Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

שיטה לשימור שורשי ביצות וריזוספרות להדמיה יסודית

Published: February 15, 2021 doi: 10.3791/62227
Automatic Translation
1, 1, 2
1Department of Plant and Soil Sciences, University of Delaware, 2National Synchrotron Radiation Lightsource-II, Brookhaven National Laboratory

Summary

אנו מתארים פרוטוקול לדוגמה, שימור וקטע שורשים שלמים ואת אדמת הריזוספירה שמסביב מסביבות ביצות באמצעות אורז(Oryza sativa L.) כמין לדוגמה. לאחר שהשתמרה, ניתן לנתח את הדגימה באמצעות טכניקות הדמיה אלמנטריות, כגון הדמיית פלואורסצנטיות כימית של קרני רנטגן סינכרוטרון (XRF).

Abstract

שורשים אינטראקציה נרחבת עם סביבת הקרקע שלהם אבל לדמיין אינטראקציות כאלה בין השורשים ואת הריזוספירה שמסביב הוא מאתגר. הכימיה של הריזוספירה של צמחי ביצות מאתגרת במיוחד ללכידה בגלל שיפועי חמצן תלולים מהשורשים לאדמה בתפזורת. כאן מתואר פרוטוקול המשמר ביעילות את מבנה השורש ואת הכימיה של קנה שורש של צמחי ביצות באמצעות הקפאת טריקה וייבוש קפוא. מקפיא סלאם, שבו המדגם קפוא בין גושי נחושת מקורר מראש עם חנקן נוזלי, ממזער נזק שורש ועיוות מדגם שיכול להתרחש עם הקפאת הבזק תוך מזעור שינויי דגימה כימיים. בעוד עיוות מדגם עדיין אפשרי, היכולת להשיג דגימות מרובות במהירות ועם עלות מינימלית מגדילה את הפוטנציאל להשיג דגימות משביעות רצון וממטבת את זמן ההדמיה. הנתונים מראים כי שיטה זו מצליחה לשמר מינים מופחתים של ארסן בשורשי אורז וריזוספרות הקשורות ללוחות ברזל. שיטה זו יכולה להיות מאומצת למחקרים של קשרי קרקע-צמחים במגוון רחב של סביבות ביצות המשתרעות על פני ריכוזים הנעים בין רכיבה על אופניים יסוד עקבות ליישומי phytoremediation.

Introduction

שורשים וריזוספרות שלהם הם דינמיים, הטרוגניים, וחשובים מאוד להבנת האופן שבו צמחים משיגים חומרים מזינים ומזהמיםמינרליים 1,2,3. שורשים הם המסלול העיקרי שבאמצעותו חומרים מזינים (למשל, זרחן) ומזהמים (למשל, ארסן) עוברים מאדמה לצמחים ובכך להבין שלתהליך זה יש השלכות על כמות ואיכות המזון, תפקוד המערכת האקולוגית והפיטורה. עם זאת, השורשים דינמיים במרחב ובזמן הגדלים בתגובה לצרכי רכישת חומרים מזינים ולעתים קרובות הם משתנים בתפקוד, בקוטר ובמבנה (למשל, שורשים לרוחב, שורשים הרפתקניים, שערות שורש)2. הטרוגניות של מערכות שורשים ניתן ללמוד על סולמות מרחביים מן הסלולר לרמת המערכת האקולוגית ועל סולמות זמניים משעה כדי decadal. לפיכך, האופי הדינמי וההטרוגני של השורשים והאדמה הסובבת שלהם, או קנה שורש, מציב אתגרים ללכידת הכימיה של הריזוספירה לאורך זמן. למרות אתגר זה, חובה ללמוד שורשים בסביבת הקרקע שלהם כדי לאפיין את מערכת היחסים הקריטית בין צמח לקרקע.

הכימיה של הריזוספירה של צמחי הביצות מאתגרת במיוחד לחקור בגלל שיפועי חמצן תלולים הקיימים מאדמה בתפזורת לשורשים, שמשתנים במרחב ובזמן. בגלל שורשים זקוקים לחמצן כדי להנשים, צמחי ביצות הסתגלו לתנאי החמצן הנמוכים של קרקעות ביצות על ידי יצירת aerenchyma4,5. Aerenchyma הם רקמות קליפת המוח חלולות המשתרעות מירי לשורשים, ומאפשרות פיזור אוויר דרך הצמח לשורשים. עם זאת, חלק מהאוויר הזה דולף לתוך הריזוספירה בחלקים פחות תת-קרקעיים של השורשים במיוחד ליד צמתים שורש לרוחב, טיפים שורש פחות בוגרים ואזורי התארכות6,7,8,9. אובדן חמצן רדיאלי זה יוצר אזור מחומצן בריזוספירה של צמחי ביצות המשפיעה על הכימיה של הריזוספירה (ביו-גיאו) ונבדלת מהאדמה בתפזורת מופחתת10,11,12. כדי להבין את גורלם והובלתם של חומרים מזינים ומזהמים בריזוספירות ובשורשים של ביצות, חיוני לשמר את האדמה בתפזורת המופחתת מבחינה כימית, את הריזוספירה המחומצנת ואת שורשי צמחי הביצות לניתוח. עם זאת, מכיוון שהאדמה בתפזורת מכילה מרכיבי קרקע מופחתים הרגישים לחמצן, שיטות שימור שורשים ואדמה חייבות לשמר מבני שורש ולמזער תגובות רגישות לחמצן.

קיימות שיטות לתיקון רקמות הצמח ולשמירה על מבנה אולטרה להדמיה, אך לא ניתן ליישם שיטות אלה כדי לשמר כימית שורשים הגדלים בקרקע ביצות. עבור חקירות שבהן רק ההתפלגות היסודית בתוך תאי הצמח רצויה, צמחים בדרך כלל גדלים הידרופוניקה ושורשים ניתן להסיר בקלות מן הפתרון, קבוע תחת החלפה הקפאה הקפאה בלחץ גבוה וחתך עבור מגוון רחב של יישומי הדמיה כולל ספקטרומטר מסה יון משני ברזולוציה גבוהה (nanoSIMS), מיקרוסקופיה אלקטרונים, וניתוח פלואורסצנטיות רנטגן סינכרוטרון (S-XRF)13, 14,15. כדי לחקור את Fe plaque בצד החיצוני של שורשי הביצות, מחקרים הידרופוניים אלה חייבים באופן מלאכותי לגרום היווצרות פלאק Fe בפתרון16, אשר אינו מייצג במדויק את ההטרוגניות של ההפצה והרכב מינרלי של היווצרות פלאק Fe ואלמנטים הקשורים במקום17,18,19,20. קיימות שיטות לשימור אדמת ביצות ומיקרואורגניזמים הקשורים עם מקפיא coring21, אבל קשה להשיג שורשים עם טכניקה זו. השיטות הנוכחיות לדמיין שורשים הגדלים בקרקע והכימיה הריזוספירית שלהם מורכבות משני סוגי מדידה עיקריים: שטפים אלמנטליים וריכוז אלמנטרי כולל (וספציה). הראשון נמדד בדרך כלל באמצעות שיפועים מפוזרים בסרטים דקים (DGT)22,23,24, שבו הקרקע ממוקמת לתוך rhizoboxes כדי לתמוך צמיחת הצמח בסביבת מעבדה ואלמנטים מעבדה בקרקע מפוזרים באמצעות ג'ל לשכבת כריכה. לאחר מכן ניתן לדמיין שכבת איגוד זו כדי לכמת את רכיבי העניין של המעבדה. טכניקה זו יכולה להמחיש בהצלחה את היחסים בין השורשים לבין הריזוספירה24,25,26,27, אבל חפצים מ תוחם שורש עשוי להתקיים על ידי גידול צמחים ב rhizoboxes, ומידע על פנים השורש אינו נתפס עם DGT. זה האחרון כרוך דגימה של השורשים ו rhizosphere, שמירה על המדגם, וניתוח ישיר של התפלגות אלמנטים על סעיף מדגם. עבור דגימה סביבתית זו של שורשי צמח הביצות ואת קנה ריזוספירה הסובבת, טיפול מדגם זהיר נדרש כדי למנוע חפצים מהכנת מדגם.

כאן מתואר פרוטוקול המשמר ביעילות מבני שורש וכימיה של פריזוספירה של צמחי ביצות על ידי הקפאת טריקה וייבוש קפוא. הקפאת הבזק יכולה להאט באופן דרסטי את התמורות של מפולות רגישות לחמצן, אך עלולה לפגוע בשורשים ועלול לגרום לגיוס כאשר הדגימות מתייבשות. עם זאת, מקפיא טריקה שבו המדגם קפוא בין בלוקים נחושת מקורר מראש עם חנקן נוזלי ממזער נזק שורש עיוות מדגם28. הדגימות המשומרות מוטמעות לאחר מכן בשרף אפוקסי המשמר כדגימה20,29 וניתן לחתוך ולצחצח להדמיה של שורשים בתוך אדמת הריזוספירה שלהם. הדגימות בדו"ח זה נותחו על ידי הדמיית דגימה כימית S-XRF לאחר חתך דק. עם זאת, ניתן להשתמש בטכניקות הדמיה אחרות, כולל ספקטרומטריית מסת פלזמה מצמידה לייזר (LA-ICP-MS), פליטת רנטגן הנגרמת על ידי חלקיקים (PIXE), ספקטרומטריית מסת יון משנית (SIMS) והדמיה של ספקטרוסקופיית פירוק המושרה בלייזר (LIBS).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת ציוד להקפאת טריקה

  1. מניחים שני גושי נחושת (כ-5 ס"מ על 5 ס"מ על 15 ס"מ) אופקית בתוך צידנית נקייה המסוגלת להחזיק חנקן נוזלי ולשפוך מספיק חנקן נוזלי כדי להטביע את הבלוקים. ברגע שהמבעבע שוכך, מניחים שני מרווחים על גבי גוש נחושת אחד בכל קצה.
    הערה: גובה המרווח קובע את גובה המדגם שיש להקפיא; דוגמה זו משתמשת במרווח של 2 ס"מ ליצירת קוביות כ-3 ס"מ x 3 ס"מ x 2 ס"מ. נפח החנקן הנוזלי יהיה תלוי בגודל הקריר יותר. דוגמה זו משתמשת בכ- 1 ליטר עבור כ- 5 קוביות בסידרה.
    אזהרה: השתמש בציוד מגן אישי מתאים ואוורור כמו חנקן נוזלי הוא קריוגן וחנק.
  2. באמצעות מלקחיים וכפפות קריוגניות, לעמוד על בלוק הנחושת האחר בקצה שלה, כדי להקל על אחזור כאשר המדגם הוא במקום.

2. איסוף דוגמאות והקפאת טריקה

  1. לחלץ את הצמח הרצוי rhizosphere מן האדמה הרטובה באמצעות את חפירה ולוודא כי הבור חפר הוא הרבה יותר גדול מאשר נפח השורש הרצוי. מניחים את האדמה והשתול לתוך מיכל ומניחים אותו על ספסל.
    הערה: ניתן להשתמש גם בכל האדמה והצמחים ממחקר סירים.
  2. קבעו את מיקום הקרקע הרצוי שבו יש לקחת שורשים (כלומר, עומק וקרבה לצילומים). חותכים אדמה עודפת באמצעות להב פלדה, תוך כדי דאגה לא להפריע לאדמה באזור הרצוי. כאשר מגיעים לאזור הרצוי, חותכים "קוביה" שורש כ 3 ס"מ x 3 ס"מ x 2 ס"מ ומיד מניחים את הקוביה בין שני המרווחים על בלוק הנחושת האופקי. באמצעות כפפות קריוגניות, להרים את בלוק נחושת אנכי ומניחים אותו על גבי spacers לטרוק-להקפיא את קוביית rhizosphere.
  3. לאחר מבעבע שוכך (~ 5 דקות), לאחזר את קוביית rhizosphere קפוא טריקה מן קוביות נחושת לעטוף בתוך ריבוע רדיד אלומיניום שכותרתו מראש. סמן את כיוון הבלוק בנייר הכסף אם תרצה. מניחים במיכל שני של חנקן נוזלי עד לאחסון במקפיא של -80 מעלות צלזיוס.
  4. חזור על הפעולה לפי הצורך כדי לקבל את המספר הרצוי של קוביות בסיס מאתר השדה או מהניסוי. ודא ששני גושי הנחושת מקבלים זמן להתקרר בין הדגימות.

3. הקפאת ייבוש והטבעת קוביות פריזוספירה

  1. הכן את מייבש ההקפאה בהתאם להוראות היצרן. הקפד להבטיח שהוא השיג את הלחץ והטמפרטורה המתאימים ואקום לפני הסרת דגימות מהמקפיא -80 °C .C.
  2. כאשר מייבש ההקפאה מוכן לקבל דגימות, מניחים קוביית ריזוספירה קפואה אחת בתוך צינור 50 מ"ל נקי ושטוף חומצה ומכסים באופן רופף עם מגבון חד פעמי נקי. אבטחו את המגבון עם גומייה. יש לחזור על הפעולה לפי הצורך כדי להבטיח קובייה אחת לכל צינור.
    הערה: אם המדגם גדול מדי עבור צינור, זה יכול להיות ממוקם ישירות לתוך כלי מייבש ההקפאה באמצעות רדיד האלומיניום כמחזיק מדגם.
  3. מניחים צינורות המכילים דגימות בכלי מייבש הקפאה ומקפיאים יבשים למשך מספר ימים. זמן הייבוש המדויק יהיה תלוי בתכונות הקרקע.
    הערה: יש לאחסן דגימות מיובשות במייבש ההקפאה או במתייבש כדי למנוע התייבשות.
  4. השתמש בלהב פלדה כדי לחתוך קוביות אדמה מיובשות לגודל, כך שהם יתאימו לצורה הרצויה (למשל, צורה בקוטר 25 מ"מ אידיאלית עבור רוב היישומים). תוויות כל צורה, מניחים את קוביות האדמה בצורות ומניחים את הצורות בתוך חיטוי ואקום.
  5. הכן אפוקסי בהתאם להוראות היצרן. ודא כי אפוקסי שנבחר אינו מזוהם עם ואינו גורם לשינויי דגימה של אלמנטים הרצויים 20,29,30.
  6. השתמש טפטפת כדי להוסיף אפוקסי לצורה בצד אחד של הקרקע, עד שהוא מכסה לחלוטין את המדגם. האדמה תתכהה בצבע כשהאפוקסי מקריר את האדמה.
    הערה: הוסף את האפוקסי לאט כדי לאפשר לאוויר באדמה לברוח.
  7. לאחר שהטפסים מתמלאים באפוקסי, סוגרים את תבשור הוואקום ומדליקים את הוואקום. בהתאם לכמות האוויר הלכודה בקרקע, ייתכן שיהיה צורך להוסיף אפוקסי נוסף לצורות מעת לעת. בדוק את רמת אפוקסי כל 30-90 דקות עבור הראשון 1-4 שעות ולהוסיף אפוקסי לפי הצורך.
  8. הסר את המדגם מהטופס לאחר האפוקסי התקשה (~ 5 ימים).

4. חיתוך וחתך קוביות הריזוספירה

  1. חותכים את הדגימה באמצעות מסור רטוב מדויק של להב היהלום. חותכים את הדגימות במקומות שונים אם לא מתקבלים שורשים בחיתוך הקודם.
  2. באופן ידני חול דגימות לחתוך עם נייר זכוכית דק יותר בהדרגה (למשל, 220, 500, 1000, ו 1500 חצץ) בצד לחתוך עבור ~ 30 s.
  3. בצע הדמיית פני השטח של הדגימות באמצעות טכניקות כגון LA-ICP-MS.
    הערה: כדי להכין מקטעים דקים עבור S-XRF, שלח את הדגימות לחברה המסוגלת להכין את המקטעים הדקים (ליטוש צד יחיד או כפול) או בצע את השלבים 4.4 - 4.6 כמתואר להלן.
  4. הדבק את הצד המדגם הרצוי למגלשת קוורץ באמצעות דבק סופר ואפשר לרפא בן לילה.
  5. באמצעות מכונת חיתוך דקה, לחתוך את הקרקע על שקופיות לעובי 2 מ"מ ולאחר מכן לטחון לעובי הרצוי (בדרך כלל 30 מיקרומטר). משטח המדגם יכול להיות מלוטש אם תרצה.
  6. בצע הדמיית S-XRF של המקטעים. בצע את השלבים המתאימים במתקן סינכרוטרון הרצוי וקו קרן כדי להגיש בקשה וניצול זמן הדמיה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

שיטה זו מאפשרת שימור של שורשים ומינים כימיים בשורשים ובריזוספירה של צמחי ביצות ולתוך האדמה בתפזורת. בעבודה זו, השיטה שימשה להערכת כמו speciation ולוקליזציה משותפת עם תחמוצות Fe ו Mn וחומרים מזינים צמחיים בריזוספירה של אורז (Oryza sativa L.). אורז גדל במתקן RICE באוניברסיטת דלאוור שבו 30 mesocosms אורז אורז (2 מ 'x 2 מ ', 49 צמחים כל אחד) משמשים לגידול אורז בתנאי ניהול קרקע ומים שונים במטרה להוריד את ספיגת As ו- Cd לגרגר אורז. ניסוי זה סיפק 1470 צמחים בודדים שמהם ניתן היה לדגום קנה ריזוספרות לאורך עונת הגידול.

בהינתן מספר מספיק של דגימות, חלקים דקים הצליחו ללכוד מגוון של מורפולוגיות שורש. איור 1A מציג מספר קטרי שורש הנמצאים במטריצת הקרקע כמקטעים רוחביים. עם זאת, חלקים מסוימים בקרקע עשויים להכיל מעט, אם בכלל, שורשים. בעבודה זו, 63 גושי קרקע עובדו וחתכו פעם אחת על המסור הרטוב כדי לקבוע איזו תת קבוצה של דגימות מתאימה לחיתוך דק. מתוך 63 הדגימות, 14 לא הכילו שורשים, 31 הכילו 1-3 שורשים ו-18 הכילו יותר מ-3 שורשים. שים לב כי השורשים עשויים להיות נוכחים ברמות שונות של איכות. איור 1B מציג שורש שמור היטב, שורש המעוות על-ידי תהליך ייבוש ההקפאה ושורש שהוצא במהלך תהליך החתך הדק.

מקטעים דקים של שורש נותחו באמצעות S-XRF כדי למפות את המיקום של אלמנטים מעניינים. איור 2B מציג מקטע רוחבי שורש עם שורש רוחבי במקטע אורך. איור 2C מציג מקטע בסיס זה שנותח על-ידי XRF עם חלקת טריקולור של Fe, Mn ו- As. ה- Fe נוכח בקרקע וסביב השורש בלוח Fe, ולוח Fe נראה גם בתמונות המיקרוגרף הקלות. מנגן נמצא באופן ייחודי בקליפת המוח של השורש לרוחב, אבל גם משתף פעולה עם Fe באזורים מסוימים ב Fe פלאק, המופיע כגוון ירוק-כחול. ארסן היה נוכח בעיקר vasculature של השורש לרוחב, מיזוג לתוך vasculature של השורש העיקרי.

הדמיית דגימה כימית הפרידה בין המינים השונים של העניין על ידי לקיחת מפות XRF חוזרות ונשנות באנרגיות קרן תקריות מרובות ושימוש בשילוב ליניארי המתאים לספקטרום XANES סטנדרטי. מפות ה-As מוצגות באיור 2D ומציגות שונות באותוקליזציה של As Species. איור 2E מציג את אותם נתונים כמו התוויית טריקולור. עלילת הטריקולור מראה ארסניט וארסניט גלוטתיון הקשורים קשר הדוק ב vasculature, בעוד arsenate ממוקם בעיקר על החלק החיצוני של השורש הקשורים פלאק Fe.

Figure 1
איור 1 - חלקים דקים משורש האורז המציגים מגוון תוצאות מתודולוגיות בקרקע של לום סחף (מוטות קנה מידה הם 0.5 מ"מ). A)ניכרים חתך קוטר שורשים רבים ושונים (בקופסאות לבנות). ב)שורשים עלולים להינזק במהלך התהליך. השורש בתיבה הלבנה נותר שלם ומעגלי, בעוד שהשורש בתיבה הכתומה נדחס במהלך תהליך ייבוש ההקפאה. התיבה האדומה מראה היכן שורש נשלף במהלך תהליך החלק הדק. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2 - חלק רוחבי של שורש אורז עם קטע אורך של שורש לרוחב בקרקע של לום. A) מקטע קרקע המציג מספר מקטעים רוחביים המשמשים כבסיס בתיבות לבנות. חצים לבנים מציינים מקטעי אורך. סרגל קנה המידה הוא 2 מ"מ. B) מקטע קרקע המציג שורש מהפינה השמאלית העליונה של החלונית A. מלבן לבן מציין אזור שמצולם על-ידי סינכרוטרון XRF. סרגל קנה המידה הוא 0.5 מ"מ. C) תמונת XRF טריקולור של ארסן (אדום), ברזל (ירוק) ומנגן (כחול). קנה המידה המרבי של As, Fe ו- Mn הם ביחס של 1:50:2.5. סרגל קנה המידה הוא 100 מיקרומטר. D)מפות דגימה של ארסן XRF עבור גלוטתיון ארסניט, ארסניט וסנאט, שם צבעים חמים יותר מצביעים על ריכוזים גבוהים יותר של As. סרגל קנה המידה הוא 100 מיקרומטר. E) חלקת טריקולור של As, שם העוצמה המרבית היא קנה מידה לארסניט (אדום) = סנאט arsenate (ירוק) = 0.5 גלוטתיון ארסניט (כחול). סרגל קנה המידה הוא 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מאמר זה מתאר פרוטוקול להשגת אדמה בתפזורת משומרת + ריזוספירות של שורשי צמח ביצות באמצעות טכניקת הקפאת טריקה שניתן להשתמש בה להדמיה יסודית ו /או מיפוי דגימה כימית.

ישנם מספר יתרונות של שיטה זו על פני שיטות קיימות. ראשית, שיטה זו מאפשרת חקירה סימולטנית של שורשים ואת הריזוספרות שמסביב. כיום קיימות שיטות לשימור ותמונה כימית של שורשים מסביבת הקרקע שלהם על ידי שטיפת האדמה ושמירה על שורשים31,32 או על ידי גידול צמחים בסביבות מלאכותיות (למשל, rhizoboxes) ושימוש בשיטות DGT כדי לבחון אינטראקציות בין קרקע שורש24,33,34 אך ללא היכולת להתבונן בשורש עצמו. השיטה המתוארת כאן מאפשרת חקירה ישירה של השורש והאדמה הסביבתית במקום לתצפית על יחסי קרקע שורש. טכניקה דומה שימשה כדי לבחון שורשי אורז במקום ואת הריזוספירה שמסביב, אבל עם צלילה את המדגם לתוך חנקן נוזלי11,35,36 במקום טריקה הקפאה המתוארת כאן. ככל שהרקמות קפואות מהר יותר, כך פוחת הסיכוי שהן ייצרו גבישי קרח37. מקפיא-טריקה בין גושי נחושת מקוררים מראש מקרר במהירות את המדגם ולכן ממזער את היווצרות גבישי הקרח ונזק לרקמת הצמח לאחר מכן שיכול להתרחש עם הקפאת הבזק באמצעות חנקן נוזלי בטמפרטורותהסביבה 11,38. בשיטה המתוארת כאן, ניתן לקחת מספר דגימות מאותו צמח, צמחים מרובים משדה ו/או מהסביבה בפרק זמן קצר יחסית. לאחר ההשגה, דגימות רבות יכולות להיות מיובשות בהקפאה, מוטבעות אפוקסי, לחתוך עם מסור רטוב להב יהלום עם עלות מינימלית. לאחר מכן ניתן לחקור דגימות אלה באמצעות מיקרוסקופ אור כדי לזהות דגימות מבטיחות שניתן לדמיין ישירות (למשל, LA-ICP-MS) או מעובדות עוד יותר עבור חתך דק והדמיה sXRF. מקטע דק אחד יכול ללכוד שורשים מרובים בגדלים שונים באותה שקופית, המסייעת ללכוד את קנה השורש ההטרוגני ולמקסם את זמן ההדמיה במכשיר. שיטה זו יכולה לשמש גם כדי לבחון ישירות יחסים בין צמחים לקרקע כגון הפרדה בלוחות Fe מבלי להפריע לריזוספירה. שיטות קיימות כדי לגרום היווצרות Fe פלאק על שורשי ביצות כמו אורז באמצעות ניסויים הידרופוניים39,40,41 לא מצליח ללכוד את ההטרוגניות של Fe פלאק במונחים של כיסוי שורש הרכב מינרלי המתרחשת צמחים שגדלו בקרקע11,18,20,42,43,44.

כדי שהשיטה תצליח, חשוב לבצע מספר שלבים מרכזיים. תחילה, ודא שהמיקום והכיוון לדוגמה שנבחרו מטפלים בשאלה הרצויה. שנית, השתמש אפוקסי כי הוא ללא זיהום יסוד עקבות הוכח לשמר דגימה כימית של כאלמנטים עניין20,29,30. שלישית, מוסיפים אפוקסי לאט ומניחים את המדגם באפוקסי תחת ואקום כדי להקל על הרטבה אפוקסית של המדגם והסרת גז לכוד. בעקבות שלבים אלה יספק מדגם באיכות גבוהה של אדמה בתפזורת, rhizosphere, ושורשים שניתן להשתמש בהם לניתוח תמונה.

יש לשקול מספר מגבלות של השיטה. ראשית, ייבוש הדגימה הקפואה על מייבש הקפאה יכול לגרום לעיוות של הקרקע, אשר עשוי להשפיע על השורשים. זה צפוי להיות מאתגר במיוחד בקרקעות עם תכולת חימר גבוהה ובכך נטייה לקריסה כמו חימר יבש. לדוגמה, דגימת ריזוספירה אורז שהתקבלה מחימר סחף הוכנה, ופיצוח האדמה ניכר, בעוד ששורש האורז מצופה הפלאק של Fe אינו מושפע(איור 3).

Figure 3
איור 3   - שורש אורז קטע דק מאדמת אורז חימר סחף. סדקים רבים בקרקע התרחשו במהלך ייבוש בהקפאה, אך סדקים אלה לא עיוותו את קטע האורך של השורש לרוחב, המתואר על ידי המלבן הלבן. סרגל קנה המידה הוא 0.5 מ"מ. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

הנתונים מראים כי טכניקה זו יכולה להשיג בהצלחה מידע בקנה מידה מיקרון בלום סחף (איורים 2, 3), וסביר להניח כי הטכניקה יכולה להצליח בקרקעות בעלות מרקם גס; עם זאת, קרקעות עם תוכן חימר גבוה יותר עשויות להציב אתגרים ויש לחקור אותן עוד יותר. שנית, ניתן להוציא שורשים מהאדמה בעת החתך. אתגר זה אינו ייחודי לפרוטוקול המתואר במאמר זה, אך יש לקחת בחשבון. שלישית, שורשים לא יכולים להיות נוכחים בכל קוביית אדמה, ולכן דגימות רבות צריך לקבל לחתוך כדי ללכוד את קנה רזוספירה של הצמח הרצוי. רביעית, שיטת השימור דורשת חנקן נוזלי, מה שעלול להציב אתגרים ללימודי שטח מרוחקים. כאן, הפרוטוקול כבר בשימוש מוצלח בתחום, שהיה פחות מ -2 קילומטרים מן החנקן הנוזלי דיואר. עם זאת, אם חנקן נוזלי אינו זמין במרחק נסיעה קצר מאתר שדה מרוחק, קיימות מספר אפשרויות להשגת המדגם. זה כולל שימוש במקור אחר כדי לקרר את גושי הנחושת או לחפור את המפעל כולו ואת האדמה שמסביב עם טבעת PVC גדולה, הצבת זה לתוך חומר בלתי חדיר גז, והובלה למקור החנקן הנוזלי הקרוב ביותר לשימור. בשביל זה, חשוב להבטיח כי לירות הצמח לא לחתוך משורשיו לפני קבלת מדגם rhizosphere. במידת הצורך, ניתן גם למקם את הדגימה תחת קירור ולשלוח אותה למשך הלילה למעבדה לשימור. לאחר שהתקבל במעבדה, חלקים יכולים להישמר באמצעות בלוקי נחושת מקוררים חנקן נוזלי. לבסוף, שינויי דגימה אפשריים עם כל שיטת שימור של קרקעות ביצות וריזוספרות. כדי למנוע זאת, יש להשיג דגימות ולהקפיא במהירות או אמצעים אחרים שננקטו לעיל כדי למנוע חשיפה לחמצן. הקצוות של דגימות מיובשות בהקפאה אז ניתן לגלח כדי למנוע קצוות כי ייתכן שהייתה חשיפה גבוהה יותר לחמצן. השימור של מינים מופחתים של ארסן בדגימות השורש והריזוספירה כאן (איור 1D, E) ובעבודההקודמת 28 מצביע על כך שטכניקה זו של הקפאת טריקה מסוגלת לשמר מינים כימיים רגישים לחמצן אם מבוצעת בקפידה.

שיטה זו יכולה לשמש כדי לענות על מספר שאלות מרכזיות במדע הריזוספירה. אלה כוללים יישומים הקשורים לחקר אינטראקציות מזינות ומזהמות בריזוספירה שעשויות לכלול אינטראקציות של מזהמים וחומרים מזינים עם פלקים Fe או Mn. השיטה מאפשרת לחקור את ההטרוגניות הזמנית והמרחבית של יחסי אדמה-צמחים ובחינת האופן שבו מורפולוגיות שורש אינטראקציה עם אלמנטים בריזוספירה במקום. זה יכול לשמש ביישומים הקשורים לביטחון מזון כגון הבנת ספיגת ארסן על ידי אורז, דינמיקה תזונתית בריזוספירה, או יישומים הקשורים phytoremedation כגון מתכת (loid) ספיגה לתוך צמחי ביצות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

המחברים מכירים במענק זרעים משותף לסיפרט וטאפרו כדי לתמוך בשיתוף פעולה בין אוניברסיטת דלאוור למעבדה הלאומית ברוקהייבן. חלקים ממחקר זה השתמשו בקו הקרן XFM (4-BM) של מקור האור הלאומי סינכרוטרון II, משרד האנרגיה האמריקאי (DOE) של מתקן משתמשים מדעיים המופעל עבור משרד DOE למדע על ידי המעבדה הלאומית ברוקהייבן תחת חוזה מס '. דה-SC0012704.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Copper blocks McMaster Carr 89275K42
Diamond blade Buehler 15 LC, 102 mm x 0.3 mm operation speed: 225 rpm
Epoxy forms Struers 40300085 FixiForm
Epoxy Epotek 301-2FL
Superglue Loctite 404
Thin sectioning machine Buehler PetroThin
Wet saw Buehler IsoMet 1000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ahkami, A. H., White, R. A., Handakumbura, P. P., Jansson, C. Rhizosphere engineering: Enhancing sustainable plant ecosystem productivity. Rhizosphere. 3 (2), 233-243 (2017).
  2. McNear, D. H. The rhizosphere - roots, soil and everything in between. Nature Education Knowledge. 4 (3), 1 (2013).
  3. Berendsen, R. L., Pieterse, C. M. J., Bakker, P. A. H. M. The rhizosphere microbiome and plant health. Trends in Plant Science. 17 (8), 478-486 (2012).
  4. Armstrong, W., Justin, S., Beckett, P. M., Lythe, S. Root adaptation to soil waterlogging. Aquatic Botany. 39 (1-2), 57-73 (1991).
  5. Armstrong, W. Oxidising activity of roots in waterlogged soils. Physiologia Plantarum. 20 (4), 920-926 (1967).
  6. Armstrong, W. Oxygen diffusion from roots of some Brittish bog plants. Nature. 204 (496), 801-802 (1964).
  7. Li, H., Ye, Z. H., Wei, Z. J., Wong, M. H. Root porosity and radial oxygen loss related to arsenic tolerance and uptake in wetland plants. Environmental Pollution. 159 (1), 30-37 (2011).
  8. Kotula, L., Ranathunge, K., Steudle, E. Apoplastic barriers effectively block oxygen permeability across outer cell layers of rice roots under deoxygenated conditions: roles of apoplastic pores and of respiration. New Phytologist. 184 (4), 909-917 (2009).
  9. Mei, X. Q., Ye, Z. H., Wong, M. H. The relationship of root porosity and radial oxygen loss on arsenic tolerance and uptake in rice grains and straw. Environmental Pollution. 157 (8-9), 2550-2557 (2009).
  10. Khan, N., et al. Root Iron Plaque on Wetland Plants as a Dynamic Pool of Nutrients and Contaminants. Advances in Agronomy. 138, 1-96 (2016).
  11. Yamaguchi, N., Ohkura, T., Takahashi, Y., Maejima, Y., Arao, T. Arsenic Distribution and Speciation near Rice Roots Influenced by Iron Plaques and Redox Conditions of the Soil Matrix. Environmental Science and Technology. 48 (3), 1549-1556 (2014).
  12. Frommer, J., Voegelin, A., Dittmar, J., Marcus, M. A., Kretzschmar, R. Biogeochemical processes and arsenic enrichment around rice roots in paddy soil: results from micro-focused X-ray spectroscopy. European Journal of Soil Science. 62 (2), 305-317 (2011).
  13. Moore, K. L., et al. Combined NanoSIMS and synchrotron X-ray fluorescence reveal distinct cellular and subcellular distribution patterns of trace elements in rice tissues. New Phytologist. 201 (1), 104-115 (2014).
  14. vander Ent, A., et al. X-ray elemental mapping techniques for elucidating the ecophysiology of hyperaccumulator plants. New Phytologist. 218 (2), 432-452 (2018).
  15. Sarret, G., Smits, E. A. H. P., Michel, H. C., Isaure, M. P., Zhao, F. J., Tappero, R. Use of Synchrotron-Based Techniques to Elucidate Metal Uptake and Metabolism in Plants. Advances in Agronomy. 119, 1-82 (2013).
  16. Moore, K. L., et al. High-Resolution Secondary Ion Mass Spectrometry Reveals the Contrasting Subcellular Distribution of Arsenic and Silicon in Rice Roots. Plant Physiology. 156 (2), 913-924 (2011).
  17. Seyfferth, A. L. Abiotic effects of dissolved oxyanions on iron plaque quantity and mineral composition in a simulated rhizosphere. Plant and Soil. 397 (1-2), (2015).
  18. Seyfferth, A. L., Webb, S. M., Andrews, J. C., Fendorf, S. Arsenic localization, speciation, and co-occurrence with iron on rice (Oryza sativa L) roots having variable Fe coatings. Environmental Science and Technology. 44 (21), (2010).
  19. Amaral, D. C., Lopes, G., Guilherme, L. R. G., Seyfferth, A. L. A new approach to sampling Iintact Fe plaque reveals Si-induced changes in Fe mineral composition and shoot As in rice. Environmental Science and Technology. 51 (1), 38-45 (2017).
  20. Seyfferth, A. L., Webb, S. M., Andrews, J. C., Fendorf, S. Defining the distribution of arsenic species and plant nutrients in rice (Oryza sativa L.) from the root to the grain. Geochimica et Cosmochimica Acta. 75 (21), (2011).
  21. Franchini, A. G., Zeyer, J. Freeze-Coring Method for Characterization of Microbial Community Structure and Function in Wetland Soils at High Spatial Resolution. Applied and Environmental Microbiology. 78 (12), 4501-4504 (2012).
  22. Smolders, E., Wagner, S., Prohaska, T., Irrgeher, J., Santner, J. Sub-millimeter distribution of labile trace element fluxes in the rhizosphere explains differential effects of soil liming on cadmium and zinc uptake in maize. Science of the Total Environment. 738, 140311 (2020).
  23. Santner, J., et al. High-resolution chemical imaging of labile phosphorus in the rhizosphere of Brassica napus L. cultivars. Environmental and Experimental Botany. 77, 219-226 (2012).
  24. Williams, P. N., et al. Localized Flux Maxima of Arsenic, Lead, and Iron around Root Apices in Flooded Lowland Rice. Environmental Science and Technology. 48 (15), 8498-8506 (2014).
  25. Yin, D. X., et al. Localized Intensification of Arsenic Release within the Emergent Rice Rhizosphere. Environmental Science and Technology. 54 (6), 3138-3147 (2020).
  26. Santner, J., et al. High-resolution chemical imaging of labile phosphorus in the rhizosphere of Brassica napus L. cultivars. Environmental and Experimental Botany. 77, 219-226 (2012).
  27. Smolders, E., Wagner, S., Prohaska, T., Irrgeher, J., Santner, J. Sub-millimeter distribution of labile trace element fluxes in the rhizosphere explains differential effects of soil liming on cadmium and zinc uptake in maize. Science of the Total Environment. 738, 140311 (2020).
  28. Seyfferth, A. L., Ross, J., Webb, S. M. Evidence for the root-uptake of arsenite at lateral root junctions and root apices in rice (Oryza sativa L.). Soil Processes. 1, 3 (2017).
  29. Masue-Slowey, Y., Kocar, B. D., Jofre, S. A. B., Mayer, K. U., Fendorf, S. Transport Implications Resulting from Internal Redistribution of Arsenic and Iron within Constructed Soil Aggregates. Environmental Science and Technology. 45 (2), 582-588 (2011).
  30. Root, R. A., Fathordoobadi, S., Alday, F., Ela, W., Chorover, J. Microscale Speciation of Arsenic and Iron in Ferric-Based Sorbents Subjected to Simulated Landfill Conditions. Environmental Science and Technology. 47 (22), 12992-13000 (2013).
  31. Blute, N. K., Brabander, D. J., Hemond, H. F., Sutton, S. R., Newville, M. G., Rivers, M. L. Arsenic sequestration by ferric iron plaque on cattail roots. Environmental Science and Technology. 38 (22), 6074-6077 (2004).
  32. Hansel, C. M., La Force, M. J., Fendorf, S., Sutton, S. Spatial and temporal association of As and Fe species on aquatic plant roots. Environmental Science and Technology. 36 (9), 1988-1994 (2002).
  33. Yin, D. X., et al. Localized Intensification of Arsenic Release within the Emergent Rice Rhizosphere. Environmental Science and Technology. 54 (6), 3138-3147 (2020).
  34. Maisch, M., Lueder, U., Kappler, A., Schmidt, C. Iron Lung: How Rice Roots Induce Iron Redox Changes in the Rhizosphere and Create Niches for Microaerophilic Fe(II)-Oxidizing Bacteria. Environmental Science and Technology Letters. 6 (10), 600-605 (2019).
  35. Voegelin, A., Weber, F. -A. A., Kretzschmar, R. Distribution and speciation of arsenic around roots in a contaminated riparian floodplain soil: Micro-XRF element mapping and EXAFS spectroscopy. Geochimica Et Cosmochimica Acta. 71 (23), 5804-5820 (2007).
  36. Smith, E., Kempson, I., Juhasz, A. L., Weber, J., Skinner, W. M., Grafe, M. Localization and speciation of arsenic and trace elements in rice tissues. Chemosphere. 76 (4), 529-535 (2009).
  37. Thompson, R. F., Walker, M., Siebert, C. A., Muench, S. P., Ranson, N. A. An introduction to sample preparation and imaging by cryo-electron microscopy for structural biology. Methods. 100, 3-15 (2016).
  38. Echlin, P., Lai, C., Hayes, T., Saubermann, A. Cryofixation of Lemna-minor roots for morphological and analytical studies. Cryoletters. 1 (9), 289-300 (1980).
  39. Ma, R., Shen, J. L., Wu, J. S., Tang, Z., Shen, Q. R., Zhao, F. J. Impact of agronomic practices on arsenic accumulation and speciation in rice grain. Environmental Pollution. 194, 217-223 (2014).
  40. Chen, Z., Zhu, Y. G., Liu, W. J., Meharg, A. A. Direct evidence showing the effect of root surface iron plaque on arsenite and arsenate uptake into rice (Oryza sativa) roots. New Phytologist. 165 (1), 91-97 (2005).
  41. Lee, C. H., Hsieh, Y. C., Lin, T. H., Lee, D. Y. Iron plaque formation and its effect on arsenic uptake by different genotypes of paddy rice. Plant and Soil. 363 (1-2), 231-241 (2013).
  42. Seyfferth, A. L., Amaral, D. C., Limmer, M. A., Guilherme, L. R. G. Combined impacts of Si-rich rice residues and flooding extent on grain As and Cd in rice. Environment International. 128, 301-309 (2019).
  43. Seyfferth, A., Limmer, M., Wu, W. Si and Water Management Drives Changes in Fe and Mn Pools that Affect As Cycling and Uptake in Rice. Soil Systems. 3 (3), (2019).
  44. Limmer, M. A., Mann, J., Amaral, D. C., Vargas, R., Seyfferth, A. L. Silicon-rich amendments in rice paddies: Effects on arsenic uptake and biogeochemistry. Science of the Total Environment. 624, 1360-1368 (2018).

Tags

מדעי הסביבה גיליון 168 הקפאת סלאם ייבוש בהקפאה מיפוי דגימה פלואורסצנטיות של קרני רנטגן LA-ICP-MS לוח שורש
שיטה לשימור שורשי ביצות וריזוספרות להדמיה יסודית
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Seyfferth, A. L., Limmer, M. A.,… More

Seyfferth, A. L., Limmer, M. A., Tappero, R. A Method to Preserve Wetland Roots and Rhizospheres for Elemental Imaging. J. Vis. Exp. (168), e62227, doi:10.3791/62227 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter