Summary
وطبق تحليل الشبكة لتقييم ارتباط مختلف المجتمعات الميكروبية الإيكولوجية، مثل التربة والمياه ورهيزوسفير. يقدم هنا بروتوكول حول كيفية استخدام خوارزمية WGCNA لتحليل شبكات التواجد المشترك المختلفة التي قد تحدث في المجتمعات الميكروبية بسبب بيئات بيئية مختلفة.
Abstract
يلعب ميكروبيوم الجذر دورا هاما في نمو النبات والتكيف البيئي. تحليل الشبكة هو أداة هامة لدراسة المجتمعات المحلية، والتي يمكن أن تستكشف بشكل فعال العلاقة التفاعل أو نموذج الحدوث المشترك للأنواع الميكروبية المختلفة في بيئات مختلفة. الغرض من هذه المخطوطة هو تقديم تفاصيل حول كيفية استخدام خوارزمية شبكة الارتباط المرجحة لتحليل شبكات التواجد المشترك المختلفة التي قد تحدث في المجتمعات الميكروبية بسبب بيئات بيئية مختلفة. يتم إجراء جميع التحليلات الخاصة بالتجربة في حزمة WGCNA. WGCNA هو حزمة R لتحليل شبكة الارتباط المرجح. وكانت البيانات التجريبية المستخدمة لإثبات هذه الأساليب هي بيانات مجتمعية ميكروبية من قاعدة بيانات المركز الوطني لمعلومات التكنولوجيا الأحيائية لثلاثة منافذ لنظام جذور الأرز (أوريزا ساتيفا). استخدمنا خوارزمية شبكة الارتباط المرجحة لبناء شبكات وفرة مشتركة من المجتمع الميكروبي في كل من المنافذ الثلاثة. ثم تم تحديد شبكات الوفرة المشتركة التفاضلية بين التربة المحيطية والرهيزوبلان ورهيزوسفير. وبالإضافة إلى ذلك، تم الحصول على الأجناس الأساسية في الشبكة من خلال حزمة "WGCNA"، التي تلعب دورا هاما منظما في وظائف الشبكة. تمكن هذه الأساليب الباحثين من تحليل استجابة الشبكة الميكروبية للاضطرابات البيئية والتحقق من نظريات الاستجابة الإيكولوجية الميكروبية المختلفة. وتبين نتائج هذه الأساليب أن الشبكات الميكروبية التفاضلية الهامة التي تم تحديدها في التربة الاندوسفيرية ورهيزوبلان ورهيزوسفير للأرز.
Introduction
أبحاث الميكروبيوم لها آثار هامة على فهم والتلاعب في عمليات النظام الإيكولوجي1،2. وترابط التجمعات الميكروبية من خلال التفاعل بين الشبكات الإيكولوجية، التي يمكن أن تؤثر خصائصها على استجابة الكائنات الحية الدقيقة للتغيرات البيئية3و4. وعلاوة على ذلك، تؤثر خصائص هذه الشبكات على استقرار المجتمعات الميكروبية، وترتبط ارتباطا وثيقا بوظيفة التربة5. وقد تم الآن تحليل شبكة الارتباط الجيني المرجح على نطاق واسع للبحث في العلاقة بين الجينات والمجتمعات الميكروبية6. وقد ركزت الدراسات السابقة أساسا على الارتباطات بين شبكات الجينات المختلفة أو السكان والعالم الخارجي7. ومع ذلك، لم يتم التحقيق في الاختلافات في شبكات الارتباط التي شكلتها المجموعات الميكروبية في ظل ظروف بيئية مختلفة. الغرض من البحث المقدم في هذه الورقة هو تقديم رؤى وتفاصيل حول التنفيذ السريع لوغاريتم WGCNA لبناء شبكة مشتركة من عينات الميكروبيوم التي تم جمعها في ظل ظروف بيئية مختلفة. وبناء على نتائج التحليل، قمنا بتقييم تكوين السكان واختلافاتهم وناقشنا العلاقة بين المجموعات الميكروبية المختلفة. تم تطبيق التدفق الأساسي التالي من خوارزمية شبكة الارتباطالمرجحة 8. أولا، يجب إنشاء مصفوفة تشابه عن طريق حساب معامل ارتباط Pearson بين ملفات تعريف التعبير وحدات التصنيف التشغيلية (OTU). ثم، تم اعتماد معلمات وظائف التجاور (السلطة أو وظائف التجاور sigmoid) مع معيار طوبولوجيا خالية من النطاق، تم تحويل مصفوفة التشابه إلى مصفوفة التجاور، وكل شبكة مشتركة بين حدوث تتوافق مع مصفوفة التجاور. استخدمنا متوسط التجميع الهرمي للربط إلى جانب الاختلاف القائم على TOM لتجميع OTUs مع ملامح تعبير متماسكة في وحدات. علاوة على ذلك، قمنا بحساب العلاقة بين الإحصاءات المحافظة ووحدات تحليل المعلمات ذات الصلة، وأخيرا تحديد وحدة الإرسال الكبرى المحورية في الوحدة النمطية. وهذه الأساليب مناسبة بشكل خاص لتحليل الاختلافات في هياكل الشبكات بين مختلف المجموعات الميكروبية في ظل ظروف بيئية متباينة. في هذه المخطوطة، قمنا بوصف طريقة تطوير شبكة التعبير المشترك بالتفصيل، وتحليل الانحرافات بين الوحدات، وقدمنا لمحة عامة موجزة عن الخطوات في الإجراء المطبق للحصول على الأنواع الأساسية في شبكات الوحدات المختلفة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. تنزيل البيانات
- تحميل البيانات من الانضمام PRJNA386367 شكل قاعدة بيانات NCBI. من بيانات الانضمام PRJNA386367، حدد بيانات ميكروبيوم رهيزوسفير ورهيزوبلان والاندوسفير من نباتات الأرز التي نمت لمدة 14 أسبوعا في حقل أرباكل المغمور في أربوكل، كاليفورنيا في عام 2014.
ملاحظة: تم عرض بيانات الميكروبيوم الخاصة ب rhizosphere و rhizoplane و الميكروبيوم المحيط المحيطي من قبل جدول OTUs في الانضمام PRJNA386367.
2. تحديد قيمة الطاقة الأمثل
ملاحظة: تحتوي حزمة WGCNA على كافة المعلمات الوظيفية التالية. WGCNA هو حزمة R لتحليل شبكة الارتباط المرجح. تشير خطوط الأوامر الرئيسية إلى الملحق S1.
- في بيئة اللغة R، افتح برنامج Rstudio وتثبيت حزمة WGCNA.
- تحميل البيانات واستخدام الدالة goodSamplesGenes للتحقق من صحة البيانات. تنفيذ أسطر الأوامر:
"gsg = goodSamplesGenes(datExpr0، مطول = 3)
gsg $allOK "
انقر فوق تشغيل. - تحقق من القيم المتطرفة وتخزين العينات التي تلبي المتطلبات. عندما تكون نتيجة التحقق TRUE، تابع إلى الخطوة التالية. حفظ النتيجة.
- استخدم الدالة PickSoftThreshold لحساب الفهرس R2 الخالي من المقياس من مجموعتي البيانات ضمن قيم طاقة مختلفة. تنفيذ سطر الأوامر:
"sft = pickSoftThreshold(datExpr0، powerVector = القوى، مطول = 5)"
انقر فوق تشغيل. - تصور النتائج (الشكل 1). تنفيذ سطر الأوامر:
"مؤامرة (sft $fitIndices[,1], -sign(sft$fitIndices[,3])*sft$fitIndices[,2],
xlab ="العتبة الناعمة (قوة)",ylab="مقياس طبولوجيا حرة نموذج صالح,موقع R ^2",type="n",
الرئيسية = لصق("ES_Scale الاستقلال"))؛
text(sft$fitIndices[,1], -sign(sft$fitIndices[,3])*sft$fitIndices[,2],
تسميات = القوى، cex = cex1، col ="أحمر")؛
abline(h=0.9,col="أحمر")
مؤامرة (sft $fitIndices[,1], sft $fitIndices[,5],
xlab ="العتبة الناعمة (قوة)",ylab="متوسط الاتصال", اكتب ="n",
الرئيسي = لصق("ES_Mean الاتصال"))
text(sft$fitIndices[,1], sft$fitIndices[,5], التسميات =القوى, cex=cex1,col="red")"
انقر فوق تشغيل.
ملاحظة: فرضية خوارزمية شبكة الارتباط المرجح هو أن بنية شبكة التعبير المشترك المنشأة تتوافق مع معايير معيار الطوبولوجيا الخالي من المقياس، مما يزيد من متانتها. يشير فهرس خال من المقياس أقرب إلى 1 إلى بنية شبكة اتصال أقرب إلى الشبكة الخالية من المقياس. - حدد قيمة الطاقة عندما يكون الفهرس R2 الخالي من المقياس مربع أكبر من 0.9 ثم انتقل إلى الخطوة التالية من التحليل.
ملاحظة: عندما يكون الفهرس الخالي من المقياس قريبا من 1، تكون بنية الشبكة أقرب إلى الشبكة الخالية من المقاييس. عند تحليل شبكتين أو أكثر، من الضروري اختيار جعل كل شبكة قريبة من قيمة الطاقة للشبكة الخالية من النطاقات لتلبية إمكانية المقارنة بين الشبكات المشتركة.
3. بناء شبكة التعبير المشترك وتحديد وحدة
ملاحظة: استنادا إلى قيمة الطاقة المحسوبة أعلاه، يتم إنشاء شبكة التواجد المشترك. تشير خطوط الأوامر الرئيسية إلى الملحق S2.
- استخدم دالة التجاور في حزمة WGCNA لإضافة معلمات موقعة لإنشاء شبكة مشاركة رمزية. تنفيذ سطر الأوامر:
"التجاور = التجاور (datExpr0، الطاقة = softPower)"
انقر فوق تشغيل. - تطبيق الدالة TOM-التشابه لتطوير شبكة تداخل طوبولوجية وحساب شبكة الاختلاف. تنفيذ سطر الأوامر:
"توم = التجاور(التجاور)؛
ديستوم = 1-توم"
انقر فوق تشغيل.
ملاحظة: تمت إضافة المعلمة الموقعة لتعيين نوع شبكة اتصال تراكب الطوبولوجيا. - استخدم الدالة hclust لتحديد أسلوب التجميع الهرمي للربط المتوسط للتكتل الهرمي. تنفيذ سطر الأوامر:
"geneTree = hclust (as.dist(dissTOM)، طريقة = "متوسط")؛
انقر فوق تشغيل. - استخدام وظيفة cutreeDynamic لأداء قطع فرع الحيوية وتعيين المعلمة minClusterSize إلى 30. الحصول على نتيجة التعرف على الوحدة النمطية. تنفيذ سطر الأوامر:
"dynamicMods = cutreeDynamic(dendro = geneTree، distM = dissTOM، deepSplit = 2، pamRespectsDendro = FALSE، minClusterSize = minModuleSize)؛ "
انقر فوق تشغيل.
ملاحظة: قد لا يكون الحد الأدنى لحجم الوحدة النمطية أقل من 30. - حساب الوحدة eigen من كل وحدة OTUs بواسطة moduleEigenes دالة. تنفيذ سطر الأوامر:
"MEList = moduleEigenes(datExpr0، ألوان = ألوان ديناميكية)
MEs = MEList $eigengenes"
انقر فوق تشغيل.
ملاحظة: تمثل الوحدة النمطية eigen مستوى التعبير OTU الكلي في الوحدة النمطية. لم يكن وحدة وحدة الإرسال الكبرى محددة، ولكن العنصر الرئيسي الأول لكل كتلة التي تم الحصول عليها عن طريق تحليل قيمة الشبكة المفرد. - قم بأداء وظيفة الكتلة استنادا إلى معامل الارتباط للوحدة eigen. استخدم دالة mergeCloseModules لدمج الوحدات النمطية بقيمة أقل من 0.25. تنفيذ سطر الأوامر:
"دمج = mergeCloseModules (datExpr0، الألوان الديناميكية، cutHeight = MEDissThres، مطول = 3)"
انقر فوق تشغيل. - وأخيرا، استخدم الدالة plotDendroAndColors التصور للحصول على الرسم التخطيطي عرض تعيين الوحدة النمطية لكل شبكة التعبير المشترك(الشكل 2). استخدم دالة الجدول لاستخراج إسناد الوحدة النمطية المطابق لكل OTin جدول تعيين الوحدة النمطية. تنفيذ سطر الأوامر:
"plotDendroAndColors (geneTree،mergedColors، "ديناميكية مدمجة"، dendroLabels = FALSE،
تعليق = 0.03، إضافةجويد = TRUE، guideHang = 0.05،
الرئيسي = "ES_Gene dendrogram وألوان وحدة")"
انقر فوق تشغيل.
ملاحظة: في الرسم التخطيطي تعيين الوحدة النمطية شبكة التعبير المشتركة تمثل ألوان مختلفة الوحدات النمطية المختلفة، ويمثل الرمادي OTUs التي لا يمكن تصنيفها إلى أي وحدة نمطية. يشير عدد أكبر من وحدات OTUs في الوحدة النمطية الرمادية إلى أن جودة المعالجة المسبقة لمصفوفة التعبير في مرحلة مبكرة ضعيفة.
4. مقارنة الوحدة
ملاحظة: يمكن استخدام هذه الطريقة لمقارنة وحدات الشبكة لمجتمعين ميكروبيين إيكولوجيين. في هذه المقالة، قارن الاختلافات بين وحدات الشبكة الميكروبية بين الغلاف المحيطين ورهيزوبلان، والغلاف المحيطي ورهيزوسفير، ورهيزوبلان.
- اختبار الحفظ
- تحميل المعلمات والنتائج من مجموعتي البيانات المحفوظة في الخطوات السابقة.
- تعيين نتيجة تعيين الوحدة النمطية للشبكة لمجموعة من البيانات الميكروبية كمجموعة مرجعية، بينما المجموعة الأخرى كمجموعة اختبار.
- استخدم دالة modulePreservation لحساب قيم المعلمات الإحصائية المحافظة Z_summary و medianRank. تنفيذ سطر الأوامر:
"system.time({mp=modulePreservation(multiExpr,
متعدد الألوان، referenceNetworks = 1،
nالتكفير =100, عشوائيSeed=1,quickCor=0,مطول=3)})"
انقر فوق تشغيل.
ملاحظة: يمكن قياس هذه النتيجة المحافظة بين الوحدات النمطية. Z_summary>10 يشير إلى أن وحدتين يتم الحفاظ عليها بشكل كبير، في حين أن Z_summary<2 يشير إلى وحدات غير محفوظة. medianRank يعبر عن الحفاظ النسبي للوحدة تقييمها حسب الترتيب. تشير القيم المتوسطة الأعلى إلى الوحدات النمطية غير المحفوظة. (خطوط الأوامر الرئيسية تشير إلى الملحق S3.) - استخدم وظيفة الرسم لتصور النتائج (الشكل 3). الحصول على المعلمات Z_summary و المتوسطالنضومتر (الجدول 1).
ملاحظة: وحدات الشبكة التي تفي كل من قيمة Z_summary أقل من 2 وقيمة الرتبة المتوسطة في الأعلى، هي الوحدة النمطية الأكثر غير المحفوظة في مجتمعين ميكروبيين إيكولوجيين. - استنادا إلى نتائج المعلمات الإحصائية المذكورة أعلاه لتحديد وحدة نمطية مع معظم وحدة غير محفوظة للغاية من الشبكتين.
- تحليل الارتباط لعضوية الوحدة النمطية
- تعيين نتائج تعيين الوحدة النمطية لشبكتي تم تعيين كمرجع ومجموعة الاختبار على التوالي.
ملاحظة: يجب أن تكون الإعدادات هي نفسها اختبار Preservation. - استخدم الدالة corPvalueStudent لاستخراج قيمة kME (عضوية الوحدة النمطية) لكل وحدة الإرسال الكبرى في عدة وحدات نمطية المرشح.
تنفيذ سطر الأوامر:
"Pvalue = as.data.frame (كوربفالويسستودنت(as.matrix
(وحدة عضو)، عينات)"
انقر فوق تشغيل.
ملاحظة: kME تعني درجة عضوية الوحدة النمطية. ME لتقف على وحدة eigen، والذي يمثل المستوى العام للتعبير وحدة الوحدة في وحدة نمطية. kME هو معامل الارتباط بين كل وحدة حرارية بريطانية و ME. تحديد أهمية وحدة الإرسال الكبرى في الشبكة حسب قيمة kME ل OTU. (خطوط الأوامر الرئيسية تشير إلى الملحق S4.) - ثم استخدم الدالة مطولةScatterplot لحساب معامل الارتباط قيمة kME من OTUs المقابلة في الشبكتين ورسم الرسم التخطيطي تحليل الارتباط(الشكل 4).
تنفيذ سطر الأوامر:
"مطولالكاتربيرلوت (القيمة المطلقة(TModuleMembership
[TmoduleGenes, تكولومن]),
القيمة المطلقة (NModuleMembership[NmoduleGenes, نكولومن]),
xlab = لصق ("kME في" ، "ES") ،
ylab = لصق ("kME في" ، "RP") ،
الرئيسي = لصق("lightyellow") ،
cex.main = 1.7، cex.lab = 1.6، cex.axis = 1.6، col = وحدة تلوين)"
انقر فوق تشغيل. - حدد الوحدة النمطية ذات معامل الارتباط الأصغر لقيمة kME لوحدة الإرسال الكبرى للشبكتين. خذ بعين الاعتبار هذه الوحدة النمطية أن يكون أكبر فرق بين شبكتي الاتصال.
- تعيين نتائج تعيين الوحدة النمطية لشبكتي تم تعيين كمرجع ومجموعة الاختبار على التوالي.
5. تحليل وحدة الشبكة التفاضلية الميكروبية
- الحصول على بيانات البكتيريا المهيمنة phyla من خلال التحليل الإحصائي لمجموعة تسلسل وحدة الوحدة مع أكبر الفرق.
ملاحظة: يتم تلخيص مجموعة تسلسل وحدة الوحدة النمطية مع الفرق الأكبر بواسطة تصنيف phyla. شكلت البكتيريا المهيمنة فيلا أكثر من 10٪. - ثم استخدم الدالة exportNetworkToCytoscape للحصول على الملف الذي يحتوي على معلومات علاقة التفاعل من وحدة الإرسال الكبرى في الوحدة النمطية التفاضلية أكبر.
تنفيذ سطر الأوامر:
"cyt = التصديرNetworkToCytoscape(modTOM،
edgeFile = لصق ("NEW-ES_CytoscapeInput-الحواف-", وحدات , ".txt", sep =""),
nodeFile = لصق ("NEW-ES_CytoscapeInput-العقد-", وحدات نمطية, ".txt", sep=")
مرجح = TRUE، عتبة = 0.5، العقدةأسماء = modProbes،
altNodeNames = modGenes، العقدةمتغير = وحدة ألوان [inModule])"
انقر فوق تشغيل. - استيراد الملف إلى Cytoscape. تعيين العتبة إلى 0.5 وضبط المعلمات الأخرى حسب الحاجة.
- بناء شبكة مشتركة من الكائنات الحية الدقيقة التفاضلية (الشكل 5).
- الحصول على معلومات من جنس الأساسية التي لها أهم دور تنظيمي في الشبكة.
ملاحظة: وفقا لقيمة kME OUT، يمكن تعريف جنس الأساسية. - وأخيرا، تم تقييم وظائف الجنس الأساسي وتحليل تأثيره على شبكة الفرق بأكملها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم تحميل النتائج التمثيلية في هذه المقالة من 2014 كاليفورنيا Abaker الأرز الجذر الميكروبيوم البيانات في قاعدة بيانات NCBI (PRJNA386367)9. وتشمل البيانات عينات الميكروبيوم من نباتات الأرز التي تزرع لمدة 14 أسبوعا في حقل أرز مغمور بالمياه. استخدمنا خوارزمية WGCNA لتحديد قيمة الطاقة التي تلبي الشبكات الثلاث التي كانت قريبة من الشبكة الخالية من النطاق(الشكل 1)وطورنا ثلاث شبكات تعبير مشترك(الشكل 2). وفي المحيطي، تم تحديد شبكة التعبير المشترك الميكروبية للتربة، وهي رهيزوبلان، ورهيزوسفير، 23 و22 و21 وحدة على التوالي. وتشير هذه النتائج إلى أن أعداد شبكات التفاعل الميكروبية في المنافذ الثلاثة كانت متساوية أساسا.
كما قارنا الاختلافات في وحدات الشبكة الميكروبية داخل التربة الاندوسفيرية والرهيزوبلان والرهيزوسفير. تم الحصول على نتائج اختبار الحفظ التالية لوحدات مجموعات المنافذ الثلاث. وتوجد ثلاث وحدات غير محفوظة للغاية بين تربة الرهيزوسفير ورهيزوبلان(الشكل 3أ، الجدول 1). بالإضافة إلى ذلك، كانت هناك تسع وحدات غير محفوظة للغاية بين تربة رهيزوسفير والغلاف المحيطي(الشكل 3ب، الجدول 2)وست وحدات غير محفوظة للغاية بين الرهيزوبلان والغلاف المحيطي(الشكل 3c، الجدول 3). وعلاوة على ذلك، تم العثور على وحدات غير محفوظة للغاية بين المنافذ الثلاثة، مما يشير إلى وجود اختلافات كبيرة في تكوين الكائنات الحية الدقيقة بين المنافذ الثلاثة. ويتضح في الشكل 4نتائج تحليل ارتباط عضوية الوحدة النمطية للوحدات غير المحافظة التي تم الحصول عليها. من هذا الرقم ، وحدة مختلفة إلى حد كبير مع أقل ارتباط بين كل مكانين واضح بين المنافذ الثلاثة ، والتي تمثل الفرق الأكثر أهمية بينهما.
في شبكة الفرق بين رهيزوسفير ورهيزوبلان(الشكل 5أ)،كان الفيلوم المهيمن هو Proteobacteria (72.97٪). في شبكة الفرق بين الرهيزوسفير والغلاف المحيطي(الشكل 5ب)،كانت الفيلا المهيمنة هي بروتيوباكتيريا (66.36٪)، أكتينوبكتيريا (10.1٪)، والبكتيريا (10.9٪). في شبكة الفرق بين الرهيزوبلان والغلاف الداخلي(الشكل 5c)،كانت الفيلا المهيمنة هي Proteobacteria (41.41٪)، والبكتيريا (10.10٪)، Firmicutes (12.12٪)، وفيروكوميكروبيا.
ثلاثة أجناس أساسية (الشكل 5a)، بما في ذلك رودوباكتر ونوفوسفينغونيوم، ستة أجناس أساسية (الشكل 5ب) ، بما في ذلك Blvii28 وDechloromonas، وخمسة أجناس أساسية (الشكل 5c) ، بما في ذلك Cellvibrio و Geobacter، مارست وظائف تنظيمية هامة في شبكات الحدوث المشترك التفاضلية الثلاث. وكان لجميع الأجناس الأساسية، باستثناء ديكلوروموناس،تأثير على شبكة واحدة فقط، مما يشير إلى توافر اختلافات كبيرة في الوفرة النسبية للتجمعات والأنواع الميكروبية بين المنافذ الثلاثة لجذور الأرز، مما أثر بشكل خطير على وفرة وتنوع المجتمعات الميكروبية الجذرية القائمة.
جنس الأساسية Azospirillum, موجودة في شبكة الفرق بين رهيزوسفير والغلاف المحيط من الأرز, شارك في تثبيت النيتروجين وتعزيز نمو النبات10. بالإضافة إلى ذلك، قد يكون جنس Geobacter، الذي تم إثراءه بشكل كبير في شبكة فرق الهيزوبلان-إندوسفير، العامل الرئيسي الذي يحفز على الحد من أكاسيد Fe و Mn غير القابلة للذوبان في العديد من التربة والرواسب11. وتتفاعل هذه الكائنات الدقيقة مع مجموعة من المجتمعات الميكروبية في منافذ الجذر وتشارك بنشاط في تنظيم الشبكات الميكروبية، وهو ما قد يكون بالغ الأهمية لنمو جذور الأرز وتطويرها.
الشكل 1. تقييم الطاقة في مجموعات البيانات. (أ) تقييم β القدرة في مجموعة بيانات ES؛ (ب) تقييم β القدرة في مجموعة بيانات جمهورية ر.م. (ج) تقييم β الطاقة في مجموعة بيانات RP، وتوزيع المؤشر R2 الخالي من المقاييس (يسار)، وتوزيع متوسط الاتصال (يمين) على طول مؤشرات القوة الناعمة المختلفة. تم تحقيق قيمة أفضل قوة عندما اتجه R2 إلى التشبع ولم يكن أقل من 0.8. وكان لا بد من تعيين شبكات التعبير المشترك الثلاث إلى نفس قيمة الطاقة لضمان قابليتها للمقارنة. (RS: تربة الرهيزوسفير، RP: رهيزوبلان، وES: الغلاف المحيطي). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. dendrogram وحدة الوحدة التي تم الحصول عليها عن طريق التجمع الهرمي الربط المتوسط. (أ)وحدة مكافحة الإرهاب dendrogram من شبكة ES؛ (ب) وحدة مكافحة الإرهاب من شبكة RS؛ (ج) وحدة مكافحة الإرهاب من شبكة RP. يشير صف الألوان أسفل مخطط الألوان إلى تعيين الوحدة النمطية الذي تحدده خوارزمية قطع الشجرة الديناميكية. (RS: تربة الرهيزوسفير، RP: رهيزوبلان، وES: الغلاف المحيطي) يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. نتائج اختبار الحفظ. (أ) تستند نتائج التحليل إلى تخصيص وحدة شبكة التعبير المشترك RS كمجموعة مرجعية ونتائج تخصيص وحدة شبكة التعبير المشترك RP كمجموعة اختبار؛ (ب) تستند نتائج التحليل إلى تخصيص وحدة شبكة التعبير المشترك ES كمجموعة مرجعية ونتائج تخصيص وحدة شبكة التعبير المشترك RS كمجموعة اختبار؛ (ج) تستند نتائج التحليل إلى تخصيص وحدة شبكة التعبير المشترك ES كمجموعة مرجعية ونتائج تخصيص وحدة شبكة التعبير المشترك RP كمجموعة اختبار. Z_summary > 10 يشير إلى أن وحدتين يتم الحفاظ عليها بشكل كبير، في حين أن Z_summary < 2 يشير إلى وحدات غير محفوظة. medianRank يعبر عن الحفاظ النسبي للوحدة تقييمها حسب الترتيب. تشير القيم المتوسطة الأعلى إلى الوحدات النمطية غير المحفوظة. (RS: تربة الرهيزوسفير، RP: رهيزوبلان، وES: الغلاف المحيطي) يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4. تحليل الارتباط لعضوية الوحدة النمطية. (أ) ارتباط الوحدة النمطية لقيمة kME بين شبكة RS وRP؛ (ب) ارتباط الوحدة النمطية لقيمة kME بين RS وRP؛ (ج) ارتباط الوحدة لقيمة ال kME بين شبكة RP وES (RS: تربة الرهيزوسفير، RP: رهيزوبلان، ES: الغلاف المحيطي، وKME: عضوية الوحدة). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5. شبكة مشتركة من الميكروبات التفاضلية في جذر الأرز. (أ)شبكة مشتركة من مجموعات الميكروبات التفاضلية في RS-RP؛ (ب) المشاركة في حدوث شبكة من التجمعات الميكروبية التفاضلية في ES-RS؛ (ج) شبكة مشتركة من التجمعات الميكروبية التفاضلية في ES-RP. تم إجراء التحليل باستخدام برنامج Cytoscape. تمثل ألوان مختلفة بوابات مختلفة في الشكل. (RS: تربة رهيزوسفير، RP: رهيزوبلان، وES: الغلاف المحيطي). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| الوحده النمطيه | متوسط ترتيب | زوماري | الوحده النمطيه | متوسط ترتيب | زوماري |
| غرينيلو | 2 | 14 | أصفر | 13 | 5.2 |
| وردي | 2 | 17 | رمادي60 | 14 | 3.1 |
| منتصف الليل الأزرق | 3 | 10 | رويال بلو | 15 | 2.1 |
| أسمر | 4 | 18 | أسود | 16 | 2.7 |
| لايتسيان | 6 | 8.5 | تان | 17 | 3.2 |
| بنفسجي | 7 | 10 | سلمون | 18 | 1.3 |
| أزرق | 7 | 22 | الارجواني | 18 | 2.2 |
| أخضر | 8 | 12 | مظلمة | 20 | -0.24 |
| سيان | 10 | 4.8 | ذهب | 20 | 14 |
| لايتغرين | 11 | 5.1 | داركغرين | 22 | -1.1 |
| لايتيلو | 12 | 5.3 | رمادي | 22 | 0.21 |
| أحمر | 12 | 6.1 |
الجدول 1 - الجداول نتيجة Zsummary و المتوسطمتوسط بين التربة رهيزوسفير ورهيزوبلان.
| الوحده النمطيه | متوسط ترتيب | زوماري | الوحده النمطيه | متوسط ترتيب | زوماري |
| سلمون | 1 | 19 | لايتسيان | 13 | 1.1 |
| أسود | 3 | 5.3 | أحمر | 15 | 0.95 |
| أصفر | 4 | 5.8 | منتصف الليل الأزرق | 15 | -0.0016 |
| لايتغرين | 5 | 0.27 | رويال بلو | 16 | 0.83 |
| غرينيلو | 7 | 3 | الارجواني | 16 | 0.52 |
| الظلام | 7 | 1.2 | داركغرين | 17 | 0.16 |
| رمادي60 | 9 | 1.1 | تان | 18 | 0.64 |
| أزرق | 10 | 3.9 | لايتيلو | 19 | 0.52 |
| بنفسجي | 10 | 2.3 | مظلمة | 19 | -0.18 |
| أسمر | 12 | 2.3 | وردي | 19 | -0.71 |
| سيان | 12 | 0.78 | ذهب | 21 | 11 |
| أخضر | 13 | 1.7 |
الجدول 2 - الأرباح نتيجة Zsummary و المتوسطابين بين التربة والغلاف المحيطي rhizosphere.
| الوحده النمطيه | متوسط ترتيب | زوماري | الوحده النمطيه | متوسط ترتيب | زوماري |
| أسود | 1 | 15 | الظلام | 13 | 1.7 |
| سلمون | 2 | 27 | منتصف الليل الأزرق | 13 | 1.6 |
| أصفر | 3 | 13 | لايتغرين | 13 | 0.64 |
| سيان | 4 | 5.4 | داركغرين | 14 | 1.5 |
| أزرق | 8 | 3.9 | مظلمة | 16 | 1.5 |
| لايتسيان | 9 | 2.6 | بنفسجي | 17 | 2.3 |
| وردي | 10 | 3.6 | غرينيلو | 18 | 0.8 |
| رويال بلو | 10 | 1.5 | لايتيلو | 18 | 0.42 |
| أسمر | 12 | 2.9 | الارجواني | 19 | 0.2 |
| أخضر | 12 | 1.9 | ذهب | 21 | 18 |
| أحمر | 12 | 1.9 | رمادي60 | 21 | -0.21 |
| تان | 13 | 2.5 |
الجدول 3 - الأرباح نتيجة Zsummary و المتوسطمتوسط بين رهيزوبلان والغلاف المحيطي.
الملحق S1: الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.
الملحق S2: الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.
الملحق S3: الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.
الملحق S4: الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد استخدمت شبكات الارتباط بشكل متزايد في تطبيقات المعلوماتية الحيوية. WGCNA هو أسلوب بيولوجيا النظم للتحليل الوصفي للعلاقات بين العناصر المختلفة للنظام البيولوجي12. تم استخدام حزمة برامج R في العمل في وقت سابق على WGCNA13،14،15. وتشمل الحزمة وظائف لبناء الشبكة ، والكشف عن وحدة ، وحسابات الخصائص الطوبولوجية ، ومحاكاة البيانات ، والتصور ، والقدرة على التفاعل مع البرامج الخارجية. وقد تم استخدام WGCNA على نطاق واسع لتحليل بيانات التعبير الجيني من سرطان الدماغ16، دورة خلايا الخميرة17، علم الوراثة الماوس18،19، أنسجة الدماغ الرئيسيات20،21، مرض السكري22، والنباتات23. يجب أن يتضمن استخدام تحليل شبكة الارتباط الجيني المرجح لإنشاء الشبكة عينة 8 على الأقل. ركزنا في هذه المقالة على شبكات التعبير المشترك الجيني التي تصف التفاعلات بين المجموعات الميكروبية في بيئات مختلفة. حصلنا على شبكات تفاضلية بين المجموعات الميكروبية في بيئات متباينة وحددنا الأنواع الرئيسية في كل شبكة. وقد استخدمت على نطاق واسع فكرة أن الأنواع الرئيسية مهمة للمجتمع في بحوث شبكة الغذاء24. بعض الأنواع في مجتمع ميكروبي معقد يمكن أن تكون ضرورية للحفاظ على استقرار ووظائف المجتمع، مثل البكتيريا في النباتات المعوية25. ويمكن تبسيط تحليل المجتمعات الميكروبية إلى حد كبير من خلال استهداف أنواع محددة ذات أهمية محتملة.
تسلط النتائج التمثيلية لدينا الضوء على الاختلافات في المجتمعات الميكروبية ، والتي يمكن تحديدها باستخدام الطريقة المذكورة أعلاه. هنا، تعرضت الكائنات الحية الدقيقة في منافذ مختلفة من نظام جذور الأرز إلى WGCNA. وتم تحديد الفرق بين المنافذ الثلاثة باستخدام تحليلات المحافظة وعضوية الوحدة النمطية. حددنا الأنواع الرئيسية في وحدات الفرق وحصلنا على معلومات عن الاختلافات في تكوين المجتمعات الميكروبية في المنافذ الثلاثة. وفي الوقت نفسه، كشفت شبكة الحدوث المشترك عن وجود تفاعل كبير بين الكائنات الحية الدقيقة المتغيرة في جذور الأرز. تقدم النتائج التي توصلنا إليها أدلة مباشرة على أهمية وجدوى WGCNA في تقييم الاختلافات المجتمعية الميكروبية في بيئات مختلفة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
Acknowledgments
تم دعم تطوير هذه المخطوطة بأموال من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية التابعة لمشروع مركز أبحاث العلوم في حكومة إقليم الصين-قويتشو (U1812401)، ومشروع أبحاث الدكتوراه في جامعة قويتشو العادية (GZNUD[20). 17]1)، مشروع دعم العلوم والتكنولوجيا في مقاطعة قويتشو (QKHZC[2021]YB459) ومشروع العلوم والتكنولوجيا في قوييانغ([2019]2-8).
ويود المؤلفون أن يشكروا إدواردز ج. أ. وآخرين على توفير بيانات ميكروبيوم الأرز في قواعد البيانات العامة والدعم المقدم من TopEdit (www.topeditsci.com) على مساعدته اللغوية أثناء إعداد هذه المخطوطة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| R | The University of Auckland | version 4.0.2 | R is a free software environment for statistical computing and graphics. It compiles and runs on a wide variety of UNIX platforms, Windows and MacOS. |
| RStdio | JJ Allaire | version 1.4.1103 | The RStudio IDE is a set of integrated tools designed to help you be more productive with R and Python. |
| Cytoscape | version 3.7.1 | Cytoscape is an open source software platform for visualizing complex networks and integrating these with any type of attribute data. | |
| NCBI database | The National Center for Biotechnology Information advances science and health by providing access to biomedical and genomic information. |
References
- Philippot, L., Raaijmakers, J. M., Lemanceau, P., vander Putten, W. H. Going back to the roots: the microbial ecology of the rhizosphere. Nature Reviews Microbiology. 11, 789-799 (2013).
- Fierer, N. Embracing the unknown: disentangling the complexities of the soil microbiome. Nature Review Microbiology. 15 (10), 579-590 (2017).
- Jin, J., Wang, G. H., Liu, X. B., Liu, J. D., Chen, X. L., Herbert, S. J. Temporal and spatial dynamics of bacterial community in the rhizosphere of soybean genotypes grown in a black soil. Pedosphere. 19 (6), 808-816 (2009).
- Ma, B., et al. Genetic correlation network prediction of forest soil microbial functional organization. ISME J. 12 (10), 2492-2505 (2018).
- de Vries, F. T., et al. Soil bacterial networks are less stable under drought than fungal networks. Nature Communications. 9 (1), 3033 (2018).
- Colin, C., et al. Correlating transcriptional networks to breast cancer survival: a large-scale coexpression analysis. Carcinogenesis. (10), 2300-2308 (2013).
- Ma, B., Zhao, K., Lv, X., et al. Genetic correlation network prediction of forest soil microbial functional organization. ISME J. 12, 2492-2505 (2018).
- Zhang, B., Horvath, S. A general framework for weighted gene co-expression network analysis. Statistical applications in genetics and molecular biology. 4 (1), (2005).
- Edwards, J. A., et al. Compositional shifts in root-associated bacterial and archaeal microbiota track the plant life cycle in field-grown rice. PLoS Biology. 16 (2), 2003862 (2018).
- Bashan, Y., De-Bashan, L. E. How the Plant Growth-Promoting Bacterium Azospirillum Promotes Plant Growth-A Critical Assessment. Advances in Agronomy. 108, 77-136 (2010).
- Lovley, D. R., et al. Geobacter: The Microbe Electric's Physiology, Ecology, and Practical Applications. Advances in Microbial Physiology. 59, 1 (2011).
- Langfelder, P., Horvath, S. WGCNA: an R package for weighted correlation network analysis. BMC Bioinformatics. 9, 559 (2008).
- Zhang, B., Horvath, S. A General Framework for Weighted Gene Co-expression Network Analysis. Statistical Applications in Genetics and Molecular Biology. 4 (1), 17 (2005).
- Horvath, S., Dong, J. Geometric interpretation of Gene Co-expression Network Analysis. PLoS Computational Biology. 4 (8), 1000117 (2008).
- Langfelder, P., Horvath, S. Eigengene networks for studying the relationships between co-expression modules. BMC Systems Biology. 1, 54 (2007).
- Horvath, S., et al. Analysis of Oncogenic Signaling Networks in Glioblastoma Identifies ASPM as a Novel Molecular Target. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (46), 17402-17407 (2006).
- Carlson, M. R., et al. and Sequence Conservation: Predictions from Modular Yeast Co-expression Networks. BMC Genomics. 7 (1), 40 (2006).
- Fuller, T., et al. Weighted Gene Co-expression Network Analysis Strategies Applied to Mouse Weight. Mammalian Genome. 6 (18), 463-472 (2007).
- Yin, L., Wang, Y., Lin, Y., et al. Explorative analysis of the gene expression profile during liver regeneration of mouse: a microarray-based study[J]. Artificial Cells Nanomedicine & Biotechnology. 47 (1), 1113-1121 (2019).
- Oldham, M., Horvath, S., Geschwind, D. Conservation and Evolution of Gene Co-expression Networks in Human and Chimpanzee Brains. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (47), 17973-17978 (2006).
- Oldham, M. C., et al. Functional organization of the transcriptome in human brain. Nature Neuroscience. 11 (11), 1271-1282 (2008).
- Keller, M. P., et al. A gene expression network model of type 2 diabetes links cell cycle regulation in islets with diabetes susceptibility. Genome Research. 18 (5), 706-716 (2008).
- Weston, D., Gunter, L., Rogers, A., Wullschleger, S. Connecting genes, coexpression modules, and molecular signatures to environmental stress phenotypes in plants. BMC Systems Biology. 2 (1), 16 (2008).
- Jorda´n, F. Keystone species and food webs. Biological Sciences. 364, 1733-1741 (2009).
- Backhed, F., Ley, R. E., Sonnenburg, J. L., Peterson, D. A., Gordon, J. I.
