Summary
여기서는 패턴 뉴런에서 교모세포종(GBM) 마이그레이션을 분석하기 위해 사용하기 쉬운 공동 배양 분석을 제시합니다. 우리는 뉴런에 GBM 세포 마이그레이션의 쉬운 정량화를 위한 FiJi 소프트웨어에 있는 매크로를 개발하고, 뉴런이 GBM 세포 침습 용량을 수정한다는 것을 관찰했습니다.
Abstract
교모세포종 (GBM), 학년 IV 악성 교모종, 때문에 그들의 공격적인 특성의 인간 암의 치명적인 유형 중 하나입니다. 이 종양의 유전학에 있는 중요한 어드밴스에 있는 중요한 어드밴스에 도 불구하고, GBM 세포가 건강한 두뇌 parenchyma를 침입하는 방법 잘 이해되지 않습니다. 특히, GBM 세포가 다른 경로를 통해 회고적 공간을 침범하는 것으로 나타났습니다. 이 논문의 주요 관심사는 백색 물질 지역(WMT)을 따라 가는 경로입니다. 회고신경세포 성분을 가진 종양 세포의 상호 작용은 잘 특징지 않다. 본명, GBM 세포 침략에 대한 뉴런의 영향을 평가하는 방법이 기재되어 있다. 이 논문은 뉴런에 GBM 줄기 와 같은 세포의 이동을 분석하여 WMT 침공을 모방 하는 체외 분석에서 고급 공동 배양 제시. 뉴런이 있는 GBM 셀의 동작은 오픈 소스 및 자유 액세스 소프트웨어와 함께 자동화된 추적 절차를 사용하여 모니터링됩니다. 이 방법은 많은 응용 프로그램에 유용하다, 특히, 기능 및 기계학 연구뿐만 아니라 뉴런에 GBM 세포 이동을 차단 할 수있는 약리학 에이전트의 효과를 분석하기위한.
Introduction
GBM을 포함하여 1 차적인 악성 gliomas는, GBM 환자를 위해 보고된 12 15 달의 중간 생존율로, 치명적인 종양입니다. 현재 치료는 방사선 요법과 결합된 큰 종양 질량 절제술 및 화학요법에 의존합니다, 이는 단지 몇 달까지 생존율을 연장합니다. 치료 실패는 혈액-뇌 장벽(BBB)을 통해 가난한 약물 전달과 밀접한 관련이 있으며, 경피 공간, 수막 및 WMTs1을따라 침습적인 성장과 관련이 있다. 혈관 공동 선택이라고도 불리는 혈관 침전은 잘 연구된 과정이며 분자 메커니즘이 해명되기 시작했습니다. 그러나, WM을 따라 GBM 세포 침공의 과정은 잘 이해되지 않습니다. 종양 세포는 Scherer의 이차 구조물2를따라 건강한 뇌로 이동합니다. 실제로, 거의 1세기 전, 한스-요아킴 셰러는 GBM의 침략적인 경로를 설명했는데, 이는 현재 복막 사텔리토시스, 각성 사텔리토증, 피증 확산 및 WMT(그림1A)를따라 침략하는 것으로 불린다.
기질 세포 유래 인자-1α(SDF1α) 및 C-X-C 모티프 케모키네 수용체 4(CXCR4)와 같은 일부 체모키네 및 그 수용체는 혈관 내피 성장 인자(VEGF)가 아닌 WMT 침입3에연루된 것으로 보인다. 최근에는 세포간 NOTCH1-SOX2 축이 GBM 세포4의WMT 침입에 중요한 통로로 나타났다. 저자는 GBM 줄기 같이 세포가 GBM 세포에 의하여 myelinated 신경의 파괴를 건의하는 부분적으로 미켈린 신경에 두뇌 parenchyma를 침입하는 방법을 설명했습니다. 이정표는 3개의 기사가 자연 저널에 연속적으로 간행될 때 2019년에 도달했습니다, 신경교종 발달에 있는 전기 활동의 역할을밑줄5,6. Monje와 협력자들의 정액 작업은 신경교종 발달을 촉진하는 neuroligin-3의 분비에서 전기 활동의 중심 역할에 빛을 비추습니다.
윙클러와 협력자는 GBM 세포 사이의 연결을 설명 (마이크로 튜브) 침습적 인 단계에서 중요하고, 최근, 새로 설명 된 신경 교종 시냅스를 통해 GBM 세포와 뉴런 사이의 상호 작용. 이러한 구조는 종양 발달과 침입을 촉진하는 GBM 세포막에 위치한 α-아미노-3-하이드록시-5-메틸-4-이삭사졸프로피오닉산(AMPA) 수용체의 글루타마테게틱 자극을 선호합니다. 종양 세포 침전은 GBM 환자에서 관찰된 바와 같이 전이 또는 먼 이차 포시의 보급에 있는 중앙 과정입니다. 여러 가지 요인이 혈전폰딘-1, 변형성장인자 베타(TGFβ-조절된 수반성 단백질, 또는 체모키네 수용체 CXCR3)7,8과같은 GBM침공에서중요한 것으로 확인되었다.
여기서, 단순화된 생체 mimetic 모델은 GBM 침공을 연구하기 위해 설명되어 왔으며, 여기서 뉴런은 라미닌의 트랙에 패턴화되고, GBM 세포는 단일 세포 또는 스페로이드(도1B)로시드된다. 두 가지 실험 설정은 GBM9,10,11에서관찰되는 뉴런에 대한 침략을 재구성하는 것을 목표로합니다. 이러한 모델은 과거에 기계적 또는 화학적특성을조절하여 세포 이동을 연구할 수 있는 정렬된 나노섬유 생체 재료(코어 쉘 전기방사)로 개발되었다. 이 문서에서 설명 된 공동 배양 모델은 GBM 세포가이 과정에 관련된 새로운 분자 경로를 정의하여 뉴런에서 탈출하는 방법을 더 잘 이해할 수 있습니다.
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Protocol
통보 된 서면 동의는 모든 환자로부터 얻어졌다 (지역 윤리위원회 규정에 따라, 노르웨이 베르겐, 하우켈랜드 병원에서). 이 프로토콜은 보르도 대학 인간 및 동물 연구 윤리 위원회의 지침을 따릅니다. 임신 한 쥐는 보르도 대학의 동물 시설에서 보관및 치료되었다. E18 시간 임신 쥐의 안락사는 CO2를사용하여 수행되었다. 모든 동물 절차는 제도적 지침에 따라 수행되었으며 지역 윤리위원회의 승인을 받았습니다. 모든 상용 제품은 재료 표에서참조됩니다.
1. 패턴 슬라이드의 준비
- 마이크로패터닝을 위한 기판 준비
- 공기/플라즈마 활성화로 18mm 원형 유리 커버립을 5분 동안 처리합니다. 커버립을 1시간 동안 건조기(3-aminopropyl) 트리에톡시실레인100 μL로 닫힌 챔버에 놓습니다.
- 100 mg/mL의 폴리(에틸렌 글리콜)-succinimidyl valerate(분자량 5,000(Peg-SVA)를 10mM 의 탄산완충제, pH > 8, 1h로 배양한다. 초순수물로 광범위하게 헹구고 화학 후드 아래에서 건조시다.
참고: 이 단계에서 는 샘플을 어두운 상태에서 4°C로 저장하여 추가 사용을 위해 할 수 있습니다. - 포산염 완충식식염수(PBS)에서 14.7 mg/mL에서 광시니티에이터, 4-벤조일벤질-트리메틸라모늄 염화물(PLPP)을 추가합니다.
참고: PLPP 젤인 PLPP의 농축 된 형태도 사용할 수 있습니다. PEG 브러시(100mJ/mm2)를저하시키는 데 필요한 자외선(UV) 조명 시간이 짧아지도록 합니다.
- 포토니티에이터 젤 증착
- PLPP 젤 3μL과 절대 에탄올 50 μL의 혼합물을 사용하여 슬라이드 중앙에 증착합니다. 절대 에탄올의 완전한 증발이 될 때까지 화학 후드 아래에 샘플을 놓습니다.
참고: 이 단계에서 는 샘플을 어두운 상태에서 4°C로 저장하여 추가 사용을 위해 할 수 있습니다.
- PLPP 젤 3μL과 절대 에탄올 50 μL의 혼합물을 사용하여 슬라이드 중앙에 증착합니다. 절대 에탄올의 완전한 증발이 될 때까지 화학 후드 아래에 샘플을 놓습니다.
- 유리 슬라이드 마이크로 패터닝
- 루딘 챔버에 커버슬립을 장착하고 자동 초점 시스템을 갖춘 현미경의 전동 단계에 놓습니다.
- 구상된 마이크로패턴에 해당하는 이미지를 소프트웨어에 로드합니다. 복제 4 x 4회, 200 μm 간격, 1,000mJ/mm2의UV 용량 등 이러한 매개변수를 적용한다. 자동 UV 조명 서열 후 여러 PBS 세차처리로 PLPP를 헹구습니다.
참고: PLPP 젤을 사용한 경우, 탈이온화된 물로 광범위하게 세싱하여 제거하고N2의스트림에서 건조하고 4°C에 보관하십시오. - 라미닌(PBS의 50 μg/mL)을 30분 동안 배양합니다. PBS로 광범위하게 씻으시면 됩니다.
참고: 정제된 녹색 형광 단백질(GFP, PBS의 10 μg/mL)의 형광용액을 라미닌과 혼합하여 형광 현미경검사법에 의해 미세 패턴을 시각화할 수 있다.
2. 공동 배양을위한 뉴런 및 GBM 세포의 준비
- 배아 쥐 해마 뉴런의 배양
- 배아(E18) 쥐의 해마를 해부하고, 조직을 행크의 균형 잡힌 염액(HBSS)/1 mM 4-(2-하이드록세틸)-1-파이프라진에탄황포닉산(HEPES)/페니실린-스트렙토마이신 용액으로 15mL 튜브로 이송한다. 해마를 건조하지 않고 과도한 용액을 제거합니다.
- 페니실린(10,000단위/mL)/연쇄절제술(10,000μg/mL)과 1mM HEPES로 보충된 트립신-에틸렌디아민 테트라아세틱산(EDTA)을 5mL, 37°C에서 15분 동안 배양한다. HBSS/HEPES/페니실린 연쇄 절제술용액으로 2x를 세척하고, 조직이 2-3분 동안 이 용액에 남아 있게 하십시오.
- 각 조직별로 10배 위아래로 파이프를 피킹하여 발포를 최소화하는 두 개의 화염 광택 파스퇴파이펫을 사용하여 조직을 분리합니다. 세포를 계산하고 셀 서스펜션의 생존 가능성을 평가합니다. 아래에 표시된 것처럼 미세 패턴 커버립에 뉴런을 플레이트.
참고: 셀 생존율은 추출 후 85-90%입니다.
- 마이크로 패턴 커버립에 뉴런을위한 세포 배양
- PBS로 마이크로 패턴 유리 슬라이드를 재수화하고 완전한 뉴런 세포 배양 배지를 배양합니다.
- E18 Sprague-Dawley 쥐로부터 얻은 해마 뉴런을 마이크로패턴 유리 커버슬립 위에 직접 심은 신경물질 배지(NBM)에서cm2당 50,000개의 세포가 3%의 말 혈청으로 농축되어 있습니다. 48h에 대한 인큐베이터 (37 °C, 5 % CO2)에마이크로 패턴 뉴런을 배치합니다.
참고 : ~ 6 시간 후, 1 차 해마 뉴런은 라미닌 미세 패턴을 준수 볼 수 있습니다.
- 뉴런에 인간 GBM 줄기 같이 세포의 공동 배양
참고: 이 연구를 위해, 멤브레인 GFP 양성 및 핵-토마토 환자 유래 GBM 세포는 이전 출판프로토콜(10)에따라 성장하였다.- 스페로이드 모양의 세포가 현탁액에서 증가함에 따라, 원심분리는 200 × g에서 5분 동안 현탁액을 분리한다. PBS의 5mL로 스페로이드를 세척하고 세포 해리 시약의 0.5 mL로 세포를 배양 (재료의 표참조) 37 °C에서 5 분 동안.
- 완전한 NBM의 4.5 mL을 추가 (B27 보충으로 보완, 헤파린, 섬유 아세포 성장 인자 2, 페니실린, 및 연쇄 상혈구, 이전 설명 대로8),자동 계수 기술을 사용하여 세포를 계산.
- 종자 1,000 GBM 세포는 3% 말 혈청으로 농축NBM에 있는 마이크로 패턴 뉴런 배양에. 플레이트를 37°C, 5% CO2및 95%의 습도로 배양합니다.
3. 라이브 세포 이미징
- GBM 세포 파종 직후, 온도 조절 챔버가 장착된 반전된 현미경의 단계에 샘플을 놓습니다. 소프트웨어에서 다차원 획득 툴박스를 사용하여 여러 위치를 기록하기 위한 전동 스테이지가 장착된 현미경에서 라이브 셀 이미징을 수행합니다. 온도(37°C) 및 가스 제어(5%CO2)환경에서 20배 의 목표로 12시간 동안 5분마다 밝은 필드 및 피불화 GFP/토마토 이미지를 획득합니다.
4. 이미지 분석
참고: 피지를 사용하여 2차원(2D) 이미지 스택은 IJ1 매크로 어휘(그림2A)로작성된 수제 및 사용자 친화적인 도구(이 주소: https://github.com/Guyon-J/Coculture_Gliomas-Neurons/blob/main/README.md)를 사용하여 반자동으로 사전 처리되거나 처리되었습니다. 자동화된 워크플로및 프로시저는 그림 2B로요약됩니다.
- 신경망 분석(도 2Bi)
- 스택의 이미지 하나를 선택합니다. 네트워크 도구를 마우스 오른쪽 으로 클릭하여 해당 옵션 대화 상자를 열고 설정(예: 임계값 = 삼각형, 리, 황..., 가우시안 블러및 중앙값 필터 = 1, 2, 3...)을 조정하여 정확한 이미지 세분화를 생성합니다. 그런 다음 확인을 클릭합니다.
- 네트워크 도구를 왼쪽 단추로 클릭하여 다음 절차를 자동으로 활성화합니다.
- 선택한 이미지를 복제하고 세 가지 색상 채널(빨간색 회색-녹색)으로 분할합니다.
- 회색 채널(브라이트필드)을 선택하고 대조 스트레치 향상(CSE)을 수행하여 서로 다른 영역 간의 분리를 향상시킵니다. Sobel Edge 검출기(SED)를 사용하여 찾기 가장자리 명령에서 이미 그룹화된 2D 신호 처리 컨볼루션 작업을 수행합니다.
- 이중 필터링(F)의 경우 가우시안 블러 및 중앙값 필터를 적용하여 노이즈를 줄이고 물체 신호를 부드럽게 합니다. 적응된 임계값 알고리즘을 실행하여 검은색 픽셀(셀 영역) 및 흰색 픽셀(배경)이 있는 이진 그림(BIN-grey)을 얻어 마스크(CM)로 변환합니다. 작은 비네트워크 입자를 제거하여 셀 영역을 단순한 네트워크(NET) 및 필터 입자(EP)로 스켈레이트화합니다.
- 적색 및 녹색 채널(핵 및 멤브레인)의 경우 이중 필터링을수행하고, 적응된 임계값을 사용하여 마스크로 변환하고, BIN-green이 입자 분석 명령을 사용하여 세포 형태를 결정할 수 있도록 합니다.
- 관심 영역(ROI)을 OR(결합) 연산자와 병합하고 초기 색상을 간단한 RGB 이미지로 재조정합니다.
- 단세포 운동성 분석(도 2Bii)
- 단일 셀 추적 도구를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 해당 옵션 대화 상자를 열고 설정을 조정합니다(예: 트레일 유형 = 핵 또는 멤브레인, 임계값 = 삼각형, 리, 황..., Z 프로젝션 = 최대 강도, 합계 슬라이스..., 가우시안 블러 및 중앙필터 = 1, 2, 3.) 이미지의 정확한 세분화를 생성합니다. 그런 다음 확인을 클릭합니다.
- 단일 셀 추적 도구를 왼쪽 단추로 클릭하여 다음 절차를 자동으로 활성화합니다.
- 회색 채널을 제거합니다. 스택에 Z 프로젝션을 적용하여 시간(T-스택)에 따라 이미지 스택에 해당하는 이미지를 생성합니다. 이중 필터를 사용하여 셀에 의해 남겨진 흔적을 마스크로 변환합니다. 작은 파티클을 BIN-빨간색/녹색 이미지로 제거합니다.
- ROI를 사용하여 셀 추적의 각 윤곽을 선택하고 옵션 대화 상자에서 상자 건너뛰기 가장자리 감지를 선택하여 후속 단계에 대한 이 전처리 단계를 건너뜁니다.
- 원래 스택에서 빨간색채널(트레일 유형 = 핵)을 분리합니다. 하나의 ROI를 선택하고 외부 영역을 제거합니다. 모든 이미지를 이중 으로 필터링하고 마스크(BIN-red)로 변환합니다. 각 비나화된 핵의 중심 X/Y 위치를 결정합니다.
- 스프레드시트소프트웨어(13)에이미 게시된 매크로를 사용하여 이 셀의 평균 정사각형 변위, 방향성 비율 및 평균 속도를 계산합니다.
- 다중 셀 추적 분석(그림 2Biii)
- 추적 도구를 마우스 오른쪽 으로 클릭하여 해당 옵션 대화 상자를 열고 설정(예: 임계값 = 삼각형, 리, 황..., 가우시안 블러 및 중앙값 필터 = 1, 2, 3...)을 조정하여 정확한 이미지 세분화를 생성합니다. 그런 다음 확인을 클릭합니다.
- 추적 도구를 왼쪽 단추로 클릭하여 다음 절차를 자동으로 활성화합니다.
- 회색 채널을 제거합니다.
- 빨간색 및 녹색 채널을 분할하고 이중 필터를사용하여 마스크로 변환합니다.
- 이미지 계산기를사용하여 채널을 병합 ... AND 연산자와 명령하여 멤브레인에서 발견되는 핵 신호만 남깁니다.
참고 : 피지의 여러 플러그인은 동시에이 이진 사전 처리 된 이미지에서 여러 세포의 X / Y 위치를 결정하는 데 사용할 수 있습니다 (재료의 표참조).
- 이전에 설명된매크로(13)를사용하여 궤적 플롯, 평균 정사각형 변위, 방향성 비율 및 이러한 셀의 평균 속도를 계산합니다.
- 신경 매트에 스페로이드 이동(그림 2Biv)
- 마이그레이션 도구를 마우스 오른쪽 으로 클릭하여 해당 옵션 대화 상자를 열고 설정(예: 임계값 = 삼각형, 리, 황..., 가우시안 블러 및 중앙값 필터 = 1, 2, 3...)을 조정하여 정확한 이미지 세분화를 생성합니다. 그런 다음 확인을 클릭합니다.
- 마이그레이션 도구를 왼쪽 단추로 클릭하여 다음 절차를 자동으로 활성화합니다.
- 빨간색 채널을 제거합니다.
- 녹색 및 회색 채널을 분할합니다.
- 회색 채널의 경우 뉴런 매트의 윤곽을 수동으로 그리고 해당 영역을 측정합니다.
- 녹색 채널의 경우 스택을 두 번 필터링하고 마스크로 변환합니다. 패턴(BIN) 외부 영역을 제거하고 각 이미지에 대해 비나화된 셀 영역을 결정합니다.
참고: 위에서 설명한 매개 변수는 관심 아이콘을 왼쪽 클릭하여 값을 변경하여 보정됩니다. 이 처리는 수동으로 수행할 수 있습니다. 그러나 많은 수의 이미지(수집당 약 100개), 채널(일반적으로 3채널), 처리 단계의 경우 자동화또는 반자동 도구가 바람직할 수 있습니다.
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Representative Results
형광 GBM 세포와 공동 배양패턴 뉴런은 프로토콜 섹션에 설명된 대로 제조되었고, 추적 실험이 수행되었다. GBM 세포는 뉴런에서 마이그레이션하는 동안 신속하게 모양을 수정(그림 1B: 패널 6 및 비디오 1). 세포는 무작위 운동(비디오 1)에서신경 확장을 따라 마이그레이션되었습니다. 형광GBM 세포 및 비형성 뉴런은 쉽게 구별될 수 있으며, 이는 프로토콜섹션(그림 2)에기재된 바와 같이 피지 매크로를 사용하여 세포 이동의 추적을 허용했다. 피지는 이미지 처리 및 분석을 용이하게 하는 개방형 라이센스 소프트웨어입니다. 수많은 이미지 의 분석에 상대적으로 시간이 많이 걸리는 수동 프로시저는 매크로에서 자동화할 수 있습니다. 이미지는 끌어오기 및 드롭 프로시저, 처리 및 정량화되어 ROI 관리자를 사용하여 사용할 수 있는 데이터를 생성하여 가져옵니다.
도구 집합 폴더에 Fiji.app | 매크로| 데착할 때 Gliomas-Neurons 도구를 더 도구 메뉴에서 사용할 수 있으며 여러 아이콘(그림2A)을표시했습니다. 아이콘을 클릭하여 얻은 이미지 처리워크는 도 2B(i-iv)에나와 있다. 세포 형상은 신경망(도2B,i)에서분석될 수 있다. 셀 트래킹으로부터의 여러 파라미터는 두 개의 별개의 영상 공정을 이용하여하나(도 2B,ii)또는 여러 세포(도2B,iii)에대해 얻을 수 있다. 뉴런상 스페로이드 GBM 세포에 의한 회복 속도도 분석할 수있다(도 2B,iv). 뉴런에 시드된 세포는 뉴런 요로(도3A, i)에따라 여러 돌출부로 길쭉한 형상을 나타내었지만, 라미닌(도3A,ii)에서직접 배양할 때 둥근 형상을 가졌다. 뉴런에서 배양된 세포는 라미닌(그림3A,iii-v)에서배양될 때 길지 않았지만 모양을 효율적으로 변형시켰다. 얇은 돌출부, 때로는 두 세포를 연결하는, 나중에 뉴런과 공동 배양 세포에서 보였다(비디오 1).
뉴런에 시드된 GBM 세포의 철새 용량은 라미닌에 직접 시드된 세포와 비교되었다. 뉴런에 시드된 세포는 라미닌 단독으로보다 더 큰 철새 용량을가졌다(그림 3B,i, ii). P3 세포의 무작위 이동은 궤적플롯(도 3B,i,ii)에도시된 바와 같이 뉴런상 P3 세포에 대한 더 큰 거리로 두 조건에서 검출되었다. 세포 운동성은 평균 제곱 변위(MSD)에 의해 정량적으로 추정되었고, 그 로그 표현은 선형함수(도 3B,iii)를장착하였다. 방향성 및 평균 속도도 두 조건 모두에 대해 계산하였다(그림3B,iv,v). P3 스페로이드의 세포 이동은 또한 뉴런에 시간이 지남에 따라 형광 영역을 검출하고 라미닌 혼자 에 의한 이동과 비교하여 뒤따랐다(그림3C,i,ii 및 비디오 2). 뉴런을 가진 패턴의 반은 선형 단면도에서 500 분 후에 GBM 세포로 덮여 있었습니다; 그러나, 스페로이드는 라미닌 패턴을 준수하지않았다(도 3D,iii 및 비디오 2).
그림 1: 패턴 뉴런에서 마이그레이션하는 교모세포종 세포의 실험 적 설정. (a)코퍼스 캘로섬을 통해 반구를 침범하는 교모세포종 세포의 표현. (B)실험용 설정. 1단계에서 플레이트 표면은 페그 방지 층으로 코팅된다. 포토니티에이터는 전체 코팅을 덮는 2단계에서 첨가됩니다. 3단계에서는 광신기 분자를 로컬로 활성화하는 현미경의 목적을 통해 UV 와이드필드 이미지가 투사됩니다. 활성화된 광시화기는 PEG 분자를 로컬로 갈라놓고 라미닌의 후속 흡착을 허용합니다. 5단계에서는 뉴런을 시드하고 라미닌 배열을 부착합니다. P3(GFP/토마토핵)교모세포종 세포는 뉴런 패턴에 증착되고, 이미지가 획득된다(6단계). 약어: PEG = 폴리에틸렌 글리콜; 자외선 = 자외선; GFP = 녹색 형광 단백질. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 피지 도구 프리젠 테이션 및 분석 워크플로우. (A) Gliomas-Neurons라는 도구는 매크로가 Fiji.app | 폴더에 추가될 때 도구 | | 도구 집합(왼쪽 패널)에서 사용할 수 있습니다. 아래에 설명된 여러 작업 도구(오른쪽 패널)로 구성됩니다. (B) i. 네트워크 도구: 신경망 및 신경교종 세포를 단순화된 표현으로 그리는 데 사용되는 이미지 처리. ii. 단일 셀 추적 도구 : 단일 셀의 변위를 분석하기 위한 셀 이동 영역을 그리고 선택하는 데 사용되는 이미지 처리. iii. 추적 도구 : 미리 설치된 피지 추적 플러그인의 사용을위한 이미지 전처리 단계. iv. 상대 마이그레이션 도구: 수동으로 선택한 패턴에서 상대 셀 마이그레이션을 결정하는 데 사용되는 이미지 처리입니다. 일부 매개 변수는 도구 버튼을 왼쪽 클릭으로 보정할 수 있습니다. 약어: CSE = 대비 스트레치 향상; SED = 소벨 에지 검출기; F = 이중 필터링; CM = 마스크로 변환; Sk = 스켈레톤화; EP = 입자 제거; OR(결합) = 선택한 ROI의 연합 연산자; AND = 선택한 ROI의 연결 연산자입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 패턴 뉴런 대 라미닌 코팅에 P3 세포 또는 스페로이드의 비교. (A)뉴런 또는 라미닌에 해리된 P3 GFP/토마토핵 세포의 형상 설명자. i. 패턴 뉴런 또는 ii. 라미닌 코팅. 스케일 바 = 50 μm. iii. 패턴 뉴런 또는 라미닌에 평균 세포 영역. iv. 폼팩터는 원으로 정규화된 영역에 대한 둘레의 비율이며, 세포 신장 및 세포 분기에 대한 매개변수를 제공한다. v. 종횡비는 셀의 작은 축에 대한 주요 축의 비율입니다. iii에서, iv및 v,15세포는 필드당 분석되었다; 4 독립적 인 패턴; 데이터는 s.E.M.(B) 해리된 P3 세포의 추적 분석± 평균으로 표현된다. 세포의 대표적인 차트 플롯(i)패턴 뉴런 및(ii)라미닌 코팅에. iii. 뉴런 또는 라미닌 코팅에 마이그레이션하는 P3 세포의 MSD. X/Y 값은 로그자리믹 저울에 있습니다. iv. 방향성 비율. v. 평균 셀 속도 마이그레이션. iii에서, iv및 v,15세포는 필드당 분석되었다; 4 독립적 인 패턴; 데이터는 P3 GFP 스페로이드의평균 ± S.E.M(C) 마이그레이션 분석으로 표현된다. P3 스페로이드의 상이한 시점에서 대표적인 이미지(i)패턴 뉴런 또는 에(ii)라미닌 코팅. 스케일 바 = 100 μm. iii. 패턴 수렴성으로 표시되는 스페로이드 마이그레이션; 4 독립적 인 패턴; 데이터는 평균 ± S.E.M 약어로 표현됩니다: GFP = 녹색 형광 단백질; S.E.M. = 평균의 표준 오류; MSD = 평균 정사각형 변위. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
비디오 1: 뉴런 또는 라미닌에 P3 세포8 시간 이상 기록 (매 5 분 이미지). 비디오는 뉴런 (왼쪽)과 라미닌 코팅 (오른쪽)에 P3 단세포 이동을 보여줍니다. 세포는 녹색 형광 단백질 (GFP, 녹색) 및 핵 토마토 (붉은 색)를 표현했다. 바 = 50 μm. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
비디오 2: 뉴런 또는 라미닌에 P3 스페로이드8 시간 이상 기록 (매 5 분 이미지). 비디오는 뉴런 (왼쪽)과 라미닌 코팅 (오른쪽)에 P3 스페로이드 이동을 보여줍니다. 세포는 녹색 형광 단백질 (GFP, 녹색 색상)을 표현했다. 바 = 100 μm. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
교모세포종은 주변 혈관의 공동 옵션, 간질 침입 또는 WMTs18에대한 침략 : 다양한 모드를 사용하여 parenchyma를 광범위하게 침공한다. 이 후자의 모드는 WMT 침공과 관련된 생체 외 또는 생체 내 모델에 적합한 것을 찾는 데 어려움이 있기 때문에 문학에서 잘 특징지 지않습니다. 여기서, 배양된 설치류 뉴런이 라미닌 코팅 표면에 패턴화되고 형광 GBM 줄기와 같은 세포가 뉴런 위에 시드되는 단순화된 모델이 제안되었다. 이 연구에서는 종양 세포 부착, 침략 및 증식의 분석을 개선하기 위해 그리드 형상 패턴이 사용되었습니다. GBM 세포는 이러한 실험에서 라미닌이었던 매트릭스에서 직접보다 뉴런 의 상단에 더 효율적으로 마이그레이션. 셀 형상은 기록 과정 전반에 걸쳐 변경되고 셀 표면적이 동시에 증가했습니다. GBM 줄기 같이 세포는 특정 신호 통로 (즉, NOTCH2/SOX2)4 또는 분비된 요인 및 뉴런 자체로부터의 신호의 활성화를 통해 뉴런 기관에 의해 끌릴 가능성이 높습니다. 이 시스템은 GBM 세포와 뉴런 사이의 분자 교환을 분석하기에 적합하며 대사 산물, 신경 전달 물질 또는 사이토카인을 포함할 수 있습니다.
최근, 벤카테시와 협력자들은 글루타민이 수용체를 활성화하는 신경성조시냅스의 형성을 기술했다, AMPAR6. GBM 셀의 WMT 침공 중에 유사한 프로세스가 관련되어 있습니까? 이것은 약리학 억제 또는 유전 접근을 사용하여 이 실험 시스템으로 조사될 수 있습니다.
다음 중요 점에 유의해야 합니다. 첫째, PEGylation 단계 동안, 기판은 접착제 방지 코팅의 무결성에 영향을 미치지 않도록 건조할 수 없습니다. 참고로, PEG-SVA 용액을 초순수물로 광범위하게 세척하고 질소 스트림 하에서 건조한 후 어둠 속에서 4°C로 보관할 수 있습니다. 둘째, 뉴런에서 GBM 셀 마이그레이션을 분석하기 위해 개발된 매크로는 개방형 모드로 FiJi 소프트웨어와 호환됩니다. 이 매크로와 업데이트는 GitHub에서 사용할 수 있지만 셀 을 감지하기 위해 적절한 보정이 필요합니다. 따라서 분석을 시작하는 동안 샘플을 품질 관리로 수동으로 확인하는 것이 유용할 수 있습니다. 여기에 사용되는 시스템의 유연성은 다른 범위로 뉴런을 분리 병렬 라인, 패턴의 다른 모양을 허용합니다. 이러한 접근법으로, WMT 침공이 주로 관찰되는 인간 뇌에서 가장 큰 백색 물질 구조인 코퍼스 캘로섬에서 관찰된 바와 같이 여러 대뇌 구조의 형상을 모방할 수 있다. 대안적으로, 동일한 UV-광 프로젝션 장치는 z-대조식방식으로UV 민감성 비 접착제 하이드로겔을 구조화하여 스페로이드 형성의 표준화를 허용하는 것으로 나타났다.
이러한 맥락에서, 3D 신경구는 GBM 침공을 테스트하기 위하여 생성될 수 있었습니다. 이 기술은 또한 혈관 같이 모양을 재현하거나 microglial 또는 그밖 면역 세포를 모방하기 위하여 두뇌 내피 세포와 같은 그밖 대뇌 세포를 패터링하기 위해 적용될 수 있습니다. 따라서, 뇌세포의 시너지 효과 또는 억제 효과는 GBM 세포와 공동 배양될 때 관찰될 수 있다. 이 연구의 한 가지 제한은 실제 생리 조건을 모방하지 않을 수 있습니다 인간의 GBM 세포와 공동 배양에서 배아 쥐 뉴런의 사용이다. 이 단점을 극복 하는 한 가지 방법은 종 교차 반응성16을피하기 위해 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 뉴런을 사용 하는 것입니다. 그러나, GBM 세포는 이러한 실험에서 와 같이 쥐 뉴런에 빠르게 부착하고 효율적으로 마이그레이션합니다. 그것은 또한 쥐 대뇌 세포보다 입증되었다 (슈완 세포) 효율적으로 인간의 뉴런과 공동 배양 될 수있다(17. 다른 방법은 신경교종 세포이동(12)을연구하는 좋은 모델을 제공하는 3D 나노섬유의 사용을 포함하지만, 나노섬유로 세포 접촉을 제한하는 것은 비살아있는 구조로 간주됩니다.
더욱이, 2D 배양은 감소, 세포 과정의 관찰을 단순화하며, 생체 내 컨텍스트(10)에대한 타당성을 제한할 수 있다. 따라서, GBM 세포 및 뉴런의 3D 공동 배양은 생체 내 상황의 더 나은 대표자이다. 미니브레인(18)과같은 복잡한 뇌 오르가노이드는 대립 문화 침략 에 사용되어왔다 19. 본 명세서에 기재된 전략의 주요 장점은 공동 배양 접근법의 재현성, 즉, 1차 뉴런은 크기 조절 마이크로패턴에 기하학적으로 제약되고, 주입된 GBM 세포와의 상호작용은 다른 곳에서는 발생할 수 없다. 더욱이, 뉴런의 공간 조직은 UV 프로젝션 시스템의 다기능성 때문에 조정될 수 있어 추가 최적화를 가능하게 한다. 궁극적으로, 이러한 생체 모방 접근법의 개발 및 검증은 생물 의학 연구에 사용되는 동물 모델의 수를 줄이는 데 도움이 될 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
이 작품은 Fondation ARC 2020, 리그 콘트르 르 암 (코미트 드 라 지롱드), ARTC, 계획 암 2021, INCA PLBIO에 의해 지원되었다. 알베올은 에이전시 내셔널 드 라 레체쉬 (그랜트 라벡스 브레인 ANR-10-LABX-43)에 의해 지원됩니다. 조리스 가이온은 툴루즈 대학 병원(추 툴루즈)의 펠로우십 수혜자입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (3-aminopropyl) triethoxysilane | Sigma | 440140-100ML | The amino group is useful for the bioconjugation of mPEG-SVA |
| 96-well round-bottom plate | Sarstedt | 2582624 | Used to prepare spheroids |
| Accutase | Gibco | A11105-01 | Stored at -20 °C (long-term) or 4 °C (short-term), sphere dissociation enzyme |
| B27 | Gibco | 12587 | Stored at -20 °C, defrost before use |
| Basic Fibroblast Growth Factor | Peprotech | 100-18B | Stored at -20 °C, defrost before use |
| Countess Cell Counting ChamberSlides | Invitrogen | C10283 | Used to cell counting |
| Coverslips | Marienfeld | 111580 | Cell culture substrate |
| Dessicator cartridges | Sigma | Z363456-6EA | Used to reduce mosture during (3-aminopropyl) triethoxysilane treatment |
| DPBS 10x | Pan Biotech | P04-53-500 | Stored at 4 °C |
| Fiji software, MTrack2 macro | ImageJ | Used to analyze pictures | |
| Flask 75 cm² | Falcon | 10497302 | |
| HBSS | Sigma | H8264-500ML | |
| Heparin sodium | Sigma | H3149-100KU | Stored at 4 °C |
| Laminin | 114956-81-9 | Promotes neuronal adhesion | |
| Leonardo software | loading of envisioned micropatterns | ||
| MetaMorph Software | Molecular Devices LLC | NA | Microscopy automation software |
| Methylcellulose | Sigma | M0512 | Diluted in NBM for a 2% final concentration |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | Stored at 4 °C |
| Nikon TiE (S Fluor, 20x/0.75 NA) | inverted microscope equipped with a motorized stage | ||
| Penicillin - Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Stored at 4 °C |
| PLPP | Alveole | PLPPclassic_1ml | Photoinitiator used to degrade the PEG brush |
| Poly(ethylene glycol)-Succinimidyl Valerate (mPEG-SVA) | Laysan Bio | VA-PEG-VA-5000-5g | Used as an anti-fouling coating |
| PRIMO | Alveole | PRIMO1 | Digital micromirror device (DMD)-based UV projection apparatus |
| Trypan blue 0.4% | ThermoFisher | T10282 | Used for cell counting |
| Trypsin-EDTA | Sigma | T4049-100ML | Used to detach adherent cells |
References
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