Summary
무릎 근간근의 정량화는 노화, 질병, 부상 및 재활에 대한 기능적 적응을 이해하는 것이 필수적입니다. 생체 무릎 확장 이소메트릭 피크 파타닉 토크에서 반복적으로 측정하는 새로운 방법을 제시합니다.
Abstract
수많은 조건과 자극에 응하여 골격 근육 가소성은 음성및 양성 모두 동시 기능 적응을 중재합니다. 클리닉과 연구 실험실에서, 최대 근육 강도 널리 인간에서 세로측정, 무릎 흥분근근 근육가장 보고 된 기능 결과. 무릎 흥분근근육 복합체의 병리학은 노화, 정형외과 상해, 질병 및 해체에 잘 문서화되어 있습니다. 무릎 내근 강도는 기능성 용량 및 부상 위험과 밀접한 관련이 있으며 무릎 내근 강도의 신뢰할 수있는 측정의 중요성을 강조합니다. 반복 가능, 전 임상 설치류 연구에서 무릎 엑스텐서 강도의 생체 내 평가는 골관절염이나 무릎 부상을 탐구하는 연구를위한 귀중한 기능적 엔포인트를 제공합니다. 우리는 반복적으로 시간에 걸쳐 마우스에 있는 무릎 엑스텐서의 등색피크 파타닉 토크를 측정하기 위하여 생체 내 및 비 침습적 프로토콜을 보고합니다. 우리는 유사한 결과를 생성하는 다중 마우스에서 반복적인 평가로 무릎 흥분기 강도를 측정하기 위하여 이 새로운 방법을 사용하여 일관성을 보여줍니다.
Introduction
골격 근은 운동, 영양, 부상, 질병, 노화 및 사용 과 같은 무수한 자극에 대응하여 질량 및 구조에 대한 보상 변경을 가진 고도로 적응력이 높은 조직입니다. 인간에서 골격 근육 적응을 조사 하는 많은 연구 골격 근육 크기와 기능에 미치는 영향을 측정 하는 방법을 사용, 금 표준 강도 평가는 쉽게 인간의 과목에서 반복.
특히, 무릎 엑스텐서와 굴곡 강도는 임상 연구에서 가장 평가됩니다. 무릎 근력에 대한 변화는 노화, 운동, 정형외과 상해, 무릎 골관절염, 만성질환, 외용1,2,3,4,5,6,7의인간 연구에서 널리 보고되었다. 그러나, 반복적으로 비침습적으로 무릎 엑스텐서 근육을 분석하는 방법 (사두근) 기계성 설치류 연구에서 강도는 상대적으로 제한되었습니다. 쥐의 생체 내 사분면 근육 수축성을 결정하는 방법은 이전에 개발되었다8; 그러나 상업적으로 이용 가능한 장비의 광범위한 건설이 필요합니다. 무릎 부상/골관절염9,10,11,12, 13에 이어 근골격계 결과를 연구하기 위해 개발된 설치류 모델의 폭을 감안할 때 사두근 강도의 비침습적 평가가 필요하다.
더욱이, 골격 근 적응을 뒷받침하는 분자 메커니즘을 조사하는 설치류 연구는 종종 쥐에 비해 쥐의 저체중 기반 투약과 관련된 재정적 비용 감소로 인해 많은 약리학적 개입 연구와 마찬가지로 유전 적 수정의 단순성으로 인해 마우스 모델을 활용합니다. 우리는 사소한 수정과 시판 가능한 장비를 사용하여 시간이 지남에 따라 동일한 마우스에서 생체 무릎 엑스텐서 기능을 반복적으로 측정하는 비 침습적 방법을보고, 다른 실험실 중 재현성을 촉진, 인간의 강도 결과에 더 직접적인 비교를 제공.
Protocol
모든 실험 절차는 켄터키 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.
1. 장비 설정
- 제조업체 사양에 따라 컴퓨터가 연결되어 있는지 확인합니다.
- 아직 제자리에 있지 않은 경우, 무릎 연장 장치와 300D-305C-FP 모터를 809C 동물 플랫폼에 부착한다.
- 워터 펌프를 37°C로 켜서 플랫폼 가열을 시작합니다.
- 컴퓨터가 아직 켜지지 않은 경우 컴퓨터를 켜고 고출력 이중 단계 자극기 및 2 채널 듀얼 모드 레버 시스템을 켭니다.
- 이소플루란을 기화기에 붓고 최대 충전 라인을 완성합니다.
2. 소프트웨어 설정
- 소프트웨어를 엽니다(자료 표에제공된 세부 정보).
- 라이브 데이터 모니터와 함께 인스턴트 자극 기능을 사용하여 프로브 배치(단계 4)를 최적화하려면 실험 준비를 선택한 다음 즉시 Stim 구성(그림 1)을선택합니다. 펄스 주파수(Hz)를 125로, 펄스 너비(ms)를 0.2로, 펄스 수를 1로, 열차 주파수(Hz)를 0.5로, 런타임(들)을 120으로 설정합니다.
- 파일 및 라이브 데이터 모니터를 엽니다.
- 트위치(5단계) 및 토크 주파수(Step 6) 실험을 수행하려면 적절한 트위치 및 무릎 확장 토크 주파수 실험(5단계 및 6단계에서 아래에 자세히 설명)을 포함하는 이전에 프로그래밍된 연구를 선택합니다.
- 적절한 실험 마우스를 선택하거나 새 동물 추가 및 토크 데이터와 함께 저장할 해당 마우스 정보를 입력합니다.
- 다음 실험 또는 이전 실험을 선택하여 트위치 프로토콜에서 토크 주파수 시퀀스로 전환합니다.
3. 마우스 설정
- 개별 마우스를 마취실에 넣습니다.
- 산소 탱크 밸브를 방출하고 2.5 %의 이소플루란으로 1 L / 분에서 산소 유량을 설정합니다.
- 마우스가 완전히 의식이 없는 때까지 뚜껑을 단단히 닫은 챔버에 남아 있는지 확인합니다. 발가락 핀치와 발 반사 결석에 의해 의식의 완전한 손실을 확인합니다.
- 마취 된 마우스를 가열 된 플랫폼의 노세콘에 머리를 가진 척추 위치에 놓고 산소 유량은 1 L /min에서 2.5 %의 이소플루란을 장착합니다.
- 전기 클리퍼를 사용하여 오른쪽 뒷다리에서 머리를 면도합니다. 알코올 닦기와 작은 진공으로 면도 영역에서 머리카락을 제거합니다. 뒷다리와 플랫폼에서 멀리 제거 된 머리를 청소합니다.
- 무릎에 상부 뒷다리, 후방을 단단히 고정시다(도2).
참고: 무릎 운동 범위가 방해되지 않도록 하십시오. - 전방 경골이 조절 가능한 플라스틱 조각을 가볍게 만지는 무릎 연장 장치에 하부 뒷다리를 놓습니다(포스 인 채널 판독은 0과 -1.0mN*m 사이를 읽어야 합니다). 마우스의 하부 뒷다리의 크기에 따라, 수술용 테이프는 다리를 안전하게 쉬게 할 수 있도록 조절 가능한 플라스틱 조각의 바닥 부분을 감싸는 수 있습니다.
참고: 맞춤 제작된 플라스틱 조각의 자세한 이미지와 치수는 보조 도 1에표시됩니다. - 무릎이 60 °에서 구부러지도록 플랫폼에 손잡이를 조정합니다.
- 마우스 몸통 위에 테이프 를 가볍게 놓고 최대 무릎 연장으로 보상 움직임을 방지합니다.
4. 전극 배치
- 전극을 사두근/무릎 엑스텐서근육(도 2)바로위에 무릎에 2-4mm 근위를 피하한다. 전극은 약 1-2mm 떨어져 있어야 합니다.
- 전극의 최적의 배치를 확인하려면 라이브 데이터 모니터를 사용하여 인스턴트 자극 기능을 활용하십시오. 반복 된 트위치에 대한 50 mA에서 amperage / 전류를 설정하여 무릎 확장을 확인합니다 (무릎 엑스텐서는 부정적인 트위치 곡선을 생성합니다). 인스턴트 자극 중에 프로브를 조정하여 라이브 데이터 모니터 창에서 측정한 최대 무릎 확장 트위치 토크를 달성합니다.
참고: 도 3은 무릎 확장을 확인하는 대표적인 인스턴트 자극 출력을 나타낸다. 보조 비디오 1 및 보충 비디오 2는 모터 팔없이 실시간 및 슬로우 모션 무릎 엑스텐서 트위치를 보여 무릎 확장의 시각적 확인을 허용. - 인스턴트 자극과반복 경련 동안, 길항제 근육의 활성화를 확인하기 위해 검지 손가락과 심파 무릎 굴곡 근육. 무릎 엑텐서를 최대적으로 자극하기 위해, 프로브 재배치는 마우스의 신체 구성과 대퇴신경 및 무릎 엑스텐서 근육의 모터 포인트의 정확한 위치에 약간의 해부학적 차이에 따라 필요할 수 있습니다.
참고: 근육 운동점은 신경의 모터 분기가 근육배에 진입하는 위치이며, 전기 전도도에 대한 저항성이 가장 적고, 그 후 전기자극(14,15)에가장 높은 반응성을 가진 지점이다. 전기 자극을 이용한 임상 응용 분야에서, 이 점은 펜 전극으로 스캔하여 근육 트위치가 가장 낮은 주입 전류14,15로발생하는 근육 위의 위치를 찾아서 식별된다. 근육 운동 포인트의 식별은 최적의 신경 근육 전기 자극을 용이하게하기 위해 필수적이다15. 인간 임상 시험에서, 사두근 근육에 대한 근육 운동 포인트는 근육의 탈반 절반에서 확인되었습니다14. 마우스에서 최적의 무릎 엑스텐서 자극을 달성하기 위해, 이 기술은 일반적으로 무릎 엑스텐서의 탈반 절반에서 발견되는 가장 밀접하게 근근 운동 지점 위치에 인스턴트 자극과 전극 배치를 사용하여 회수되었다. 최대 토크를 초래하는 전극 배치(비교적 피상적에서 깊은 것까지)에는 약간의 가변성이 존재하며, 즉각적인 자극 기능은 최적의 전극 배치를 용이하게 합니다.
5. 최적의 전류의 결정
- 최적의 프로브 배치가 결정되면 일련의 진행성 트위치를 수행하여 토크 주파수 실험에 사용되는 최적의 암스페리지/전류를 결정하고 최대 트위치 토크 출력을 달성하기 위해 가장 낮은 전류를 결정합니다. 50mA에서 현재 세트로 시작하여 실행 실험을 선택하여 단일 트위치를 생성합니다. 결과를 분석하여 토크 출력을 표시합니다. 기준선 빼기로 Max Force 아래에 표시되는 트위치 토크를 기록합니다.
참고: Force 채널을 반전하여 측정값을 음수 토크에서 양수로 변환하는 옵션을 선택합니다. - 전류를 60-70mA로 늘리고 트위치 실험을 반복합니다. 기준선 빼기로 Max Force 아래에 표시되는 트위치 토크를 기록합니다.
- 트위치 토크가 더 이상 증가하지 않을 때까지 이러한 방식으로 일련의 트위치 실험(각 진행시 약 10-20mA 증가)을 계속합니다(고원 또는 감소하기 시작). 트위치 시리즈의 예는 표 1에표시됩니다.
- 가장 높은 트위치 토크가 달성된 가장 낮은 전류를 기록합니다. 이 전류는 사용되며 다가오는 힘 주파수 실험 중에 일정하게 유지됩니다. 도 4는 대표적인 피크 트위치를 나타낸다.
6. 피크 동면 성 파타닉 토크를 결정하는 토크 주파수 실험
- 소프트웨어(재료 표참조)에서 다음 설정을 보장하는 무릎 확장을 위해 미리 프로그래밍된 토크 주파수 실험을 선택합니다. 자극 지속 시간: 0.35 s, 주파수 서열: 10 Hz, 40 Hz, 120 Hz, 150 Hz, 180 Hz, 200 Hz, 펄스/수축 사이의 휴식 기간: 120 s
참고: 샘플링 속도는 10,000Hz(기본 설정)입니다. - 실험을 실행하고결과를 분석하고기준선 빼기로 Max Force 아래에 표시되는 토크를 수동으로 기록합니다(무릎 엑스텐서 수축이 각 주파수에서 음의 토크를 생성하므로 힘 채널이 반전되었는지 확인하십시오). 최대 최대 힘 값은 최대 등대식 파타닉 토크로 표시됩니다. 토크 주파수 데이터의 예는 표 2 및 도 5에 도시되어 120Hz에서 달성된 피크 동위원소 토크 출력에 대한 대표적인 파상풍 곡선을 나타낸다.
7. 실험 종료
- 토크 주파수 실험이 완료되면 후속 트위치를 수행하고 동일한 전류의 초기 피크 트위치와 비교하여 손상/피로를 평가합니다.
참고: 부상과 질병의 일부 모델에서는 골격 근육의 운명성이 증가할 것으로 예상되며 실험 용 설정이나 마우스에 문제가 되지 않습니다. - 모든 토크 측정이 완료되면 전극 프로브를 부드럽게 제거하고 무릎을 고정 해제합니다.
- 이소플루란을 끄고 코 콘에서 마우스를 제거합니다.
- 마우스를 온난화 패드 위에 놓인 적절한 케이지에 다시 넣습니다. 마우스가 회복되고 의식을 되찾을 때 모니터링합니다.
참고: 마우스는 2-3분 이내에 의식이 있어야 합니다.
8. 데이터 분석
- 분석 소프트웨어에서 실험 후 데이터를 추출합니다(재료 표참조).
- 개방형 분석 소프트웨어.
- 소프트웨어에서 데이터 받기를 선택합니다.
- 실험이 수행된 날짜와 적절한 마우스 코드를 선택합니다.
- 관심 빈도를 선택합니다(모든 트위치 실험및 토크 주파수 실험의 각 주파수가 나열됩니다).
- 근육 분석선택 .
- 기준 변경 사용이 확인되는지 확인합니다.
참고: 기준선 토크는 소프트웨어에 의해 샘플링되고 절대 최대 토크 값에서 빼는 처음 100점의 평균으로 계산됩니다. - 최대 아래에 나열된 토크 값을 기록합니다.
참고: 여기에 제시된 데이터는 필터링되지 않았습니다. 그러나 원하는 경우 소프트웨어에서 필터를 선택할 수 있습니다.
- 또는, 전술한 6.2단계에서 설명한 바와 같이, 분석 결과 창을 통해 각 토크 주파수 포인트/수축시 최대력 아래에 표시되는 토크 출력을 수동으로 기록한다.
- 기준선이 빼지고 힘 채널이 반전되는지 확인합니다.
- 체중 정규화 계산(그램의 토크/체중) 및 관심의 그래프 및 통계 분석을 위한 스프레드시트에 데이터를 입력합니다. 통계 소프트웨어는 토크 주파수 곡선을 그래프화하고 곡선 아래의 영역을 계산하기 위해 사용되었습니다.
참고: 토크 데이터는 mN.m(밀리뉴턴 미터)에서 측정됩니다.
- 파상풍 곡선을 생성하려면 분석 소프트웨어에서 각 주파수에서 전체 데이터를 내보냅니다.
- 위의 8.1.1-8.1.4 단계를 반복합니다.
- 내보내기 데이터선택 .
- 원시 필터링된 데이터를 선택하고 원하는 위치에 저장합니다. MATLAB은 내보낸 텍스트 파일 및/또는 추가 분석을 위해 파상풍 곡선을 생성하는 데 사용될 수 있습니다.
참고: 요청 시 텍스트 파일에서 파상풍 곡선을 생성하는 MATLAB 코드를 사용할 수 있습니다.
9. 듀얼 모드 레버 시스템 교정
- 초기 사용 전에 시스템을 보정하여 정확하고 신뢰할 수 있는 데이터를 확보하고 데이터 수집 소프트웨어 및 알려진 가중치를 사용하여 주기적으로 교정을 반복합니다.
- 데이터 수집 소프트웨어를 엽니다.
- 설정 탭을 클릭하고 채널 설정을 선택합니다.
- 내 악기 아래에 나열된 305C-FP를 선택합니다.
- 선택한 보정을 클릭하여 교정 편집기 창을 엽니다.
- 길이를 보정하려면 음수 및 양전압(예: -3, -2, -1, 0, 1, 2, 3 V)을 포함한 일련의 테스트 전압을 입력합니다.
- 첫 번째 줄에 대한 설정을 클릭합니다.
- 읽기를클릭합니다.
- 레버 암의 정확한 길이를 밀리미터 단위로 측정하고 해당 상자에 입력합니다.
- 다음 전압을 반복합니다.
- 모든 전압을 기록하면 Cal 팩터 계산(mm/Volt로 기록됨)을 클릭합니다.
- 힘을 보정하려면 선형 진행에서 증가하는 알려진 가중치 집합을 활용하십시오.
- 레버 암이 벤치탑과 평행하게 되어 가장자리에 매달려 무게를 걸 수 있도록 벤치 나 테이블의 가장자리에 놓이도록 모터를 조정합니다.
- 고무 밴드를 사용하여 레버 암에서 첫 번째 무게를 걸어. 적용 힘하에서, 고무 대역의 질량을 차지하는 그램에 알려진 중량을 입력합니다.
- 읽기를선택합니다.
- 알려진 가중치가 3개 이상 반복됩니다.
- Cal 팩터 계산을 선택합니다.
- 계산을 확인하려면 플롯 Cal을 선택하여 교정 데이터와 곡선 을 플롯합니다.
- 강제 를 보정하려면 교정 전압(최대 10볼트)을 입력합니다.
- 교정 전압 바로 옆에 설정된 경우를 클릭합니다.
- 각 전압 라인에 대해 반복합니다.
- 포스 아웃이 변경되지 못하고 모터 암이 움직이기 시작할 때까지 손가락을 사용하여 레버 암에 압력을 부드럽게 가합니다.
- 이 위치를 유지관리합니다. 읽기를선택합니다.
- 각 전압 라인에 대해 반복합니다.
- Cal 팩터 계산을 선택합니다.
Representative Results
토크 주파수 곡선은 낮은 주파수를 사용하여 상대적으로 낮은 토크의 여러 개의 격리된 등대 경련을 생성하고 점점 더 높은 주파수를 통해 진행되며, 그 결과 피크 파상풍 토크가 얻어지는 등대식 파상풍 수축을 위한 트위치의 융합이 발생합니다. 무릎 확장 피크 파타닉 토크에 대한 제시 된 프로토콜은 3 개의 격리 된 트위치를 유도하는 10 Hz에서 시작되는 힘 주파수 곡선을 시작합니다. 트위치의 부분융합은 40Hz에서 발생하며, 피크 파탄 토크는 120-180Hz(도5)에도달한다.
도 6은 여성 C57BL/6 마우스의 대표적인 무릎 확장 토크 주파수 곡선을 나타낸다. 3개의 개별 마우스는 기준선에서 시험되었고, 실험은 재현성을 평가하기 위하여 비교를 위해 2 주 후에 각 마우스에서 반복되었습니다. 토크 주파수 곡선은 원시 토크값(그림 6A)과함께 표시되며 마우스 체중(그림6B)으로정규화된 원시 토크 값으로 도시되어 있습니다. 반복된 관측은 실험 사이 2 주 휴식 기간을 가진 모든 3 마우스에 있는 비교 가능한 결과를 보여줍니다. 체중이 약간 변동되면 기능적 출력에 영향을 미칠 수 있으며 원시 토크만으로는 고려되지 않기 때문에 체중이 정규화된 토크 데이터는 원시 토크 이외에 고려해야 합니다. 또한, 체중 정규화 토크 데이터는 다양한 크기의 마우스의 비교를 용이하게한다. 토크는 또한 근육 습식 중량 또는 근섬유 단면 영역으로 정규화될 수 있으며, 이전에16을보았듯이.
도 7A는 4개의 별도 C57BL/6 마우스에 대해 완전한 토크 주파수 실험(10Hz, 40Hz, 120Hz, 180Hz, 200Hz)에서 몸무게 정규화된 동체 토크 데이터를 사용하여 곡선 아래 영역을 나타내며, 5.6%에서 동일한 8%의 동일한 총 토크 출력및 계수를 강조한다. 데이터는 120-200 Hz에서 반복되는 파상풍 동위 수축으로부터 최대 토크 값인 피크 파타닉토크(그림 7B)로가장 간단하게 보고된다. 피크 파탄식 토크 출력은 동일한 마우스 내에서 세로 평가를 통해 4.8%와 8.7% 사이의 변동계수를 가진 6-8개월 된 암컷 C57BL/6마우스(도 7B)에서비교된다. 피크 파상풍 토크는 인간 연구에서 금 표준 강도 평가에 가장 비슷합니다: 최대 동위 학적 토크.
더욱이, 무릎 엑스텐서 피크 파탄식 토크 프로토콜은 여러 마우스 모델의 강도 차이를 검출하는 유용한 도구이다. 도 8은 미오스타틴/GDF8이 기절하는 초라생리성 비대증의 비부상, 건강한 6개월 된 C57BL/6 암컷 마우스(블랙 라인)와 형질전환 마우스 모델에서 무릎 엑스텐서 강도 사이의 극명한 대비를 보여준다. 우리는 또한 전방 십자 인대 (ACL-T)(빨간 선)의 수술 적 편부 후 7 일 C57BL/6 마우스에서 피크 파상풍 곡선을 보여 주며 부상 후 피크 토크가 거의 50 % 감소하여 부상이 없는 마우스의 반복 테스트로 관찰된 변이계를 훨씬 벗어났습니다. 인간 데이터와동시(17)18,강도는 ACL-T와 현저히 감소된다. 모든 마우스는 여성과 유사한 나이 (6-8 개월)입니다.
| 트위치 실험 | 암페리지/전류(mA) | 토크 (mN•m) |
| 1 | 50 | 1.279 |
| 2 | 70 | 1.341 |
| 3 | 90 | 1.36 |
| 4 | 110 | 1.362 |
| 5 | *130 | 1.449 |
| 6 | 150 | 1.436 |
| 7 | 140 | 1.333 |
표 1: 트위치 시리즈의 예입니다. * 최적의 암전 / 전류를 나타냅니다.
| 주파수(Hz) | 토크(mN•m) |
| 10 | 1.385 |
| 40 | 1.869 |
| 120 | *18.765 |
| 150 | 18.375 |
| 180 | 17.97 |
| 200 | 17.548 |
표 2: 토크 주파수 곡선 데이터의 예입니다. * 피크 파타닉 토크를 나타냅니다.
그림 1: 데이터 수집 소프트웨어 설정. 라이브 데이터 모니터를 사용하여 데이터 수집 소프트웨어에 대한 설정 그림입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 마우스 설정 및 전극 배치. (A-B)가열 된 플랫폼에서 코 콘을 통해 마취를 수신하는 마우스의 수핀 위치. 상부 뒷다리는 무릎 관절에서 무제한 운동을 할 수 있도록 무릎뒤쪽으로 단단히 고정됩니다. 무릎이 약 60 °에서 구부러지되도록 모터 암이 조정됩니다. 대퇴 신경 운동 점은 무릎 엑스텐서의 수축을 활성화하기 위해 바늘 전극에 의해 자극된다. 마우스 설정은 측면뷰(A)및 오버헤드뷰(B)에서표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 등등 측정 무릎 확장을 달성하기 위해 최적의 전극 배치의 결정. 인스턴트 자극 기능을 사용하여 50mA로 자극된 반복적인 네거티브 트위치의 표현과 라이브 데이터 모니터에서 볼 수 있습니다. 빨간색 화살표는 처음 세 개의 무릎 연장 경련을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 최적의 암전을 결정하는 대표 트위치. 가장 높은 트위치 동포메트릭 토크를 유도하는 가장 낮은 암퍼리지는 점진적으로 증가된 암피리지를 가진 반복된 트위치 실험에 의해 포스 주파수 실험을 위해 결정되어야 한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 동일한 마우스에 대한 토크 주파수 실험 전반에 걸쳐 대표적인 파타닉 토크 곡선. (A)10Hz에서 생성된 극성 동체 성 파탄성 토크.(B)40Hz(C) 120Hz(D) 이소측정 파타닉토크 출력에서 180Hz(F) 이소메트릭 파탄성 토크에서 이소메트릭 동체 토크20Hz(F) 이소메트릭 테탄성 토크를 20Hz에서 이소메트릭 동막식 토크로 이소측정 식토닉 토크. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 대표적인 토크 주파수 곡선 데이터. (A-B). 토크 주파수 곡선은 3개의 개별 마우스에서 2개의 다른 타임포인트(주 1 및 3)에서, 생 피크토크(A)및 생 피크 토크로 제시되어체중(B)으로정규화된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 7: 곡선(AUC) 및 피크 파상풍 토크 데이터 아래의 대표적인 영역. (A)4개의 개별 마우스에 대한 AUC, 체중으로 정규화된 원시 토크로 제시하였다. (B)동일한 4 개의 마우스에 대한 피크 파상닉 토크, 체중으로 정상화 된 원시 피크 파상닉 토크로 제시. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 8: 여러 마우스 모델에서 무릎 엑스텐서의 피크 파타닉 토크. 과다 비대 형 편성 마우스 모델 (GDF8 KO), 부상되지 않은 건강한 C57BL /6 마우스 (마우스 2), 전방 십자 인대 절제술 (ACL-T) 후 7 일 후 C57BL /6 마우스에 대한 대표적인 피크 토크 파상풍 곡선. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 도 1: 사용자 정의 조작 플라스틱의 치수. 빨간색으로 인세트는 깊이의 차원을 보여줍니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보조 비디오 1 : 모터 팔없이 실시간 무릎 엑스텐서 트위치. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보조 비디오 2: 모터 팔없이 슬로우 모션 무릎 엑스텐서 트위치. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
설치류 모델의 근육 기능 측정 및 분석은 운동, 부상, 질병 및 치료 치료로 관찰된 조직학적 및 분자 골격 근육 적응에 관한 번역적이고 의미 있는 추론을 하는 것이 필수적입니다. 당사는 시판 되는 장비를 사용하여 마우스에서 무릎 엑스텐서 최대 강도를 안정적으로 반복적으로 평가하는 방법을 시연하며, 전방 경골에서 하부 뒷다리를 고정하는 조절 가능한 플라스틱 조각을 복제할 수 있는 유일한 맞춤형 제조 된 부분입니다.
일반적인 기능성 평가 도구는 러닝머신과 같은 마우스 내에서 의력 피로, 로타로드 성능 테스트, 반전된 집착 테스트 및 그립 강도 테스트와 같은 마우스 내에서 물리적 성능을 반복적으로 평가하는 데 널리 사용되어 왔습니다. 그러나, 유익한 동안, 이러한 평가는 심폐 및 행동 구성 요소(들)를 포함, 이러한 물리적 성능 측정과 관련 된 신경 근육 기능의 심문을 난독화 할 수 있는. 또한, 지구력의 요소, 조정, 균형다양 한 수준에 이러한 기능 평가의 많은 존재, 근육 강도에 대 한 명확한 해석을 제한. 설치류 근육의 힘 생산 능력 (들) 시험관 내에서 측정 될 수있다, 시투에서, 또는 생체 내에서. 각 접근 방식에는 상대적인 이점과 한계가 있습니다. 구체적으로, 체외 평가를 통해, 근육은 완전히 분리되어 동물의 몸에서 제거되어 관류 또는내분(19)으로부터아무런 영향이 없다. 이 수축 능력을 확인 하는 잘 제어 된 환경을 산출 하지만 테스트 하는 동안 산소와 영양소의 수동 확산에 의존을 통해 공부 되 고 근육의 크기를 제한. 시투 테스트에서 근육의 내적 및 혈액 공급을 유지하지만, 체외검사(20)와마찬가지로 단수 단말 평가로 제한됩니다. 마지막으로, 생체 내 시험은 근육을 전기적으로 자극하기 위해 모터 신경 근처에 삽입된 경피 전극으로 모국 환경에 남아 있는 근육과 함께 가장 침습적입니다. 생체내 접근법의 강도는21,22,23에걸쳐 세로 테스트의 잠재력이다.
피크 근육 수축의 생체 내에서 마우스의 정상적인 해부학 및 생리학이 그대로 유지되고 개입 전후 또는 수명 내내 동일한 마우스에서 반복될 수 있기 때문에 최대 강도를 최적으로 측정할 수 있다. 구체적으로, 마우스에서 무릎 내근강도의 생체 내 측정은 인간 연구에 가장 큰 번역적 관련성을 가지는 뮤린 강도 평가이며, 최대 무릎 연장 토크는 일반적으로 측정되고 다양한 기능및 건강 결과와 상관관계가 있는 인간에서 금표준 강도 시험으로 간주되기 때문에24,25,26,27 . 더욱이, 무릎 흥분병증은 노화뿐만 아니라 무수한 부상및질환1,2,4,5,6로관찰되지만, 이러한 조건의 영향을 마우스에서 세로로 혈압강도에 대한 평가는 용이하게 달성할 수 없다.
이 방법은 세로 방식으로 무릎 엑스텐서 피크 토크를 결정하는 유틸리티를 제공하지만 프로토콜의 특정 제한을 고려해야합니다. 40Hz에서 120Hz 사이의 낮은 주파수는 토크 주파수 프로토콜에서 생략되어 부상이나 질병으로 토크 주파수 곡선의 왼쪽 또는 오른쪽 이동을 감지하는 기능을 제한할 수 있습니다. 그러나, 이러한 토크 주파수 프로토콜을 이용하여, 우리는 ACL 부상 모델과 C56BL/6 야생형 마우스 와 초극성 마우스 모델 사이의 피크 파타닉 토크로의 변화를 검출할 수있었다(그림 8). 우리는 근육 수축이 약간 전극을 이동할 수 있기 때문에 도움의 손 또는 유사한 장치로 전극을 확보하는 것이 유리할 수 있다는 점에 유의한다. 우리는 진보적 인 수축과 전극의 명백한 변위를 주의하지 않았다; 그러나, 전극의 약간의 운동의 가능성을 배제 할 수 없다, 이는 근육 자극에 영향을 미칠 수 있습니다. 또한, 근육 내 전기촬영(EMG)은 자극 프로토콜과 함께 수행되지 않았다; 그러나, EMG 조치의 포함은 가능할 수 있으며, 원하는 경우 관심있는 실험 모델에 적합할 수 있다.
정형 외과 상해및 질병의 murine 모형에 있는 무릎 흥분기 강도의 평가는 임상 강도 측정에 의미 있는 번역 관련성을 가진 전 임상 연구를 촉진할 것입니다. 우리의 프로토콜은 모든 실험실에 접근 할 수있는 상용 장비와 마우스에서 최대 무릎 엑스텐서 강도의 정확하고 반복적인 평가를 가능하게합니다.
Disclosures
매튜 보르코프스키는 잠재적으로 연구 결과에서 혜택을 누릴 수 있고 또한 회사의 임원인 오로라 사이언티픽 Inc.에 의해 고용됩니다.
Acknowledgments
로사리오 마로토에게 기술 지원을 부탁드립니다. 이 간행물에 보고된 연구는 상 번호 R01 AR072061 (CSF)의 밑에 건강의 국가 학회의 관절염과 근골격계 및 피부 질병의 국가 학회에 의해 지원되었습니다. 이 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 보건원의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1300A: 3-in-1 Whole Animal System- Mouse | Aurora Scientific Incorporated | 300D-305C-FP: dual-mode motor with custom knee extension apparatus, 605A: Dynamic Muscle Data Acquisition and Analysis System, 701C: Electrical Stimulator, 809C: in-situ Mouse Apparatus | |
| 6100 Dynamic Muscle Control LabBook software | Aurora Scientific Incorporated | DMC v6.000 | |
| 611A Dynamic Muscle Analysis | Aurora Scientific Incorporated | DMA v5.501 | |
| BravMini hair clippers | Wahl Clipper Corporation | ASIN: B00IN24ILE | |
| Eye Lube | Optixcare | Item Number: 142422 | |
| Isoflurane | Covetrus | NDC: 11695-6777-2 | |
| V-1 Tabletop Laboratory Animal Anesthesia System | VetEquip Inhalation Anesthesia Systems | Item Number: 901806 | |
| Prism 8 | GraphPad Software, LLC | Version 8.3.0 (328) |
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