Summary
Kvantifisering av kneekstensor maksimal styrke er viktig for å forstå funksjonelle tilpasninger til aldring, sykdom, skade og rehabilitering. Vi presenterer en ny metode for å gjentatte ganger måle in vivo kneforlengelse isometrisk topp tetanisk dreiemoment.
Abstract
Skjelettmuskelplastisitet som svar på utallige forhold og stimuli formidler samtidig funksjonell tilpasning, både negativ og positiv. I klinikken og forskningslaboratoriet måles maksimal muskelstyrke langsgående hos mennesker, med kneekstensormuskulatur som det mest rapporterte funksjonelle utfallet. Patologi av kneet extensor muskelkomplekset er godt dokumentert i aldring, ortopedisk skade, sykdom og disuse; kneekstensorstyrke er nært knyttet til funksjonell kapasitet og skaderisiko, noe som understreker viktigheten av pålitelig måling av kneekstensorstyrke. Repeterbar, in vivo vurdering av kneet ekstensor styrke i pre-kliniske gnager studier tilbyr verdifulle funksjonelle endepunkter for studier som utforsker slitasjegikt eller kneskade. Vi rapporterer en in vivo og ikke-invasiv protokoll for gjentatte ganger å måle isometrisk topp tetanisk dreiemoment av kneekstensorene hos mus over tid. Vi viser konsistens ved hjelp av denne nye metoden for å måle kneekstensorstyrke med gjentatt vurdering hos flere mus som gir lignende resultater.
Introduction
Skjelettmuskulatur er et svært tilpasningsdyktig vev med kompenserende endringer i masse og struktur som svar på et utall stimuli, som trening, ernæring, skade, sykdom, aldring og disuse. Mange studier som undersøker skjelettmuskulaturtilpasning hos mennesker, bruker metoder for å måle både skjelettmuskulaturstørrelse og innvirkning på funksjon, da gullstandard styrkevurderinger lett kan gjentas hos mennesker.
Spesielt er kneekstensor og flexor styrke mest vurdert i klinisk forskning. Endringer i kneekstensorstyrke har blitt mye rapportert i menneskelige studier av aldring, trening, ortopedisk skade, kne slitasjegikt, kronisk sykdom og bruk1,2,3,4,5,6,7. Imidlertid har metoder for gjentatte ganger og ikke-invasivt analysere kneekstensormuskel (quadriceps) styrke i mekanistiske gnagerstudier vært relativt begrenset. En metode for å bestemme in vivo quadriceps muskel kontraktilitet hos rotter ble tidligere utviklet8; Det kreves imidlertid omfattende bygging av ikke-kommersielt tilgjengelig utstyr. Gitt bredden av gnagermodeller utviklet for å studere muskuloskeletale utfall etter kneskade / slitasjegikt9,10,11,12,13, eksisterer det behov for ikke-invasiv vurdering av quadriceps styrke.
Videre bruker gnagerstudier som undersøker molekylære mekanismer som underbygger skjelettmuskulaturtilpasning ofte musemodeller på grunn av enkelheten i genetisk modifikasjon, som mange farmakologiske intervensjonsstudier på grunn av de reduserte økonomiske utgiftene forbundet med lavere vektbasert dosering av et stoff hos mus sammenlignet med rotter. Vi rapporterer en ikke-invasiv metode for gjentatte ganger å måle in vivo kne ekstensor funksjon i samme mus over tid ved hjelp av kommersielt tilgjengelig utstyr med mindre modifikasjon, letter reproduserbarhet blant ulike laboratorier, og gir mer direkte sammenligning med menneskelige styrke utfall.
Protocol
Alle eksperimentelle prosedyrer ble godkjent av University of Kentucky Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Oppsett av utstyr
- Kontroller at maskiner er koblet til i henhold til produsentens spesifikasjoner.
- Hvis den ikke allerede er på plass, fest 300D-305C-FP-motoren med kneforlengelsesapparat til 809C dyreplattformen.
- Slå på vannpumpen til 37 °C for å begynne å varme opp plattformen.
- Hvis datamaskinen ikke allerede er på, slår du på datamaskinen, etterfulgt av høyeffekts bifasestimulator og 2-kanals tomodusshåndtakssystem.
- Hell isofluran i fordamper til maksimal påfyllingslinje.
2. Programvareoppsett
- Åpne programvaren (detaljer i Materialliste).
- Hvis du vil bruke funksjonen Øyeblikkelig stimulering sammen med Live Data Monitor til å optimalisere probeplasseringen (trinn 4), velger du Forbered eksperiment etterfulgt av Konfigurer Øyeblikkelig stim (Figur 1). Angi pulsfrekvensen (Hz) som 125, pulsbredde (ms) som 0,2, antall pulser som 1, togfrekvens (Hz) som 0,5 og kjøretid (er) som 120.
- Velg Fil , og åpne Live Data Monitor.
- For å utføre rykninger (trinn 5) og dreiemomentfrekvens (trinn 6) eksperimenter, velg en tidligere programmert studie som inkluderer passende rykninger og dreiemomentfrekvenseksperimenter for kneforlengelse (beskrevet nedenfor i trinn 5 og trinn 6).
- Velg riktig eksperimentell mus eller Legg til nytt dyr og skriv inn tilsvarende museinformasjon som skal lagres med dreiemomentdata.
- Velg Neste eksperiment eller Forrige eksperiment for å gå over fra twitch-protokoll til momentfrekvenssekvens.
3. Oppsett av mus
- Plasser den enkelte musen i bedøvelseskammeret.
- Slipp oksygentankventilen og sett oksygenmengden til 1 L/min med 2,5 % isofluran.
- Pass på at musen forblir i kammeret med lokket godt lukket til den er helt bevisstløs. Bekreft fullstendig bevissthetstap ved fraværende fot refleks med tåklemme.
- Plasser bedøvet mus i en liggende stilling med hodet i nosecone på den oppvarmede plattformen med oksygenstrømningshastighet på 1 l / min med 2,5% isofluran.
- Barber håret fra høyre bakre lem ved hjelp av elektriske clippers. Fjern hår fra det barberte området med en alkoholserviett og et lite vakuum. Rengjør fjernet hår vekk fra bakre lem og plattformen.
- Klem den øvre bakre lemmen godt fast, bakre til kneet (Figur 2).
MERK: Pass på at knebevegelsesområdet ikke hindres. - Plasser den nedre bakre lemmen i kneforlengelsesapparatet med den fremre tibiaen som berører det justerbare plaststykket lett (Kraften i kanalavlesningen skal lese mellom 0 og -1,0 mN * m). Avhengig av størrelsen på musens nedre bakre lem, kan kirurgisk tape pakkes rundt den nederste delen av det justerbare plaststykket slik at benet hviler sikkert.
MERK: Detaljerte bilder og dimensjoner på det spesialfabrikerte plaststykket er vist i tilleggsfigur 1. - Juster knottene på plattformen for å sikre at kneet er bøyd ved 60°.
- Legg lett et stykke tape over overkroppen på plattformen for å forhindre kompenserende bevegelse med maksimal kneforlengelse.
4. Plassering av elektrode
- Plasser elektroder subkutant 2-4 mm proksimalt i kneet rett over quadriceps/kneekstensormuskulaturen (Figur 2). Elektroder skal være ca. 1-2 mm fra hverandre.
- For å bestemme optimal plassering av elektroder, bruk Instant Stimulation-funksjonen med Live Data Monitor. Still inn strømstyrke/strøm på 50 mA for gjentatte rykninger for å bekrefte kneforlengelsen (kneekstensorene vil produsere en negativ rykningskurve). Juster sondene under øyeblikkelig stimulering for å oppnå maksimal dreiemoment for kneforlengelse som målt i Live Data Monitor-vinduet.
MERK: Figur 3 viser en representativ hurtigstimuleringseffekt som bekrefter kneforlengelsen. Tilleggsvideo 1 og tilleggsvideo 2 viser kneekstensor i sanntid og sakte film uten at motorarmen er på plass, noe som gir visuell bekreftelse av kneforlengelse. - Under gjentatte rykninger med øyeblikkelig stimulering, palpate kneet flexor muskler med pekefingeren for å bekrefte ingen aktivering av antagonistiske muskler. For å maksimalt stimulere kneekstensorer, kan sondeplassering være nødvendig avhengig av musens kroppssammensetning og små anatomiske forskjeller i den nøyaktige plasseringen av motorpunktet til lårnerven og kneekstensormuskulaturen.
MERK: Et muskelmotorpunkt er stedet der motorgrenen av en nerve kommer inn i muskelmagen og er punktet med minst motstand mot elektrisk ledningsevne og deretter den høyeste responsen på elektrisk stimulering14,15. I kliniske applikasjoner ved hjelp av elektrisk stimulering identifiseres dette punktet ved å skanne med en penneelektrode for å finne plasseringen over muskelen der en muskelrykning oppstår med den laveste injiserte strømmen14,15. Identifisering av muskelmotorpunktet er viktig for å lette optimal nevromuskulær elektrisk stimulering15. I menneskelige kliniske studier har muskelmotoriske punkter for quadriceps muskler blitt identifisert i den distale halvdelen av muskelen14. For å oppnå optimal kneekstensorstimulering hos mus, ble denne teknikken rekapitulert ved hjelp av elektrodeplassering med øyeblikkelig stimulering til mest omtrentlige muskelmotorpunktplasseringer som vanligvis finnes i den distale halvdelen av kneekstensorer. Det finnes en viss variasjon i elektrodeplassering (fra relativt overfladisk til dyp) som resulterer i maksimalt dreiemoment, og Instant Stimulation-funksjonen letter optimal elektrodeplassering.
5. Bestemmelse av optimal strøm
- Når optimal sondeplassering er bestemt, utfør en rekke progressive rykninger for å bestemme optimal strømstyrke / strøm som skal brukes til dreiemomentfrekvenseksperimentet, med sikte på å bestemme den laveste strømmen for å oppnå maksimal dreiemomentutgang for rykninger. Begynn med gjeldende sett på 50 mA og velg Kjør eksperiment for å produsere en enkelt rykk. Velg Analyser resultater for å vise dreiemomentutgang. Registrer twitch-dreiemomentet som vises under Max Force med baseline trukket fra.
MERK: Velg alternativet for å invertere Kraftkanalen for å konvertere målinger fra negativt dreiemoment til positivt. - Øk strømmen til 60-70 mA og gjenta rykninger eksperiment. Registrer twitch-dreiemomentet som vises under Max Force med baseline trukket fra.
- Fortsett med en rekke rykninger eksperimenter på denne måten (øker ca 10-20 mA med hver progresjon) til twitch dreiemoment ikke lenger øker (enten platåer eller begynner å redusere). Eksempel på twitch-serier vises i Tabell 1.
- Registrer den laveste strømmen der det høyeste rykninger dreiemomentet ble oppnådd. Denne strømmen vil bli brukt og forbli konstant under det kommende kraftfrekvenseksperimentet. Figur 4 viser en representativ topprykning.
6. Dreiemomentfrekvenseksperiment for å bestemme topp isometrisk tetanisk dreiemoment
- I programvaren (se Materialfortegnelser) velger du det forhåndsprogrammerte dreiemomentfrekvenseksperimentet for kneforlengelse som sikrer følgende innstilling. Stimulus varighet: 0.35 s, Frekvenssekvens: 10 Hz, 40 Hz, 120 Hz, 150 Hz, 180 Hz, 200 Hz, Hvileperiode mellom pulser / sammentrekninger: 120 s
MERK: Samplingsfrekvensen er 10 000 Hz (standardinnstilling). - Kjør Eksperiment, Analyser resultater, og registrer dreiemomentet som vises manuelt under Max Force med baseline trukket fra (sørg for at kraftkanalen er invertert, da kneekstensorkontraksjon vil gi negativt dreiemoment) ved hver frekvens. Legg merke til den høyeste Max Force-verdien som det høyeste isometriske tetaniske dreiemomentet. Eksempel på dreiemomentfrekvensdata er vist i tabell 2 og figur 5 viser en representativ stivkrampekurve for topp isometrisk tetanisk dreiemomentutgang oppnådd ved 120 Hz.
7. Avslutning av eksperiment
- Når dreiemomentfrekvenseksperimentet er fullført, utfører du en oppfølgingsrykning og sammenligner med den første topprykningen på samme strøm for å vurdere skade / tretthet.
MERK: I noen modeller av skade og sykdom forventes økt fatigabilitet av skjelettmuskulaturen og utgjør ikke et problem med det eksperimentelle oppsettet eller musen. - Når alle dreiemomentmålinger er fullført, fjerner du elektrodesondene forsiktig og løsner kneet.
- Slå av isofluran og fjern musen fra nesekjeglen.
- Plasser musen tilbake i et passende bur plassert på toppen av en varmepute. Overvåk når musen gjenoppretter og gjenvinner bevisstheten.
MERK: Musen skal være bevisst og bevege seg innen 2-3 min.
8. Dataanalyse
- Trekk ut data etter eksperimentet fra analyseprogramvaren (se Materialfortegnelser).
- Programvare for åpen analyse.
- Velg Hent data fra programvaren.
- Velg datoen da eksperimentet ble utført og passende musekode.
- Velg frekvensen av interesse (alle twitch eksperimenter og hver frekvens av dreiemoment-frekvens eksperimentet vil bli oppført).
- Velg Muskelanalyse.
- Kontroller at det er merket av for Bruk rettelse av opprinnelig plan.
MERK: Baseline dreiemoment beregnes av programvaren som gjennomsnittet av de første 100 punktene samplet og trukket fra den absolutte maksimale dreiemomentverdien. - Registrer dreiemomentverdien som er oppført under Maksimum.
MERK: Data som presenteres her er ufiltrert; Et filter kan imidlertid velges i programvaren, hvis ønskelig.
- Alternativt, som beskrevet ovenfor i trinn 6.2, kan du manuelt registrere dreiemomentutgangen som vises under Max Force i sanntid ved hvert dreiemomentfrekvenspunkt / sammentrekning gjennom vinduet Analyser resultater.
- Kontroller at grunnlinjen er trukket fra, og at kraftkanalen er invertert.
- Legge inn data i et regneark for normaliseringsberegninger av kroppsvekt (dreiemoment/kroppsvekt i gram) og grafiske og statistiske analyser av interesse. Statistisk programvare ble brukt med det formål å grafere dreiemomentfrekvenskurver og beregningsområde under kurven.
MERK: Dreiemomentdata måles i mN.m (milliNewton.meters).
- Hvis du vil generere stivkrampekurver, eksporterer du fullstendige data fra hver frekvens fra analyseprogramvaren.
- Gjenta trinn 8.1.1-8.1.4 ovenfor.
- Velg Eksporter data.
- Velg Rå filtrerte data, og lagre i ønsket plassering. MATLAB kan brukes til å generere stivkrampekurver fra den eksporterte tekstfilen og/eller til videre analyse.
MERK: MATLAB-kode for å generere stivkrampekurve fra tekstfil er tilgjengelig på forespørsel.
9. Kalibrering av tomodussspaksystem
- Kalibrer systemet før første gangs bruk for å sikre nøyaktige og pålitelige data, og gjenta kalibreringen med jevne mellomrom ved hjelp av datainnsamlingsprogramvaren og kjente vekter.
- Åpne programvare for datainnsamling.
- Klikk kategorien Oppsett , og velg Kanaloppsett.
- Velg 305C-FP oppført under Mine instrumenter.
- Klikk Kalibrer valgt for å åpne Kalibreringsredigering-vinduet.
- For å kalibrere lengden, skriv inn en rekke testspenninger, inkludert både negative og positive spenninger (f.eks. -3, -2, -1, 0, 1, 2, 3 V).
- Klikk Angi for den første linjen.
- Klikk Les.
- Mål den nøyaktige lengden på spakarmen i millimeter og skriv inn i den tilsvarende boksen.
- Gjenta for neste spenning.
- Ved registrering av alle spenninger, klikk beregn kalkfaktorer (registrert i mm / volt).
- For å kalibrere kraft inn, bruk et sett med kjente vekter som øker i en lineær progresjon.
- Juster motoren slik at den hviler på kanten av benken eller bordet med spakarmen parallelt med benken og henger over kanten slik at vekten henger.
- Heng den første vekten fra spakarmen ved hjelp av et gummibånd. Under Applied Forceskriver du inn den kjente vekten i gram som står for massen av gummibåndet.
- Velg Les.
- Gjenta for minst 3 kjente vekter.
- Velg Beregn beregningsfaktor.
- Hvis du vil kontrollere beregningen, tegner du inn kalibreringsdata og kurvetilpasning ved å velge Tegn kal .
- For å kalibrere kraften ut, angi kalibreringsspenninger (opptil 10 volt)
- Klikk på Still inn rett ved siden av kalibreringsspenningen.
- Gjenta for hver spenningslinje.
- Trykk forsiktig på spakarmen med en finger til Force Out slutter å skifte og motorarmen begynner å bevege seg.
- Oppretthold denne posisjonen. Velg Les.
- Gjenta for hver spenningslinje.
- Velg Beregn beregningsfaktor.
Representative Results
Dreiemomentfrekvenskurven bruker lavere frekvenser for å produsere flere isolerte isometriske rykninger med relativt lavt dreiemoment og utvikler seg gjennom stadig høyere frekvenser, noe som resulterer i sammensmelting av rykninger for en isometrisk stivkrampekontraksjon der topp tetanisk dreiemoment oppnås. Den presenterte protokollen for kneforlengelse topp tetanisk dreiemoment kraftfrekvenskurven initierer ved 10 Hz som fremkaller 3 isolerte rykninger. Delvis fusjon av rykninger skjer ved 40 Hz, og topp stivkrampe dreiemoment nås mellom 120-180 Hz (Figur 5).
Figur 6 illustrerer representative dreiemomentfrekvenskurver for kneforlengelse fra kvinnelige C57BL/6-mus. Tre separate mus ble testet ved baseline, og eksperimentet ble gjentatt i hver mus 2 uker senere for sammenligning for å vurdere reproduserbarhet. Dreiemomentfrekvenskurver vises med rå dreiemomentverdier (Figur 6A), samt rå dreiemomentverdier normalisert til musens kroppsvekt (Figur 6B). Gjentatte observasjoner viser sammenlignbare resultater hos alle 3 mus med en 2-ukers hvileperiode mellom eksperimenter. Kroppsvekt normaliserte dreiemomentdata bør vurderes i tillegg til rå dreiemoment, da mindre svingninger i vekt kan påvirke funksjonell utgang og ikke vurderes med rå dreiemoment alene. Videre letter kroppsvekt normaliserte dreiemomentdata sammenligning av mus av forskjellige størrelser. Dreiemoment kan også normaliseres til muskel våt vekt eller myofiber tverrsnittsområde, som vi tidligere har vist16.
Figur 7A viser området under kurven ved hjelp av kroppsvekt normaliserte isometriske dreiemomentdata fra komplette dreiemomentfrekvenseksperimenter (10 Hz, 40 Hz, 120 Hz, 150 Hz, 180 Hz, 200 Hz) for 4 separate C57BL/6-mus, og fremhever lignende total dreiemomentutgang og variasjonskoeffisienter mellom 5,6% til 8,8% med gjentatte eksperimenter innen de samme musene. Data rapporteres ganske enkelt som topp tetanisk dreiemoment (Figur 7B) som er den maksimale dreiemomentverdien fra de gjentatte stivkrampe isometriske sammentrekningene fra 120-200 Hz. Topp tetanic dreiemoment utgang er sammenlignbar i 6-8 måneder gamle kvinnelige C57BL / 6 mus (Figur 7B) med koeffisienter av variasjon mellom 4,8% og 8,7% med langsgående vurdering innenfor de samme musene. Peak tetanic dreiemoment er mest sammenlignbar med gull-standard styrke vurdering i menneskelige studier: maksimal isometrisk toque.
Videre er kneekstensor peak tetanic dreiemomentprotokoll et nyttig verktøy for å oppdage styrkeforskjeller i flere musemodeller. Figur 8 viser den sterke kontrasten mellom kneekstensorstyrke i en ikke-skadet, sunn 6 måneder gammel C57BL/6 kvinnelig mus (svart linje) og en transgen musemodell av suprafysiologisk hypertrofi der myostatin/GDF8 slås ut (blå linje). Vi viser også en topp stivkrampekurve fra en C57BL/6-mus 7 dager etter kirurgisk transeksjon av det fremre korsbåndet (ACL-T) (rød linje), som viser en nesten 50% nedgang i toppmoment etter skade som er godt utenfor variasjonskoeffisientene som observeres med gjentatt testing av uskadede mus. Samtidig med menneskelige data17,18, reduseres styrken markert med ACL-T. Alle mus er kvinner og i samme alder (6-8 måneder).
| Twitch-eksperiment | Strømstyrke/strøm (mA) | Dreiemoment (mN•m) |
| 1 | 50 | 1.279 |
| 2 | 70 | 1.341 |
| 3 | 90 | 1.36 |
| 4 | 110 | 1.362 |
| 5 | *130 | 1.449 |
| 6 | 150 | 1.436 |
| 7 | 140 | 1.333 |
Tabell 1: Eksempel på twitch-serier. * angir optimal strømstyrke/strøm.
| Frekvens (Hz) | Dreiemoment(mN•m) |
| 10 | 1.385 |
| 40 | 1.869 |
| 120 | *18.765 |
| 150 | 18.375 |
| 180 | 17.97 |
| 200 | 17.548 |
Tabell 2: Eksempel på kurvedata for dreiemomentfrekvens. * betegner topp tetanisk dreiemoment.
Figur 1: Programvareoppsett for datainnsamling. Illustrasjon av oppsett for datainnsamlingsprogramvare med Live Data Monitor. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Museoppsett og elektrodeplassering. (A-B) Supine-posisjonen til musen som mottar anestesi via en nesekjegle på den oppvarmede plattformen. Øvre bakre lem er sikkert klemt, bakre til kneet for å tillate ubegrenset bevegelse i kneleddet. Motorarmen justeres slik at kneet bøyes ved ca. 60°. Lårnervemotorpunktet stimuleres av nåleelektroder for å aktivere sammentrekning av kneekstensorer. Museoppsettet vises fra en sidevisning (A) og overhead-visning (B). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Bestemmelse av optimal elektrodeplassering for å oppnå isometrisk kneforlengelse. Representasjon av gjentatte negative rykninger stimulert med 50 mA ved hjelp av Instant Stimulation-funksjonen og vist i Live Data Monitor. Røde piler indikerer de tre første kneforlengelsesrykningene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Representativ rykninger for å bestemme optimal amperasje. Den laveste amperasjen for å fremkalle det høyeste isometriske dreiemomentet for rykninger må bestemmes for kraftfrekvenseksperimentet ved gjentatte rykningseksperimenter med gradvis økt amperasje. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Representative tetaniske dreiemomentkurver gjennom et dreiemomentfrekvenseksperiment for samme mus. (A) Submaksimalt isometrisk tetanisk dreiemoment produsert ved 10 Hz. (B) Submaksimalt isometrisk tetanisk dreiemoment ved 40 Hz. (C) Topp isometrisk tetanisk dreiemomentutgang ved 120 Hz. (D) Isometrisk tetanisk dreiemoment ved 150 Hz. (E) Isometrisk tetanisk dreiemoment ved 180 Hz. (F) Isometrisk stivkratisk dreiemoment ved 200 Hz. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Representative dreiemomentfrekvenskurvedata. (A-B). Dreiemomentfrekvenskurve ved 2 forskjellige tidspunkter (uke 1 og 3) i 3 separate mus, presentert som rå toppmoment (A) og rå toppmoment normalisert til kroppsvekt (B). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Representativt område under kurven (AUC) og topp tetaniske dreiemomentdata. (A) AUC for 4 separate mus, presentert som rå dreiemoment normalisert til kroppsvekt. (B) Topp tetanisk dreiemoment for de samme 4 musene, presentert som rå topp tetanisk dreiemoment normalisert til kroppsvekt. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 8: Topp tetanisk dreiemoment av kneekstensorer i flere musemodeller. Representative peak dreiemoment stivkrampe kurver for en overt hypertrofi transgen mus modell (GDF8 KO), en uskadet sunn C57BL/6 mus (mus 2), og en C57BL/6 mus 7 dager etter fremre korsbånd transeksjon (ACL-T). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Supplerende figur 1: Dimensjoner på tilpasset fremstilt plast. Innsettet i rødt viser dybdedimensjonen. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende video 1: Sanntids kneekstensor rykninger uten motorarm. Klikk her for å laste ned denne videoen.
Tilleggsvideo 2: Saktegående kneekstensor rykninger uten motorarm. Klikk her for å laste ned denne videoen.
Discussion
Måling og analyse av muskelfunksjon i gnagermodeller er avgjørende for å gjøre translasjonelle og meningsfulle slutninger angående histologiske og molekylære skjelettmuskulaturtilpasninger observert med trening, skade, sykdom og terapeutisk behandling. Vi demonstrerer en metode for å vurdere kneekstensor maksimal styrke pålitelig og gjentatte ganger hos mus som bruker kommersielt tilgjengelig utstyr, med det justerbare plaststykket for å holde bakre lem på den fremre tibiaen som den eneste tilpassede fabrikkerte delen som kan replikeres.
Vanlige funksjonelle vurderingsverktøy har blitt mye brukt til å evaluere fysisk ytelse gjentatte ganger i samme mus, for eksempel tredemølle som løper til volitional tretthet, rotarod ytelsestest, invertert klammetest og grepstyrketest. Men selv om de er informative, involverer disse vurderingene kardiopulmonale og atferdsmessige komponenter, som kan tilsløre avhør av nevromuskulær funksjon forbundet med disse fysiske ytelsestiltakene. Videre er elementer av utholdenhet, koordinering og balanse til stede i mange av disse funksjonelle vurderingene til forskjellige nivåer, noe som begrenser klar tolkning i forhold til muskelstyrke. Kraften som produserer evne til gnagermuskel(er) kan måles in vitro, in situ eller in vivo. Hver tilnærming har relative fordeler og begrensninger. Spesielt, med in vitro vurdering, er muskelen helt isolert og fjernet fra dyrets kropp slik at det ikke er noen innflytelse fra perfusjon eller innervasjon19. Dette gir et godt kontrollert miljø for å fastslå kontraktil evne, men begrenser størrelsen på muskelen som studeres gjennom avhengighet av passiv diffusjon av oksygen og næringsstoffer under testing. In situ testing opprettholder innervering og blodtilførsel av muskelen, men er begrenset til en entall terminal vurdering, som med in vitro testing20. Til slutt er in vivo-testing den minst invasive med muskelen som gjenstår i sitt opprinnelige miljø med perkutane elektroder satt inn i nærheten av motornerven for å stimulere muskelen elektrisk. En styrke av in vivo-tilnærmingen er potensialet for langsgående testing over tid21,22,23.
In vivo evaluering av topp muskel kontraktilitet optimalt måler maksimal styrke som normal anatomi og fysiologi av musen forblir intakt og metoden kan gjentas på samme mus før og etter en intervensjon eller gjennom hele levetiden. Spesielt er in vivo-måling av kneekstensorstyrke hos mus den murine styrkevurderingen med størst translasjonell relevans for menneskelige studier, da maksimalt kneforlengelsesmoment måles og betraktes som gullstandard styrketest hos mennesker med sammenheng med ulike funksjonelle og helsemessige resultater24,25,26,27 . Videre observeres kneekstensorpatologi med aldring samt et utall skader og sykdommer1,2,4,5,6, men å vurdere virkningen av disse forholdene på kneekstensorstyrke langsgående hos mus har ikke vært lett oppnåelig.
Selv om denne metoden tilbyr verktøy for å bestemme kneekstensor topp dreiemoment på en langsgående måte, bør visse begrensninger i protokollen vurderes. Lavere frekvenser mellom 40 Hz og 120 Hz ble utelatt fra momentfrekvensprotokollen, noe som kan begrense muligheten til å oppdage venstre eller høyredreiningsskift i dreiemomentfrekvenskurven med skade eller sykdom. Ved hjelp av denne dreiemomentfrekvensprotokollen har vi imidlertid kunnet oppdage endringer i topp tetanisk dreiemoment i en ACL-skademodell og mellom C56BL/6 wild type mus og en transgen musemodell av suprafysiologisk muskelmasse (figur 8). Vi merker at det kan være gunstig å sikre elektrodene med hjelpende hender eller lignende apparater, da muskelsammentrekninger kan bevege elektroder litt. Vi noterte ingen åpenbar forskyvning av elektroder med progressive sammentrekninger; Muligheten for liten bevegelse av elektrodene kan imidlertid ikke utelukkes, noe som kan påvirke muskelstimulering. I tillegg ble intramuskulær elektromyografi (EMG) ikke utført i forbindelse med stimulusprotokollen; Inkludering av EMG-tiltak kan imidlertid være mulig, om ønskelig og hensiktsmessig for den eksperimentelle interessemodellen.
Vurdering av kneekstensorstyrke i murinmodeller av ortopedisk skade og sykdom vil legge til rette for preklinisk forskning med meningsfull translasjonell relevans for kliniske styrketiltak. Vår protokoll muliggjør presis og gjentatt vurdering av maksimal kneekstensorstyrke hos mus med kommersielt tilgjengelig utstyr tilgjengelig for ethvert laboratorium.
Disclosures
Matthew Borkowski er ansatt i Aurora Scientific Inc., et selskap som potensielt kan dra nytte av forskningsresultatene og også er en leder av selskapet.
Acknowledgments
Vi vil takke Rosario Maroto for teknisk assistanse. Forskning rapportert i denne publikasjonen ble støttet av National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases of the National Institutes of Health under Award Number R01 AR072061 (CSF). Innholdet er utelukkende forfatternes ansvar og representerer ikke nødvendigvis de offisielle synspunktene til National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1300A: 3-in-1 Whole Animal System- Mouse | Aurora Scientific Incorporated | 300D-305C-FP: dual-mode motor with custom knee extension apparatus, 605A: Dynamic Muscle Data Acquisition and Analysis System, 701C: Electrical Stimulator, 809C: in-situ Mouse Apparatus | |
| 6100 Dynamic Muscle Control LabBook software | Aurora Scientific Incorporated | DMC v6.000 | |
| 611A Dynamic Muscle Analysis | Aurora Scientific Incorporated | DMA v5.501 | |
| BravMini hair clippers | Wahl Clipper Corporation | ASIN: B00IN24ILE | |
| Eye Lube | Optixcare | Item Number: 142422 | |
| Isoflurane | Covetrus | NDC: 11695-6777-2 | |
| V-1 Tabletop Laboratory Animal Anesthesia System | VetEquip Inhalation Anesthesia Systems | Item Number: 901806 | |
| Prism 8 | GraphPad Software, LLC | Version 8.3.0 (328) |
References
- Brightwell, C. R., et al. Moderate-intensity aerobic exercise improves skeletal muscle quality in older adults. Translational Sports Medicine. 2 (3), 109-119 (2019).
- Moro, T., et al. Muscle protein anabolic resistance to essential amino acids does not occur in healthy older adults before or after resistance exercise training. Journal of Nutrition. 148 (6), 900-909 (2018).
- Angelozzi, M., et al. Rate of force development as an adjunctive outcome measure for return-to-sport decisions after anterior cruciate ligament reconstruction. Journal of Orthopedic Sports Physical Therapy. 42 (9), 772-780 (2012).
- Kalyani, R. R., et al. Quadriceps strength, quadriceps power, and gait speed in older U.S. adults with diabetes mellitus: results from the National Health and Nutrition Examination Survey, 1999-2002. Journal of American Geriatric Society. 61 (5), 769-775 (2013).
- Culvenor, A. G., Ruhdorfer, A., Juhl, C., Eckstein, F., Øiestad, B. E. Knee extensor strength and risk of structural, symptomatic, and functional decline in knee osteoarthritis: A systematic review and meta-analysis. Arthritis Care Res (Hoboken). 69 (5), 649-658 (2017).
- Abramowitz, M. K., et al. Skeletal muscle fibrosis is associated with decreased muscle inflammation and weakness in patients with chronic kidney disease. American Journal of Physiology and Renal Physiology. 315 (6), 1658-1669 (2018).
- Arentson-Lantz, E. J., English, K. L., Paddon-Jones, D., Fry, C. S. Fourteen days of bed rest induces a decline in satellite cell content and robust atrophy of skeletal muscle fibers in middle-aged adults. Journal of Applied Physiology. 120 (1985), 965-975 (2016).
- Pratt, S. J. P., Lovering, R. M. A stepwise procedure to test contractility and susceptibility to injury for the rodent quadriceps muscle. Journal of Biological Methods. 1 (2), (2014).
- Kamekura, S., et al. Osteoarthritis development in novel experimental mouse models induced by knee joint instability. Osteoarthritis Cartilage. 13 (7), 632-641 (2005).
- Kwok, J., et al. Histopathological analyses of murine menisci: implications for joint aging and osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 24 (4), 709-718 (2016).
- Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse. Osteoarthritis Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).
- Christiansen, B. A., et al. Musculoskeletal changes following non-invasive knee injury using a novel mouse model of post-traumatic osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 20 (7), 773-782 (2012).
- Wurtzel, C. N., et al. Pharmacological inhibition of myostatin protects against skeletal muscle atrophy and weakness after anterior cruciate ligament tear. Journal of Orthopedic Research. 35 (11), 2499-2505 (2017).
- Botter, A., et al. Atlas of the muscle motor points for the lower limb: implications for electrical stimulation procedures and electrode positioning. European Journal of Applied Physiology. 111 (10), 2461-2471 (2011).
- Gobbo, M., Maffiuletti, N. A., Orizio, C., Minetto, M. A. Muscle moter point identification is essential for optimizing neuromuscular electrical stimulation use. Journal of Neuroengineering and Rehabililitation. 11, 17 (2014).
- Neelakantan, H., et al. Small molecule nicotinamide N-methyltransferase inhibitor activates senescent muscle stem cells and improves regenerative capacity of aged skeletal muscle. Biochemical Pharmacology. 163, 481-492 (2019).
- Kline, P. W., Morgan, K. D., Johnson, D. L., Ireland, M. L., Noehren, B. Impaired quadriceps rate of torque development and knee mechanics after anterior cruciate ligament reconstruction with patellar tendon autograft. American Journal of Sports Medicine. 43 (10), 2553-2558 (2015).
- Hiemstra, L. A., Webber, S., MacDonald, P. B., Kriellaars, D. J. Knee strength deficits after hamstring tendon and patellar tendon anterior cruciate ligament reconstruction. Medicine and Science in Sports and Exercise. 32 (8), 1472-1479 (2000).
- Park, K. H., et al. Ex vivo assessment of contractility, fatigability and alternans in isolated skeletal muscles. Journal of Visualized Experiments. (69), e4198 (2012).
- MacIntosh, B. R., Esau, S. P., Holash, R. J., Fletcher, J. R. Procedures for rat in situ skeletal muscle contractile properties. Journal of Visualized Experiments. (56), e3167 (2011).
- Chiu, C. S., et al. Non-invasive muscle contraction assay to study rodent models of sarcopenia. BMC Musculoskeletal Disorder. 12, 246 (2011).
- Mintz, E. L., Passipieri, J. A., Lovell, D. Y., Christ, G. J. Applications of in vivo functional testing of the rat tibialis anterior for evaluating tissue engineered skeletal muscle repair. Journal of Visualized Experiments. (116), e54487 (2016).
- Gerlinger-Romero, F., et al. Non-invasive assessment of dorsiflexor muscle function in mice. Journal of Visualized Experiments. (143), e58696 (2019).
- Davis, C. C., Ellis, T. J., Amesur, A. K., Hewett, T. E., Di Stasi, S. Improvements in knee extension strength are associated with improvements in self-reported hip function following arthroscopy for femoroacetabular impingement syndrome. International Journal of Sports Physical Therapy. 11 (7), 1065-1075 (2016).
- Omori, G., et al. Quadriceps muscle strength and its relationship to radiographic knee osteoarthritis in Japanese elderly. Journal of Orthopedic Science. 18 (4), 536-542 (2013).
- Wilk, K. E., Romaniello, W. T., Soscia, S. M., Arrigo, C. A., Andrews, J. R. The relationship between subjective knee scores, isokinetic testing, and functional testing in the ACL-reconstructed knee. Journal of Orthopedic Sports and Physical Therapy. 20 (2), 60-73 (1994).
- Bobowik, P., Wiszomirska, I. Diagnostic dependence of muscle strength measurements and the risk of falls in the elderly. Internation Journal of Rehabilitation Research. 43 (4), 330-336 (2020).
