Summary
טכניקת החרקים הסטריליים (SIT) משמשת להדברת אוכלוסיות יתושים ספציפיות וחשובות מבחינה רפואית שעשויות להיות עמידות בפני הדברות כימיות. כאן אנו מתארים שיטה לגידול המוני והכנה של יתושים זכרים סטריליים לשחרור בתוכנית SIT מבצעית המכוונת ליתוש Aedes aegypti .
Abstract
השליטה במחלות אנושיות כמו דנגי, זיקה וצ'יקונגוניה מסתמכת על השליטה של הווקטור שלהם, יתוש Aedes aegypti , מכיוון שאין מניעה. הדברת וקטורים של יתושים יכולה להסתמך על כימיקלים המופעלים על שלבים לא בוגרים ובוגרים, מה שיכול לתרום לתמותה של אנשים שאינם מטרות וחשוב מכך, להוביל לעמידות לקוטלי חרקים בווקטור. טכניקת החרקים הסטריליים (SIT) היא שיטה להדברת אוכלוסיות של מזיקים באמצעות שחרור זכרים בוגרים מעוקרים המזדווגים עם נקבות בר כדי לייצר צאצאים שאינם בני קיימא. מאמר זה מתאר את התהליך של ייצור זכרים סטריליים לשימוש בתוכנית SIT מבצעית להדברת יתושי Aedes aegypti . להלן השלבים המשמשים בתוכנית, כולל גידול ותחזוקה של מושבה, הפרדת גלמים זכרים ונקבות, הקרנה וסימון של זכרים בוגרים ושליחת זכרים Aedes aegypti לאתר השחרור. כמו כן נדונו אזהרות פרוצדורליות, מגבלות תוכנית ויעדים עתידיים.
Introduction
העברת פתוגנים המועברים על ידי יתושים לבני אדם גורמת למיליוני מקרים של מחלות ומקרי מוות מדי שנה ברחבי העולם. בהיעדר חיסונים יעילים ומאושרים למחלות המועברות על ידי יתושים, כגון זיקה או קדחת דנגי, אחת הדרכים היעילות ביותר להפחית את ההדבקה היא להפחית את אוכלוסיות היתושים הווקטוריים למחלות. באופן מוזר, מספר גדל והולך של מיני יתושים, שבאופן מסורתי ממוקדים על ידי חומרי הדברה, מפגינים רמות הולכות וגדלות של עמידות לחומרי הדברה1. במקביל, סוכנויות ממשלתיות ביטלו באגרסיביות או אסרו על שימוש בחומרי הדברה שאושרו בעבר, ומעט אמצעי הדברה כימיים חדשים ויעילים מפותחים 2,3. קבוצת כוכבים זו של מכשולים להדברת יתושים הניעה את החיפוש אחר טכניקות חלופיות לא כימיות להפחתת אוכלוסיות היתושים.
מיני יתושים מסוימים מציבים אתגרים לשליטה בבעיות של עמידות ורישום חומרי הדברה. Aedes aegypti (L.) הוא יתוש בולט-וקטור מחלה שקשה מאוד לשלוט בו באמצעות ניהול וקטורים משולב מסורתי בשל בית הגידול הפרה-ביתי הקריפטי המנוצל על ידי מין זה להתפתחות לא בשלה ומנוחה בוגרת 4,5. אתגרים הקשורים לניצול בית הגידול הסמוי סביב בתי מגורים כוללים את הקושי להגיע למקומות אלה באמצעות טכניקות ריסוס חומרי הדברה, כמו גם את חוסר הקבלה הפוטנציאלי של הציבור לגישה חוזרת ונשנית לרכוש פרטי עבור סוכנויות בקרת וקטורים לבריאות הציבור כדי לנהל את פעילויות המעקב והבקרה האינטנסיביות החיוניות לניהול וקטורים משולב יעיל (IVM) עבור מין זה.
למרבה המזל, SIT, גישה שהוכחה כמוצלחת להדברה מתמשכת של מיני חרקיםמאתגרים אחרים 6, מיושמת על בעיית Aedes aegypti בסדרה פורצת דרך של ניסויים וניסויים מבצעיים המבוססים בסנט אוגוסטין, פלורידה (KJL, RLA, SCB נתונים שלא פורסמו). SIT יושם על מגוון מיני חרקים, כולל יתושים, ונבדק לעומק 7,8. SIT ממנף את השחרור ההמוני של זכרים שגודלו במושבה ומעוקרים, למשל, על ידי חשיפה לקרינה מייננת או לכימיקלים כדי להכריע את בחירת ההזדווגות של אוכלוסיות טבעיות של נקבות. זכרים מעוקרים המזדווגים עם נקבות בר הופכים את הביצים לעקרות עקב נזק שנגרם על ידי גמטות זכרים, ואם הן קיימות במספרים מספיקים, יכולות תיאורטית לרסק את אוכלוסיית Aedes aegypti הטבעית.
תוכנית SIT יזמה כדי לנסות לצמצם אוכלוסיות של Aedes aegypti באזור עירוני בחוף האטלנטי של פלורידה שבו מין זה התיישב מחדש לאחרונה והוא מתרחב ומהווה סיכון לבריאות הציבור להעברת וירוסים כמו זיקה, דנגי או צ'יקונגוניה. כדי למקסם את פוטנציאל ההתאמה עם נקבות הבר, הוקמה מושבה חדשה באמצעות Aedes aegypti שנלכדו בטבע מאוכלוסיית היעד כדי לייצר זכרים לתוכנית9. זה התבסס על ההשערה שזכרים מקומיים, שגודלו במושבה, יהיו בעלי סבירות גבוהה יותר להיות תחרותיים עם זכרי בר מקומיים להזדווגות עם נקבות בר מקומיות. כדי שה-SIT יהיה יעיל, לא רק שמספר עצום של זכרים סטריליים צריכים להיות נוכחים באזור היעד, אלא שהם גם צריכים להיות מסוגלים לחזר ולהזדווג ביעילות עם יתושי בר מקומיים.
סדרה של ניסויים נערכה כדי לקבוע את המספר האופטימלי של זכרים סטריליים לשחרור (KJL, RLA, SCB נתונים שלא פורסמו) כמו גם מינונים אופטימליים של קרינה שיהפכו את הזכרים לעקרים מבלי להפריע להישרדות, התנהגות או קבלה על ידי נקבות בר (KJL, RLA, SCB נתונים שלא פורסמו). נתונים אלה מופיעים בפרסומים של בעלות הברית מקבוצה זו, אך חלק מהממצאים הללו נלכדים גם בפרוטוקול זה ויכולים לשמש כנקודת מוצא לתוכניות בקרה חדשות של SIT Aedes aegypti במקומות אחרים. מין זה מרחיב ללא הרף את הטווח שלו, ותוכניות SIT מראות הבטחה גדולה להיות פתרונות חסכוניים וארוכי טווח לשליטה באוכלוסייה זו. מטרת פרוטוקול זה היא לייצר יתושי Aedes aegypti מעוקרים, זכריים, שגודלו במושבה, לשחרור שיטתי לאזורים חיצוניים כדי לשבש את מחזורי הרבייה הטבעיים של אוכלוסיות Aedes aegypti מקומיות בתוכנית בקרת וקטורים תפעולית לבריאות הציבור.
בעוד שפרוטוקולים וזרימות עבודה דומים פורסמו לייצור זכרי Aedes aegypti מהונדסים וזרימות עבודה של ייצור עבור Aedes SIT, או תוכניות אי-תאימות מבוססות וולבצ'יה פורסמו במקומות אחרים, פרוטוקול זה ממחיש כיצד הפרוטוקולים הקיימים הותאמו לייצור Aedes aegypti, הפרדה והקרנה של גלמים זכרים, סימון ואריזה של זכרים בוגרים, ומשלוח לאתר השחרור של תוכנית זו 9, 10,11,12,13,14,15,16,17,18. ייתכן שרכיב הסימון של פרוטוקול זה לא יידרש בתוכנית SIT תפעולית בוגרת; עם זאת, היא נכללה כאן מכיוון שהיא אחת הדרכים לפקח על היעילות ולשלוט באיכות התהליך כולו בשנים הראשונות של הקמת תוכנית SIT. תוכניות הדברת יתושים מנוהלות בדרך כלל על ידי הרשויות המקומיות, כך שהן יכולות להשתנות במידה רבה בהיבטים רבים של הארגון שלהן, החל מגודל ובסיס מימון ועד לכוונון טקטיקות הדברה כדי למקסם את ההצלחה המקומית. לפיכך, הפרוטוקול המתואר כאן צריך להיות מוערך עבור תאימות עם המשאבים הזמינים.
Protocol
הערה: פרוטוקול זה ספציפי לטיפול ב-Aedes aegypti, אך ניתן לשנותו כך שיהיה יעיל עבור מיני יתושים אחרים.
1. ייצור ותחזוקה של מושבת Aedes aegypti
- מגדלים Aedes aegypti בוגרים ומייצרים ביצים.
- הכינו מסגרת אלומיניום מתקפלת בגודל 0.6 מ' x 0.6 מ', כלוב גידול גדול עם רשת פיברגלס בגודל 20 x 20 x 20 ושרוול סטוקינט על קיר אנכי אחד.
- הניחו גיגית פלסטיק בנפח 1,900 מ"ל עם גלמים Aedes aegypti (יחס מין של 1:1) בכל כלוב גידול, קשרו את השרוול סגור והשאירו את הכוסות במקומן לצורך קליטה עד שלא ייצאו עוד בוגרים (כלומר, כ-4 ימים). בשלב זה, הסר את הכוסות, ושמור על כלובי הגידול למבוגרים ב 28-30 מעלות צלזיוס, >50% לחות יחסית (Rh), ומחזור 12:12 או 14:10 אור:כהה (L:D).
הערה: הייצור של גלמים Aedes aegypti מתואר בסעיף 1.2. צפיפות הגלמים באמבטיה של 1900 מ"ל צריכה להיות כזו שיש מספיק מקום לכל הגלמים לעלות לאוויר בו זמנית. - עשרים וארבע שעות לאחר הנחת הגלמים בכלובי הגידול, הניחו מיכל של תמיסת סוכרוז 10% עם פתיל ספוג, ותלו ספוג בגודל 10X2 ס"מ ספוג בדבש מתוך וו תיל בכל כלוב כדי לספק מקורות נפרדים של הידרציה ותזונה ליתושים בוגרים. עקבו אחר מיכל הספוגים והסוכרוז לאיתור יובש או צמיחת עובש, ומלאו או החליפו לפי הצורך.
הערה: השתמש בכוס פלסטיק בגודל 120 מ"ל עם פתיל ספוג בגודל 10 ס"מ על 2 ס"מ המותקן דרך חתך במכסה בכלובי גידול קטנים וכוס פלסטיק בגודל 460 מ"ל עם פתיל ספוג בגודל 12 ס"מ על 8 ס"מ בכלובים גדולים. - ספק ארוחת דם לכל כלוב גידול 48-72 שעות לאחר שרוב הבוגרים הגיחו וכל 2-3 ימים לאחר מכן כדי לשמור על מספר גבוה של נקבות שניזונו מדם כדי למקסם את תפוקת הביצים. מלאו קונדום מעור כבש ב-50-100 מ"ל של דם בקר מתפרק, וחממו לכ-37 מעלות צלזיוס באמבט מים חמים. לאחר מכן, השתמשו במטלית או במגבת נייר כדי לטפוח ולייבש חלקית את הקונדום לפני שתניחו אותו על צלחת פטרי מרופדת נייר בתוך הכלוב למשך 30-60 דקות.
הערה: לפני השימוש, יש לשטוף את החלק הפנימי והחיצוני של כל קונדום במים פי 2-3 כדי להסיר חומרי סיכה או מצעים אחרים, ולבדוק אם יש חורים. ניתן לעשות שימוש חוזר בקונדומים במשך 3-5 האכלות על ידי שטיפת הדם ואחסונם בכוס מים קרים. מכיוון שמושבות מסוימות עלולות לחוות התפשטות נמלים, ייתכן שיהיה צורך להשעות קונדומים כדי להגביל את הגישה. - יש להמתין 48-72 שעות לאחר כל האכלת דם, ולאחר מכן להכניס אובפוזיציה לכל כלוב גידול בוגרים. הכינו את כוסות ההטלה על ידי הוספת 200 מ"ל של מי פופל מסוננים (כלומר, זחלי המים והגלמים גודלו פנימה) לכוס פלסטיק בגודל 460 מ"ל עם יריעה בגובה 8-10 ס"מ וברוחב 30 ס"מ של נייר נביטת זרעים (נייר oviposition) המותאם להדחה לאורך ההיקף הפנימי של הכוס. בדוק את ניירות ה- oviposition מדי יום, החלף אותם כל 2-4 ימים, ואחסן בזהירות את ניירות ה- oviposition עמוסי הביצים על ידי השארתם לייבוש במשך 24-48 שעות במחיר של >50% Rh19.
הערה: השאירו את כוסות ההטלה בכלובי הגידול למשך לא יותר מ-72 שעות כדי למנוע מהביצים לבקוע. - תחזקו את כלובי הגידול למבוגרים עד 3-4 שבועות לפני פירוקם והקמת כלובי גידול מבוגרים חדשים.
- כדי לשבור כלוב גידול, הסר ונקה את ההצבעה, אחסן את נייר ההדחה עמוס הביצים, הסר ונקה את מיכל תמיסת הסוכרוז ואת ספוג הדבש, והקפיא את הכלוב כדי להרוג את כל היתושים.
- הסר את כל גופי היתושים, ונקה ביסודיות את החלק הפנימי והחיצוני של כל כלוב עם מים וסבון מדולל באמצעות מגבות נייר וכריות סריקה עם ספוגים. אפשרו לכלוב הנקי להתייבש למשך 24 שעות לפחות לפני שתשתמשו בו במחזור הגידול הבא.
הערה: השתמש בציוד ואקום המצויד בסינון ביעילות גבוהה כדי להסיר חלקיקים שעלולים להוביל לאלרגיות. מיכלי תמיסת סוכרוז ניתנים לניקוי ולשימוש חוזר 3-5x.
- גידול זחלי Aedes aegypti מביצים
- הכינו ציר של זחלים תזונתיים על ידי ערבוב 80 גרם של יחס של 3:2 של אבקת כבד בקר:שמרי בירה במי ברז של 2200 מ"ל. הכינו מזון דגים מפולפל. יוצקים פתיתי דגים למטחנת תבלינים וטוחנים עד לקבלת אבקה דקה.
הערה: תפרחת זו מוגדרת כחומה במעבדה זו. - באמצעות נייר oviposition עמוס ביצים (5,000-10,000 ביצים) משלב 1.1.5, חותכים חלק של 3-7 ס"מ מנייר הביצים בניצב לקו הביצים, ומניחים אותו במיכל של 460 מ"ל מלא למחצה במי ברז יחד עם קמצוץ של פתיתי מזון דגים. מכסים ומתסיסים במרץ למשך דקה לפחות.
הערה: יש לאחסן נייר ביציות למשך 7 ימים לפחות (אך לא יותר מ-90 יום, מה שיכול להפחית את הבקיעה) לאחר הבקיעה לפני תחילת תהליך הבקיעה כדי לאפשר את ההבראה. חיידקים ואצות הנמצאים במזון הדגים מפרקים במהירות את המים, מה שגורם להתפתחות הזחל. - יוצקים את כל תכולת המיכל משלב 1.2.2 לתוך מחבת גידול זחלים מוכנה עם 3 ליטר מי ברז ו 50 מ"ל של slurry חום . סמנו את המחבת עם תאריך התחלה, מידע על הזן, לוח הזמנים של ההזנה לפי טבלה 1, ואחסנו בטמפרטורה של 28-30 מעלות צלזיוס, >50% לחות יחסית, ו-L:D של 12:12 או 14:10 מחזור.
הערה: היחס של 3 ליטר מים עד 50 מ"ל חום מבוסס על עומק המים במחבתות הזחלים המסוימות המוזכרות בטבלת החומרים. מחבתות בגדלים שונים יתמכו בצפיפויות גורים שונות ולכן ידרשו כמויות שונות של מים ותבשילים חומים . שיעורי האכלת הזחלים בטבלה 1 ניתנים כטווח; בחירת הכמות שבה נעשה שימוש מבוססת על ניסיון וקביעת הבריאות הכללית של הזחלים המתפתחים באמצעות משתנים כגון עכירות המים, צבע וריח; נוכחות של סרט חיידקי על המים; מספר או יחס של זחלים חיים ומתים; ותנועתיות הזחלים. בימים 3 עד 6, האכילו יתושים לא בשלים את מזון הדגים לפי טבלה 1. הוספת מים, הפחתת מזון והקמת 2-3 מחבתות נוספות ממה שהפרויקט דורש הן דרכים לניהול מחבתות זחלים לא בריאות.
- הכינו ציר של זחלים תזונתיים על ידי ערבוב 80 גרם של יחס של 3:2 של אבקת כבד בקר:שמרי בירה במי ברז של 2200 מ"ל. הכינו מזון דגים מפולפל. יוצקים פתיתי דגים למטחנת תבלינים וטוחנים עד לקבלת אבקה דקה.
| יום | תוספת נפח תזונתי | נפח מים נוסף | פעולות |
| 1 | 50 מ"ל | 3000 מ"ל | |
| 2 | (ללא אוכל) | (ללא מים) | |
| 3 | 1/4 - 1/2 כפית (מזון דגים מפולפל) | 500-1000 מ"ל | |
| 4 | 1/2 - 3/4 כפית (מזון דגים מפולפל) | 500-1000 מ"ל | |
| 5 | 1/2 - 3/4 כפית (מזון דגים מפולפל) | 500-1000 מ"ל | |
| 6 | 1/4 - 1/2 כפית (מזון דגים מפולפל) | 500-1000 מ"ל | |
| 7 | (ללא אוכל) | (ללא מים) | זן גלמים וזחלים |
טבלה 1: לוח זמנים להאכלה לגידול המוני של זחלי Aedes aegypti.
2. הפרדה של גלמים זכרים Aedes aegypti
- רכז גלמים ממחבתות הזחלים. לאחר שמגיעים ליחס הסף המשוער של הגלמים, יוצקים את התוכן של כל מחבת דרך מסננת (גודל 20-40). השתמשו בבקבוק לחיץ של מי ברז כדי לשטוף את הגלמים והזחלים מהמסננת אל תוך פלסטיק מדורגת בגודל 3,000 מ"ל.
הערה: יש להעביר רק 2-3 מחבתות זחלים לכל של 3000 מ"ל כדי למנוע צפיפות יתר כך שהגלמים עשויים להגיע לפני השטח בנוחות. הגלמים צפויים להתפתח בין 130-140 שעות לאחר בקיעת הביצה בתנאי הטמפרטורה והאור המוזכרים בשלב 1.2.3. צפו לבקיעת ביצים בולטת באותו יום שבו מוקמות הביצים. בהתאם לתנאי הסביבה, כ-20-70% מהזחלים יגדלו ויהיו מוכנים לניפוי תוך 6 ימים. חלוקת הגלמים על פני מספר כוסות של 3000 מ"ל מבטיחה נפחים הניתנים לניהול לשפוך לתוך המפריד. - הפרד בין הגלמים הזכרים לבין הזחלים והגלמים הנקביים.
הערה: שלב זה יכול להתבצע על-ידי אופרטור אחד או שני אופרטורים.- עבור מפעיל יחיד המפריד בין גלמים זכרים:
- חלק את התכולה של כל של 3000 מ"ל שנוצרה בשלב 2.1 למכלי פלסטיק מרובים של 1900 מ"ל כדי להפחית את השפיכה והעומס על המפריד. הכינו את מפריד הלוחות על-ידי הצבת מיכל איסוף קשיח רדוד של 4,000 מ"ל מתחת למפריד שבבסיס המפריד (איור 1). מלאו שתי כוסות פלסטיק מדורגות של 3000 מ"ל בערך 3/4 מלאות במי ברז.
הערה: השתמש בצינור כיור כחלופה לכוסות הפלסטיות המדורגות בגודל 3,000 מ"ל. אחרת, יהיה צורך למלא את הכוסות באופן רציף לאורך כל תהליך ההפרדה. פרטים נוספים להפעלת מפריד הפופל ניתן למצוא בהפניות12,20. - מוזגים מים דרך החלל שבין לוחות הזכוכית ומכווננים את הידיות העליונות והתחתונות בכיוון השעון או נגד כיוון השעון כדי לאפשר למים לזרום באופן רציף ובמקביל לייצר מים עומדים לגובה של כ-1.25 ס"מ מבסיס הלוחות. סמן את מיקומי ההתחלה של הידיות התחתונות באמצעות סרט הדבקה. לאחר שהמים העומדים מופצים באופן שווה על פני בסיס לוחות הזכוכית עם גובה וקצב ניקוז שווים, מתחילים לשפוך את תכולת מיכלי הגלמים והזחלים דרך החלל שבין הצלחות.
הערה: צריכה להיות הפרדה ברורה בין גלמים קטנים (זכריים) וגדולים (נקבה); אחרת, שטפו אצווה זו והתאימו את הידיות העליונות כדי להקטין את הרווח בין הלוחות. - תוך כדי שפיכת מים באיטיות דרך המפריד, סובבו ברציפות את הידיות התחתונות כזוג נגד כיוון השעון ~ 1-2 ס"מ מעמדת ההתחלה המסומנת בסרט עד שרוב הזחלים או כולם שטפו והחליקו במורד המפריד לתוך מיכל האיסוף.
הערה: מכיוון שיד אחת משמשת לשפיכת מים, היד השנייה מסובבת את הידיות בזו אחר זו, אך באותה מידה ובמרווחים קטנים, כדי לפתוח לאט את הצלחות. רוב הזחלים נשטפים במהירות, אך יהיו כמה זחלים שייתפסו עם הגלמים הזכרים. זחלים אלה יוקרנו אך יפגרו בהתפתחותם ולא יתקרבו לבוגרים עם קבוצת המוקד של הגלמים. - השליכו או מחזרו את הזחלים בחזרה למושבה, אך בכל מקרה, הוציאו אותם ממיכל האיסוף לפני שהגלמים הזכרים יתחילו לשטוף דרך המפריד. השהה את התהליך על ידי הפסקת זרימת המים בזמן שמיכל האיסוף בבסיס הזחל מנוקה מהזחלים על ידי שפיכת מסננת #30, אשר נשטפת בחזרה למיכל נפרד.
הערה: הזחלים זורמים ראשונים, אחריהם גלמים זכרים, ולבסוף הנקבות (איור 1). - ממשיכים לשפוך מים ומסובבים את הידיות התחתונות עד שהזחלים הזכרים נשטפים ומופרדים לתוך מיכל האיסוף. השהו את התהליך כדי לבדוק ולהסיר זחלים ממיכל האיסוף לפני העברת הגלמים הזכרים בשלב הבא.
הערה: מספר השטיפות הדרושות להפרדת הזכרים תלוי בקצב של מזיגת המים ובמהירות שבה מסובבים את הידיות. בדרך כלל נדרשים 2000-2500 מ"ל מים כדי לשטוף את הזחלים החוצה, 1000-1500 מ"ל כדי לשטוף את הגלמים הזכרים, ו-200-400 מ"ל כדי לשטוף את הגלמים הנקביים. - יוצקים את הגלמים הזכרים ממיכל האיסוף דרך מסננת #20 מעל כיור. השתמש בבקבוק לחיץ של 1000 מ"ל של מי ברז כדי לשטוף בחזרה את הגלמים הזכרים מהמסננת תוך כדי מזיגה למיכל נפרד של 1900 מ"ל.
- לאחר שכל הגלמים הזכרים הופרדו, המשיכו לשפוך מים דרך המפריד, והתאימו את הידיות התחתונות לשטיפה דרך הגלמים הנקביים. העבירו את הנקבות באמצעות תהליך המסננת המתואר בשלב 2.2.1.6 למיכל נפרד עד שכל היתושים הלא בשלים נשטפים החוצה מהמפריד. השליכו את הגלמים הנקביים. לאחר עיבוד האצווה, החזירו את הידיות למיקומי ההתחלה המקוריים שלהן, וחזרו על התהליך עם האצווה הבאה. לאחר עיבוד כל הקבוצות, השאירו את הצלחות פתוחות כך שהמפריד יוכל להתייבש.
הערה: אין הפרדה מושלמת באמצעות מכשיר זה, מה שדורש סבלנות ותרגול. גלמים או זחלים עקשנים יכולים להיות מנותקים עם זרם כבד של מים, אך לא במידה שהיא דוחפת אותם לצדדים, מה שעלול לזהם הצפות עתידיות.
- חלק את התכולה של כל של 3000 מ"ל שנוצרה בשלב 2.1 למכלי פלסטיק מרובים של 1900 מ"ל כדי להפחית את השפיכה והעומס על המפריד. הכינו את מפריד הלוחות על-ידי הצבת מיכל איסוף קשיח רדוד של 4,000 מ"ל מתחת למפריד שבבסיס המפריד (איור 1). מלאו שתי כוסות פלסטיק מדורגות של 3000 מ"ל בערך 3/4 מלאות במי ברז.
- עבור שני אופרטורים המפרידים בין הגלמים הזכרים, שנה את סעיף 2.2.1 באופן הבא.
- מפעיל ראשון: שופכים מים דרך המפריד, ומסובבים את הידיות בהדרגה כדי להפריד בין זחלים, גלמים זכרים וגלמים נקביים.
- מפעיל שני: לאחר שכל שלב נאסף לתוך מיכל הסליחה, מסננים את תכולת מיכל הסלייס כדי לחלק את הזחלים, הגלמים הזכרים והגלמים הנקביים למכלי איסוף מרובים ונפרדים. השאירו את הכוסות הגדולות מלאות במים אם צינור כיור אינו זמין.
- עבור מפעיל יחיד המפריד בין גלמים זכרים:
איור 1: מפריד פופאל המכיל קבוצה של Aedes aegypti לא בוגרים. ההפרדה מתחילה בשפיכת מים דרך המפריד תוך סיבוב הידיות התחתונות 1-2 ס"מ נגד כיוון השעון עד שהסט הממוקד, כלומר זחלים, גלמים זכרים או גלמים נקביים, בודד ככל האפשר מהסטים שנותרו (תמונה שמאלית). תמונה ימנית מראה הפרדה בין זחלים (הלהקה הנמוכה ביותר), גלמים זכרים (רצועה אמצעית) וגלמים נקביים (פס עליון). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
3. הכנת גלמים זכרים Aedes aegypti להקרנה
- מחלקים את הגלמים הזכרים לצלחות פטרי 60 מ"מ מפלסטיק.
הערה: מספר מנות הפטרי הדרושות תלוי במספר הגלמים הזכרים הזמינים להקרנה: מחבת גידול זחלים אחת משלב 1.2 תמלא כ-1.5 צלחות פטרי. גיל הגלמים נע בין 1 ל 40 שעות. בפרוטוקול זה, הקוטר הקטן יותר של צלחת פטרי נקרא החלק התחתון, והחצי הרדוד בקוטר גדול יותר נקרא החלק העליון.- הכינו דיסקים חתוכים מראש של נייר סינון כך שיתאימו לקוטר הפנימי של תחתית צלחת פטרי. הניחו דיסק נייר סינון אחד לח במים בכל אחת מתחתית צלחות הפטרי כדי לשמור על הגלמים מיובשים לאורך כל ההובלה ותהליך ההקרנה.
- מעבירים את הגלמים לתוך צלחות פטרי. מסננים את הגלמים הזכרים שנאספו בשלב 2.2.1.6 עם מסננת ושוטפים את הגלמים לתוך מדורגת של 1000 מ"ל עם כמה שפחות מים. מזגו בזהירות את הגלמים לתוך צלחות פטרי עד שכל דיסק נייר סינון יכוסה באופן שווה בשכבה אחת של גלמים (איור 2A - C). סדרו את צלחות הפטרי בקצה השולחן בשורה כדי להקל על המזיגה.
הערה: חלופה למאמץ הגלמים היא לחתוך את קצה פיפטה פסטר מפלסטיק 3 מ"ל לקוטר גדול מספיק כדי להכיל את הגלמים. השתמשו בפיפטה כדי להעביר את הגלמים מהמכל המיוצר בשלב 2.2.1.6 ישירות אל דיסקי נייר הסינון, כך שתהיה שכבה אחת ארוזה היטב של גלמים בכל צלחת פטרי. זה מעשי רק עבור קבוצות קטנות. - השתמשו בפיפטה פסטר 3 מ"ל ללא שינוי כדי להסיר מים עומדים מתחתית צלחת פטרי כדי למנוע תזוזה של פופל במהלך שלב המין (3.2) והובלה.
איור 2: העברת גלמים לתבשילי פטרי לצורך הקרנה . (A) גלמים מצופים נמזגים ונשטפים לאחור לתוך פלסטיק בגודל 1000 מ"ל. (B) מים מינימליים נשמרים בכוס כדי להקל על המזיגה לתוך צלחות פטרי. (C) צלחות פטרי מסודרות בשורה לאורך קצה המשטח כדי להקל על מזיגה בשכבה אחת של גלמים. (D) צלחות פטרי עמוסות גלמים נערמות ומאובטחות למסירה למתקן ההקרנה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
- מין הגלמים כדי לבדוק אם יש זיהום עם נקבות. תחת טווח ניתוח, השתמשו בגששים כדי לסובב כל גולם כדי לבדוק את משטח הגחון עבור אונה גניטלית בגודל גדול (איור 3) המציין את מין הזכר. הסר והשלך את הגלמים עם אונות איברי מין מופחתות או קטנות המציינות נקבות והחלף במספר שווה של גלמים זכרים כדי לשמור על הספירה הנכונה.
הערה: בתוכנית אופרטיבית, שלב זה אינו מעשי בגלל מספר גדול של יתושים, והעובדה שההפרדה, ההעברה, ההקרנה והכנת הכלובים לאחר ההקרנה נעשים כולם ביום אחד עם זמן מוגבל. ניתן לבצע בדיקת איכות של דגימה ממנות פטרי נבחרות, במיוחד בשלבים המוקדמים של פיתוח תוכנית ה-SIT.
איור 3: סקסינג של גלמים באמצעות האונה של איברי המין . (A) מבטים גחוניים ו-(B) לרוחב של גלמים נקביים () וזכריים ♀ (♂) Aedes aegypti , עם אונות איברי המין המסומנות כדי להראות את הדימורפיזם המיני. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
- מכסים את התחתונים עם החלק העליון של צלחות פטרי, ולאבטח עם סרט מעבדה. צרפו את צלחות הפטרי המודבקות עם רצועות אלסטיות בערימות בגודל המתאים לתא ההקרנה, ואטמו בתוך שקית מסומנת בנפח 3.8 ליטר הניתנת לסגירה חוזרת (איור 2D). אין לאפשר לגלמים להישאר חשופים למשך >1 שעות.
4. הקרנה של גלמים זכרים Aedes aegypti
- הכינו סרט דוזימטריה מאותו לוט על ידי חיתוך 1 ס"מ2 ריבועי סרטים והנחת כל ריבוע במעטפת האישית שלו.
הערה: כל הסרטים המשמשים בכל יום נחתכים בו-זמנית. פעולה זו מפחיתה את הכמות הקטנה של השונות המושרה על-ידי אחסון. מספר הריבועים הדרושים לכל ערימה הוא 1 + (מספר צלחות פטרי). - הכינו ערכה שתיכנס למתקן ההקרנה, שאמורה לכלול טיימר מעבדה, סרט מעבדה, סמן קבוע, מעטפות מוכנות של סרט דוזימטריה, תג דוזימטריה וגיליון הערות מעבדה עם רשימות תיוג כדי לעקוב אחר מידע מרכזי (איור 4).
איור 4: גיליון מתאר של ספר מעבדה - IR הושלם עבור ערכת תגובה למינון. תיבות טקסט המסומנות בקו מיתאר אדום (מסומנות בחצים אדומים) מציינות הערות שימושיות במקטעים השונים וחוזרות על מידע מרכזי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
- מעבירים את הגלמים למתקן ההקרנה. הניחו את צלחות הפטרי של הגלמים הזכרים משלב 3.3 במיכלים מבודדים ואחסנו הרחק מאור שמש ישיר ועם מיזוג אוויר במהלך ההובלה.
- הכינו ערימות של צלחות פטרי להקרנה אצל המקרינה. ערמו את המספר המתאים של צלחות פטרי כדי להתאים לתא ההקרנה עם מעטפת סרט דוזימטריה שבמרכזה בין כל צלחת ובחלק העליון והתחתון של הערימה. אבטח את המעטפות ואת הערימה כולה באמצעות סרט מעבדה כדי למנוע שפיכה ולהקל על מיקום הערימה בתא.
- להקרין את צלחות הפטרי של גלמים זכרים. הנח את ערימת צלחות הפטרי על רשת המתכת הנוקשה בתא כדי למקם אותה בגובה הנכון לחרוט החשיפה האופטימלי בהתבסס על מיפוי מינון קודם של יחידת ההקרנההספציפית 21. הפעל את הפטיפון על ההקרנה והקרן, בו זמנית ייזום טיימר המעבדה. הקרן עבור המרווח המתאים כדי להשיג את המינון הרצוי (דוגמאות מוצגות בטבלה 2).
הערה: פרוטוקול זה מבוסס על מקרין צזיום-137 (ראה טבלת החומרים) ומנת יעד של 50 Gy. מכיוון ש-Cs-137 דועך עם הזמן, קצב המינון מותאם מדי שנה על ידי ביצוע סדרת מינון-תגובה באמצעות דוזימטרים של אלנין, בתוספת סרט רדיוכרומי לדוזומטריה שגרתית ואלנין בכ-10% מהדגימות המוקרנות. בהתחשב בקצב המינון הנוכחי של 8.8 Gy/min, השגת מינון היעד של 50 Gy דורשת חשיפה של 5 דקות, 41 שניות. דוזימטריה שגרתית של סרטים מתרחשת כמתואר בשלב 4.7. דוזימטריה של כדורי אלנין מבוצעת במרכז הלאומי לחקר קרן אלקטרונים באוניברסיטת טקסס A&M או במכון הלאומי לתקנים וטכנולוגיה בגייטרסבורג, מרילנד, ארה"ב.
| מינון (ג'י) | זמן (מבוסס על 8.8 Gy/min) |
| 0 | נה |
| 10 | 1 דקה 8 שניות |
| 30 | 3 דקות 24 שניות |
| 50 | 5 דקות 41 שניות |
| 65 | 7 דקות 23 שניות |
| 85 | 9 דקות 39 שניות |
| 100 | 11 דק' 22 שניות |
| 110 | 12 דקות 30 שניות |
טבלה 2: זמני מינון לדוגמה עבור מקרין צזיום-137.
- לאחר הזמן שנקבע חלף, להסיר את צלחות פטרי מן המקרינה, בזהירות לפרק את הערימה. תייג את כל צלחות הפטרי ומעטפות הסרטים עם התאריך והמיקום בערימה. אטמו את המעטפות ואחסנו דוזימטריה. ארזו מחדש את צלחות הפטרי לתוך המיכל המבודד להובלה חזרה למעבדה הראשית.
הערה: רשום אם הבוגרים הגיחו במהלך ההקרנה וסמן את צלחת הפטרי הפגועה כך שהבוגרים לא יברחו כאשר הגלמים מוכנסים לכלובים המגדלים (שלב 5.2). - אשר את מינון ההקרנה עם סרט דוזימטריה על ידי מדידת הסרט כ 24 שעות לאחר החשיפה. הפעילו את קורא הדוזימטריה ואפשרו לו להתאזן לטמפרטורת החדר. טען את הסרט באמצעות מלקחיים שסופקו עם הקורא ופעל לפי הוראות היצרן לקריאת הסרט המוקרן, כמו גם הסרט הריק הלא מוקרן מאותה אצווה. אפס את הקורא ללא סרט בין הקריאות, ורשום נתונים כמו בגיליון הנתונים לדוגמה המוצג באיור 5.
הערה: פרוטוקול זה מבוסס על תקני ערכת מסנני QA ND0.5 ו- ND1.0. חשוב למדוד את הסרט כאשר הצד המט פונה למפעיל.
איור 5: גיליון נתוני דוזימטריה המאוכלס בנתונים לדוגמה. כותרות העמודות מבקשות מהמפעיל ללכוד נתוני מפתח לצורך ניתוח מאוחר יותר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
5. גידול של גלמים זכרים מוקרנים Aedes aegypti לבוגרים
- נקו והכינו כלובי גידול קטנים מפלסטיק בגודל 30X30X30 ס"מ, כך שיהיו מוכנים לגלמים מוקרנים עם חזרתם למעבדה הראשית. עבור כל 2 צלחות פטרי של גלמים זכרים מוקרנים, הכינו כלוב גידול אחד. מלאי כל כלוב גידול בכוס פלסטיק מלאה למחצה המכילה 460 מ"ל מי ברז ומיכל תמיסת סוכרוז אחד של 10%, כמתואר בשלב 1.1.3.
- העבירו מיד את הגלמים המוקרנים לכלובי הגידול המוכנים לאחר החזרה ממתקן ההקרנה. השתמשו בבקבוק מים לחיץ כדי לשטוף בזהירות את הגלמים מכל צלחת פטרי לתוך 460 מ"ל המים בכוס הפלסטיק בכל כלוב גידול. לאחר 24 שעות, העבירו את הכוסות לכלובים חדשים ונקיים המכילים את מקור התזונה, והמתינו לשאריות של Aedes aegypti בוגרים, זכרים מוקרנים.
הערה: אם הופיעו גלמים במהלך תהליך ההקרנה, פתח את צלחות הפטרי עם הזבובים לכלוב ריק, ולאחר מכן המשך בשלב 5.2. השליכו את הזכרים שנאספו בכלוב זה. הגלמים מועברים לכלובים חדשים לאחר 24 שעות מכיוון שהזכרים מגיחים לפני נקבות מאותה קבוצה ובידוד ימי הופעתם יכול להפחית את שכיחות הזיהום הנשי ולהבטיח הזדקנות מדויקת של הזכרים.
6. סימון ושקילה של זכרי Aedes aegypti בוגרים מוקרנים
הערה: סעיף זה של הפרוטוקול מניח ששני אנשים מבצעים את המשימות; עבור אדם אחד, ראה 6.4.
איור 6: אריזת Aedes aegypti זכרי מסומן, מוקרן, לתוך מיכלי שחרור. (A) מיכל שחרור המציג סטוקינט מהודק לחור שנחתך בצד גליל הקרטון עם סרט מיסוך, סיכות ודבק חם. המסגרת נמצאת במקומה עם גב של סרט מיסוך המודבק בצד. המסגרת שומרת על כיסוי רשת הטול המשוך בחוזקה; רצועה אלסטית (שאינה נראית לעין) מחזיקה גם את הטול במקומו מתחת למסגרת. (B) קבוצה של זכרים מורדים בתהליך של טבילה בצבע ורוד בכוס קרטון קטנה. (ג) ארבע מכולות שחרור בתוך מכולה מבודדת. שימו לב ששרוולי הסטוקינט מכוונים לאמצע מיכל השילוח, חומרי האריזה תחובים סביב מיכלי השחרור, ומקורות תזונה והידרציה נמצאים במקומם על גבי כל מיכל שחרור המכוסה על ידי תחתית צלחת פטרי הפוכה המוחזקת במהירות על ידי רצועות אלסטיות מוצלבות ופיסות סרט. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
- הכינו מיכלי שחרור קרטון.
- חתכו חור בקוטר 11.5 ס"מ בצדו של מיכל קרטון גלילי בקוטר 3.9 ליטר בנפח 1.5-3.0 ס"מ מלמטה, כך שהחור לא יכוסה על ידי המכסה (איור 6A).
- חותכים סטוקינט באורך 40-50 ס"מ, ומהדקים קצה אחד שלו סביב החלק הפנימי של החור בקוטר 11.5 ס"מ שנחתך ב-6.1.1. השתמשו במהדק משרדי סטנדרטי שנפתח כך שניתן יהיה לכפות סיכות דרך הסטוקינט והקרטון מתוך המיכל ולתוך משטח עבודה מתאים כמו גוש של קצף פוליסטירן קשה. לחצו על הסיכות באמצעות מברג בעל ראש שטוח כדי להצמיד בחוזקה את הסטוקינט להיקף החור ולהדק את סרט המיסוך על הצד המכווץ כדי למנוע תקלות. אטמו את קצה הסטוקינט בחלק הפנימי של הצילינדר אל הקרטון עם דבק חם והצליבו את כל המכלול לאיתור חורי מילוט.
- צרו מסגרת תומכת על ידי הסרת הדיסק הפנימי מהמכסה וחתכו רשת טול ניילון בגודל 33 ס"מ על 33 ס"מ כדי לשמור על יתושי Aedes aegypti זכרים בוגרים. הנח את הרשת בקצה הפתוח של הצילינדר והתאם את המסגרת מעל הרשת כדי להחזיק אותה במקומה ללא רווחים. משכו את הרשת כלפי מטה כך שהיא תבלוט מתחת למסגרת כדי לגרום לרשת הנלמדת לרוחב הקצה הפתוח ולאטום את הרשת הבולטת היטב כנגד הצילינדר באמצעות גומייה.
- הניחו פיסת סרט מיסוך באורך 10 ס"מ בצד המסגרת המכוסה בפיסת סרט הדבקה באורך 8 ס"מ, כך שניתן יהיה להחליף את סרט התיוג בקלות מבלי לקרוע את המסגרת.
הערה: מיכלי שחרור הם עמידים וניתן לעשות בהם שימוש חוזר >10x עם טיפול מתאים. לפני הצגת כל אצווה חדשה של יתושים מסומנים, מוקרנים, בוגרים, זכרים, בדקו שהסטוקינט מחובר היטב למיכל, ובצעו מיד תיקונים במידת הצורך.
- הכינו את עמדת השקילה והסימון.
- יוצקים כ-50 מ"ג של צבע סימון לתוך מיכל קרטון של 240 מ"ל, ומפזרים את הצבע כציפוי אבקה באופן שווה סביב המשטחים הפנימיים של המיכל. הקישו בעדינות כדי להיפטר מעודפי צבע. השתמשו בכוסות עם תוויות ברורות לצבעים מרובים כדי לשמור על הפרדה בין הצבעים.
- Tare סירה במשקל 100-500 גרם על איזון אלקטרוני של 0.0001 גרם; יצירת טופס נתונים (טבלה 3); והדבק יחד ארבעה גיליונות של נייר העתקה בגודל 215.9 מ"מ x 355.6 מ"מ כדי ליצור משטח עבודה בגודל 431.8 מ"מ x 711.2 מ"מ.
| מיכל שחרור | משקל היתושים | מספר כלוב | נקבות באצווה | מספר זכרים | מיכל שחרור | מסה כוללת |
| ורוד א | 0.024 | D1 #1 | 25 | ורוד א | 2.03 | |
| ורוד א | 2.007 | D1 #1 | 7 | ורוד ב' | 1.99 | |
| ורוד ב' | 1.990 | D1 #1 | ורוד 3 | 2.03 | ||
| ורוד 3 | 0.026 | D1 #3 | 25 | |||
| ורוד 3 | 2.000 | D1 #3 | 18 |
טבלה 3: טבלת נתוני תחנות שקילה.
- סמן קבוצות מכמתות של זכרים בוגרים מוקרנים עם פיגמנט פלואורסצנטי.
- העבירו יתושים בוגרים (בני 2.5-3.5 ימים) מכל כלוב גידול לבקבוקוני אספירטור. הסר מקורות תזונה מכלוב הגידול משלב 5.2 והכנס את הכלוב כולו לתא CO2 גדול למשך 5-7 דקות, תוך דפיקת דפנות המיכל כדי לעקור יתושים שעשויים להיאחז בכלוב הגידול. לאחר שחלף זמן החשיפה, הסירו את כלוב הגידול מהתא ושאפו את כל היתושים הבוגרים לסדרה של בקבוקוני שאיפת פלסטיק.
הערה: הניהול של 99.5-100% CO2 הוא ממיכל עם וסת, מוט פליז וצינורות סיליקון המתועלים לתוך התא בקצב זרימה של 6 ליטר לדקה. מספר הבקבוקונים הדרושים לפינוי כלוב הגידול תלוי במספר היתושים בכלוב ובמיומנות המפעיל, אך בדרך כלל נדרשים 3-5 בקבוקונים לכל כלוב. בחר אספירטור שיש לו בקבוקונים קטנים לשינוי מהיר כדי להקל על ניהול יתושים בוגרים בקבוצות, למשל, אחד באמצעות בקבוקון איסוף פוליסטירן 60 מ"ל אטום עם מסך אלומיניום רשת 20 x 20 בצד אחד ושסתום דש אצטט שקוף בצד השני. הכלוב כולו מורדם לפני השאיפה לקצר את הזמן להעברת יתושים לבקבוקונים כדי להפחית את הלחץ על היתושים ולשמור על הפרוטוקול. - מיין את כל היתושים הבוגרים מכל כלוב גידול לפי מין.
- חשוף את הבקבוקון הראשון משלב 6.3.1 ל- CO 2 בתא קטן למשך 4 דקות, ולאחר מכן נער בעדינות את היתושים המרדים החוצה, ופזר אותם על פני משטח העבודה של הנייר הלבן שהוכן בשלב 6.2.2.
- העמיסו בקבוקון ריק חדש לתוך השואף, ושאפו בזהירות את כל הזכרים מפני העבודה, והעבירו את הבקבוקון לתחנת השקילה (שלב 6.3.3.). סמנו את כל הנקבות שנותרו מאחור, שאפו אותן לבקבוקון נפרד והשליכו אותן, יחד עם כל הזכרים המרוסקים.
- חזור על תהליך זה עם הבקבוקונים הנותרים מ 6.3.1, אבל בשלב מסוים בתהליך מיון המין, ליצור בקבוקון נפרד עם רק 25 זכרים כי הוא מועבר גם לתחנת השקילה. חזור על שלב 6.3.2. עבור כל כלוב גידול.
הערה: בעת עיבוד זכרים בוגרים מוקרנים לצורך סקס, שקילה וסימון, עקוב אחר מספר הנקבות בכל אצווה, שהם נתוני מפתח לפתרון בעיות והבטחת איכות של מיון מין פופאל והתהליך כולו. אם ספירת הנקבות גבוהה מהצפוי, אדם שני צריך לחלץ נקבות בעוד המפעיל הראשי שואף את הזכרים. חשוב לשקול דגימה של 25 זכרים מכל כלוב גידול כדי לחשב משקל ממוצע ליתוש, אשר ישמש להערכת מספר הזכרים המוקרנים המסומנים המשתחררים בסוף הפרוטוקול.
- שוקלים וצובעים קבוצות של יתושים זכרים בוגרים.
- בתחנת השקילה, מניחים את הבקבוקון הראשון של יתושים זכרים בוגרים מתחנת המין (סעיף 6.3.2) לתוך תא CO 2 קטן למשך 2 דקות, ומנערים בזהירות את היתושים לתוך סירת השקילה הזפת שהוכנה בשלב 6.2.2. רשמו את משקל היתושים ושפכו את היתושים לתוך הצבע שהוכנה ב-6.2.1.
- הטה וסובב באיטיות את הכוס בסיבוב מלא אחד בכיוון השעון ונגד כיוון השעון, כך שהיתושים ייגעו בציפוי האבקה שעל המשטחים הפנימיים של הכוס וכולם מאובקים קלות בצבע (איור 6B). יוצקים את היתושים המסומנים לסירת שקילה.
- המשך במהירות לשלב הבא כדי שהיתושים לא יתאוששו ויברחו. חזור על שלב זה עד שכל הבקבוקונים מסעיף 6.3.2 יעובדו.
הערה: משקל הזכרים מהבקבוקון הנפרד של 25 זכרים שנוצר עבור כל כלוב גידול בסעיף 6.3.2 נרשם ומשמש לחישוב המשקל הממוצע לזכר מאותו כלוב.
- טען את מיכלי השחרור עם זכרים בוגרים מוקרנים מסומנים. לקפל מעט את סירת השקילה המכילה יתושים זכרים מורמים, מסומנים, מוקרנים, מסוף סעיף 6.3.3. כדי ליצור ערוץ, ולאחר מכן לכוון ערוץ זה דרך שרוול stockinette כדי להעביר את הזכרים לתוך מיכל שחרור. ממשיכים להוסיף יתושים עד שכ-2.0 גרם או 1500-3000 יתושים זכרים נמצאים במיכל השחרור וקושרים את שרוול הסטוקינט סגור. סמן את סרט התיוג על המסגרת של מיכל השחרור בצבע צבע, מספר מיכל ומשקל כולל של יתושים, והעתק נתונים אלה לטופס משלב 6.2.2.
הערה: טיפול ביתושים בכל שלב בחיים גורם ללחץ ויכול להפחית את ההישרדות או המרץ. סדרת ההרדמה המתוארת בפרוטוקול זה עלולה להשפיע על היתושים; עם זאת, ניסיונות לרדוף ולשאוף יתושים שאינם מורדמים בכל שלב יגרמו ללחץ גדול יותר ולפרוטוקול שאינו בר קיימא. לחלק את המשקל הכולל של היתושים בכל מיכל שחרור במשקל הממוצע לכל יתוש זכר שנוצר בסעיף 6.3.3 כדי לגזור אומדן של מספר הזכרים באותו מיכל שחרור; כל מיכל שחרור צריך להיות לא יותר מ 2 גרם של זכרים, אשר שווה בערך 1 כלוב גידול גדול.
- העבירו יתושים בוגרים (בני 2.5-3.5 ימים) מכל כלוב גידול לבקבוקוני אספירטור. הסר מקורות תזונה מכלוב הגידול משלב 5.2 והכנס את הכלוב כולו לתא CO2 גדול למשך 5-7 דקות, תוך דפיקת דפנות המיכל כדי לעקור יתושים שעשויים להיאחז בכלוב הגידול. לאחר שחלף זמן החשיפה, הסירו את כלוב הגידול מהתא ושאפו את כל היתושים הבוגרים לסדרה של בקבוקוני שאיפת פלסטיק.
- שינויים בפרוטוקול הסימון עבור אופרטור יחיד
- ערכו תחילה מיון מין לכל הכלובים הגדולים. חשפו כל כלוב גדול ל-CO2 למשך 4-5 דקות ושאפו את כל היתושים ל-4-5 בקבוקונים. חושפים כל בקבוקון ל-CO 2 למשך2-3 דקות, מעלים את כל היתושים על משטח העבודה של הנייר הלבן, מסירים את הנקבות ומחזירים את הזכרים לכלוב האוכלוסייה הגדול שלהם.
- שקילה וסימון
- התחילו עם כלוב ההחזקה הגברי הראשון שיוצר בשלב 6.4.1: הסירו את מקור התזונה והרדימו את הזכרים בתא CO2 גדול למשך 5-7 דקות. שאפו את הזכרים המורדמים באופן שווה לבקבוקונים נפרדים. חזור על שלב זה עם כל כלוב מחזיק בסדר שבו הם יוצרו.
הערה: כ-2-3 בקבוקונים צפופים ייווצרו לכל כלוב החזקה. עיבוד כלובי ההחזקה של הזכרים לפי הסדר שבו הם הופקו ממקסם את זמן ההחלמה של כל כלוב של זכרים. - הרדימו את הבקבוקון הראשון שהופק בשלב 6.4.2.1. במשך 1 - 2 דקות בתא CO2 קטן. שפכו מספר קטן של יתושים על משטח העבודה של הנייר הלבן, שאפו 25 יתושים זכרים לבקבוקון חדש, ועבדו כמו ב-6.3.2 כדי לקבוע את המשקל הממוצע לזכר עבור אותו כלוב. להחזיר זכרים נוספים לבקבוקון המקור, או לשאוף לבקבוקון נפרד חדש שיעובד מאוחר יותר; המשך בשקילה, סימון והעברה למכלי השחרור עבור שאר הזכרים בבקבוקון הראשון כמתואר בהמשך שלב 6.3. חזור על שלב 6.4.2.2. (למעט בידוד 25 זכרים לבקבוקון נפרד) עבור שאר הבקבוקונים המיוצרים בשלב 6.4.2.1. לפי הסדר שבו הם יוצרו, ולאחר מכן עוברים לכלוב הגידול הבא הממוין במין המיוצר ב-6.4.1.
הערה: תהליכי עבודה עם אדם אחד הם איטיים יותר, ויהיה צורך להרדים יתושים זכרים מסוימים מספר פעמים. כל הזמן לחפש ולהסיר יתושים נקבה.
- התחילו עם כלוב ההחזקה הגברי הראשון שיוצר בשלב 6.4.1: הסירו את מקור התזונה והרדימו את הזכרים בתא CO2 גדול למשך 5-7 דקות. שאפו את הזכרים המורדמים באופן שווה לבקבוקונים נפרדים. חזור על שלב זה עם כל כלוב מחזיק בסדר שבו הם יוצרו.
7. מכולות אריזה ושחרור משלוח של זכר מסומן, מוקרן, בוגר Aedes aegypti
- הכן את מכולות השחרור למשלוח. לאחר מילוי מיכל שחרור בזכרים מסומנים, מניחים 4 כדורי צמר גפן רטובים בתמיסת סוכרוז 10% על מכסה הרשת ומכסים בתחתית הפוכה של צלחת פטרי המוחזקת במקומה על ידי שתי גומיות שנמתחו סביב המיכל כולו ומעל צלחת הפטרי ליצירת צלב. הניחו חתיכת סרט מיסוך על ה-X של שתי הגומיות כדי לשמור אותן במקומן על גבי צלחת הפטרי ההפוכה.
הערה: ודא שכדורי הצמר גפן עם תמיסת סוכרוז 10% אינם רוויים עד כדי טפטוף, מה שיפגע במיכל וילכד ויהרוג יתושים. - ארזו את מיכלי השחרור של קרטון לתוך מצנן שילוח של קצף פוליסטירן. נקבו 4 חורי אוורור דרך מכסה הקירור וסתמו עם כותנה כדי להרחיק נמלים ולהרחיק יתושים נמלטים. הניחו 4 מכולות שחרור זקופות לתוך מצנן השילוח כאשר המלאי של כל מכולה פונה למרכז (איור 6C). יש לתחוב את עטיפת הבועות בין כל מיכל ובמרכז כדי לייצב אותם. מלאו את שאר החלל במצנן השילוח בכריות אוויר או ערמו שכבה שנייה של 4 מיכלי שחרור ישירות על גבי השכבה הראשונה והתייצבו באופן דומה עם כריות אוויר.
הערה: מיכלי השחרור צריכים להיות מיוצבים מספיק כדי לא לזוז כאשר הם מזועזעים. הטמפרטורה בתוך החבילה היא הסביבה. - הכינו את מצנן המשלוח למשלוח. אטמו את מצנן השילוח עם המכסה המאוורר, והכניסו לתוך אריזת הקרטון, הקלטת סגורה ושלחו באמצעות Night Express למיקום השחרור.
Representative Results
גידול יתושים ערני והולם כולל זמינות מאוזנת היטב של זכרים ונקבות בכלובי מושבה, תחזוקה של תמיסת סוכרוז טרייה ודבש, והאכלת דם עקבית באיכות גבוהה. תנאים אלה יספקו יריעות ביצים צפופות ואופטימליות לשימוש במחבתות גידול זחלי SIT. אחסון ושימוש נכון ביריעות ביצים מיובשות, כגון תיוג שיטתי כדי להקל על השימוש מהישן ביותר לחדש ביותר, יתמכו בבקיעה אחידה בכל המחבתות. מילוי כל מחבתות גידול הזחלים במים לפני הבקיעה עלול לקצר את משך הזמן שבו יריעות הביצים נמצאות במיכלי הבקיעה ולקדם התפתחות בריאה. תחזוקה של מחבתות הזחלים מהבקיעה ועד הגור דורשת מעורבות זהירה של אנשי המושבה, שכן חלק מהמחבתות עשויות להזדקק ליותר או פחות מזון או מים נוספים, בהתאם לשלבי ההתפתחות ולמשתנים הסביבתיים. אם יש בעיות עם שלב ההתפתחות עד היום המתוכנן של הפרדת מין הגור, יש לבצע התאמות מוקדם יותר בתהליך כגון בקיעה מוקדם יותר או מאוחר יותר, התאמת מזון או שינוי טמפרטורת האינקובטור.
תהליך הגידול בפרוטוקול זה אינו גורם לכל הביצים שבקעו בזמן להתפתח לגלמים שניתן להקרין ולהשתמש בהם למטרות בקרה. בין 20% ל-50% מהיתושים שגודלו במושבה עדיין יהיו זחלים עד שיהיה צורך להפריד בין הגלמים. עם זאת, זחלים אלה אינם מתבזבזים, אך מותר להם להבשיל במשך 24 שעות כדי לעבד גלמים נוספים שניתן לשלב עם גלמים נקבות מההפרדה של היום הקודם ולמחזר בחזרה לכלובים במושבה. בכלובי המושבה, הגלמים יורשו להבשיל לבוגרים, להזדווג, להאכיל בדם ולייצר ביצים המקיימות את פרויקט ה-SIT.
הפרדת הגלמים, מזיגת הגלמים לתוך צלחות פטרי, הקרנה והצבה בכלובי החזקה בוגרים לאחר הקרנה חייבים להתרחש ביום אחד; לפיכך, יש להקצות זמן מספיק כדי לעבד את כל השלבים בנוחות. הרכבה והכנה של מיכלי שחרור צריך להיעשות לפני תהליך הסימון. כאשר תיבות משלוח מוחזרות מאתר השחרור, יש לבדוק את מכולות השחרור ולהכין אותן לשימושן הבא. השלכת כדורי צמר גפן רטובים, אוורור מיכלי שחרור רטובים, ניקוי צלחות פטרי, החלפת רשת והסרת רצועות אלסטיות מהמיכל, אף שאינן בשימוש, יאריכו מאוד את חיי מיכלי השחרור.
בהתחשב במציאות העולמית של מגפת COVID-19, פרוטוקול זה שהוא בדרך כלל פעולה מרובת אנשים שונה כך שיהיה ניתן למתיחה על ידי אדם אחד העובד לבדו במעבדה עבור כל שלב. השלבים בתהליך שמפריעים ביותר על ידי תרחיש של אדם אחד הם שלבי המין, הסימון, השקילה וגידול המושבה. הפרדת הגלמים לפי מין על ידי אדם אחד אמורה להספיק אם ישנם מספר מפרידים הפועלים בו זמנית בחדרים שונים. במצב מגיפה שבו ריחוק חברתי מתרחש במקום העבודה, נדרשת הצטיידות במספר תחנות כדי להשלים צעדים ממין ועד אריזה. בהתאם למהירות המפעיל, לוקח לאדם אחד ~ 4 שעות למין 15,000 יתושים ואז עוד 1-2 שעות כדי לסמן, לשקול ולארוז אותם. תרחיש של שני אנשים מקטין את הזמן שבו מרדיימים יתושים לצורך סימון ומקצר את זמן העבודה הכולל. עם זאת, אפילו בתרחיש של שני אנשים, הקצאת מלוא 2.0 גרם היתושים לכל כלוב שחרור יכולה להיות מאתגרת בשל זמן עבודה מוגבל בזמן שהיתושים מורדם. למרות שתהליך הניקוי וההכנה של חומרי גידול לזחלים ולבוגרים גוזל זמן רב ודורש עבודה רבה, ניתן לחלק אותו כך שמפעילים בודדים יוכלו לעבוד באופן עצמאי ובטוח במהלך מגיפה.
שחרור זכרי Aedes aegypti בוגרים, מסומנים ומוקרנים הוא מחוץ לתחום של פרוטוקול זה, אך הוא מוצג כאן בקצרה. תהליך שחרור היתושים הזכרים המסומנים, המוקרנים, מתחיל בקביעת התפלגות שחרור אחידה של מיכלי השחרור על בסיס משקלים (ולפיכך, מספרים מוסקים של זכרים סטריליים), כפי שדווח בטבלה 3. לאחר מסירת המשלוחים למחוז הבקרה הווקטורי, התיבות נפתחות, ומכולות השחרור מוערכות לכל בעיה עם תמותה או מצב של מכולות השחרור. יתושים במיכלי השחרור מורשים לאחר מכן להתאקלם לטמפרטורת הסביבה וללחות למשך 1-2 שעות לפני ההובלה לאזור הטיפול. אתרי שחרור באזור הטיפול מזוהים לאחר מעקב אינטנסיבי אחר נקודות חמות של אוכלוסיות בר של Aedes aegypti. התזמון, התדירות והצפיפות של השחרורים מאוזנים על ידי הביונומיקה של המין, כמו גם מטאורולוגיה, תמיכה ציבורית ויכולות גידול מעבדה.
מכיוון שמיכלי שחרור ספציפיים מותאמים לאתרי שחרור מסוימים, יש להצליב את התווית לפני פתיחת מיכל השחרור על ידי חיתוך הרשת בחלק העליון, מה שמאפשר למפעיל לעוות את הרשת כך שחלק מהזכרים יוכלו לברוח. שיטת שחרור חלקית זו חוזרת על עצמה בכל נקודת שחרור שהוקצתה למיכל עד לשחרור כל הזכרים המעופפים בחופשיות. לאחר מכן תהליך זה חוזר על עצמו עבור כל גורם מכיל של שחרור במיקום השחרור שהוקצה לו בהתאמה עד לעיבוד כל המכולות. לחלופין, לאחר שחרור היתושים, ניתן לאסוף יתושים מתים או נכים שלא עזבו בחופשיות לתוך צלחות פטרי ולתייג אותם ידנית או לשקול אותם כדי לתקן את המספר המשוער ששוחרר. מעקב מתמשך ונרחב אחר שלבים בוגרים, ביצים ושלבים לא בשלים של Aedes aegypti פראי באזור היעד, ואולי גם באתרי בקרה ללא התערבות, נערך כדי להעריך את היעילות של פעולת ה- SIT.
Discussion
ייזום תוכנית בקרה הכוללת SIT המשתמשת בקרינה דורש הקמת זן מקומי של Aedes aegypti. שלב זה הוא קריטי ויכול לאפשר ל-SIT לבדל את עצמה באמת מטכנולוגיות בקרה דומות. על ידי פיתוח הפרויקט מזן מקומי של יתושים, סביר להניח שלזכרים שנוצרו יהיו התנהגויות המאפשרות להם להסתגל לשינויים ולרמזים סביבתיים ולאתר ולהזדווג עם נקבות בר בסביבה. יתר על כן, שחרורם של זכרים מקומיים מוקרנים עשוי שלא לעורר דעת קהל שלילית בהשוואה, למשל, לשחרור זן לא מקומי של יתושים מהונדסים גנטית שעלול, למשל, להחדיר אללים חדשים לאוכלוסיית היתושים המקומית.
השקעת משאבים משמעותיים לגידול כמויות עצומות של יתושים רק כדי להיות מסוגלים להשתמש בכמחציתם למטרות הדברה היא מגבלה של תוכנית Aedes aegypti SIT. יש לבצע חידודים לפרוטוקול הגידול כדי לדחוס את הבשלת הזחלים לפרקי זמן מוגדרים יותר שבהם הגלמים יהיו מוכנים. זה יאפשר לאסוף יותר גלמים בזמן האופטימלי של ההפרדה. עם זאת, גלמים נוספים לעיבוד מגבירים את הסיכון של יותר נקבות לגור כאשר הגלמים נאספים ולכן מגדילים את הסבירות שהנקבות יגיעו לצלחות פטרי עם זכרים ואולי ישוחררו. אף על פי שתוחלת החיים, התנהגות ההזנה בדם והתנהגות ההנעה בנקבות המוקרנות Aedes aegypti pupae מופחתות בבוגרים, אין זו אסטרטגיה טובה לשחרר נקבות אגב לצד זכרים מוקרנים22. לכן, זה צריך להישאר בראש סדר העדיפויות כדי למזער את מספר הנקבות מופרדות בשוגג, מוקרנות, מסומנות ומשוחררות עם זכרים.
הצלחתה של תוכנית SIT מסתמכת בסופו של דבר על תחרות מוצלחת של בני זוג על ידי זכרים מקרינים שגודלו במושבה. שימור התחרותיות של הזכרים מסתמך על בחירה ממצה של המינון שמקורה בניסויים ומקסום היחס המשוער של זכרים סטריליים:פראיים באוכלוסייה. בחירת המינון נקבעת על ידי מספר גורמי מפתח הכוללים אריכות ימים, פוריות, נקבות ותמותת גורים. נצפה כי יתושים זכרים יפגינו עקומת פוריות אסימפטוטית המתקרבת לאפס ככל שהקרינה עולה (KJL, RLA, SCB נתונים שלא פורסמו). במקביל, תוחלת החיים והפעילות של יתושים זכרים פוחתת באופן אקספוננציאלי ככל שמינון הקרינה עולה (KJL, RLA, SCB נתונים שלא פורסמו). לכן, במקום לזהות מינון שמניב 99.9% סטריליות אצל גברים, עדיף להתמקד באחוז סטריליות נמוך יותר תוך תמיכה בניצולים. לאחר שזוהה טווח מינון שאינו מבדיל בין אריכות ימים או תמותת גורים של זכרים מוקרנים לזה של זכרים שאינם מוקרנים, יש לבצע הערכות נוספות על פוריות כדי לזהות מינון שהופך את הזכרים לסטריליים באופן גורף, אך תחרותיים.
במקביל, חשוב להשוות את מספר היתושים הזכרים באוכלוסייה לזה של הזכרים המוקרנים המשוחררים. ניתן להשיג זאת על ידי איסוף זכרים ממקומות שונים באזור שחרור היעד ובסביבתו שוב ושוב מאותו מיקום ולפני, במהלך ואחרי תחילת תוכנית ה-SIT. יש לערוך מחקר סימן, שחרור, לכידה מחדש כדי להעריך את היחס בין יתושים זכרים פראיים ליתושים ששוחררו. מחקר סימן, שחרור, לכידה מחדש מסתמך על שחרור מספר ידוע של יתושים מסומנים מנקודה מסוימת ועל לכידתם מחדש מאוחר יותר בנקודות בסמיכות סביב נקודת השחרור הראשונית. על ידי השוואת מספר הזכרים שנלכדו מחדש וזכרי הבר במרחקים מנקודת השחרור, ניתן להעריך את אוכלוסיית הבר הכללית של הזכרים באזור כך שניתן יהיה לשחרר יחסים תחרותיים של זכרים סטריליים23. מקסום היחס בין זכרי בר סטריליים יכול להיות מושג על ידי שחרור זכרים סטריליים יותר ו/או על ידי צמצום אוכלוסיית הבר באמצעי בקרה קלאסיים כגון הפחתת מקור, שליטה לא בוגרת או טיפולים ברצח מבוגרים.
כדי לאמוד את היעילות של שחרורים זכריים סטריליים, ניתן להשוות אוספים למבוגרים באופן כרונולוגי מול אזור ללא התערבות. כאשר זכרים סטריליים משתחררים ומספר הזכרים והנקבות שנאספו באזור מסוים פוחת ביחס לאזור דומה ללא התערבות, אז ניתן לשער שזה נובע מכך שהזכרים הסטריליים המשתחררים מצליחים לגבור על הזכרים הפוריים המקומיים. ניתן לראות השפעה זו גם בכוסות מלכודת oviposition הפרוסות הן באתרי ההתערבות והן באתרי אי-ההתערבות. ניתן עדיין לייצר ביצים באתר ההתערבות, אך אם פחות בוקעות מאלו מהאתר ללא התערבות, ניתן לשער שהן אינן מופרות בגלל נקבות המזדווגות עם זכרים סטריליים. יותר ויותר oviposition של ביציות לא מופרות יכול בסופו של דבר להוביל להפחתה oviposition עקב אי החלפה של נקבות באתר ההתערבות 8,24.
כיוונים עתידיים של טכנולוגיית SIT ותוכניות מתרחבים באופן טבעי למיני יתושים חשובים נוספים מבחינה רפואית. לדוגמה, טכנולוגיה זו עשויה להיות מותאמת בקלות כדי לשלוט Aedes albopictus, בהתחשב בביונומיקה דומה מאוד של Aedes aegypti ו Aedes albopictus. מינים אחרים של יתושי וקטור מחלה מעניינים כוללים את Culex quinquefasciatus, Culex tarsalis, ומיני אנופלס שונים. שיפור היעילות של טכנולוגיה זו תלוי בהגדלת היכולת של גלמים זכרים המיוצרים בזמן נתון, אשר ניתן להשיג באמצעות מניפולציה גנטית או ברירה מלאכותית, ושיפור התחרותיות הגברית, אשר ניתן להשיג על ידי הגדלת הגבריות, פוריות, או אריכות ימים.
בסופו של דבר, תוכניות SIT אינן כדור כסף להדברת יתושים. במקום זאת, הם כלי בחבילה של טכניקות בקרה אחרות, כגון תוכניות IVM, המפצות על חולשות בין טכניקות. לדוגמה, בעוד שהדברה כימית מציעה שליטה מהירה וזולה, היא גם מעודדת פיתוח עמידות ותמותה שאינה מטרה; ובעוד ש-SIT הוא ספציפי למינים ואינו צפוי ליצור עמידות, זכרי SIT חייבים להיות מיוצרים ומשוחררים לנצח כדי לשלוט באוכלוסיות המהגרות מחוץ למחוז הבקרה הווקטורי.
Disclosures
כל המחברים הצהירו על היעדר ניגוד עניינים.
Acknowledgments
אנו מודים לד"ר ר.-ד. Xue, C. Bibbs, W. Qualls, ו- V. Aryaprema ממחוז בקרת היתושים אנסטסיה, סנט אוגוסטין, פלורידה, לשותפות בפיתוח תוכנית SIT ותובנות מומחים על שחרור מבצעי יעיל של Aedes aegypti זכר סטרילי. מחקר זה נתמך על ידי USDA-ARS ומשרד החקלאות והשירותים לצרכן של פלורידה (FDACS). אזכור שמות מסחריים או מוצרים מסחריים בפרסום זה נועד אך ורק לצורך מתן מידע ספציפי ואינו מרמז על המלצה או אישור של USDA או FDACS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-1/8" wrench (1" (1 inch) = 2.54 cm) | Craftsman | CMMT44707 | |
| 1/2 pint cardstock cup (1/2 pint = 236.5 mL) | Science Supplies WLE corp | 1/2 pint | |
| 1/4" tubing - tygon | Hudson Extrusions | LLDPE1/8 X 1/4 BLK | to attach to CO2 gas regulator |
| 1/8" brass barb w/ MIP connection | B&K | BHB-85NLB | to attach to CO2 gas regulator |
| 1000 mL graduated plastic beakers with handle | Thermo Scientific | 1223-1000 | |
| 3000 mL graduated plastic beakers with handle | Thermo Scientific | 1223-3000 | |
| Adult large cage | Bioquip | 1450D | |
| Aspirator vials | Bioquip | 2809V | |
| Bovine liver powder | MP Biomedicals | 290039601 | |
| Brewers yeast | MP Biomericals | 02903312-CF | |
| CO2 regulator | Randor | 64003038 | |
| CO2 tank (20# canister) | Praxair | CDBEVCARB20 | |
| Collection basin | Treasure Gurus | KI-ENAMELBOWL | for separator |
| Cotton balls - large | Fisher Scientific | 22-456-883 | |
| Deli cups w/lids - 470 mL | Pactiv DELItainer | PCTYSD2516 | |
| Deli cups w/lids - 1900 mL | Berry Global | T60764 | |
| DoseReader 4 | ND0.5 and ND1.0 QA Filter Set standards | ||
| Dosimetry film | Far West Technology, Inc. | ||
| Filter paper | Millipore | AP10045S0 | |
| Flashlight aspirator | Bioquip | 2809D | |
| Forceps - fine featherweight | Bioquip | 4748 or 4750 | featherweight |
| GAFchromic | radiochromic film | ||
| Gammator M | Radiation Machinery Corporation, Parsippany, NJ | Cesium-137 irradiator | |
| Hand held mechanical aspirator | Clarke Mosquito | 13500 | |
| Lambskin condoms | Trojan | Naturalamb | |
| Large CO2 chamber | Sterilite | Walmart # 568789514 | |
| Larval rearing pans | Blue Ridge Thermoforming | 01-FG-400-3N-ABS | Dimensions: 22.375 x 17.5 x 3 (inches) |
| Magnets - 20# pull | Master magnetics | MHHH20BX | |
| Marking dye | Dayglo | ECO-11 | Aurora Pink |
| Marking dye | Dayglo | ECO-17 | Saturn Yellow |
| Mesh | Falk | T301 | |
| Pasture pipettes | Thermo Scientific | 02-708-006 | |
| Petri dishes - large | VWR International | 25384-090 CS | |
| Petri dishes - small (60 mm x 15 mm) | Fisher Brand | FB0875713A | |
| Pupa separator | J.W. Hock | 1512 | |
| Red rubber hose | Welch | 331040-5 | |
| Release containers | Science Supplies WLE corp | 1 gallon | |
| Rubber bands - cross #19 | Alliance | ALL37196 | |
| Rubber bands - latitude #64 | Skillcraft | NSN0589974 | |
| Scale | Ohaus | H-4737 | |
| Seed germination paper - Heavy stock 76# | Anchor Paper | #76 | |
| Shipping coolers- 16 x 13 x 12.5" | MrBoxonline.com | Husky Foam Cooler kit | |
| Sieve #20 | Advantech | 20BS8F | |
| Sieve #30 | Advantech | 30BS8F | |
| Small cage - Bug Dorm | MegaView | Bug Dorm-1 | |
| Small CO2 chamber | Mainstays | Walmart # 562922221 | |
| Souffle cup lid | SOLO | 41165277456 | |
| Souffle cups - 4 oz (1 oz = 29.6 mL) | SOLO | 41165024104 | |
| Sponge | ocelo | MMM7274FD | |
| Squeeze bottle | Dynalon | 3UUP6 | |
| Stereoscope | Meiji Techno | EMZ-5 | |
| Stockinette | BSN Medical | 30-1006 | |
| Styrofoam | extruded polystyrene foam | ||
| Tropical fish flake food | Tetra | 4.52 pound | |
| Vaccum chamber - desiccator | BelArt | T9FB892757 | |
| Weigh boats | Globe Scientific | 3621 |
References
- Moyes, C. L., et al. Contemporary status of insecticide resistance in the major Aedes vectors of arboviruses infecting humans. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (7), 0005625 (2017).
- Baldacchino, F., et al. Control methods against invasive Aedes mosquitoes in Europe: a review. Pest Management Science. 71 (11), 1471-1485 (2015).
- Burkett, D. A., Cope, S. E., Strickman, D. A., White, G. B. The Deployed Warfighter Protection (DWFP) Research Program: Developing new public health pesticides, application technologies, and repellent systems. Journal of Integrated Pest Management. 4 (2), 1-7 (2013).
- Harwood, J. F., et al. Controlling Aedes aegypti in cryptic environments with manually carried ultra-low volume and mist blower pesticide applications. Journal of the American Mosquito Control Association. 32 (3), 217-223 (2016).
- Morrison, A. C., Zielinski-Gutierrez, E., Scott, T. W., Rosenberg, R. Defining challenges and proposing solutions for control of the virus vector Aedes aegypti. PLoS Medicine. 5 (3), 68 (2008).
- Klassen, W., Curtis, C. F. History of the sterile insect technique. Sterile insect technique: principles and practice in area-wide integrated pest management. InDyck, V. A., Hendrichs, J., Robinson, A. S. , Springer. Netherlands, Dordrecht. 3-36 (2005).
- Alphey, L., et al. Sterile-insect methods for control of mosquito-borne diseases: an analysis. Vector Borne and Zoonotic Diseases. 10 (3), 295-311 (2010).
- Dame, D. A., Curtis, C. F., Benedict, M. Q., Robinson, A. S., Knols, B. G. Historical applications of induced sterilisation in field populations of mosquitoes. Malaria Journal. 8, Suppl 2 (2009).
- FAO IAEA. Guidelines for colonization of Aedes mosquito species. Version 1.0. Maiga, H., et al. , Vienna, Austria. Available from: http://www.naweb.iaea.org/nafa/ipc/public/Guidelines-for-colonisation-of-Aedes-mosquito-species-v1.0.final.pdf (2018).
- Bond, J. G., et al. Optimization of irradiation dose to Aedes aegypti and Ae. albopictus in a sterile insect technique program. PloS One. 14 (2), 0212520 (2019).
- Bourtzis, K., Lees, R. S., Hendrichs, J., Vreysen, M. J. B. More than one rabbit out of the hat: Radiation, transgenic and symbiont-based approaches for sustainable management of mosquito and tsetse fly populations. Acta Tropica. 157, 115-130 (2016).
- Carvalho, D. O., et al. Mass production of genetically modified Aedes aegypti for field releases in Brazil. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , e3579 (2014).
- Carvalho, D. O., et al. Aedes aegypti lines for combined sterile insect technique and incompatible insect technique applications: the importance of host genomic background. Entomologia experimentalis et applicata. 168 (6-7), 560-572 (2020).
- FAO/IAEA. Guidelines for mass-rearing of Aedes mosquito species. Version 1.0. Maiga, H., et al. , Vienna, Austria. Available from: http://www-naweb.iaea.org/nafa/ipc/public/Guidelines-for-mass-rearingofAedes-mosquitoes_v1.0.pdf (2020).
- FAO/IAEA. Guidelines for mark-release-recapture procedures of Aedes mosquitoes. Bouyer, J., et al. , Vienna, Austria. Available from: http://www-naweb.iaea.org/nafa/ipc/public/Guidelines-for-MRR-Aedes_v1.0.pdf (2020).
- FAO/IAEA. Guidelines for Routine Colony Maintenance of Aedes Mosquito Species, Version 1.0. Maiga, H., et al. , Vienna, Austria. Available from: http://www-naweb.iaea.org/nafa/ipc/public/guidelines-for-routine-colony-maintenance-of-Aedes-mosquito-species-v1.0.pdf (2017).
- Mamai, W., et al. Aedes aegypti larval development and pupal production in the FAO/IAEA mass-rearing rack and factors influencing sex sorting efficiency. Parasite. 27, 43 (2020).
- Zheng, X., et al. Incompatible and sterile insect techniques combined eliminate mosquitoes. Nature. 572 (7767), 56-61 (2019).
- BEI Resources. Methods in Aedes Research. , Available from: https://www.beiresources.org/Portals/2/VectorResources/Methods%20in%20Aedes%20Research%202016.pdf (2016).
- Focks, D. A. An improved separator for the developmental stages, sexes, and species of mosquitoes (Diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. 17 (6), 567-568 (1980).
- International Atomic Energy Agency. Manual of Dosimetry in Radiotherapy. Technical Reports Series No. 110. , Vienna. (1970).
- Aldridge, R. L., et al. Gamma-irradiation reduces survivorship, feeding behavior, and oviposition of female Aedes aegypti. Journal of the American Mosquito Control Association. 36 (3), 152-160 (2020).
- Cianci, D., et al. Estimating mosquito population size from mark-release-recapture data. Journal of Medical Entomology. 50 (3), 533-542 (2013).
- Knipling, E. F. The basic principles of insect population suppression and management. , United States Department of Agriculture. Washington, DC. (1979).
