Rad, USA | 1450102 | |
| Human TGF-β2 | Joachim Nickel, University of Wurzburg | Gift | Other commercial recommendation: 302-B2, R&D systems |
| Triton X-100 | Merck, USA | 1086031000 | |
| SB431542 | Tocris Bioscience, UK | 1614 | |
| Tris | Roche, Switzerland | 11814273001 |
References
- Ma, J., Sanchez-Duffhues, G., Goumans, M. -J., Ten Dijke, P. TGF-β-induced endothelial to mesenchymal transition in disease and tissue engineering. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, (2020).
- Piera-Velazquez, S., Jimenez, S. A. Endothelial to mesenchymal transition: role in physiology and in the pathogenesis of human diseases. Physiological Reviews. 99 (2), 1281-1324 (2019).
- Sánchez-Duffhues, G., de Vinuesa, G. A., ten Dijke, P. Endothelial-to-mesenchymal transition in cardiovascular diseases: developmental signaling pathways gone awry. Developmental Dynamics. 247 (3), 492-508 (2018).
- Evrard, S. M., et al. Endothelial to mesenchymal transition is common in atherosclerotic lesions and is associated with plaque instability. Nature Communications. 7 (1), 1-16 (2016).
- Qiao, L., et al. Endothelial fate mapping in mice with pulmonary hypertension. Circulation. 129 (6), 692-703 (2014).
- Zeisberg, E. M., et al. Endothelial-to-mesenchymal transition contributes to cardiac fibrosis. Nature Medicine. 13 (8), 952-961 (2007).
- Clere, N., Renault, S., Corre, I. Endothelial-to-mesenchymal transition in cancer. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, (2020).
- Saito, A. EMT and EndMT: regulated in similar ways. The Journal of Biochemistry. 153 (6), 493-495 (2013).
- Bolós, V., et al. The transcription factor Slug represses E-cadherin expression and induces epithelial to mesenchymal transitions: a comparison with Snail and E47 repressors. Journal of Cell Science. 116 (3), 499-511 (2003).
- Aird, W. C. Endothelial cell heterogeneity. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (1), 006429 (2012).
- Yang, J., et al. Guidelines and definitions for research on epithelial-mesenchymal transition. Nature Reviews Molecular Cell Biology. , 1-12 (2020).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), (2014).
- Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
- Arbiser, J. L., et al. Oncogenic H-ras stimulates tumor angiogenesis by two distinct pathways. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 94 (3), 861-866 (1997).
- MA, J., et al. TGF-?-induced endothelial to mesenchymal transition results from a balance between SNAIL and ID factors. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 182 (9), (2021).
- Chen, X., et al. Probing the impact of chromatin conformation on genome editing tools. Nucleic Acids Research. 44 (13), 6482-6492 (2016).
- Hunter, F. W., et al. Functional CRISPR and shRNA screens identify involvement of mitochondrial electron transport in the activation of evofosfamide. Molecular Pharmacology. 95 (6), 638-651 (2019).
- Mao, Y., et al. Lentiviral vectors mediate long-term and high efficiency transgene expression in HEK 293T cells. International Journal of Medical Sciences. 12 (5), 407 (2015).
- Liu, S., et al. Deubiquitinase activity profiling identifies UCHL1 as a candidate oncoprotein that promotes TGFβ-induced breast cancer metastasis. Clinical Cancer Research. 26 (6), 1460-1473 (2020).
- Medici, D., et al. Conversion of vascular endothelial cells into multipotent stem-like cells. Nature Medicine. 16 (12), 1400 (2010).
- Kokudo, T., et al. Snail is required for TGFβ-induced endothelial-mesenchymal transition of embryonic stem cell-derived endothelial cells. Journal of Cell Science. 121 (20), 3317-3324 (2008).
- Dong, J., et al. Single-cell RNA-seq analysis unveils a prevalent epithelial/mesenchymal hybrid state during mouse organogenesis. Genome Biology. 19 (1), 1-20 (2018).
- Oatley, M., et al. Single-cell transcriptomics identifies CD44 as a marker and regulator of endothelial to haematopoietic transition. Nature communications. 11 (1), 1-18 (2020).
- Halaidych, V., et al. Inflammatory responses and barrier function of endothelial cells derived from human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 10 (5), 1642-1656 (2018).
- Li, Y., Lui, K. O., Zhou, B. Reassessing endothelial-to-mesenchymal transition in cardiovascular diseases. Nature Reviews Cardiology. 15 (8), 445-456 (2018).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Grav, L. M., et al. One-step generation of triple knockout CHO cell lines using CRISPR/Cas9 and fluorescent enrichment. Biotechnology Journal. 10 (9), 1446-1456 (2015).
- Abudayyeh, O. O., et al. RNA targeting with CRISPR-Cas13. Nature. 550 (7675), 280-284 (2017).
- Paddison, P. J., et al. Cloning of short hairpin RNAs for gene knockdown in mammalian cells. Nature Methods. 1 (2), 163-167 (2004).
- Reynolds, A., et al. Rational siRNA design for RNA interference. Nature Biotechnology. 22 (3), 326-330 (2004).
- Lourenço, A. R., et al. C/EBPɑ is crucial determinant of epithelial maintenance by preventing epithelial-to-mesenchymal transition. Nature Communications. 11 (1), 1-18 (2020).
