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Developmental Biology

Generazione di cellule staminali pluripotenti indotte da cellule fetali della sindrome di Turner (45XO) per la modellazione a valle dei deficit neurologici associati alla sindrome

Published: December 4, 2021 doi: 10.3791/62240
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1, 1
1Manipal Institute of Regenerative Medicine, Manipal Academy of Higher Education, Manipal, Karnataka, India-576104, 2Department of Medical Genetics, Manipal Hospitals
* These authors contributed equally

Summary

Questo protocollo descrive la generazione di iPSC libere da integrazione da fibroblasti del tessuto fetale attraverso la somministrazione di plasmidi episomiali mediante nucleofezione seguita dalla descrizione dei metodi utilizzati per la caratterizzazione iPSC e la differenziazione neuronale.

Abstract

Le aneuploidie cromosomiche causano gravi malformazioni congenite tra cui malformazioni del sistema nervoso centrale e morte fetale. Lo screening genetico prenatale è puramente diagnostico e non chiarisce il meccanismo della malattia. Sebbene le cellule dei feti aneuploidi siano preziose materie biologiche che portano l'aneuploidia cromosomica, queste cellule sono di breve durata, limitandone l'uso per esperimenti di ricerca a valle. La generazione di modelli di cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) è un metodo efficace di preparazione cellulare per la conservazione perpetua dei tratti aneuploidi. Si auto-rinnovano e si differenziano in cellule specializzate che ricordano lo sviluppo embrionale. Pertanto, le iPSC servono come strumenti eccellenti per studiare i primi eventi di sviluppo. La sindrome di Turner (TS) è una condizione rara associata a un cromosoma X completamente o parzialmente mancante. La sindrome è caratterizzata da infertilità, bassa statura, disturbi endocrini, metabolici, autoimmuni e cardiovascolari e difetti neurocognitivi. Il seguente protocollo descrive l'isolamento e la coltura di fibroblasti dal tessuto fetale TS (45XO), la generazione di TSiPSC libere da integrazione attraverso la somministrazione di plasmidi di riprogrammazione episomiale mediante nucleofezione seguita da caratterizzazione. Le TSiPSC di riprogrammazione sono state inizialmente sottoposte a screening mediante colorazione di fosfatasi alcalina a cellule vive, seguita da un'ampia indagine per i biomarcatori di pluripotenza. Colonie selezionate sono state sezionate meccanicamente, sono state attraversate più volte e cellule stabili auto-rinnovanti sono state utilizzate per ulteriori esperimenti. Le cellule hanno espresso fattori di trascrizione a pluripotenza OCT4, NANOG, SOX2, marcatori di superficie cellulare SSEA 4 e TRA1-81 tipici delle cellule staminali pluripotenti. Il cariotipo 45XO originale è stato mantenuto dopo la riprogrammazione. Le TSiPSC sono state in grado di formare corpi embrioidi e differenziarsi in cellule di endoderma, mesoderma ed ectoderma esprimendo biomarcatori specifici del lignaggio ((SRY BOX17), (MYOSIN VENTRICULAR HEAVY CHAINα/β), (βIII TUBULIN)). I plasmidi episomiali esogeni sono stati persi spontaneamente e non rilevati dopo il passaggio 15 nelle cellule. Queste TSiPSC sono una preziosa risorsa cellulare per modellare il neurosviluppo molecolare e cellulare difettoso che causa deficit neurocognitivi associati alla sindrome di Turner.

Introduction

Le aneuploidie portano a difetti alla nascita / malformazioni congenite e perdita di gravidanza negli esseri umani. ~ 50% -70% dei campioni da perdite di gravidanza mostrano anomalie citogenetiche. Gli embrioni aneuploidi persi all'inizio della gravidanza non possono essere facilmente ottenuti per l'analisi sperimentale, sollevando la necessità di sviluppare altri modelli che rappresentino da vicino l'embriogenesi umana. Le cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) derivate da cellule con diagnosi di disturbi genetici sono state utilizzate per modellare le irregolarità genetiche rappresentative e le loro conseguenze sullo sviluppo fetale1,2,3,4. Queste iPSC assomigliano alle cellule epiblastiche dell'embrione in via di sviluppo e possono ricapitolare i primi eventi di formazione dell'embrione. Consentono la comprensione e la caratterizzazione del programma di sviluppo dei lignaggi cellulari e il patterning nei primi embrioni di mammiferi. iPSC derivate in precedenza da fibroblasti cutanei e amniociti da test diagnostici prenatali di sindromi aneuploidiche come la monosomia X (sindrome di Turner), la trisomia 8 (sindrome di Warkany 2), la trisomia 13 (sindrome di Patau) e la trisomia parziale 11; 22 (sindrome di Emanuel) hanno fornito preziose informazioni sullo sviluppo fallito4.

La sindrome di Turner (TS) è una condizione rara caratterizzata da infertilità femminile, bassa statura, disturbi endocrini e metabolici, aumento del rischio di malattie autoimmuni e predisposizione alle malattie cardiovascolari5. Sebbene sia l'unica sindrome da monosomia sopravvissuta, è anche letale per l'embrione in via di sviluppo causando aborti spontanei6. Gli individui sopravvissuti con TS presentano gradi di alterazione del materiale cromosomico X nelle loro cellule. I cariotipi vanno dalla perdita completa di un cromosoma X (45,XO) a mosaici come 45,XO/46,XX; 45,XO/47,XXX, la presenza di cromosomi ad anello, la presenza di materiale cromosomico Y, ecc5.

La diagnosi della sindrome viene generalmente effettuata mediante cariotipizzazione del sangue di individui sintomatici e campionamento dei villi coriali (CVS) per rilevare le sindromi da aneuploidia precoce. Poiché le sindromi aneuploidiche rappresentano circa il 30% degli aborti spontanei, è di routine cariotipizzare il prodotto del concepimento (POC) su un aborto spontaneo. Queste cellule fetali tra cui i villi coriali che possiedono l'anomalia citogenetica e le iPSC da esse derivate forniscono una preziosa fonte di materiale biologico per studiare le sindromi da aneuploidia4,6. Le iPSC TS sono state precedentemente stabilite da amniociti tramite riprogrammazione retrovirale4, fibroblasti di villi coriali (ottenuti attraverso diagnosi prenatale) tramite riprogrammazione retrovirale6, da cellule mononucleate del sangue7 tramite riprogrammazione del virus Sendai e da fibroblasti cutanei di individui TS tramite riprogrammazione lentivirale4 . Poiché l'obiettivo principale del nostro laboratorio è comprendere il fallimento dello sviluppo, abbiamo generato iPSC TS da POC, in particolare la componente villi corionica di un aborto spontaneo8. Tutte le cellule isolate da questo tessuto fetale avevano un cariotipo 45XO e producevano iPSC con lo stesso cariotipo. Queste iPSC sono uniche in quanto sono le prime ad essere generate da un feto abortito e forniscono una risorsa preziosa per studiare i fallimenti della gravidanza legati all'aneuploidia. Questo articolo fornisce una metodologia dettagliata della generazione di iPSC da questa fonte cellulare unica tramite riprogrammazione episomiale.

I primi metodi di generazione di iPSC utilizzavano la trasduzione virale e i trasposoni per fornire i fattori di riprogrammazione. I metodi per indurre le cellule alla pluripotenza si sono evoluti dall'uso di vettori retroviraliintegranti 9,vettori lentivirali escissibili10,11 e metodi basati su trasposoni12 a vettori adenovirali non integranti13 e vettori basati sul virus Sendai14. La riprogrammazione retrovirale e lentivirale, sebbene efficiente, comporta l'integrazione dei fattori di riprogrammazione nei cromosomi dell'ospite, causando mutazioni di inserzione che hanno effetti imprevisti nelle iPSC. Inoltre, la riprogrammazione virale impedisce l'applicazione traslazionale delle iPSC. Sono stati esplorati i sistemi basati sull'RNA15 e il rilascio diretto di proteine16 per eliminare completamente i potenziali rischi associati all'uso di virus e trasfezioni di DNA. Tuttavia, questi metodi si sono dimostrati inefficienti.

Nel 2011, Okita et al. hanno riportato una migliore efficienza di riprogrammazione da parte dei plasmidi episomiali aumentata con la soppressione di TP53 tramite shRNA. Hanno anche sostituito cMYC con LMYC non trasformante (MYC associato al carcinoma polmonare a piccole cellule) per migliorare la sicurezza delle hiPSC. Questi plasmidi episomiali esprimono 5 fattori di riprogrammazione: OCT4, LIN28, SOX2, KLF4, LMYC e shRNA per TP5317,18. Questi vettori vengono mantenuti extra-cromosomicamente e persi dalle cellule riprogrammate su coltura continua, rendendo così le linee prive di transgeni entro 10-15 passaggi. La nucleofezione è una forma specializzata di elettroporazione che fornisce acidi nucleici direttamente nel nucleo delle cellule ospiti. È un metodo efficiente per la consegna dei plasmidi di riprogrammazione in vari tipi di cellule. I plasmidi episomiali sono convenienti e compensano gli alti costi della nucleofezione. Questo metodo è efficiente e riproducibile in condizioni ottimizzate producendo iPSC stabili da una varietà di cellule somatiche. In questo protocollo, descriviamo il metodo per la generazione di iPSC da fibroblasti isolati dal tessuto fetale mediante nucleofezione di plasmidi di riprogrammazione episomiale. Ecco i protocolli dettagliati per l'isolamento dei fibroblasti dai villi corionici fetali, la purificazione dei plasmidi, la nucleofezione, il prelievo di colonie dalla piastra di riprogrammazione e la creazione di iPSC stabili.

È essenziale confermare la presenza di tratti di pluripotenza nelle iPSC appena generate. Ciò include la dimostrazione di fattori correlati alla pluripotenza (ad esempio, espressione di fosfatasi alcalina, NANOG, SSEA4, Tra 1-80, Tra 1-81, E-caderina; di solito mostrata con saggi di immunofluorescenza o espressione genica), identificazione dei tre strati germinali mediante saggi di differenziazione in vitro per convalidare i loro potenziali di differenziazione, cariotipizzazione per determinare il contenuto cromosomico, tipizzazione STR per stabilire l'identità con le cellule genitrici, verificare la perdita di geni esogeni, e saggi in vivo più rigorosi come la formazione di teratomi e la complementazione tetraploide. Qui descriviamo i protocolli di caratterizzazione del cariotipo, la colorazione della fosfatasi alcalina delle cellule vive, il rilevamento di biomarcatori correlati alla pluripotenza mediante immunofluorescenza, saggi di differenziazione in vitro e metodo per dimostrare la perdita di geni esogeni19.

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Protocol

FCV sono stati ottenuti dal Manipal Hospital, Bengaluru, sotto l'approvazione del Comitato Etico degli Ospedali Manipal.

NOTA: vedere la Tabella 1 per la composizione di tutti i buffer e le soluzioni.

1. Isolamento dei fibroblasti dai villi corionici fetali (FCV)

  1. Raccolta del campione e disintegrazione dei tessuti nella collagenasi
    1. Raccogliere FCV in condizioni sterili in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e trasportare (a temperatura ambiente) all'impianto di coltura cellulare.
    2. Trasferire i villi in una capsula di Petri da 60 mm e lavare più volte (minimo 4 volte) in PBS contenente 1x soluzione antibiotica antimicotica (PBS-AA). Rimuovere completamente PBS-AA mediante pipettaggio.
    3. Trattare i villi corionici con 1 mL di miscela di collagenasi (5 mg/mL) per 5 minuti a 37 °C.
    4. Neutralizzare con terreno di coltura cellulare contenente il 10% di siero bovino fetale (FBS), trasferire il digest in un tubo da 15 ml e centrifugare a 225 x g per 5 minuti per raccogliere i villi disintegrati e le cellule rilasciate come pellet.
  2. Sottocultura ed espansione delle scorte
    1. Villi disintegrati a piastra insieme a cellule rilasciate in un pallone di coltura T25 contenente 5 ml di mezzi completi (ad esempio, AmnioMAX) e crescono fino a ottenere una coltura di fibroblasti confluenti.
    2. Espandere i fibroblasti in coltura per preparare le scorte per l'uso in successivi esperimenti di trasfezione e caratterizzazione come segue:
      1. Aggiungere 2 ml di tripsina allo 0,05% al matraccio T25 contenente fibroblasti FCV e incubare a 37 °C per 3-5 minuti per dissociare le cellule.
      2. Dopo l'incubazione, neutralizzare la tripsina aggiungendo FBS (allo stesso volume della tripsina).
        NOTA: il terreno di coltura contenente FBS può anche essere utilizzato per neutralizzare la tripsina, se aggiunto a un rapporto tripsina: media 1:3.
      3. Raccogliere le cellule dissociate in un tubo da 15 ml e centrifugare a 225 x g per 5 minuti per ottenere pellet cellulare.
      4. Decantante surnatante e pellet cellulare riconsoso in 1 mL di mezzo completo.
      5. Trasferire 500 μL ciascuno a piatti trattati con coltura tissutale da 60 mm e portare il volume a 5 mL. Questo rapporto di divisione di 1:2, è stato utilizzato anche per i passaggi successivi.
  3. Crioconservazione
    1. Eseguire la dissociazione enzimatica utilizzando lo 0,05% di tripsina come descritto nei passaggi 1.2.2.1 - 1.2.2.3 e ottenere pellet cellulare.
    2. Scartare il surnatante e risospendare il pellet cellulare in 1 mL di miscela di congelamento, comprendente 1:9 dimetilsolfossido (DMSO): FBS.
    3. Trasferire il contenuto in un crioviale sterile e posizionare il flaconcino in un contenitore di congelamento.
    4. Congelare durante la notte a -80 °C e quindi trasferire i flaconcini in azoto liquido (-196 °C) il giorno successivo.

2. Isolamento e verifica del DNA dei plasmidi

  1. Preparazione delle cellule batteriche
    1. Streak glycerol stocks di E. coli contenenti i tre singoli plasmidi pCXLE-hOCT3/4-shp53-F, pCXLE-hSK e pCXLE-hUL (da Addgene) su piastre separate di Agar Luria Bertani-ampicillina.
    2. Inoculare singole colonie in colture starter da 5 ml di terreno Luria Bertani-ampicillina. Incubare per 8 ore a 37 °C con agitazione (10 x g).
    3. Inoculare 200 μL di questa coltura di avviamento in 100 mL di terreno di luria Bertani-ampicillina. Incubare durante la notte a 37 °C con agitazione.
    4. Raccogliere la coltura batterica durante la notte mediante centrifugazione a 6000 x g per 15 minuti a 4 °C.
  2. Isolamento plasmidi con kit di purificazione Midi Plasmid
    1. Resuspend pellet batterico in tampone di risuspensione da 4 mL.
    2. Aggiungere 4 mL di tampone di lisi e mescolare accuratamente invertendo vigorosamente 4-6 volte e incubare a temperatura ambiente per 5 minuti.
    3. Aggiungere 4 mL di tampone di neutralizzazione pre-refrigerato e invertire il tubo 4-6 volte per mescolare accuratamente. Incubare su ghiaccio per 15 min.
    4. Centrifugare a ≥20.000 x g per 30 min a 4 °C. Raccogliere il surnatante in un tubo fresco e ricentrizzare a ≥20.000 x g per 15 minuti a 4 °C.
    5. Equilibrare la colonna applicando 4 mL di tampone di equilibrio.
    6. Applicare il surnatante alla colonna.
    7. Lavare la colonna due volte con 10 ml di tampone di lavaggio.
    8. DNA eluto con 5 mL di tampone di eluizione caldo (65 °C).
    9. Precipitare il DNA aggiungendo 3,5 ml di isopropanolo al DNA eluito. Mescolare bene. Centrifugare a ≥15.000 x g per 30 min a 4 °C. Decantante surnatante con attenzione.
    10. Lavare il pellet di DNA con 2 ml di etanolo al 70% e centrifugare a ≥15.000 x g per 10 minuti. Decantante surnatante con attenzione.
    11. Pellet essiccato all'aria per 5-10 min e sciogliere il DNA in un volume adeguato di acqua di grado PCR per ottenere una concentrazione finale di 1 μg/mL.
      NOTA: Non sciogliere il DNA in tamponi in quanto non è adatto per l'elettroporazione. La vecchia preparazione del DNA plasmidico non produce colonie riprogrammate.
  3. Verifica del plasmide mediante digestione di restrizione EcoRI
    1. Combinare 15 μL di acqua priva di nucleasi, 2 μL di tampone 10x, 1 μg di DNA plasmidico e 1 μL di enzima EcoRI. Mescolare delicatamente.
    2. Incubare la miscela a 37 °C per 15 minuti in un blocco di calore.
    3. Mescolare i campioni di plasmide digeriti con 6x colorante di carico di gel di DNA ed elettroforese su gel di agarose all'1% in 1 tampone TAE con 0,5 μg / mL di bromuro di etidio. Includi la scala del DNA standard. Immagina il gel dopo che il DNA si è risolto in modo appropriato. Le dimensioni previste della banda EcoRI di pCXLE-hOCT3 / 4-shp53-F sono 6.834 bp, 3.758 bp e 1.108 bp; pCXLE-hUL sono 10.200 bp e 1.900 bp; pCXLE-hSK sono 10.200 bp e 2.500 bp.

3. Nucleofezione

  1. Pellettizzazione delle celle
    1. Coltivare i fibroblasti dei villi corionici fetali isolati in pallone T25 in 5 ml di mezzo completo fino all'80-90% di confluenza.
    2. Lavare le cellule due volte con PBS e tripsinizzare come descritto nei passaggi 1.2.2.1 - 1.2.2.3.
    3. Rimuovere il pellet surnatante e riconsosciato in 5 ml di mezzi sierici ridotti (ad esempio, Opti-MEM). Conta le cellule con l'emocitometro e prendi 106 cellule per la nucleofezione. Centrifuga a 225 x g per 5 min. Rimuovere completamente il surnatante.
  2. Preparazione del reagente e nucleofezione
    1. Preparare il reagente nucleofettivo mescolando 0,5 mL di integratore e 2,25 mL di soluzione nucleofettrice (entrambi forniti nel kit).
    2. Aggiungere 100 μL di soluzione nucleofettrice in un tubo da 1,5 mL. Aggiungere 1μg ciascuno di pCXLE-hOCT3/4-shp53-F, pCXLE-hSK e pCXLE-hUL al tubo. Risusegnare delicatamente 106 celle (dal punto 3.1.2) in questa miscela.
    3. Trasferire la sospensione di DNA cellulare in cuvetta, assicurandosi che il campione copra il fondo della cuvetta (fornita nel kit) senza bolle d'aria. Tappare la cuvetta e inserirla nel supporto. Selezionare il nucleofettore Programma U-23 (per un'alta efficienza) e applicare.
    4. Rimuovere la cuvetta dal supporto e aggiungere 1 mL di supporto completo. Trasferire delicatamente il contenuto in una capsula di Petri trattata con coltura tissutale da 60 mm riempita con 4 mL di terreno completo (per un totale di 5 mL di terreno). Incubare le cellule in un incubatore a CO2 umidificato a 37 °C.
    5. Dopo 24 ore, controllare se le celle si sono attaccate. Sostituire completamente il supporto.
      NOTA: Il tasso di morte cellulare è elevato in nucleofezione lasciando poche cellule vitali che si attaccano.
    6. Mantenere le cellule in supporti completi per 10 giorni e passare a supporti a pluripotenza per i prossimi 20 giorni.
      NOTA: Visualizzare regolarmente le cellule per seguire i cambiamenti morfologici che si verificano nelle cellule di riprogrammazione (come la morfologia epiteliale e la formazione di colonie compatte) per confermare se l'esperimento sta funzionando. Circa 25 colonie di iPSC possono essere viste dopo 20 giorni di coltura in mezzi di pluripotenza.

4. Raccolta e propagazione delle colonie di iPSC

  1. Raccolta della colonia dalla piastra di riprogrammazione
    1. Sezionare manualmente le colonie embrionali simili a cellule staminali formate nel piatto di riprogrammazione utilizzando pipette di vetro tirate o aghi per siringa da 1 mL e trasferirle su una piastra precedentemente preparata con alimentatori di fibroblasti embrionali di topo inattivati con mezzo di pluripotenza o stabilire colture prive di alimentatore su piastre rivestite di Matrigel con mezzo mTESR.
      NOTA: I fibroblasti embrionali di topo (MEF) sono stati derivati utilizzando l'isolamento enzimatico da embrioni di topo (sezionati da topi femmina gravidi di 13-14 giorni) e sono stati mitoticamente inattivati dal trattamento con mitomicina C. Stabilire popolazioni di singoli cloni facendo crescere singole colonie dalla piastra di riprogrammazione in piatti separati o popolazioni di cloni misti trasferendo molte colonie dalla piastra di riprogrammazione a un singolo piatto.
  2. Trasferimento meccanico delle colonie emergenti agli alimentatori freschi e al passaggio per stabilire iPSC stabili
    1. Propagare le iPSC in mezzo di pluripotenza nutrendosi ogni due giorni e dividere 1:3 ogni 5-7 giorni. Preparare le scorte crioconservando in un mix di congelamento di KnockOut Serum Replacement e DMSO nel rapporto 9:1.
      NOTA: KnockOut Serum Replacement viene utilizzato nella miscela di congelamento per la crioconservazione di iPSC invece di FBS in quanto i componenti dell'FBS potrebbero indurre la differenziazione delle cellule pluripotenti durante la conservazione a lungo termine.

5. Caratterizzazione delle iPSC

NOTA: Gli studi di caratterizzazione, tra cui PCR e immunostaining per biomarcatori di pluripotenza, sono stati effettuati dopo il numero di quinto passaggio. Il cariotipo è stato eseguito in un numero di passaggio successivo.

  1. Cariotipo
    1. Trattare una capsula di Petri confluente da 60 mm di iPSC con colcemide per 45 minuti in incubatore a CO2 umidificato a 37 °C.
    2. Raccolta con trattamento con tripsina 0,05% e centrifuga. Rimuovere il surnatante e pipettare le tracce rimanenti di mezzo per allentare il pellet cellulare.
    3. Aggiungere 5 ml di soluzione ipotonica. Mescolare invertendo il tubo e incubare per 20 minuti a 37 °C. Centrifuga a 225 x g per 5 min.
      NOTA: Il pellet ottenuto dovrebbe apparire soffice.
    4. Aggiungere lentamente 2,5 ml di soluzione fissativa di Carnoy, picchiettando per allentare il pellet.
    5. Preparare gli spread per il cariotipo facendo cadere la sospensione cellulare su vetrini puliti.
    6. Trattare i vetrini con tripsina allo 0,15% per 1 minuto e lavare una volta con PBS. Quindi colorare con la soluzione giemsa per 4 minuti e terminare con un lavaggio ad acqua distillata. Acquisire ed elaborare con software appropriato.
  2. Dimostrazione dello stato di transgene free
    1. Isolamento del DNA genomico
      1. Pipettare 20 μL di proteasi nel fondo di un tubo microcentrifuga da 1,5 mL.
      2. Aggiungere 200 μL di TSiPSC spese in PBS al tubo microcentrifuga.
      3. Aggiungere 200 μL di Buffer AL al campione e mescolare per 15 s mediante vortice di impulsi.
      4. Incubare per 10 minuti a 56 °C.
      5. Centrifugare brevemente il tubo microcentrifuga per rimuovere le gocce dall'interno del coperchio.
      6. Aggiungere 200 μL di etanolo (96-100%) al campione e mescolare di nuovo per 15 s mediante vortice di impulsi. Dopo la miscelazione, centrifugare brevemente il tubo per rimuovere le gocce dall'interno del coperchio.
      7. Applicare con attenzione la miscela del passaggio precedente alla colonna mini spin (in un tubo di raccolta da 2 ml) senza bagnare il cerchio. Chiudere il tappo e centrifugare a 6000 x g per 1 min. Scartare il tubo contenente il filtrato e posizionare la mini colonna di centrifuga in un tubo di raccolta pulito da 2 ml.
      8. Aprire con attenzione la mini colonna di rotazione e senza bagnare il cerchio, aggiungere 500 μL di Buffer AW1. Chiudere il tappo e la centrifuga a 6000 x g per 1 min. Posizionare la colonna mini spin in un tubo di raccolta pulito da 2 ml ed eliminare il tubo di raccolta contenente il filtrato.
      9. Aprire con attenzione la mini colonna di rotazione e aggiungere 500 μL di Buffer AW2 senza bagnare il cerchio. Chiudere il tappo e centrifugare a piena velocità (20.000 x g) per 3 min.
      10. Posizionare la mini colonna di centrifuga in un nuovo tubo di raccolta da 2 ml e scartare il vecchio tubo di raccolta con il filtrato. Centrifugare a piena velocità per 1 minuto per eliminare la possibilità di un possibile riporto del Buffer AW2.
      11. Posizionare la colonna mini spin in un tubo microcentrifuga pulito da 1,5 mL ed eliminare il tubo di raccolta contenente il filtrato. Aprire con attenzione la mini colonna di rotazione e aggiungere 200 μL di Tampone AE o acqua distillata. Incubare a temperatura ambiente (15-25 °C) per 5 min, quindi centrifugare a 6000 x g per 1 min.
    2. Transgene-Free Status PCR (utilizzando KAPA HiFi PCR Kit KR0368)
      1. Assicurarsi che tutti i reagenti siano adeguatamente scongelati e miscelati.
      2. Preparare una miscela master PCR contenente il volume appropriato di tutti i componenti della reazione in base alla Tabella 2 (impostare le reazioni sul ghiaccio).
      3. Trasferire i volumi appropriati di mix master PCR, modello e primer ai singoli tubi PCR.
      4. Tappare le singole reazioni, mescolare e centrifugare brevemente.
      5. Eseguire la PCR seguendo la Tabella 3.
  3. Identificazione di biomarcatori di pluripotenza
    1. Colorazione alcalina della fosfatasi (AP)
      1. Preparare una soluzione di lavoro con macchie vive 1x AP diluendo 3 μL di soluzione stock 500x in 1,5 mL DMEM/F-12 per ogni 10 cm2 di area di coltura.
      2. Rimuovere il mezzo dal piatto di coltura iPSC. Lavare la coltura con DMEM/F-12 una volta. Aggiungere la soluzione di colorazione viva 1x AP sulle iPSC. Incubare a 37 °C per 45 min.
      3. Rimuovere la macchia AP e lavare due volte con DMEM/F-12. Aggiungi DMEM/F-12 fresco e immagine al microscopio fluorescente utilizzando un filtro FITC standard entro 30-90 minuti dalla colorazione.
    2. Immunostaining per biomarcatori di pluripotenza
      1. Fissare colture confluenti di iPSC con il 4% di paraformaldeide durante la notte a 4 °C. Lavare tre volte con PBS Tween 20 (PBST), ogni lavaggio per 5 min.
      2. Permeabilizzare le cellule con 0,3% Triton X-100 in PBST per 15 minuti a temperatura ambiente. Lavare tre volte con PBST.
        NOTA: La permeabilizzazione deve essere eseguita solo per gli antigeni intracellulari.
      3. Blocca le cellule con il 3% di albumina sierica bovina (BSA) in PBST per 30 minuti a temperatura ambiente. Macchiare le cellule con anticorpi primari (diluiti 1:1000 in 1% BSA) durante la notte. Dopo l'incubazione degli anticorpi primari, lavare tre volte con PBST.
      4. Incubare le cellule con l'anticorpo secondario (diluito 1:1000 in 1% BSA) per 5 ore a temperatura ambiente. Lavare tre volte con PBST.
      5. Etichettare i nuclei con 0,5 μg/mL 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) per 1 minuto. Lavare le cellule una volta con PBST.
      6. Cattura immagini al microscopio fluorescente.

6. Saggi di differenziazionein vitro

  1. Differenziazione del corpo embrioide (EB)
    1. Tagliare le colonie di iPSC in piccoli pezzi, raccogliere e placcare in piastre di Petri a basso attacco in mezzo corporeo embrionale. Far crescere le cellule per 15 giorni sostituendo il mezzo ogni 3 giorni.
      NOTA: Gli EB del giorno 15 possono essere utilizzati direttamente per il rilevamento dei tre biomarcatori dello strato germinale. In alternativa, specifici lignaggi cellulari possono essere indotti con fattori di crescita, seguiti dal rilevamento di biomarcatori.
  2. Differenziazione dell'endoderma (epatociti)
    1. Coltiva le iPSC in colture monostrato in mezzo di pluripotenza.
    2. Una volta confluente, passare a supporti RPMI 1640 con 1x insulina transferrina selenito e 100 ng / mL activina A per 2 giorni, seguito da una crescita dei mezzi RPMI 1640 con 30 ng / mL bFGF e 20 ng / mL BMP4 per 9 giorni. Sostituire il mezzo ogni 2 giorni.
    3. Dal giorno 10 in poi, integrare i media con desametasone da 0,1 μM. Terminare l'esperimento il giorno 20.
  3. Differenziazione del mesoderma (cardiomiociti)
    1. Piastra giorno 8 EBs su piastre rivestite di Matrigel allo 0,5% in mezzo corporeo embrioide. Consentire agli EB di attaccarsi e comprimere.
    2. Integrare i supporti con 20 ng / mL BMP4 e crescere per 20 giorni. Sostituire il mezzo ogni 2-3 giorni. Terminare l'esperimento il giorno 20.
  4. Differenziazione dell'ectoderma (neuronale)
    1. Piastra giorno 4 EBs su 2 μg/cm2 piastre rivestite di collagene di tipo IV in mezzo corporeo embrioide. Consentire agli EB di attaccarsi e comprimere.
    2. Il giorno successivo, passare al DMEM F-12 con 2 mg / mL di glucosio, 1x insulina transferrina selenito e 2,5 μg / mL di fibronectina. Terminare l'esperimento il giorno 15.
  5. Formazione di organoidi cerebrali
    1. Coltiva TSiPSC in un piatto di coltura tissutale da 35 mm su MEF fino al 70-80% di confluente. Tagliare le colonie e raccoglierle in un tubo da 15 ml. Centrifugare le celle a 225 x g per 5 min. Scartare il surnatante.
    2. Lavare i pezzi di colonie riconsociendo in 2 ml di PBS e centrifugare per rimuovere il surnatante.
    3. Aggiungere 1 mL di tripsina allo 0,05% e toccare il tubo per rimuovere le cellule. Incubare il tubo a 37 °C per 3-4 minuti per dissociare i pezzi della colonia in una sospensione a cellula singola.
    4. Neutralizzare la tripsina per diluizione con 4 mL di mezzo di pluripotenza contenente 10 μg/mL di inibitore della proteina chinasi rho-associata (ROCK) Y-27632 dicloridrato (ROCKi) per prevenire la morte cellulare indotta dalla dissociazione.
    5. Centrifuga per ottenere un pellet. Scartare il surnatante e risusemere le cellule in un mezzo corporeo embrioide da 2 ml contenente 10 μg/mL di ROCKi.
    6. Rimuovere 10 μL di sospensione cellulare per il conteggio cellulare. Aggiungere 10 μL di blu trypan per rilevare le cellule morte. Contare le cellule usando un emocitometro.
    7. Aggiungere un volume appropriato di mezzo corporeo embrioide con ROCKi alla sospensione cellulare per ottenere 9.000 cellule vive per 150 μL.
    8. Piastra da 150 μL in ogni pozzetti di una piastra a 96 pozzetti a basso attacco e incubare in un incubatore a CO2 umidificato a 37 °C. Controllare le piastre per l'aggregazione dopo 24 ore. Il giorno 2 rimuovere delicatamente il mezzo e sostituirlo con un mezzo embrionale fresco senza ROCKi.
    9. Il giorno 6, trasferire gli EB ai pozzetti di una piastra a 24 pozzetti a attacco basso contenente 500 μL di mezzo di induzione neurale composto da DMEM-F12 con supplemento N2 all'1%, supplemento GlutaMAX da 2 mM e 1 mM di aminoacidi non essenziali e 1 μg/mL di eparina. Cambia il mezzo ogni 2 giorni.
    10. Dopo 5 giorni nel mezzo di induzione neurale incorporare gli aggregati neuroepiteliali in Matrigel stratificando un quadrato di parafilm di 2 cm x 2 cm su un vassoio di punta vuoto di punte da 200 μL. Premere parafilm con le dita guantate su ciascun foro nel vassoio della punta per fare piccole ammaccature. Pulire il parafilm con il 70% di etanolo per sterilizzare.
    11. Trasferire il quadrato del parafilm in una parabola da 60 mm. Utilizzare punte tagliate da 200 μL per trasferire gli aggregati neuroepiteliali sulle ammaccature nel parafilm. Rimuovere il mezzo in eccesso mediante pipettaggio.
    12. Aggiungere 30 μL di Matrigel scongelato sugli aggregati neuroepithliali e posizionare l'aggregato al centro del Matrigel usando una punta di pipetta. Posizionare il piatto da 60 mm per 20-30 minuti in un incubatore a 37 °C per la polimerizzazione del Matrigel.
    13. Aggiungere 5 mL di mezzo di differenziazione organoide cerebrale composto da 1:1 DMEM-F12: mezzo neurobasale, integratore N2 0,5%, 2,5 μg/mL di insulina, integratore GlutaMAX da 2 mM, 0,5 mM NEAA, supplemento B27 all'1% e 2,5 ml di penicillina-streptomicina.
    14. Usando una pinica sterile capovolgere il foglio di parafilm e agitare il piatto fino a quando gli aggregati incorporati in Matrigel cadono dal foglio nel mezzo. Coltivare gli aggregati incorporati in un incubatore a CO2 umidificato a 37 °C per 4 giorni, dando cambiamenti di supporto a giorni alterni.
    15. Dopo 4 giorni di coltura statica posizionare le parabole da 60 mm su uno shaker orbitale installato all'interno dell'incubatore scuotendo a 50 giri/min. Colturare gli organoidi per 3 mesi dando cambiamenti completi dei media con mezzo di differenziazione organoide cerebrale ogni 3 giorni.

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Representative Results

Generazione di iPSC senza integrazione da un feto abortito spontaneamente con cariotipo 45XO
Abbiamo isolato fibroblasti da FCV con un cariotipo 45XO specifico per la sindrome di Turner (TS) e li abbiamo nucleoatizzati con plasmidi di riprogrammazione episomiale per generare TSiPSC che possono essere utilizzate per la modellazione a valle della sindrome, in particolare i deficit neurologici associati (Figura 1a&b). Abbiamo usato vettori episomiali non ingragratori e nucleofezione per gli esperimenti di trasfezione (Figura 1 c&d). Abbiamo seguito i cambiamenti morfologici delle cellule per monitorare il successo della riprogrammazione. È stato osservato il passaggio dalla morfologia fibroblasto a quella epiteliale, seguito da una formazione compatta di colonie delineata (Figura 2a). Le TSiPSC hanno acquisito una morfologia simile a una cellula staminale embrionale umana con bordi distinti e un elevato rapporto nucleo-citoplasma intorno al giorno 20 dopo la trasfezione (Figura 2b). Al contrario, le cellule non completamente riprogrammate acquisiscono morfologie epiteliali ma non riescono a formare colonie compatte. (Figura 2c).

Caratterizzazione delle TSiPSC
Il cariotipo delle TSiPSC ha rivelato il cariotipo 45XO associato alla sindrome di Turner (Figura 3a). L'immunofluorescenza delle TSiPSC ha mostrato espressione dei fattori di trascrizione a pluripotenza OCT4, NANOG, SOX2 e dei marcatori di superficie cellulare SSEA4, E-Caderina e TRA-1-81. Le cellule staminali embrionali umane sono il gold standard delle cellule staminali pluripotenti. Abbiamo eseguito contemporaneamente l'immunofluorescenza di HUES 1 che è stata utilizzata come controllo positivo per il confronto dell'espressione di biomarcatori di pluripotenza da parte di TSiPSC (Figura 3b). Lo stato libero da transgeni delle TSiPSC è stato dimostrato da una PCR genomica del DNA per i marcatori plasmidici episomiali OriP ed EBNA. Con il passaggio 15, i geni OriP ed EBNA sono stati persi nelle TSiPSCs.I geni episomiali OriP ed EBNA sono stati amplificati e hanno mostrato bande nel passaggio 9 TSiPSCs che indicano la presenza dei plasmidi episomiali in questa fase. Tuttavia, questi geni non sono stati amplificati nel passaggio 15 TSiPSCs indicando una perdita dei plasmidi episomiali e quindi uno stato libero da transgeni (Figura 3c).

Saggi di differenziazione in vitro
Il potenziale di differenziazione delle linee TSiPSC è stato dimostrato in vitro. TSiPSCs all'aggregazione in placche a basso attacco formavano corpi embrioidi (Figura 4a). La differenziazione indotta dal fattore di crescita delle TSiPSC è stata utilizzata per generare i tipi cellulari dei tre strati germinali. L'analisi di immunofluorescenza utilizzando biomarcatori specifici del lignaggio ha confermato che le TSiPSC si differenziavano in derivati rappresentativi dell'endoderma (SOX17), del mesoderma (MYOSIN VENTRICULAR HEAVY CHAINα/β) e dell'ectoderma (βIII TUBULIN) (Figura 4b).

Differenziamento organoide cerebrale.
Le TSiPSC sono state differenziate come organoidi cerebrali in modo graduale. Le sospensioni monocellulari di TSiPSCs sono state aggregate in corpi embrioidi per stimolare lo sviluppo di strati germinali per i primi 6 giorni, seguiti dall'induzione dello sviluppo neuroepiteliale per 5 giorni. I neuroepiteliali aggregati erano incorporati in Matrigel che forniva la matrice extracellulare e i componenti della membrana basale che supportano il corretto orientamento apicobasale, la escrescenza delle gemme neuroepiteliali che si espandono e formano i lumi. L'immunofluorescenza con marcatore neuroepiteliale NESTIN è stata eseguita per osservare la morfologia complessiva degli organoidi (Figura 5b). Il neuroepitelio circonda una cavità simile a un ventricolo (Figura 5c - linea bianca). Gli organoidi mostrano morfologicamente zone ventricolari (VZ), zona sub ventricolare (SVZ) e regioni simili allacorteccia (Figura 5c - linee rosse, arancioni e gialle rispettivamente)

Figure 1
Figura 1: Isolamento e riprogrammazione dei fibroblasti tramite nucleofezione.  (a) Immagine microscopica dei villi corionici fetali prima del trattamento con collagenasi. b)Fibroblasti isolati da villi corionici fetali per esperimenti di riprogrammazione. c)Verifica della riprogrammazione dei plasmidi mediante digestione a restrizione EcoRI. (d) Diagramma schematico del protocollo di trasfezione impiegato per la generazione di iPSC da fibroblasti villi coriali fetali utilizzando plasmidi di riprogrammazione episomiale tramite nucleofezione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Istituzione di cellule staminali pluripotenti indotte dalla Sindrome di Turner. a)Cambiamenti della morfologia cellulare osservati durante il corso della riprogrammazione. b)Una colonia TSiPSC completamente riprogrammata. c)Un'immagine rappresentativa di una colonia con cellule riprogrammate in modo improprio. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Caratterizzazione delle STIPSC.  a)Cariotipo delle TSiPSC. b)Analisi di immunofluorescenza dei biomarcatori di pluripotenza OCT4, NANOG, SOX2, SSEA-4 e TRA-1-81 nelle TSiPSC rispetto alle cellule staminali embrionali HUES1. I nuclei sono colorati con 4', 6-diamidino-2-fenilindolo. 3c. Dimostrazione dello stato di transgene free delle TSiPSC. Lane 1- DNA ladder, Lane 2- OriP positive control con pCXLE-hSK, Lane 3- EBNA positive control con pCXLE-hSK, Lane 4-OriP con TSiPSCs, Lane 5-EBNA con TSiPSCs. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Potenziale di differenziazione in vitro delle TSiPSC.  a) TSiPSC differenziato in corpi embrioidi. b)Analisi di immunofluorescenza delle STIPSC per marcatori endodermici SOX17, marcatori mesodermici miosina ventricolare a catena pesante α/β e marcatori ectodermici βIII tubulina e SOX2. I nuclei sono colorati con 4', 6-diamidino-2-fenilindolo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Differenziazione organoide neuronale e cerebrale delle TSiPSC.  ( a ) Per comprendere la citoarchitettura dei neuroni differenziati, è stata eseguitalacolorazione con falloidina dell'actina. I neuroni derivati da TSiPSC mostravano soma neuronale di forma piramidale (punta di freccia) con dendriti e assoni (frecce). I nuclei sono colorati con 4', 6-diamidino-2-fenilindolo. Immunostaining. a)Immunostaining per Nestin e actina per osservare la morfologia grossolana degli organoidi. (c) Colorazione per Nestin per visualizzare gli strati neuronali organizzati apicalmente e basalmente. I nuclei sono colorati con 4', 6-diamidino-2-fenilindolo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Composizione di supporti, buffer e soluzioni Fare clic qui per scaricare questa tabella.

Tabella 2: PCR Reaction Mix Fare clic qui per scaricare questa tabella.

Tabella 3: Programma di ciclismo PCR Fare clic qui per scaricare questa tabella.

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Discussion

La generazione di modelli cellulari stabili di tessuto fetale citogeneticamente anormale è necessaria per perpetuare il fenotipo difettoso. La via iPSC è il metodo più efficace di preparazione cellulare per la conservazione perpetua delle proprietà difettose20.

Le cellule staminali pluripotenti (PSC) mostrano proprietà di auto-rinnovamento e differenziazione in cellule specializzate che ricordano gli embrioni di scissione precoce21. Quindi, i PSC possono servire come modelli eccellenti per studiare i primi difetti molecolari, cellulari e di sviluppo nei feti abortiti prematuramente.

In questo articolo abbiamo descritto la generazione di iPSC umana utilizzando la nucleofezione combinata con i vettori episomiali migliorati. I risultati mostrano che questa combinazione comprende un metodo robusto per generare linee iPSC umane prive di integrazione, come evidenziato dal fatto che le singole trasfezioni erano sufficienti per una riprogrammazione di successo. Abbiamo monitorato la progressiva conversione dei fibroblasti FCV in cellule pluripotenti al microscopio. 20 giorni dopo la trasfezione abbiamo osservato colonie di TSiPSC riprogrammate circondate da fibroblasti FCV non riprogrammati. Morfologicamente, le iPSC umane derivate assomigliavano a cellule staminali embrionali cresciute insieme in laboratorio. Tipicamente, le cellule si aggregavano come colonie compatte con bordi lucidi. Le cellule delle colonie avevano nuclei grandi e strettamente imballati suggerendo uno stretto contatto di membrana tra le cellule. I fibroblasti non riprogrammati si inarcavano e circondavano queste colonie. Al momento del trasferimento agli iMEF continuano a proliferare nella cultura per oltre 30 trasferimenti dimostrando la proprietà di un continuo auto-rinnovamento.

Poiché le TSiPSC sono state generate da fibroblasti 45XO, abbiamo cariotipizzato le cellule per verificare se mantenevano la composizione cromosomica. Le TSiPSC hanno mantenuto il cariotipo 45XO in coltura cellulare continua suggerendo un corredo genetico cromosomico 45XO stabile. Per essere utili come risorsa cellulare che rappresenta l'aneuploidia 45XO, le TSiPSC dovrebbero essere prive di DNA esogeno utilizzato negli esperimenti di riprogrammazione. Abbiamo verificato la presenza di plasmidi episomiali residui eseguendo una PCR genomica del DNA per marcatori episomiali specifici-OriP ed EBNA. Non abbiamo trovato traccia di questi marcatori nelle cellule TSiPS dopo 15 passaggi suggerendo che le TSiPSC hanno progressivamente perso vettori di riprogrammazione episomiale in coltura prolungata.

Il segno distintivo di una cellula pluripotente è il suo potenziale di differenziarsi in cellule di tre linee germinali sia in vitro che in vivo. Per testare questa capacità nelle TSiPSC derivate, le abbiamo sottoposte in vitro a saggi di formazione e differenziazione del corpo embrioide diretti dal lignaggio specificando citochine e fattori di crescita. Le TSiPSC formavano corpi embrioidi e si differenziavano in cellule ectodermiche che esprimono marcatori neuronali, cellule mesodermiche che esprimono marcatori cardiaci e cellule endodermiche che esprimono SOX17 un biomarcatore del destino dell'endoderma. Abbiamo anche testato la capacità delle TSiPSC di differenziarsi in organoidi cerebrali 3D di ordine superiore utilizzando i protocolli precedentemente stabiliti22. Le TSiPSC si auto-organizzano progressivamente grazie ai propri programmi di sviluppo intrinseci in mini tessuti chiamati organoidi. Le TSiPSC hanno prodotto organoidi cerebrali che mostrano una citoarchitettura simile al tessuto cerebrale con neuroepitelio che circonda una cavità simile a un ventricolo. Tuttavia, questi organoidi devono essere ulteriormente caratterizzati in modo estensivo per rivelare i tipi cellulari esatti e confrontati con le normali iPSC per distinguere le proprietà intrinseche di pattern del tessuto neurale delle TSiPSC. Questi organoidi cerebrali e altri tipi di organoidi cerebrali generati da TSiPSCs possono essere utilizzati per modellare incongruenze dello sviluppo e funzionali che possono contribuire ai sintomi di carenze neurologiche di individui TS. Le TSiPSC hanno mostrato caratteristiche biomarcatori di pluripotenza e il tratto distintivo della differenziazione, evidenziando così il successo della riprogrammazione alla pluripotenza indotta.

Il metodo sopra descritto ha funzionato in modo efficiente nella riprogrammazione dei fibroblasti dermici e delle cellule mesenchimali derivate da varie fonti nel nostro laboratorio (dati di altre linee non mostrati). Nella nostra esperienza, i seguenti passaggi sono fondamentali per il successo dell'esperimento di riprogrammazione:

a) Qualità della preparazione dei plasmidi: i vecchi preparati non producono iPSC.
b) Qualità delle cellule utilizzate per le trasfezioni: le cellule proliferanti sono essenziali per la generazione di iPSC. Da 0,5 a 1 milione di cellule per trasfezione hanno prodotto un'efficienza di riprogrammazione riproducibile.
c) Reagenti nucleofettori appena ricostituiti: i reagenti nucleofettiri ricostituiti conservati per oltre un mese non hanno prodotto iPSC.
d) Il mantenimento della banca di cellule master mediante sottocoltura meccanica delle iPSC ha prodotto linee stabili. La dissociazione enzimatica è stata utilizzata secondo i requisiti dell'esperimento.

L'obiettivo futuro del laboratorio è quello di stabilire un pannello di iPSC cromosomicamente anormali per lo sviluppo a valle, la modellazione funzionale e della malattia utilizzando questo metodo efficiente. Le aneuploidie fetali causano perdita di gravidanza e malformazioni d'organo nei nati vivi. Le iPSC aneuploidi derivate da tessuti di aborti spontanei sono una risorsa preziosa per modellare e studiare eventi di sviluppo embrionale falliti. I sistemi di coltura 2D e 3D in vitro, compresi i corpi embrioidi e gli organoidi specifici dei tessuti22, consentiranno ai ricercatori di comprendere le irregolarità molecolari e cellulari come la proliferazione cellulare aberrante e la morte cellulare in cellule specifiche del lignaggio che potrebbero manifestarsi come anomalie dello sviluppo e fallimenti della gravidanza associati alle sindromi aneuploidiche.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Il sostegno finanziario per la ricerca di cui sopra è stato fornito da Manipal Academy of Higher Education. La caratterizzazione della linea è stata condotta parzialmente nel laboratorio di M.M. Panicker presso NCBS. Ringraziamo Anand Diagnostic Laboratory per l'assistenza con il cariotipo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.15% trypsin Thermo Fisher Scientific 27250018 G Banding
2-mercaptoethanol Thermo Fisher Scientific 21985023 Pluripotency and Embryoid body medium
4', 6 diamidino-2-phenylindole Sigma Aldrich D8417 Immunocytochemistry
Activin A Sigma Aldrich SRP3003 Differentiation assays
Alkaline Phosphatase Live Stain Thermo Fisher Scientific A14353 AP staining
AMAXA Nucleofector II Lonza - Nucleofection
AmnioMAX II complete media Thermo Fisher Scientific, Gibco 11269016 Medium specific for foetal chorionic villi cell cultures
Ampicillin HiMedia TC021 Plasmid purification
Anti Mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 488 Invitrogen A11059 Immunocytochemistry
Anti Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 488 Invitrogen A11034 Immunocytochemistry
Anti Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 546 Invitrogen A11035 Immunocytochemistry
Antibiotic-Antimycotic Thermo Fisher Scientific, Gibco 15240096 Contamination control
Anti-E-Cadherin BD Biosciences 610181 Immunocytochemistry
Anti-Nanog BD Biosciences 560109 Immunocytochemistry
Anti-OCT3/4 BD Biosciences 611202 Immunocytochemistry
Anti-SOX17 BD Biosciences 561590 Immunocytochemistry
Anti-SOX2 BD Biosciences 561469 Immunocytochemistry
Anti-SSEA4 BD Biosciences 560073 Immunocytochemistry
Anti-TRA 1-81 Millipore MAB4381 Immunocytochemistry
basic Fibroblast Growth Factor[FGF2] Sigma Aldrich F0291 Pluripotency medium
Bone Morphogenetic Factor 4 Sigma Aldrich SRP3016 Differentiation assays
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A3059 Blocking
Collagen Human Type IV BD Biosciences 354245 Differentiation assays
Collagenase blend Sigma Aldrich C8051 Digestion of foetal chorionic villi
Dexamethasone Sigma Aldrich D4902 Differentiation assays
DMEM F12 Thermo Fisher Scientific 11320033 Differentiation assays
FastDigest EcoR1 Thermo Scientific FD0274 Restriction digestion
Fibronectin Sigma Aldrich F2518 Differentiation assays
Giemsa Stain HiMedia S011 G Banding
Glacial Acetic Acid HiMedia AS001 Fixative for karyotyping
Glucose Sigma Aldrich G7528 Differentiation assays
GlutaMAX Thermo Fisher Scientific 35050061 Pluripotency and Embryoid body medium
Heparin sodium Sigma Aldrich H3149 Differentiation assays
Insulin solution human Sigma Aldrich I9278 Differentiation assays
Insulin Transferrin Selenite Sigma Aldrich I1884 Differentiation assays
KAPA HiFi PCR kit Kapa Biosystems KR0368 OriP, EBNA1 PCR
KaryoMAX Colcemid Thermo Fisher Scientific 15210040 Mitotic arrest for karyotyping
KnockOut DMEM Thermo Fisher Scientific 10829018 Pluripotency and Embryoid body medium
KnockOut Serum Replacement Thermo Fisher Scientific 10828028 Pluripotency and Embryoid body medium
Luria Bertani agar HiMedia M1151F Plasmid purification
Matrigel BD Biosciences 356234 Differentiation assays
MEM Non-essential amino acids Thermo Fisher Scientific 11140035 Pluripotency and Embryoid body medium
Methanol HiMedia MB113 Fixative for karyotyping
Myosin ventricular heavy chain α/β Millipore MAB1552 Immunocytochemistry
NHDF Nucleofector Kit Lonza VAPD-1001 Nucleofection
Paraformaldehyde (PFA) Sigma Aldrich P6148 Fixing cells
pCXLE-hOCT3/ 4-shp53-F Addgene 27077 Episomal reprogramming Plasmid
pCXLE-hSK Addgene 27078 Episomal reprogramming Plasmid
pCXLE-hUL Addgene 27080 Episomal reprogramming Plasmid
Penicillin Streptomycin   Thermo Fisher Scientific,  15070063 Pluripotency and Embryoid body medium
Phalloidin- Tetramethylrhodamine B isothiocyanate Sigma Aldrich P1951 Immunocytochemistry
Phosphate buffered saline Sigma Aldrich P4417 1 X PBS 1 tablet of PBS dissolved in 200mL of deionized water and sterilized by autoclaving
Storage: Room temperature.
PBST- 0.05% Tween 20 in 1X PBS.
Storage: Room temperature.
Plasmid purification Kit- Midi prep QIAGEN 12143 Plasmid purification
Potassium Chloride Solution HiMedia MB043 Hypotonic solution for karyotyping
QIAamp DNA Blood Kit Qiagen 51104 Genomic DNA isolation
RPMI 1640 Thermo Fisher Scientific 11875093 Hepatocyte differentiation medium
Sodium Citrate HiMedia RM255 Hypotonic solution for karyotyping
Triton X-100 HiMedia MB031 Permeabilisation
Trypsin-EDTA (0.05%) Thermo Fisher Scientific, Gibco 25300054 Subculture of  foetal chorionic villi fibroblasts
Tween 20 HiMedia MB067 Preparation of PBST
β III tubulin Sigma Aldrich T8578 Immunocytochemistry
Y-27632 dihydrochloride Sigma Aldrich Y0503 Differentiation assays

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Biologia dello sviluppo Numero 178 Riprogrammazione Cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo Aneuploidie Malformazioni congenite Morte fetale spontanea Sindrome di Turner Deficit neurologici
Generazione di cellule staminali pluripotenti indotte da cellule fetali della sindrome di Turner (45XO) per la modellazione a valle dei deficit neurologici associati alla sindrome
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Veerasubramanian, N., Karthikeyan, V., Hegde, S., Dhanushkodi, A., Parveen, S. Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Turner Syndrome (45XO) Fetal Cells for Downstream Modelling of Neurological Deficits Associated with the Syndrome. J. Vis. Exp. (178), e62240, doi:10.3791/62240 (2021).

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