Summary
Kvantifiering av knä extensor maximal styrka är absolut nödvändigt att förstå funktionella anpassningar till åldrande, sjukdom, skada, och rehabilitering. Vi presenterar en ny metod för att upprepade gånger mäta in vivo knä förlängning isometrisk topp tetanic vridmoment.
Abstract
Skelettmuskel plasticitet som svar på otaliga villkor och stimuli förmedlar samtidig funktionell anpassning, både negativa och positiva. I kliniken och forskningslaboratoriet mäts maximal muskelstyrka allmänt longitudinellt hos människor, med knäutökning eller muskulatur det mest rapporterade funktionella resultatet. Patologi av knä extensor muskelkomplexet är väl dokumenterad i åldrande, ortopedisk skada, sjukdom, och disuse; knä extensor styrka är nära besläktade med funktionell kapacitet och skada risk, understryker vikten av tillförlitlig mätning av knä extensor styrka. Repeterbar, in vivo-bedömning av knäutökningsstyrka i prekliniska gnagarstudier erbjuder värdefulla funktionella effektmått för studier som utforskar artros eller knäskada. Vi rapporterar en in vivo och icke-invasiva protokoll att upprepade gånger mäta isometriska topp tetanic vridmoment av knä extensorer hos möss över tid. Vi visar konsistens med denna nya metod för att mäta knä extensor styrka med upprepad bedömning i flera möss producerar liknande resultat.
Introduction
Skelettmuskeln är en mycket anpassningsbar vävnad med kompensatoriska förändringar i massa och struktur som svar på en myriad av stimuli, såsom motion, näring, skada, sjukdom, åldrande och disuse. Många studier som undersöker skelettmuskulaturanpassning hos människor använder metoder för att mäta både skelettmuskelstorlek och funktionspåverkan, eftersom guldstandardstyrka bedömningar är lätt repeterbara hos människor.
Specifikt bedöms knäutöknings- och flexorstyrka mest i klinisk forskning. Förändringar i knä extensor styrka har rapporterats allmänt i mänskliga studier av åldrande, motion, ortopedisk skada, knä artros, kronisk sjukdom, och disuse1,2,3,4,5,6,7. Metoder för att upprepade gånger och icke-invasivt analysera knä extensor muskel (quadriceps) styrka i mekanistiska gnagare studier har dock varit relativt begränsade. En metod för att bestämma in vivo quadriceps muskelkontraktilitet hos råttor utvecklades tidigare8; Det krävs dock omfattande konstruktion av icke-kommersiellt tillgänglig utrustning. Med tanke på bredden av gnagare modeller som utvecklats för att studera muskuloskeletala resultat efter knäskada/artros9,10,11,12,13 finns det ett behov av icke-invasiv bedömning av quadriceps styrka.
Dessutom använder gnagarestudier som undersöker molekylära mekanismer som ligger till grund för skelettmuskelanpassning ofta musmodeller på grund av enkelheten i genetisk modifiering, liksom många farmakologiska interventionsstudier på grund av den minskade ekonomiska kostnaden i samband med lägre viktbaserad dosering av ett läkemedel hos möss jämfört med råttor. Vi rapporterar en icke-invasiv metod för att upprepade gånger mäta in vivo knä extensor funktion i samma mus över tid med hjälp av kommersiellt tillgänglig utrustning med mindre modifiering, underlätta reproducerbarhet mellan olika laboratorier och ge mer direkt jämförelse med mänskliga styrka resultat.
Protocol
Alla experimentella förfaranden godkändes av University of Kentucky Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Utrustningsinställning
- Kontrollera att maskiner är anslutna enligt tillverkarens specifikationer.
- Om den inte redan är på plats, fäst 300D-305C-FP-motorn med knäförlängningsapparatur på 809C djurplattformen.
- Slå på vattenpumpen till 37 °C för att börja värma plattformen.
- Om datorn inte redan är på, slå på datorn, följt av högeffektsstimulatorn med bifas och 2-kanals spaken med dubbla lägen.
- Häll isofluran i vaporizer till maximal fyllningslinje.
2. Programvaruinställningar
- Öppna programvaran (uppgifter i materialförteckningen).
- Om du vill använda funktionen Omedelbar stimulering tillsammans med Live Data Monitor för att optimera avsökningsplaceringen (steg 4) väljer du Förbered experiment följt av Konfigurera omedelbar stim (bild 1). Ställ in pulsfrekvensen (Hz) som 125, pulsbredden (ms) som 0,2, antalet pulser som 1, tågfrekvensen (Hz) som 0,5 och körtiden (120).
- Välj Arkiv och öppna Live Data Monitor.
- För att utföra ryckningar (steg 5) och momentfrekvens (steg 6) experiment, välj en tidigare programmerad studie som innehåller lämpliga ryck- och knäförlängningsmomentfrekvensexperiment (beskrivs nedan i steg 5 och steg 6).
- Välj lämplig experimentell mus eller Lägg till nytt djur och mata in motsvarande musinformation som ska lagras med vridmomentdata.
- Välj Nästa experiment eller Föregående experiment för att övergå från twitch-protokoll till vridmomentfrekvenssekvens.
3. Musinställningar
- Placera den enskilda musen i bedövningskammaren.
- Släpp syretankventilen och ställ in syreflödet på 1 L/min med 2,5 % isofluran.
- Se till att musen förblir i kammaren med locket ordentligt stängt tills det är helt medvetslöst. Bekräfta fullständig förlust av medvetande genom frånvarande fot reflex med tå nypa.
- Placera den sövda musen i ett supinläge med huvudet i noskonen på den uppvärmda plattformen med syreflödet vid 1 L/min med 2,5% isofluran.
- Raka håret från höger bakben med elektriska klippare. Ta bort hår från det rakade området med en alkoholservett och ett litet vakuum. Rengör borttaget hår bort från bakbenen och plattformen.
- Spänn fast den övre bakbenen ordentligt, bakre delen av knät (Bild 2).
OBS: Se till att knäområdet inte hindras. - Placera nedre bakbenet i knäförlängningsapparaten med den främre skenbenet lätt vidröra den justerbara plastbiten (Kraft i kanalavläsningen ska läsas mellan 0 och -1,0 mN *m). Beroende på storleken på musens nedre bakben kan kirurgisk tejp lindas runt den nedre delen av den justerbara plastbiten så att benet kan vila ordentligt.
OBS: Detaljerade bilder och dimensioner av den specialtillverkade plastbiten visas i kompletterande figur 1. - Justera rattarna på plattformen för att säkerställa att knät är böjt vid 60°.
- Placera lätt en bit tejp över muskroppen på plattformen för att förhindra kompensatorisk rörelse med maximal knäförlängning.
4. Elektrodplacering
- Placera elektroderna subkutant 2-4 mm proximalt på knäet direkt ovanför quadriceps/knäutmattningsmusklerna (Figur 2). Elektroder bör vara ca 1-2 mm ifrån varandra.
- För att bestämma optimal placering av elektroder, använd instant stimuleringsfunktionen med Live Data Monitor. Ställ in amperage/ström på 50 mA för upprepade ryckningar för att bekräfta knäförlängningen (knäutstöndringarna ger en negativ ryckkurva). Justera sonderna under omedelbar stimulering för att uppnå maximalt vridmoment för knäförlängningsryckning enligt dataövervakningsfönstret.
OBS: Figur 3 visar en representativ omedelbar stimuleringsutgång som bekräftar knäförlängningen. Kompletterande video 1 och kompletterande video 2 visar realtids- och slow motion knäutsöndrarryckningar utan motorarmen på plats, vilket möjliggör visuell bekräftelse av knäförlängning. - Under upprepade ryckningar med omedelbar stimulering, palpate knä flexor muskler med pekfingret för att bekräfta ingen aktivering av antagonist muskler. För att maximalt stimulera knäutmattning kan sond ompositionering vara nödvändigt beroende på musens kroppssammansättning och små anatomiska skillnader i den exakta platsen för motorpunkten för lårbensnerven och knäutmattningsmusklerna.
OBS: En muskelmotorisk punkt är den plats där en nervs motorgren kommer in i muskelmagen och är den punkt med minst motståndskraft mot elektrisk ledningsförmåga och därefter den högsta lyhördheten för elektrisk stimulering14,15. I kliniska applikationer med elektrisk stimulering identifieras denna punkt genom skanning med en pennelektrod för att hitta platsen ovanför muskeln där en muskelryckning uppstår med den lägsta injiceradeströmmen 14,15. Identifiering av muskelmotorpunkten är avgörande för att underlätta optimal neuromuskulär elektrisk stimulering15. I kliniska prövningar på människa har muskelmotoriska punkter för quadriceps muskler identifierats i den distala halvan av muskeln14. För att uppnå optimal knä extensor stimulering hos möss, var denna teknik rekapituleras med hjälp av elektrod placering med omedelbar stimulering till närmast ungefärliga muskel motoriska punkt platser som vanligtvis finns i den distala hälften av knä extensorer. Det finns en viss variation i elektrodplacering (från relativt ytlig till djup) som resulterar i maximalt vridmoment, och instant stimuleringsfunktionen underlättar optimal elektrodplacering.
5. Bestämning av optimal ström
- När optimal sondplacering har fastställts, utför en serie progressiva ryckningar för att bestämma optimalt amperage / ström som ska användas för vridmomentfrekvensexperimentet, med målet att bestämma den lägsta strömmen för att uppnå maximal ryckmomentutgång. Börja med aktuell uppsättning på 50 mA och välj Kör experiment för att producera en enda ryckning. Välj Analysera resultat för att visa vridmomentutgång. Registrera ryckmomentet som visas under Max Force med baslinjen subtraherad.
OBS: Välj alternativet att invertera kraftkanalen för att konvertera mätningar från negativt vridmoment till positivt. - Öka strömmen till 60-70 mA och upprepa twitch-experimentet. Registrera ryckmomentet som visas under Max Force med baslinjen subtraherad.
- Fortsätt med en serie ryckexperiment på detta sätt (öka cirka 10-20 mA med varje progression) tills ryckmomentet inte längre ökar (antingen platåer eller börjar minska). Exempel på twitch-serier visas i tabell 1.
- Registrera den lägsta strömmen vid vilken det högsta ryckmomentet uppnåddes. Denna ström kommer att användas och förbli konstant under det kommande kraftfrekvensexperimentet. Bild 4 visar en representativ toppryckning.
6. Momentfrekvensexperiment för att bestämma toppetriskt stelt vridmoment
- I programvaran (se Materialförteckning) väljer dudet förprogrammerade momentfrekvensexperimentet för knäförlängning som säkerställer följande inställning. Stimulansvaraktighet: 0,35 s, Frekvenssekvens: 10 Hz, 40 Hz, 120 Hz, 150 Hz, 180 Hz, 200 Hz, Viloperiod mellan pulser/sammandragningar: 120 s
OBSERVERA: Samplingshastigheten är 10 000 Hz (standardinställning). - Kör experiment, analysera resultatoch registrera manuellt vridmomentet som visas under Max Force med baslinjen subtraherad (se till att kraftkanalen är inverterad, eftersom knäutökningskontraktion kommer att ge negativt vridmoment) vid varje frekvens. Notera det högsta Max Force-värdet som toppetriskt steletiskt vridmoment. Exempel på momentfrekvensdata visas i tabell 2 och figur 5 visar en representativ stelkrampskurva för den högsta isometriska tetaniska vridmomentutgången vid 120 Hz.
7. Avslutande av experiment
- När momentfrekvensexperimentet är slutfört, utför en uppföljande ryckning och jämför med den första toppryckningen vid samma ström för att bedöma skador/trötthet.
OBS: I vissa modeller av skada och sjukdom förväntas ökad fetthalt i skelettmuskeln och utgör inte ett problem med den experimentella inställningen eller musen. - När alla momentmätningar är klara, ta försiktigt bort elektrodsonder och lossa knäet.
- Stäng av isofluran och ta bort musen från noskonen.
- Placera musen i en lämplig bur placerad ovanpå en värmande kudde. Övervaka när musen återhämtar sig och återfår medvetandet.
OBS: Musen ska vara medveten och röra sig inom 2-3 min.
8. Dataanalys
- Extrahera data efter experimentet från analysprogramvaran (se Materialförteckning ).
- Öppen analysprogramvara.
- Välj Hämta data från programvaran.
- Välj datum då experimentet utfördes och lämplig muskod.
- Välj frekvens av intresse (alla ryckexperiment och varje frekvens av momentfrekvensexperimentet kommer att listas).
- Välj muskelanalys.
- Bekräfta att Använd originalkorrigering är markerat.
OBS: Utgångsmomentet beräknas av programvaran som genomsnittet av de första 100 punkterna som provtas och subtraheras från det absoluta maximala vridmomentvärdet. - Registrera vridmomentvärdet som anges under Maximum.
OBS: Data som presenteras här är ofiltrerade; Ett filter kan dock väljas i programvaran, om så önskas.
- Alternativt, som beskrivs ovan i steg 6.2, registrera manuellt vridmomentutgången som visas under Max Force i realtid vid varje vridmomentfrekvenspunkt/sammandragning genom fönstret Analysresultat.
- Bekräfta att baslinjen är subtraherad och att kraftkanalen är inverterad.
- Indata i ett kalkylblad för normaliseringsberäkningar av kroppsvikt (vridmoment/kroppsvikt i gram) samt grafering och statistiska analyser av intresse. Statistisk programvara användes för att grafera vridmomentfrekvenskurvor och beräkna området under kurvan.
OBS: Momentdata mäts i mN.m (milliNewton.meter).
- Om du vill generera stelkrampskurvor exporterar du fullständiga data från varje frekvens från analysprogramvaran.
- Upprepa steg 8.1.1-8.1.4 ovan.
- Välj Exportera data.
- Välj Råfiltrerade data och spara på valfri plats. MATLAB kan användas för att generera stelkrampskurvor från den exporterade textfilen och/eller för vidare analys.
MATLAB-kod för att generera stelkrampskurva från textfilen är tillgänglig på begäran.
9. Kalibrering av spakar med dubbla lägen
- Kalibrera systemet före den första användningen för att säkerställa exakta och tillförlitliga data och upprepa kalibreringen regelbundet med hjälp av datainsamlingsprogramvaran och kända vikter.
- Öppen programvara för datainsamling.
- Klicka på fliken Inställningar och välj Kanalinställningar.
- Välj 305C-FP som listas under Mina instrument.
- Klicka på Kalibrera markerat om du vill öppna fönstret Kalibreringsredigeraren.
- För att kalibrera längden, mata in en serie testspänningar inklusive både negativa och positiva spänningar (t.ex. -3, -2, -1, 0, 1, 2, 3 V).
- Klicka på Ange för den första raden.
- Klicka på Läs.
- Mät den exakta längden på spakens arm i millimeter och mata in i motsvarande låda.
- Upprepa för nästa spänning.
- När du registrerar alla spänningar klickar du på Beräkna calfaktorer (registrerade i mm/volt).
- För att kalibrera in kraft, använd en uppsättning kända vikter som ökar i en linjär progression.
- Justera motorn så att den vilar på kanten av bänken eller bordet med spakens arm parallellt med bänkskivan och hänger över kanten så att vikten kan hänga.
- Häng den första vikten från spakens arm med hjälp av ett gummiband. Under Applied Forceanger du den kända vikten i gram som står för gummibandets massa.
- Välj Läs.
- Upprepa i minst 3 kända vikter.
- Välj Beräkna beräkningsfaktor.
- Om du vill verifiera beräkningen ritar du kalibreringsdata och kurva genom att välja Plot Cal.
- För att kalibrera kraft ut, ange kalibreringsspänningar (upp till 10 volt)
- Klicka på Ställ in direkt bredvid kalibreringsspänningen.
- Upprepa för varje spänningsledning.
- Tryck försiktigt på spakens arm med ett finger tills Force Out upphör att förändras och motorarmen börjar röra sig.
- Behåll den här positionen. Välj Läs.
- Upprepa för varje spänningsledning.
- Välj Beräkna beräkningsfaktor.
Representative Results
Momentfrekvenskurvan använder lägre frekvenser för att producera flera isolerade isometriska ryckningar med relativt lågt vridmoment och fortskrider genom allt högre frekvenser, vilket resulterar i fusion av ryckningar för en isometrisk stelkrampskontraktion vid vilken toppetiskt vridmoment erhålls. Det presenterade protokollet för knäförlängning topp tetaniskt vridmoment kraftfrekvenskurvan initierar vid 10 Hz som framkallar 3 isolerade ryckningar. Partiell fusion av ryckningar sker vid 40 Hz, och toppetiskt vridmoment uppnås mellan 120-180 Hz (figur 5).
Figur 6 illustrerar representativa vridmomentfrekvenskurvor för knäförlängning från kvinnliga C57BL/6-möss. Tre separata möss testades vid baslinjen, och experimentet upprepades i varje mus 2 veckor senare för jämförelse för att bedöma reproducerbarhet. Vridmomentfrekvenskurvor visas med råa vridmomentvärden (figur 6A), samt råa vridmomentvärden normaliserade till muskroppens vikt (Figur 6B). Upprepade observationer visar jämförbara resultat hos alla 3 möss med en 2-veckors viloperiod mellan experimenten. Normaliserade momentdata för kroppsvikt bör beaktas utöver råvridmoment, eftersom mindre viktfluktuationer kan påverka funktionell effekt och inte beaktas enbart med rå vridmoment. Dessutom underlättar normaliserade momentdata för kroppsvikt jämförelse av möss av varierande storlek. Vridmoment kan också normaliseras till muskel våt vikt eller myofiber tvärsnittsområde, som vi tidigare har visat16.
Figur 7A visar området under kurvan med hjälp av normaliserade isometriska momentdata för kroppsvikt från fullständiga momentfrekvensexperiment (10 Hz, 40 Hz, 120 Hz, 150 Hz, 180 Hz, 200 Hz) för 4 separata C57BL/6-möss, vilket belyser liknande total vridmomentutgång och variationskoefficienter mellan 5,6% och 8,8% med upprepade experiment inom samma möss. Data rapporteras helt enkelt som toppetiskt vridmoment (figur 7B) vilket är det maximala vridmomentvärdet från de upprepade stelkrampsometriska sammandragningarna från 120-200 Hz. Topptetisk vridmomenteffekt är jämförbar hos 6-8 månader gamla kvinnliga C57BL/6 möss (Figur 7B) med variationskoefficienter mellan 4,8% och 8,7% med longitudinell bedömning inom samma möss. Toppetiskt vridmoment är mest jämförbart med bedömningen av guldstandardstyrka i humanstudier: maximal isometrisk toque.
Dessutom är knäutökningsor topp tetaniskt vridmoment protokoll ett användbart verktyg för att upptäcka styrka skillnader i flera mus modeller. Figur 8 visar den skarpa kontrasten mellan knäutmattningsstyrka i en icke-skadad, frisk 6 månader gammal C57BL/6 kvinnlig mus (svart linje) och en transgen musmodell av suprafysiologisk hypertrofi där myostatin/GDF8 slås ut (blå linje). Vi visar också en topp stelkrampskurva från en C57BL/6 mus 7 dagar efter kirurgiska transection av främre korsband ligament (ACL-T) (röd linje), visar en nästan 50% nedgång i topp vridmoment efter skada som ligger långt utanför de koefficienter av variation som observerats med upprepad testning av oskadda möss. Samtidigt med mänskliga data17,18, styrka minskas markant med ACL-T. Alla möss är kvinnor och i liknande ålder (6-8 månader).
| Twitch-experiment | Amperage/ström (mA) | Vridmoment (mN•m) |
| 1 | 50 | 1.279 |
| 2 | 70 | 1.341 |
| 3 | 90 | 1.36 |
| 4 | 110 | 1.362 |
| 5 | *130 | 1.449 |
| 6 | 150 | 1.436 |
| 7 | 140 | 1.333 |
Tabell 1: Exempel på twitch-serier. * betecknar optimalt amperage/ström.
| Frekvens (Hz) | Vridmoment(mN•m) |
| 10 | 1.385 |
| 40 | 1.869 |
| 120 | *18.765 |
| 150 | 18.375 |
| 180 | 17.97 |
| 200 | 17.548 |
Tabell 2: Exempel på kurvdata för vridmomentfrekvens. * betecknar topptetiskt vridmoment.
Bild 1: Inställningar för datainsamlingsprogram. Illustration av installation för datainsamlingsprogram med Live Data Monitor. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Bild 2:Musinställning och elektrodplacering. Övre bakbenet är ordentligt fastklämt, bakre till knäet för att möjliggöra obegränsad rörelse vid knäleden. Motorarm justeras så att knäet böjs vid ca 60°. Lårbensnervens motoriska punkt stimuleras av nålelektroder för att aktivera sammandragning av knäutmattning. Musinställningar visas från en sidovy (A) och overheadvy (B). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3:Bestämning av optimal elektrodplacering för att uppnå isometrisk knäförlängning. Representation av upprepade negativa ryckningar stimuleras med 50 mA med hjälp av instant stimulering funktionen och visas i Live Data Monitor. Röda pilar indikerar de tre första knäförlängningsryckningarna. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 4:Representativa ryckningar för att bestämma optimalt amperage. Den lägsta ampere som framkallar det högsta ryckningsetometriska vridmomentet måste bestämmas för kraftfrekvensexperimentet genom upprepade ryckexperiment med progressivt ökad ampere. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 5:Representativa tetaniska vridmomentkurvor under ett momentfrekvensexperiment för samma mus. (B) Submaximalt isometriskt tetaniskt vridmoment vid 40 Hz. (C) Topp isometrisk tetanisk vridmomentutgång vid 120 Hz. (D) Isometriskt tetaniskt vridmoment vid 180 Hz. (F) Isometriskt tetaniskt vridmoment vid 200 Hz. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 6:Representativa momentfrekvenskurvadata. Vridmomentfrekvenskurva vid 2 olika tidpunkter (vecka 1 och 3) hos 3 separata möss, presenterade som rå toppvridmoment(A)och rå toppvridmoment normaliserat till kroppsvikt (B). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 7:Representativt område under kurvan (AUC) och toppdata för stelkramtiskt vridmoment. B)Toppeteriskt vridmoment för samma 4 möss, presenterade som råt toppetranglystmoment normaliserat till kroppsvikt. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 8:Toppetiskt vridmoment för knäutstöndrar i flera musmodeller. Representativa topp vridmoment stelkramp kurvor för en öppen hypertrofi transgen mus modell (GDF8 KO), en oskadd friska C57BL/6 mus (mus 2) och en C57BL/6 mus 7 dagar efter främre korsband transection (ACL-T). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Kompletterande figur 1: Mått på specialtillverkad plast. Inset i rött visar dimensionen av djup. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande video 1: Knäutökning i realtid utan motorarm. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Kompletterande video 2: Långsam rörelse knä extensor ryck utan motorarm. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Discussion
Mätning och analys av muskelfunktion i gnagare modeller är absolut nödvändigt att göra translationella och meningsfulla slutsatser om histologiska och molekylär skelettmuskulatur anpassningar observeras med motion, skada, sjukdom och terapeutisk behandling. Vi visar en metod för att bedöma knä extensor maximal styrka tillförlitligt och upprepade gånger hos möss med kommersiellt tillgänglig utrustning, med justerbar plast bit för att hålla nedre bakbenet vid främre skenbenet är den enda anpassade tillverkade delen som kan replikeras.
Vanliga funktionella bedömningsverktyg har använts i stor utsträckning för att upprepade gånger utvärdera fysisk prestanda inom samma mus, såsom löpband som löper till viljeutmattning, rotarodprestandatest, inverterat clingtest och grepphållfasthetstest. Men även om dessa bedömningar är informativa, omfattar dessa bedömningar cardiopulmonary och beteendemässiga komponenter, som kan fördunkla förhöret av neuromuskulär funktion i samband med dessa fysiska prestandamått. Dessutom finns element av uthållighet, samordning och balans i många av dessa funktionella bedömningar till olika nivåer, vilket begränsar tydlig tolkning i förhållande till muskelstyrka. Den kraftproducerande förmågan hos gnagaremuskel(er) kan mätas in vitro, in situ eller in vivo. Varje tillvägagångssätt har relativa fördelar och begränsningar. Specifikt, med in vitro-bedömning, är muskeln helt isolerad och avlägsnas från djurets kropp så att det inte finns någon påverkan från perfusion eller innervation19. Detta ger en välkontrollerad miljö för att fastställa kontraktil förmåga men begränsar storleken på muskeln som studeras genom beroende av passiv diffusion av syre och näringsämnen under testning. In situ-testning upprätthåller muskelns innervation och blodtillförsel, men är begränsad till en ovanlig terminal bedömning, som med in vitro-testning20. Slutligen är in vivo-testning den minst invasiva med muskeln kvar i sin ursprungliga miljö med perkutan elektroder insatta nära motornerven för att elektriskt stimulera muskeln. En styrka i in vivo-metoden är potentialen för longitudinell testning övertid 21,22,23.
In vivo utvärdering av topp muskel kontraktilitet mäter optimalt maximal styrka som den normala anatomin och fysiologin hos musen förblir intakt och metoden kan upprepas på samma mus före och efter en intervention eller under hela livslängden. Specifikt är in vivo-mätning av knäutökningsstyrka hos möss murinstyrkabedömningen med största translationella relevans för mänskliga studier, eftersom maximalt vridmoment för knäförlängning mäts och anses vara guldstandardhållfasthetstestet hos människor med korrelation till olika funktionella och hälsomässigaresultat 24,25,26,27 . Dessutom observeras knä extensor patologi med åldrande samt en myriad av skador ochsjukdomar 1,2,4,5,6, men att bedöma effekterna av dessa villkor på knä extensor styrka längsgående hos möss har inte varit lätt att uppnå.
Även om denna metod erbjuder verktyg för att bestämma knä extensor topp vridmoment på ett längsgående sätt, bör vissa begränsningar i protokollet övervägas. Lägre frekvenser mellan 40 Hz och 120 Hz utelämnades från momentfrekvensprotokollet, vilket kan begränsa förmågan att upptäcka vänster- eller högerförskjutningar i vridmomentfrekvenskurvan med skada eller sjukdom. Med hjälp av detta momentfrekvensprotokoll har vi dock kunnat upptäcka förändringar i toppetaniskt vridmoment i en ACL-skademodell och mellan C56BL/6 vilda möss och en transgen musmodell av suprafysiologisk muskelmassa (Figur 8). Vi noterar att det kan vara fördelaktigt att säkra elektroderna med hjälpande händer eller liknande apparatur eftersom muskelsammandragningar kan flytta elektroder något. Vi noterade inte någon uppenbar förskjutning av elektroder med progressiva sammandragningar; Möjligheten till liten rörelse av elektroderna kan dock inte uteslutas, vilket kan påverka muskelstimulering. Dessutom utfördes inte intramuskulär elektromyografi (EMG) i samband med stimulansprotokollet. Införandet av EMG-åtgärder kan dock vara genomförbart, om så önskas och lämpligt för den experimentella intressemodellen.
Bedömning av knä extensor styrka i murin modeller av ortopedisk skada och sjukdom kommer att underlätta preklinisk forskning med meningsfull translationell relevans för kliniska styrka åtgärder. Vårt protokoll möjliggör exakt och upprepad bedömning av maximal knä extensor styrka hos möss med kommersiellt tillgänglig utrustning tillgänglig för alla laboratorier.
Disclosures
Matthew Borkowski är anställd av Aurora Scientific Inc., ett företag som potentiellt kan dra nytta av forskningsresultat och är också en verkställande direktör för företaget.
Acknowledgments
Vi vill tacka Rosario Maroto för teknisk hjälp. Forskning som rapporterades i denna publikation stöddes av National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases vid National Institutes of Health under Award Number R01 AR072061 (CSF). Innehållet är enbart författarnas ansvar och representerar inte nödvändigtvis de nationella hälsoinstitutens officiella åsikter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1300A: 3-in-1 Whole Animal System- Mouse | Aurora Scientific Incorporated | 300D-305C-FP: dual-mode motor with custom knee extension apparatus, 605A: Dynamic Muscle Data Acquisition and Analysis System, 701C: Electrical Stimulator, 809C: in-situ Mouse Apparatus | |
| 6100 Dynamic Muscle Control LabBook software | Aurora Scientific Incorporated | DMC v6.000 | |
| 611A Dynamic Muscle Analysis | Aurora Scientific Incorporated | DMA v5.501 | |
| BravMini hair clippers | Wahl Clipper Corporation | ASIN: B00IN24ILE | |
| Eye Lube | Optixcare | Item Number: 142422 | |
| Isoflurane | Covetrus | NDC: 11695-6777-2 | |
| V-1 Tabletop Laboratory Animal Anesthesia System | VetEquip Inhalation Anesthesia Systems | Item Number: 901806 | |
| Prism 8 | GraphPad Software, LLC | Version 8.3.0 (328) |
References
- Brightwell, C. R., et al. Moderate-intensity aerobic exercise improves skeletal muscle quality in older adults. Translational Sports Medicine. 2 (3), 109-119 (2019).
- Moro, T., et al. Muscle protein anabolic resistance to essential amino acids does not occur in healthy older adults before or after resistance exercise training. Journal of Nutrition. 148 (6), 900-909 (2018).
- Angelozzi, M., et al. Rate of force development as an adjunctive outcome measure for return-to-sport decisions after anterior cruciate ligament reconstruction. Journal of Orthopedic Sports Physical Therapy. 42 (9), 772-780 (2012).
- Kalyani, R. R., et al. Quadriceps strength, quadriceps power, and gait speed in older U.S. adults with diabetes mellitus: results from the National Health and Nutrition Examination Survey, 1999-2002. Journal of American Geriatric Society. 61 (5), 769-775 (2013).
- Culvenor, A. G., Ruhdorfer, A., Juhl, C., Eckstein, F., Øiestad, B. E. Knee extensor strength and risk of structural, symptomatic, and functional decline in knee osteoarthritis: A systematic review and meta-analysis. Arthritis Care Res (Hoboken). 69 (5), 649-658 (2017).
- Abramowitz, M. K., et al. Skeletal muscle fibrosis is associated with decreased muscle inflammation and weakness in patients with chronic kidney disease. American Journal of Physiology and Renal Physiology. 315 (6), 1658-1669 (2018).
- Arentson-Lantz, E. J., English, K. L., Paddon-Jones, D., Fry, C. S. Fourteen days of bed rest induces a decline in satellite cell content and robust atrophy of skeletal muscle fibers in middle-aged adults. Journal of Applied Physiology. 120 (1985), 965-975 (2016).
- Pratt, S. J. P., Lovering, R. M. A stepwise procedure to test contractility and susceptibility to injury for the rodent quadriceps muscle. Journal of Biological Methods. 1 (2), (2014).
- Kamekura, S., et al. Osteoarthritis development in novel experimental mouse models induced by knee joint instability. Osteoarthritis Cartilage. 13 (7), 632-641 (2005).
- Kwok, J., et al. Histopathological analyses of murine menisci: implications for joint aging and osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 24 (4), 709-718 (2016).
- Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse. Osteoarthritis Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).
- Christiansen, B. A., et al. Musculoskeletal changes following non-invasive knee injury using a novel mouse model of post-traumatic osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 20 (7), 773-782 (2012).
- Wurtzel, C. N., et al. Pharmacological inhibition of myostatin protects against skeletal muscle atrophy and weakness after anterior cruciate ligament tear. Journal of Orthopedic Research. 35 (11), 2499-2505 (2017).
- Botter, A., et al. Atlas of the muscle motor points for the lower limb: implications for electrical stimulation procedures and electrode positioning. European Journal of Applied Physiology. 111 (10), 2461-2471 (2011).
- Gobbo, M., Maffiuletti, N. A., Orizio, C., Minetto, M. A. Muscle moter point identification is essential for optimizing neuromuscular electrical stimulation use. Journal of Neuroengineering and Rehabililitation. 11, 17 (2014).
- Neelakantan, H., et al. Small molecule nicotinamide N-methyltransferase inhibitor activates senescent muscle stem cells and improves regenerative capacity of aged skeletal muscle. Biochemical Pharmacology. 163, 481-492 (2019).
- Kline, P. W., Morgan, K. D., Johnson, D. L., Ireland, M. L., Noehren, B. Impaired quadriceps rate of torque development and knee mechanics after anterior cruciate ligament reconstruction with patellar tendon autograft. American Journal of Sports Medicine. 43 (10), 2553-2558 (2015).
- Hiemstra, L. A., Webber, S., MacDonald, P. B., Kriellaars, D. J. Knee strength deficits after hamstring tendon and patellar tendon anterior cruciate ligament reconstruction. Medicine and Science in Sports and Exercise. 32 (8), 1472-1479 (2000).
- Park, K. H., et al. Ex vivo assessment of contractility, fatigability and alternans in isolated skeletal muscles. Journal of Visualized Experiments. (69), e4198 (2012).
- MacIntosh, B. R., Esau, S. P., Holash, R. J., Fletcher, J. R. Procedures for rat in situ skeletal muscle contractile properties. Journal of Visualized Experiments. (56), e3167 (2011).
- Chiu, C. S., et al. Non-invasive muscle contraction assay to study rodent models of sarcopenia. BMC Musculoskeletal Disorder. 12, 246 (2011).
- Mintz, E. L., Passipieri, J. A., Lovell, D. Y., Christ, G. J. Applications of in vivo functional testing of the rat tibialis anterior for evaluating tissue engineered skeletal muscle repair. Journal of Visualized Experiments. (116), e54487 (2016).
- Gerlinger-Romero, F., et al. Non-invasive assessment of dorsiflexor muscle function in mice. Journal of Visualized Experiments. (143), e58696 (2019).
- Davis, C. C., Ellis, T. J., Amesur, A. K., Hewett, T. E., Di Stasi, S. Improvements in knee extension strength are associated with improvements in self-reported hip function following arthroscopy for femoroacetabular impingement syndrome. International Journal of Sports Physical Therapy. 11 (7), 1065-1075 (2016).
- Omori, G., et al. Quadriceps muscle strength and its relationship to radiographic knee osteoarthritis in Japanese elderly. Journal of Orthopedic Science. 18 (4), 536-542 (2013).
- Wilk, K. E., Romaniello, W. T., Soscia, S. M., Arrigo, C. A., Andrews, J. R. The relationship between subjective knee scores, isokinetic testing, and functional testing in the ACL-reconstructed knee. Journal of Orthopedic Sports and Physical Therapy. 20 (2), 60-73 (1994).
- Bobowik, P., Wiszomirska, I. Diagnostic dependence of muscle strength measurements and the risk of falls in the elderly. Internation Journal of Rehabilitation Research. 43 (4), 330-336 (2020).
