Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Förbereda bestrålade och märkta manliga Aedes aegypti-myggor för frisättning i ett operativt sterilt insektsteknikprogram

Published: March 12, 2021 doi: 10.3791/62260
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 2, 2, 1
1US Department of Agriculture, Agricultural Research Service Center for Medical, Agricultural, & Veterinary Entomology, 2Department of Entomology and Nematology, University of Florida

Summary

Den sterila insektstekniken (SIT) används för att kontrollera specifika, medicinskt viktiga myggpopulationer som kan vara resistenta mot kemiska kontroller. Här beskriver vi en metod för massuppfödning och beredning av sterila hanmyggor för frisättning i ett operativt SIT-program riktat mot Aedes aegypti-myggan .

Abstract

Kontrollen av sådana mänskliga sjukdomar som dengue, Zika och chikungunya är beroende av kontrollen av deras vektor, Aedes aegypti-myggan , eftersom det inte finns något förebyggande. Kontroll av myggvektorer kan förlita sig på kemikalier som appliceras på de omogna och vuxna stadierna, vilket kan bidra till dödligheten hos icke-mål och ännu viktigare, leda till insekticidresistens i vektorn. Den sterila insektstekniken (SIT) är en metod för att kontrollera populationer av skadedjur genom frisättning av steriliserade vuxna män som parar sig med vilda honor för att producera icke-livskraftiga avkommor. Detta dokument beskriver processen att producera sterila män för användning i ett operativt SIT-program för kontroll av Aedes aegypti-myggor . Här beskrivs stegen som används i programmet, inklusive uppfödning och underhåll av en koloni, separera manliga och kvinnliga puppor, bestråla och markera vuxna män och skicka Aedes aegypti-män till utsättningsplatsen. Dessutom diskuteras procedurmässiga varningar, programbegränsningar och framtida mål.

Introduction

Överföring av myggburna patogener till människor orsakar miljontals fall av sjukdomar och dödsfall varje år över hela världen. I avsaknad av effektiva, godkända vacciner för myggburna sjukdomar, såsom zika eller denguefeber, är ett av de mest effektiva sätten att minska överföringen att minska sjukdomsvektormyggpopulationerna. Irriterande nog uppvisar ett ökande antal myggarter, som traditionellt är måltavlor för bekämpningsmedel, ökande nivåer av bekämpningsmedelsresistens1. Samtidigt har myndigheter aggressivt avregistrerat eller förbjudit tidigare godkända bekämpningsmedel, och få nya, effektiva kemiska kontrollåtgärder utvecklas 2,3. Denna konstellation av hinder för myggbekämpning har motiverat utforskningen av alternativa icke-kemiska tekniker för att minska myggpopulationerna.

Vissa myggarter innebär utmaningar när det gäller att kontrollera resistens och registrering av bekämpningsmedel. Aedes aegypti (L.) är en framträdande sjukdomsvektormygga som är extremt svår att kontrollera genom traditionell integrerad vektorhantering på grund av den kryptiska peridomestica livsmiljön som utnyttjas av denna art för omogen utveckling och vuxen vila 4,5. Utmaningar relaterade till utnyttjandet av den kryptiska livsmiljön runt bostäder inkluderar svårigheten att nå dessa platser med bekämpningsmedelsspraytekniker samt den potentiella bristen på acceptans från allmänheten för upprepad tillgång till privat egendom för folkhälsovektorkontrollbyråer för att genomföra de intensiva övervaknings- och kontrollaktiviteter som är avgörande för effektiv integrerad vektorhantering (IVM) för denna art.

Lyckligtvis tillämpas SIT, ett tillvägagångssätt som visat sig framgångsrikt för varaktig kontroll av andra mycket utmanande insektsarter6, på Aedes aegypti-problemet i en banbrytande serie experiment och operativa försök baserade i St. Augustine, Florida (KJL, RLA, SCB opublicerade data). SIT har applicerats på en rad insektsarter, inklusive myggor, och har granskats på djupet 7,8. SIT utnyttjar massfrisättningen av koloniuppfödda män som steriliseras, till exempel genom exponering för joniserande strålning eller kemikalier för att överväldiga kompisvalet av naturliga populationer av honor. Steriliserade hanar som parar sig med vilda honor gör äggen infertila på grund av skador som manliga könsceller lidit, och om de finns i tillräckligt antal kan de teoretiskt krascha den naturliga Aedes aegypti-populationen.

Ett SIT-program initierades för att försöka minska populationerna av Aedes aegypti i ett stadsområde i Atlantkusten Florida där denna art nyligen återkoloniserades och expanderar och utgör en folkhälsorisk för överföring av virus som Zika, dengue eller chikungunya. För att maximera potentialen för kompatibilitet med vilda honor etablerades en ny koloni med vildfångad Aedes aegypti från målpopulationen för att producera hanar för programmet9. Detta baserades på hypotesen att lokalt härledda, koloniuppfödda hanar skulle vara mer benägna att vara konkurrenskraftiga med lokala vilda hanar för parning med lokala vilda honor. För att SIT ska vara effektivt måste inte bara ett överväldigande antal sterila hanar vara närvarande i målområdet, utan de måste också kunna uppvakta och para sig effektivt med lokala vilda kvinnliga myggor.

En serie experiment genomfördes för att bestämma det optimala antalet sterila män att släppa (KJL, RLA, SCB opublicerade data) samt optimala doser av strålning som skulle göra hanarna infertila utan att störa överlevnad, beteende eller acceptans av vilda honor (KJL, RLA, SCB opublicerade data). Dessa data kommer i allierade publikationer från denna grupp, men några av dessa fynd fångas också i detta protokoll och kan användas som utgångspunkt för nya SIT Aedes aegypti-kontrollprogram någon annanstans. Denna art utökar ständigt sitt utbredningsområde, och SIT-program visar stort löfte om att vara kostnadseffektiva, långsiktiga lösningar för att kontrollera denna population. Målet med detta protokoll är att producera steriliserade, manliga, koloniuppfödda Aedes aegypti-myggor för systematisk utsättning i utomhusområden för att störa de naturliga reproduktionscyklerna hos lokala Aedes aegypti-populationer i ett operativt folkhälsovektorkontrollprogram.

Medan liknande protokoll och arbetsflöden har publicerats för produktion av transgena Aedes aegypti-män och produktionsarbetsflöden för Aedes SIT, eller Wolbachia-baserade inkompatibilitetsprogram har publicerats någon annanstans, illustrerar detta protokoll hur befintliga protokoll har anpassats för Aedes aegypti-produktion, separation och bestrålning av manliga puppor, märkning och förpackning av vuxna män och leverans till släppplatsen för detta program9, 10,11,12,13,14,15,16,17,18. Märkningskomponenten i detta protokoll kanske inte krävs i ett moget operativt SIT-program; Det har dock inkluderats här eftersom det är ett sätt att övervaka effektiviteten och kontrollera kvaliteten på hela processen under de första åren av upprättandet av SIT-programmet. Myggkontrollprogram drivs vanligtvis av lokala myndigheter, så de kan variera mycket i många aspekter av deras organisation från storlek och finansieringsbas till inställning av kontrolltaktik för att maximera lokal framgång. Således bör protokollet som beskrivs häri utvärderas för kompatibilitet med tillgängliga resurser.

Protocol

OBS: Detta protokoll är specifikt för hantering av Aedes aegypti men kan modifieras för att vara effektivt för andra myggarter.

1. Produktion och underhåll av en Aedes aegypti-koloni

  1. Bakre vuxna Aedes aegypti och producera ägg.
    1. Förbered en 0,6 m x 0,6 m x 0,6 m hopfällbar aluminiumram, stor uppfödningsbur med 20 x 20 glasfibernätskärm och en reach-in stockinettehylsa på en vertikal vägg.
    2. Placera ett 1900 ml plastkar med Aedes aegypti-puppor (1: 1 könsförhållande) i varje uppfödningsbur, knyt ärmen stängd och lämna koppar på plats för eclosion tills inga fler vuxna dyker upp (dvs. cirka 4 dagar). Ta nu bort kopparna och håll de vuxna uppfödningsburarna vid 28-30 ° C, >50% relativ luftfuktighet (Rh) och en 12:12 eller 14:10 ljus: mörk (L: D) cykel.
      OBS: Produktion av Aedes aegypti puppor beskrivs i avsnitt 1.2. Tätheten av puppor i 1900 ml badkaret bör vara sådan att det finns tillräckligt med utrymme för alla puppor att komma upp för luft samtidigt.
    3. Tjugofyra timmar efter att popparna har placerats i uppfödningsburarna, placera en behållare med 10% sackaroslösning med en svampveke och häng upp en 10 cm x 2 cm svamp som blötläggs i honung från en trådkrok i varje bur för att ge separata källor till hydrering och näring till vuxna myggor. Övervaka svamparna och sackarosbehållaren för torrhet eller mögeltillväxt och fyll på eller byt vid behov.
      OBS: Använd en 120 ml plastkopp med en 10 cm x 2 cm svampveke monterad genom en utskärning i locket i små uppfödningsburar och en 460 ml plastkopp med en 12 cm x 8 cm svampveke i stora burar.
    4. Ge en blodmjöl till varje uppfödningsbur 48-72 timmar efter att majoriteten av vuxna har dykt upp och var 2-3: e dag därefter för att upprätthålla ett stort antal blodmatade honor för att maximera äggutbytet. Fyll en lammskinnskondom med 50-100 ml defibrerat nötkreatursblod och värm till cirka 37 °C i ett varmt vattenbad. Använd sedan en trasa eller pappershandduk för att klappa ner och delvis torka kondomen innan du lägger den på en pappersfodrad petriskål inuti buren i 30-60 minuter.
      OBS: Skölj insidan och utsidan av varje kondom före användning med vatten 2-3x för att ta bort smörjmedel eller andra underlag och kontrollera om det finns hål. Kondomer kan återanvändas för 3-5 matningar genom att skölja ut blodet och förvara dem i en kopp kallt vatten. Eftersom vissa kolonier kan uppleva myrangrepp kan kondomer behöva avbrytas för att begränsa åtkomsten.
    5. Vänta 48-72 timmar efter varje blodmatning och introducera sedan en ovipositionskopp i varje vuxen uppfödningsbur. Förbered ovipositionskopparna genom att tillsätta 200 ml filtrerat valpvatten (dvs. vattenlarverna och pupporna föddes upp) i en plastkopp på 460 ml försedd med ett 8-10 cm högt x 30 cm brett ark frögroningspapper (ovipositionspapper) monterat jämnt längs koppens inre omkrets. Kontrollera ovipositionspapperna dagligen, byt ut dem var 2-4: e dag och förvara försiktigt de äggbelastade ovipositionspapperna genom att låta dem torka i 24-48 timmar vid >50% Rh19.
      OBS: Låt ovipositionskopparna stå i uppfödningsburarna i högst 72 timmar för att förhindra att äggen kläcks.
    6. Underhåll de vuxna uppfödningsburarna i upp till 3-4 veckor innan du bryter ner dem och sätter upp nya uppfödningsburar för vuxna.
      1. För att bryta ner en uppfödningsbur, ta bort och rengör ovipositionskoppen, förvara det äggbelastade ovipositionspapperet, ta bort och rengör sackaroslösningsbehållaren och honungssvampen och frys buret för att döda alla myggor.
      2. Ta bort alla myggkroppar och rengör noggrant insidan och utsidan av varje bur med utspädd tvål och vatten med pappershanddukar och skurkuddar med svampar. Låt den rena buren torka i minst 24 timmar innan du använder den i nästa uppfödningscykel.
        OBS: Använd vakuumutrustning utrustad med högeffektiv filtrering för att avlägsna partiklar som kan leda till allergier. Sackaroslösningsbehållare kan rengöras och återanvändas 3-5x.
  2. Uppfödning av Aedes aegypti larver från ägg
    1. Förbered ett lager av larvnäringsuppslamning genom att blanda 80 g av ett 3: 2-förhållande av bovint leverpulver: bryggerjäst i 2200 ml kranvatten. Förbered pulveriserad fiskmat. Häll fiskflingor i en kryddkvarn och slipa tills det är ett fint pulver.
      OBS: Denna uppslamning betecknas som brun i detta laboratorium.
    2. Använd äggbelastat (5 000-10 000 ägg) ovipositionspapper från steg 1.1.5, skär en 3-7 cm del av äggpapperet vinkelrätt mot ovipositionslinjen och placera den i en 460 ml behållare halvfylld med kranvatten tillsammans med en nypa pulveriserade fiskmatflingor. Täck och agitera kraftigt i minst 1 min.
      OBS: Äggpapper måste förvaras i minst 7 dagar (men högst 90 dagar, vilket kan minska kläckningen) efter ägglossning innan kläckningsprocessen påbörjas för att tillåta embryonation. Bakterier och alger som finns i fiskmaten deoxygenerar snabbt vattnet, vilket utlöser larvutveckling.
    3. Häll hela innehållet i behållaren från steg 1.2.2 i en larvuppfödningspanna beredd med 3 liter kranvatten och 50 ml brun uppslamning. Markera pannan med startdatum, staminformation, matningsschemat per tabell 1 och förvara vid 28-30 °C, >50% Rh och en 12:12 eller 14:10 L:D cykel.
      OBS: 3 L vatten till 50 ml brunt förhållande baseras på vattendjupet i de specifika larvpannorna som nämns i materialförteckningen. Kokkärl i olika storlekar stöder olika pupaldensiteter och kräver därför olika mängder vatten och brun uppslamning. Larvmatningshastigheter i tabell 1 anges som ett intervall; valet av den använda mängden baseras på erfarenhet och bestämning av den allmänna hälsan hos de utvecklande larverna med hjälp av variabler som vattengrumlighet, färg och lukt; närvaro av bakteriefilm på vattnet; antal eller förhållande mellan levande och döda larver; och larvernas rörlighet. På dagarna 3 till 6, mata omogna myggpulveriserad fiskmat enligt tabell 1. Att tillsätta vatten, minska maten och sätta upp 2-3 extra kokkärl än vad projektet kräver är sätt att hantera ohälsosamma larvpannor.
Dag Volym näringsuppslamning tillsatt Volym tillsatt vatten Åtgärder
1 50 ml (uppslamning) 3000 ml
2 (ingen mat) (inget vatten)
3 1/4 - 1/2 tsk (pulveriserad fiskmat) 500-1000 ml
4 1/2 - 3/4 tsk (pulveriserad fiskmat) 500-1000 ml
5 1/2 - 3/4 tsk (pulveriserad fiskmat) 500-1000 ml
6 1/4 - 1/2 tsk (pulveriserad fiskmat) 500-1000 ml
7 (ingen mat) (inget vatten) stampuppor och larver

Tabell 1: Utfodringsschema för massuppfödning av Aedes aegypti larver.

2. Separation av manliga Aedes aegypti puppor

  1. Koncentrera puppor från larvpannorna. När den ungefärliga tröskelandelen puppor har uppnåtts, häll innehållet i varje kastrull genom en sil (storlek 20-40). Använd en pressflaska kranvatten för att tvätta pupporna och larverna ur sikten till en 3000 ml graderad plastbägare.
    OBS: Endast 2-3 larvpannor bör överföras till varje 3000 ml bägare för att undvika överbeläggning så att puppor kan nå ytan bekvämt. Puppor förväntas utvecklas mellan 130-140 timmar efter äggkläckning under de temperatur- och ljusförhållanden som nämns i steg 1.2.3. Räkna med märkbar äggkläckning samma dag som äggen sätts upp. Beroende på miljöförhållandena kommer cirka 20-70% av larverna att ha poppat och vara redo att siktas inom 6 dagar. Genom att dela upp popparna över flera 3000 ml bägare säkerställer hanterbara volymer att hälla i separatorn.
  2. Separera manliga puppar från larverna och kvinnliga puppar.
    OBS: Detta steg kan utföras av en operatör eller två operatörer.
    1. För en enskild operator som separerar hanpuppor:
      1. Dela upp innehållet i varje 3000 ml bägare som genereras i steg 2.1 i flera 1900 ml plastbehållare för att minska spill och överbelasta separatorn. Förbered plattavskiljaren genom att placera en styv grund uppsamlingsbehållare på 4000 ml under slussen vid separatorns botten (figur 1). Fyll två 3000 ml graderade plastbägare ca 3/4 fulla med kranvatten.
        OBS: Använd en diskbänksslang som ett alternativ till 3000 ml plastgraderade bägare. Annars måste bägare kontinuerligt fyllas på under hela separationsprocessen. Ytterligare detaljer för användning av valpseparatorn finns i referenserna12,20.
      2. Häll vatten genom utrymmet mellan glasplattorna och justera de övre och nedre vreden medurs eller moturs så att vatten kontinuerligt kan strömma igenom samtidigt som stående vatten genereras till en höjd av cirka 1,25 cm från plattans botten. Markera startpositionerna för de nedre vreden med tejp. När stående vatten är jämnt fördelat över basen av glasplattorna med samma höjd och dräneringshastighet, börja hälla innehållet i behållarna med puppar och larver genom utrymmet mellan plattorna.
        OBS: En tydlig separation bör finnas mellan små (manliga) och stora (kvinnliga) puppor; Annars spolar du igenom denna sats och justerar de övre vreden för att minska utrymmet mellan plattorna.
      3. Medan du långsamt häller vatten genom separatorn, rotera kontinuerligt de nedre vreden som ett par moturs ~ 1-2 cm från det tejpmarkerade startläget tills de flesta eller alla larver har tvättat igenom och glidit ner slussen i uppsamlingsbehållaren.
        OBS: Eftersom ena handen används för att hälla vatten, roterar den andra handen vreden en i taget, men lika och i små steg, för att långsamt öppna plattorna. De flesta larver tvättas snabbt igenom, men det kommer att finnas några larver som fångas med hanpupporna. Dessa eftersläntringslarver kommer att bestrålas men kommer att släpa efter i utvecklingen och inte komma nära vuxna med fokalkohorten av puppor.
      4. Kassera eller återvinn larverna tillbaka till kolonin, men ta i båda fallen bort dem från uppsamlingsbehållaren innan hanpupporna börjar tvätta genom separatorn. Pausa processen genom att upphöra med vattenflödet medan uppsamlingsbehållaren vid slussens botten rensas från larver genom att hälla genom en #30-sil, som återspolas i en separat behållare.
        OBS: Larver flyter igenom först, följt av manliga puppor och slutligen honorna (figur 1).
      5. Fortsätt att hälla vatten och rotera bottenknapparna tills de manliga larverna tvättas igenom och separeras i uppsamlingsbehållaren. Pausa processen för att söka efter och ta bort larver från uppsamlingsbehållaren innan hanpupporna överförs i nästa steg.
        OBS: Antalet spolningar som behövs för att separera männen beror på vattenhällens tempo och hastigheten med vilken knopparna roteras. Det tar vanligtvis 2000-2500 ml vatten att spola ut larverna, 1000-1500 ml för att spola ut hanpupporna och 200-400 ml för att spola ut honpupporna.
      6. Häll hanpupporna ur uppsamlingsbehållaren genom en #20 sikt över ett handfat. Använd en 1000 ml pressflaska kranvatten för att backspola hanpupporna från sikten medan du häller i en separat 1900 ml behållare.
      7. När alla manliga puppor har separerats, fortsätt att hälla vatten genom separatorn och justera de nedre vreden för att spola genom honpupporna. Överför honorna med hjälp av den siktprocess som beskrivs i steg 2.2.1.6 till en separat behållare tills alla omogna myggor spolas ut ur separatorn. Kassera honpupporna. När batchen har bearbetats, återställ vreden till sina ursprungliga startpositioner och upprepa processen med nästa sats. När alla partier har bearbetats, lämna plattorna öppna så att separatorn kan torka.
        OBS: Det finns ingen perfekt separation med den här enheten, vilket kräver tålamod och övning. Envisa puppor eller larver kan lossas med ett kraftigt flöde av vatten, men inte i den utsträckning att det skjuter dem åt sidorna, vilket kan förorena framtida översvämningar.
    2. För två operatorer som separerar hanpupporna ändrar du avsnitt 2.2.1 enligt följande.
      1. Första operatören: Häll vatten genom separatorn och rotera vreden stegvis för att separera larver, hanpuppor och kvinnliga puppor.
      2. Andra operatören: När varje steg har samlats upp i slussbehållaren, sikta ut innehållet i slussbehållaren för att dela upp larverna, hanpupporna och honpupporna i flera, separata slussuppsamlingsbehållare. Håll de stora bägarna fyllda med vatten om en diskbänksslang inte är tillgänglig.

Figure 1
Figur 1: Pupalavskiljare som innehåller ett parti omogna Aedes aegypti. Separationen börjar med att hälla vatten genom separatorn medan du roterar bottenknapparna 1-2 cm moturs tills den riktade uppsättningen, dvs larver, manliga puppor eller kvinnliga puppor, har isolerats så mycket som möjligt från de uppsättningar som finns kvar (vänster bild). Höger bild visar separation av larver (lägsta bandet), manliga puppor (mittband) och kvinnliga puppor (övre bandet). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

3. Beredning av manliga Aedes aegypti puppor för bestrålning

  1. Dela upp hanpupporna i 60 mm petriskålar av plast.
    OBS: Antalet petriskålar som behövs beror på hur många manliga puppor som finns tillgängliga för bestrålning: en larvuppfödningspanna från steg 1.2 fyller cirka 1,5 petriskålar. Åldern på popparnas ålder varierar från 1 till 40 h gammal. I detta protokoll kallas den mindre diametern djupare halvan av petriskålen botten, och den grundare halvan med större diameter kallas toppen.
    1. Förbered förskurna skivor av filterpapper för att passa innerdiametern på petriskålens botten. Placera en vattenfuktad filterpappersskiva i var och en av petriskålarnas bottnar för att hålla pupporna hydratiserade under hela transporten och bestrålningsprocessen.
    2. Överför pupporna till petriskålar. Sila hanpupporna som samlats in i steg 2.2.1.6 med en sil och tvätta pupporna i en 1000 ml graderad bägare med så lite vatten som möjligt. Häll försiktigt popparna i petriskålar tills varje filterpappersskiva är jämnt täckt med ett enda lager puppor (figur 2A - C). Ordna petriskålarna vid kanten av ett bord i rad för att underlätta hällningen.
      OBS: Ett alternativ till att sila pupporna är att klippa spetsen på en plast 3 ml Pasteur-pipett till en diameter som är tillräckligt stor för att rymma pupporna. Använd pipetten för att överföra pupporna från behållaren som produceras i steg 2.2.1.6 direkt till filterpappersskivorna så att det finns ett enda, tätt packat lager av puppor i varje petriskål. Detta är endast praktiskt för små satser.
    3. Använd en oförändrad 3 ml Pasteur-pipett för att ta bort stående vatten från petriskålens botten för att förhindra pupalrörelse under sexsteget (3.2) och transporten.

Figure 2
Figur 2: Överföring av puppor till petriskålar för bestrålning . (A) Siktade puppor hälls och tvättas tillbaka i en 1000 ml plastbägare. (B) Minimalt med vatten hålls kvar i bägaren för att underlätta hällning i petriskålar. (C) Petriskålar uppradade längs kanten av en yta för att underlätta hällning i ett enda lager puppor. (D) Petriskålar lastade med puppor staplas och säkras för leverans till bestrålningsanläggningen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

  1. Sex pupporna för att kontrollera om det finns kontaminering med honor. Under ett dissekerande omfång, använd sonder för att rotera varje puppa för att kontrollera den ventrala ytan för en stor könslob (figur 3) som indikerar manligt kön. Ta bort och kassera pupporna med reducerade eller små könslober som indikerar honor och ersätt med lika många manliga puppor för att bibehålla rätt antal.
    OBS: I ett operativt program är detta steg inte praktiskt på grund av ett stort antal myggor och det faktum att separation, överföring, bestrålning och förberedelse av burar efter bestrålning görs på en dag med begränsad tid. Kvalitetskontroll av ett prov från utvalda petriskålar kan göras, särskilt i tidiga faser av utvecklingen av SIT-programmet.

Figure 3
Figur 3: Könspuppor med hjälp av könsorganet. (A) Ventrala och (B) laterala vyer av kvinnliga () och manliga (♀ ♂) Aedes aegypti puppor, med könslober indikerade för att visa sexuell dimorfism. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

  1. Täck bottnarna med toppen av petriskålarna och säkra med laboratorietejp. Bunta de tejpade petriskålarna med elastiska band i staplar som är dimensionerade för att passa i bestrålningskammaren och försegla inuti en märkt 3,8 L återförslutningsbar påse (figur 2D). Låt inte puppor förbli avtäckta i >1 timme.

4. Bestrålning av manliga Aedes aegypti puppor

  1. Förbered dosimetrifilm från samma parti genom att klippa 1 cm2 rutor med filmer och placera varje kvadrat i sitt individuella kuvert.
    OBS: All film som används varje dag klipps samtidigt. Detta minskar den lilla mängd variation som orsakas av lagring. Antalet rutor som behövs för varje stapel är 1 + (antal petriskålar).
  2. Förbered ett kit att ta in i bestrålningsanläggningen, som bör innehålla en laboratorietimer, laboratorietejp, permanent markör, förberedda kuvert av dosimetrifilm, dosimetrimärke och ett laboratorieanteckningsblad med checklistor för att hålla reda på viktig information (figur 4).

Figure 4
Figur 4: Laboratoriebokens översikt-IR-ark ifyllt för en dosresponsuppsättning. Textrutor som är markerade med rött (markerade med röda pilar) anger användbara anteckningar om de olika avsnitten och upprepar viktig information. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

  1. Transportera pupporna till bestrålningsanläggningen. Placera petriskålarna av manliga puppor från steg 3.3 i isolerade behållare och förvara i direkt solljus och med luftkonditionering under transport.
  2. Förbered staplar med petriskålar för bestrålning vid bestrålningen. Stapla lämpligt antal petriskålar för att passa in i bestrålningskammaren med ett dosimetrifilmhölje centrerat mellan varje maträtt och längst upp och längst ner i stapeln. Säkra kuverten och hela stapeln med laboratorietejp för att förhindra spill och underlätta placering av stapeln i kammaren.
  3. Bestråla petriskålarna av manliga puppor. Placera bunten med petriskålar på det styva metallnätet i kammaren för att placera den i rätt höjd för optimal exponeringskon baserat på tidigare doskartläggning av den specifika bestrålningsenheten21. Aktivera skivspelaren på bestrålningen och bestråla, samtidigt som laboratorietimern initieras. Bestråla för lämpligt intervall för att uppnå önskad dos (exempel visas i tabell 2).
    OBS: Detta protokoll är baserat på en cesium-137-bestrålning (se materialtabellen) och en måldos på 50 Gy. Eftersom Cs-137 sönderfaller med tiden justeras dosraten varje år genom att utföra en dos-responsserie med alanindosimetrar, kompletterad med radiokrom film för rutindosimetri och alanin i cirka 10% av bestrålade prover. Med tanke på den aktuella dosraten på 8,8 Gy/min krävs 5 min, 41 s exponering för att uppnå måldosen på 50 Gy. Rutinmässig filmdosimetri sker enligt beskrivningen i steg 4.7. Alaninpelletsdosimetri utförs antingen vid National Center for Electron Beam Research vid Texas A&M University eller vid National Institute of Standards and Technology i Gaithersburg, MD, USA.
Dosering (Gy) Tid (baserat på 8,8 Gy/min)
0 NA
10 1 min 8 s
30 3 min 24 s
50 5 min 41 s
65 7 min 23 s
85 9 min 39 s
100 11 min 22 s
110 12 min 30 s

Tabell 2: Exempel på doseringstider för Cesium-137-bestrålningen.

  1. När den föreskrivna tiden har gått, ta bort petriskålarna från bestrålningen och demontera försiktigt stapeln. Märk alla petriskålar och filmkuvert med datum och plats i stapeln. Försegla kuverten och förvara för dosimetri. Packa om petriskålarna i den isolerade behållaren för transport tillbaka till huvudlaboratoriet.
    OBS: Anteckna om vuxna uppstod under bestrålning och markera den drabbade petriskålen så att den eller de vuxna inte kommer ut när pupporna sätts in i uppfödningsburarna (steg 5.2).
  2. Bekräfta bestrålningsdosen med dosimetrifilm genom att mäta filmen cirka 24 timmar efter exponering. Aktivera dosimetriläsaren och låt den balansera till rumstemperatur. Ladda filmen med pincett som medföljer läsaren och följ tillverkarens instruktioner för att läsa den bestrålade filmen samt den obestrålade tomma filmen från samma sats. Nollställ läsaren utan film mellan avläsningarna och registrera data som i exempeldatabladet som visas i figur 5.
    OBS: Detta protokoll är baserat på ND0.5 och ND1.0 QA Filter Set-standarder. Det är viktigt att mäta filmen med den matta sidan vänd mot operatören.

Figure 5
Bild 5: Dosimetridatablad ifyllt med exempeldata. Kolumnrubrikerna uppmanar operatören att samla in nyckeldata för senare analys. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

5. Uppfödning av bestrålade manliga Aedes aegypti puppar till vuxna

  1. Rengör och förbered små plastburar på 30 cm x 30 cm x 30 cm så att de är redo för bestrålade puppor när de återvänder till huvudlaboratoriet. För varje 2 petriskålar av bestrålade manliga puppar, förbered 1 uppfödningsbur. Fyll varje uppfödningsbur med en halvfylld plastmugg som innehåller 460 ml kranvatten och en 10 % sackaroslösningsbehållare, enligt beskrivningen i steg 1.1.3.
  2. Överför omedelbart de bestrålade pupporna till de förberedda uppfödningsburarna efter att ha återvänt från bestrålningsanläggningen. Använd en pressflaska vatten för att försiktigt tvätta pupporna från varje petriskål i 460 ml vatten i plastkoppen i varje uppfödningsbur. Efter 24 timmar, överför kopparna till nya, rena uppfödningsburar som innehåller näringskällan och vänta på återstående eclosion av vuxen, manlig bestrålad Aedes aegypti.
    OBS: Om puppor har dykt upp under bestrålningsprocessen, öppna petriskålarna med flygbladen i en tom bur och fortsätt sedan med steg 5.2. Kassera männen som samlats i denna bur. Puppor överförs till nya uppfödningsburar efter 24 timmar eftersom hanar dyker upp före honor i samma kohort och isolering av uppkomstdagarna kan minska förekomsten av kvinnlig kontaminering och säkerställa korrekt åldrande av män.

6. Märkning och vägning av bestrålade vuxna Aedes aegypti-hanar

OBS: Detta avsnitt av protokollet förutsätter att två personer utför uppgifterna; för 1 person, se 6.4.

Figure 6
Figur 6: Förpackning märkt, bestrålad, hane Aedes aegypti i släppbehållare. (A) Släpp behållare som visar stockinette fäst vid ett hål som skärs i sidan av kardstockcylindern med maskeringstejp, häftklamrar och varmt lim. Ramen är på plats med en maskeringstejpetikett som är fäst på sidan. Ramen behåller det tätt dragna tyllnätskyddet; Ett elastiskt band (inte synligt) håller också tyllen på plats under ramen. (B) Parti sövda hanar som håller på att tumlas i rosa färgämne i en liten kardstockskopp. (C) Fyra frigöringsbehållare inuti isolerad fraktbehållare. Observera att stockinettehylsorna är orienterade mot mitten av fraktbehållaren, förpackningsmaterial är undangömda runt frigöringsbehållarna och närings- och hydratiseringskällor finns på plats ovanpå varje frigöringsbehållare täckt av en inverterad petriskålbotten som hålls fast av korsade elastiska band och tejpbitar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

  1. Förbered kardstocksfrigöringsbehållare.
    1. Skär ett hål med en diameter på 11,5 cm i sidan av en lockad, cylindrisk 3,9 L kardstockbehållare på 1,5-3,0 cm från botten så att hålet inte täcks av locket (figur 6A).
    2. Skär en 40-50 cm lång stockinette och häfta ena änden av den runt insidan av 11,5 cm hålet som skärs i 6.1.1. Använd en vanlig kontorshäftapparat som öppnas så att häftklamrar kan tvingas genom stockinetten och kartongen från behållarens insida och in i en lämplig arbetsyta, till exempel ett block av hårt extruderat polystyrenskum. Krymp häftklamrarna med en platt skruvmejsel för att tätt fästa stockinetten i hålets omkrets och fäst maskeringstejpen över den krympta sidan för att förhindra hakar. Försegla kanten på stockinetten på insidan av cylindern till kardstocken med varmt lim och korskontrollera hela enheten för utrymningshål.
    3. Skapa en kvarhållningsram genom att ta bort den inre skivan från locket och skär en 33 cm x 33 cm kvadrat nylontyllnät tillräckligt bra för att behålla vuxna manliga Aedes aegypti-myggor . Placera nätet på cylinderns öppna ände och montera ramen över nätet för att hålla det på plats utan mellanrum. Dra nätet nedåt så att det sticker ut under ramen för att göra nätet lärt över den öppna änden och täta det utskjutande nätet tätt mot cylindern med ett gummiband.
    4. Placera en 10 cm bit maskeringstejp på sidan av ramen täckt med en 8 cm bit märkningstejp så att märkningstejpen enkelt kan bytas ut utan att riva ramen.
      OBS: Släppbehållare är hållbara och kan återanvändas > 10x med korrekt hantering. Innan du introducerar varje ny sats av märkta, bestrålade, vuxna, manliga myggor, kontrollera att stockinetten är ordentligt fastsatt på behållaren och gör omedelbart reparationer om det behövs.
  2. Förbered vägnings- och märkningsstationen.
    1. Häll cirka 50 mg markeringsfärg i en 240 ml kardstockbehållare och sprid ut färgämnet som ett lager pulver jämnt runt behållarens inre ytor. Tryck försiktigt för att kasta överflödigt färgämne. Använd tydligt märkta koppar för flera färgämnen för att hålla färgerna åtskilda.
    2. Ta en 100-500 g vägande båt på en 0,0001 g elektronisk balans; skapa ett dataformulär (tabell 3); och tejpa ihop fyra ark med 215,9 mm x 355,6 mm kopieringspapper för att göra en arbetsyta på 431,8 mm x 711,2 mm.
Släpp behållare Vikt av myggor Burnummer Kvinnor i batch Antal män Släpp behållare Total massa
ROSA I 0.024 D1 #1 25 ROSA I 2.03
ROSA I 2.007 D1 #1 7 ROSA II 1.99
ROSA II 1.990 D1 #1 ROSA III 2.03
ROSA III 0.026 D1 #3 25
ROSA III 2.000 D1 #3 18

Tabell 3: Datatabell för vägningsstationen.

  1. Markera kvantifierade partier av vuxna bestrålade hanar med fluorescerande pigment.
    1. Överför vuxna myggor (2,5-3,5 dagar gamla) från varje uppfödningsbur till sugdjur. Ta bort näringskällor från uppfödningsburen från steg 5.2 och placera hela buren i en stor CO 2-kammare i 5-7 minuter och knacka på behållarens sidor för att lossa myggor som kan klamra sig fast vid uppfödningsburen. När exponeringstiden har gått, ta bort uppfödningsburet från kammaren och aspirera alla vuxna myggor i en serie plastiska aspirationsflaskor.
      OBS: Administrering av 99,5-100% CO2 kommer från en tank med en regulator, mässingsstång och silikonrör kanaliserade in i kammaren med en flödeshastighet på 6 L / min. Antalet injektionsflaskor som behövs för att rensa uppfödningsburen beror på hur många myggor som finns i buren och operatörens skicklighet, men 3-5 injektionsflaskor krävs vanligtvis per bur. Välj en aspirator som har små snabbväxlingsflaskor för att underlätta hanteringen av vuxna myggor i omgångar, till exempel en med en 60 ml polystyrenuppsamlingsflaska förseglad med 20 x 20 mesh aluminiumskärm i ena änden och en klar acetatklaffventil i den andra. Hela buren bedövas före aspiration för att minska tiden för att överföra myggor till injektionsflaskor för att minska belastningen på myggor och hålla protokollet lätthanterligt.
    2. Sortera alla vuxna myggor från varje uppfödningsbur efter kön.
      1. Exponera den första injektionsflaskan från steg 6.3.1 till CO 2 i en liten kammare i 4 minuter och skaka sedan försiktigt ut de bedövade myggorna och sprid dem över arbetsytan på vitt papper som förberetts i steg 6.2.2.
      2. Fyll på en ny tom injektionsflaska i aspiratorn och sug försiktigt upp alla hanar från arbetsytan och skicka injektionsflaskan till vägningsstationen (steg 6.3.3.). Räkna alla kvinnor som är kvar och aspirera dem i en separat injektionsflaska och kassera, tillsammans med alla krossade män.
      3. Upprepa denna process med de återstående injektionsflaskorna från 6.3.1, men vid någon tidpunkt i könssorteringsprocessen generera en separat injektionsflaska med endast 25 hanar som också skickas till vägningsstationen. Upprepa steg 6.3.2. för varje uppfödningsbur.
        OBS: När du bearbetar bestrålade vuxna män för köning, vägning och märkning, håll koll på antalet honor i varje sats, vilket är viktiga data för felsökning och kvalitetssäkring av valpsexsortering och hela processen. Om det kvinnliga antalet är högre än förväntat bör en andra person extrahera honor medan huvudoperatören aspirerar männen. Det är viktigt att väga ett urval av 25 män från varje uppfödningsbur för att beräkna en genomsnittlig vikt per mygga, som kommer att användas för att uppskatta antalet markerade bestrålade män som släpps ut i slutet av protokollet.
    3. Väg och färga partier av vuxna manliga myggor.
      1. Vid vägningsstationen ska den första injektionsflaskan med vuxna hanmyggor från könsuppfödandestationen (punkt 6.3.2) placeras i en liten CO 2-kammare i 2 minuter och försiktigt skaka myggorna i den tjärade vägningsbåt som förberetts i steg 6.2.2. Registrera myggans vikt och häll myggorna i färgkoppen som framställts i 6.2.1.
      2. Luta och rotera långsamt koppen 1 full rotation medurs och moturs så att myggorna kommer i kontakt med pulverlacken på koppens inre ytor och alla dammas lätt med färgämne (figur 6B). Häll de markerade myggorna i en vägningsbåt.
      3. Fortsätt snabbt till nästa steg så att myggorna inte återhämtar sig och flyr. Upprepa detta steg tills alla injektionsflaskor från avsnitt 6.3.2 har bearbetats.
        Anmärkning: Vikten av hanarna från den separata injektionsflaskan med 25 hanar som genereras för varje uppfödningsbur i avsnitt 6.3.2 registreras och används för att beräkna medelvikten per hane från den buren.
    4. Ladda frigöringsbehållarna med märkta bestrålade vuxna män. Vik lätt den vägande båten som innehåller bedövade, markerade, bestrålade, manliga myggor från slutet av avsnitt 6.3.3. för att skapa en kanal och sedan rikta den här kanalen genom stockinettehylsan för att överföra männen till frigöringsbehållaren. Fortsätt att lägga till myggor tills cirka 2,0 g eller 1500-3000 manliga myggor finns i frigöringsbehållaren och knyt stockinettehylsan stängd. Markera märkningstejpen på frigöringsbehållarens ram med färgfärg, behållarnummer och myggans totala vikt och kopiera dessa data till formuläret från steg 6.2.2.
      OBS: Hantering av myggor i alla livsstadier inducerar stress och kan minska överlevnad eller kraft. Serien av bedövningsmedel som beskrivs i detta protokoll kan påverka myggorna; försök att förfölja och aspirera icke-bedövade myggor vid varje steg skulle dock framkalla större stress och ett ohållbart protokoll. Dela den totala vikten av myggor i varje släppbehållare med den genomsnittliga vikten per hanmygga som genereras i avsnitt 6.3.3 för att få fram en uppskattning av antalet hanar i den utlösningsbehållaren. Varje frisättningsbehållare bör inte ha mer än 2 g män, vilket motsvarar cirka 1 stor uppfödningsbur.
  2. Ändringar av märkningsprotokollet för en enskild operatör
    1. Gör sexsortering för alla stora burar först. Utsätt varje stor bur för CO2 i 4-5 min och sug alla myggor i 4-5 injektionsflaskor. Utsätt varje injektionsflaska för CO 2 i2-3 minuter, tippa ut alla myggor på arbetsytan på vitt papper, ta bort honorna och räkna och återför hanarna till deras stora befolkningsbur.
    2. Vägning och märkning
      1. Börja med den första hanburen som produceras i steg 6.4.1: ta bort näringskällan och bedöva hanarna i en stor CO 2-kammare i 5-7 minuter. Aspirera de bedövade männen jämnt i separata injektionsflaskor. Upprepa detta steg med varje hållbur i den ordning de producerades.
        OBS: Cirka 2-3 trånga flaskor kommer att produceras per bur. Bearbetning av manliga hållburar i den ordning de producerades maximerar återhämtningstiden för varje bur av män.
      2. Bedöva den första injektionsflaskan som produceras i steg 6.4.2.1. i 1-2 min i en liten CO2-kammare . Häll ut ett litet antal myggor på arbetsytan på vitt papper, sug in 25 hanmyggor i en ny injektionsflaska och bearbeta som i 6.3.2 för att bestämma medelvikten per hane för den buren. Returnera eventuella ytterligare hanar till injektionsflaskan med källan, eller asspirera i en ny separat injektionsflaska som ska bearbetas senare; Fortsätt med vägning, märkning och överföring till frigöringsbehållarna för resten av hanarna i den första injektionsflaskan enligt beskrivningen i resten av steg 6.3. Upprepa steg 6.4.2.2. (med undantag för isolering av 25 hanar i en separat injektionsflaska) för resten av injektionsflaskorna som produceras i steg 6.4.2.1. i den ordning de producerades och sedan gå vidare till nästa könssorterade uppfödningsbur som produceras i 6.4.1.
        OBS: Arbetsflöden med en person är långsammare, och vissa manliga myggor måste bedövas flera gånger. Sök ständigt efter och ta bort kvinnliga myggor.

7. Förpacknings- och fraktbehållare av märkt, bestrålat, vuxet Aedes aegypti-hane

  1. Förbered frigöringsbehållarna för leverans. När en frigöringsbehållare är fylld med märkta män, placera 4 bomullsbollar fuktade med 10% sackaroslösning på nätlocket och täck med en inverterad botten av en petriskål som hålls på plats av två gummiband sträckta runt hela behållaren och över petriskålen för att bilda ett kors. Placera en bit maskeringstejp över X av de två gummibanden för att hålla dem på plats ovanpå den inverterade petriskålen.
    OBS: Se till att bomullsbollarna med 10% sackaroslösning inte är mättade till dropp, vilket kommer att skada behållaren och fälla och döda myggor.
  2. Packa kartongsläppbehållare i en extruderad polystyrenskumkylare. Stick 4 ventilationshål genom det svalare locket och ockludera med bomull för att hålla ut myror och hålla i utrymda myggor. Placera 4 frigöringsbehållare upprätt i fraktkylaren med lagerhållaren på varje behållare vänd mot mitten (figur 6C). Stoppa bubbelplast mellan varje behållare och i mitten för att stabilisera dem. Fyll i resten av utrymmet i fraktkylaren med luftkuddar eller stapla ett andra lager med 4 frigöringsbehållare direkt ovanpå det första lagret och stabilisera på samma sätt med luftkuddar.
    OBS: Frigöringsbehållarna ska vara tillräckligt stabiliserade för att inte röra sig när de skakas. Temperaturen inuti förpackningen är omgivande.
  3. Förbered fraktkylaren för leverans. Försegla fraktkylaren med det ventilerade locket och lägg i kartongöverpackningen, tejpa och skicka via nattexpress till släppplatsen.

Representative Results

Vaksam och adekvat mygguppfödning består av välbalanserad tillgång på män och kvinnor i koloniburar, underhåll av färsk sackaroslösning och honung och konsekvent högkvalitativ blodmatning. Dessa förhållanden kommer att ge tätt packade äggplåtar som är optimala för användning i SIT-larvuppfödningspannor. Korrekt lagring och användning av torkade äggark, såsom systematisk märkning för att underlätta användning från äldsta till nyaste, kommer att stödja enhetlig kläckning över alla kokkärl. Att fylla alla larvuppfödningspannor med vatten före kläckning kan minska tiden för äggbladen i kläckbehållare och främja en sund utveckling. Underhåll av larvpannor från lucka till förpupp kräver noggrant engagemang av kolonipersonal eftersom vissa kokkärl kan behöva mer eller mindre mat eller ytterligare vatten beroende på utvecklingsstadier och miljövariabler. Om det finns problem med utvecklingsstadiet vid den schemalagda dagen för pupal könsseparation, bör justeringar göras tidigare i processen, såsom kläckning tidigare eller senare, justering av mat eller ändring av inkubatortemperaturen.

Uppfödningsprocessen i detta protokoll gör inte att alla ägg kläcks i tid för att utvecklas till puppor som kan bestrålas och användas för kontrolländamål. Mellan 20 och 50% av de koloniuppfödda myggorna kommer fortfarande att vara larver när pupporna behöver separeras. Dessa larver slösas dock inte bort utan får mogna i 24 timmar för att göra ytterligare puppor som kan kombineras med kvinnliga puppor från föregående dags separation och återvinnas tillbaka till koloniburar. I koloniburarna kommer puppor att få mogna till vuxna, para sig, blodmata och producera ägg som upprätthåller SIT-projektet.

Att separera puppor, hälla puppor i petriskålar, bestrålning och placering i vuxna burar efter bestrålning måste ske på en dag; Därför bör tillräcklig tid avsättas för att behandla alla steg bekvämt. Montering och beredning av frigöringsbehållare bör göras före märkningsprocessen. När fraktlådor returneras från frisläppningsplatsen bör frigöringsbehållare inspekteras och förberedas för nästa användning. Kassering av våta bomullsbollar, luftning av våta frigöringsbehållare, rengöring av petriskålar, byte av nät och avlägsnande av elastiska band från behållaren, även om de inte används, kommer att förlänga livslängden på frigöringsbehållarna kraftigt.

Med tanke på den globala verkligheten i COVID-19-viruspandemin har detta protokoll som vanligtvis är en operation med flera personer modifierats för att kunna hanteras av en person som arbetar ensam i ett laboratorium för varje steg. De steg i processen som hindras mest av ett enpersonsscenario är könsbestämning, märkning, vägning och koloniuppfödning underhållssteg. Att separera puppor efter kön av en person bör vara tillräckligt om det finns flera separatorer som arbetar samtidigt i olika rum. I en pandemisk situation där social distansering sker på arbetsplatsen krävs utrustning av flera stationer för att slutföra steg från sexing till packning. Beroende på operatörens hastighet tar det en person ~ 4 h att köna 15 000 myggor och sedan ytterligare 1-2 timmar för att markera, väga och paketera dem. Ett scenario med två personer minskar den tid under vilken myggor bedövas för märkning och minskar den totala arbetstiden. Men även i ett scenario med två personer kan det vara utmanande att fördela hela 2,0 g myggor per utsättningsbur på grund av begränsad arbetstid medan myggorna är nedsövda. Även om processen med rengöring och beredning av larv- och vuxenuppfödningsmaterial är extremt tidskrävande och arbetskrävande, kan den delas upp så att enskilda operatörer kan arbeta självständigt och säkert under en pandemi.

Att släppa ut vuxna, märkta, bestrålade Aedes aegypti-hanar ligger utanför ramen för detta protokoll men presenteras här i korthet. Processen att frigöra markerade, bestrålade, manliga myggor börjar med att bestämma en enhetlig frisättningsfördelning av frisättningsbehållarna baserat på vikter (och därmed härledda antal sterila hanar), som rapporterats i tabell 3. Efter att leveranserna har levererats till vektorkontrolldistriktet öppnas lådorna och frigöringsbehållarna utvärderas för eventuella problem med dödlighet eller tillstånd hos frisättningsbehållarna. Myggor i utlösningsbehållarna får sedan acklimatisera sig till omgivningstemperatur och luftfuktighet i 1-2 timmar före transport till behandlingsområdet. Utsättningsplatser i behandlingsområdet identifieras efter intensiv övervakning av heta platser i vilda populationer av Aedes aegypti. Tidpunkten, frekvensen och tätheten av utsläpp balanseras av artens bionomik samt meteorologi, offentligt stöd och laboratorieuppfödningsförmåga.

Eftersom specifika frigöringsbehållare matchas med särskilda frisläppningsplatser måste etiketten dubbelkontrolleras innan frigöringsbehållaren öppnas genom att nätet på ovansidan skärs av, så att operatören kan deformera maskorna så att en del av hanarna kan komma ut. Denna metod med fraktionerad frisättning upprepas vid varje tilldelad frigöringspunkt för behållaren tills alla fritt flygande hanar har släppts. Den här processen upprepas sedan för varje frigöringsbehållare på respektive tilldelade frigöringsplats tills alla behållare har bearbetats. Alternativt, efter att myggorna har släppts, kan alla döda eller funktionshindrade myggor som inte lämnade fritt samlas in i petriskålar och märkas för att räknas för hand eller vägas för att korrigera det uppskattade antalet som släpptes. Pågående och genomgripande övervakning av vuxna, ägg och omogna stadier av vilda Aedes aegypti i målområdet, och eventuellt på icke-interventionskontrollplatser, utförs för att bedöma effektiviteten av SIT-operationen.

Discussion

Initiering av ett kontrollprogram med SIT som använder strålning kräver etablering av en lokal stam av Aedes aegypti. Detta steg är kritiskt och kan göra det möjligt för SIT att verkligen skilja sig från liknande styrtekniker. Genom att utveckla projektet från en lokal myggstam kommer de män som genereras sannolikt att ha beteenden som gör att de kan anpassa sig till miljöförändringar och ledtrådar och att lokalisera och para sig med vilda honor i närheten. Dessutom kan det hända att utsättningen av bestrålade lokala hanar inte genererar en negativ allmän opinion jämfört med till exempel utsläpp av en icke-lokal stam av genetiskt modifierade myggor som till exempel kan införa nya alleler i den lokala myggpopulationen.

Att spendera betydande resurser för att föda upp stora mängder myggor bara för att kunna använda ungefär hälften av dem för kontrolländamål är en begränsning av Aedes aegypti SIT-programmet. Förfining bör göras i uppfödningsprotokollet för att kondensera mognaden av larver till mer definierade tidsramar när pupporna kommer att vara klara. Detta skulle göra det möjligt att samla in fler puppor vid den optimala separationstidpunkten. Ytterligare puppor att bearbeta ökar dock risken för att fler honor förpuppas när pupporna samlas in och ökar därför sannolikheten för att honor hamnar i petriskålar med hanar och eventuellt släpps. Även om livslängden, blodmatningsbeteendet och ovipositionsbeteendet hos bestrålade kvinnliga Aedes aegypti-puppor reduceras hos vuxna, är det inte en bra strategi att släppa kvinnor för övrigt tillsammans med bestrålade män22. Därför bör det förbli en prioritet att minimera antalet honor som oavsiktligt separeras, bestrålas, markeras och släpps ut med män.

Framgången för ett SIT-program är i slutändan beroende av framgångsrik kompiskonkurrens av koloniuppfödda, bestrålade hanar. Att bevara manlig konkurrenskraft bygger på uttömmande experimentellt härledd val av dos och maximering av det uppskattade förhållandet mellan sterila:vilda hanar i populationen. Dosval bestäms av flera nyckelfaktorer som inkluderar livslängd, fertilitet, fecundity och pupal mortalitet. Det har observerats att manliga myggor kommer att uppvisa en asymptotisk fertilitetskurva som närmar sig noll när strålningen ökar (KJL, RLA, SCB opublicerade data). Samtidigt minskar manlig mygglivslängd och aktivitetsnivåer exponentiellt när strålningsdosen ökar (KJL, RLA, SCB opublicerade data). Därför, snarare än att identifiera en dos som ger 99.9% sterilitet hos män, är det att föredra att fokusera på en lägre sterilitetsprocent samtidigt som man stöder överlevnad. När ett dosintervall har identifierats som inte skiljer livslängden eller valpdödligheten hos bestrålade män från den hos icke-bestrålade män, bör ytterligare bedömningar av fertiliteten utföras för att identifiera en dos som gör män överväldigande sterila men ändå konkurrenskraftiga.

Samtidigt är det viktigt att jämföra antalet manliga myggor i befolkningen med antalet frisläppta bestrålade män. Detta kan åstadkommas genom att samla in hanar från olika platser i och runt målutsättningsområdet upprepade gånger från samma plats och före, under och efter initiering av SIT-programmet. En studie av märke, frisättning, återfångst bör genomföras för att bedöma förhållandet mellan vilda manliga myggor och frisläppta myggor. En studie av mark, release, recapture förlitar sig på frisättningen av ett känt antal markerade myggor från en specifik punkt och deras senare återerövring vid punkter i närheten av den ursprungliga frisättningspunkten. Genom att jämföra antalet återfångade hanar och vilda hanar på avstånd från utsättningspunkten är det möjligt att uppskatta den allmänna vilda populationen av hanar i området så att konkurrenskraftiga förhållanden för sterila hanar kan släppas23. Maximering av förhållandet mellan sterila:vilda hanar kan uppnås genom att släppa ut mer sterila hanar och/eller genom att minska den vilda populationen med klassiska kontrollmedel som källreduktion, omogen kontroll eller adulticidbehandlingar.

För att mäta effektiviteten hos sterila manliga utgåvor kan vuxna samlingar jämföras kronologiskt mot ett icke-interventionsområde. När sterila hanar frigörs och antalet insamlade hanar och honor i ett område minskar i förhållande till ett jämförbart icke-interventionsområde, kan det antas att det beror på att de frisläppta sterila hanarna framgångsrikt konkurrerar ut lokala fertila hanar. Denna effekt kan också observeras i ovipositionsfällor som används på både interventions- och icke-interventionsställena. Ägg kan fortfarande produceras på interventionsplatsen, men om färre kläcks än de från icke-interventionsplatsen kan det antas att de inte befruktas på grund av att honor parar sig med sterila hanar. Mer och mer oviposition av obefruktade ägg kan så småningom leda till minskad oviposition på grund av att honor inte ersätts på interventionsstället 8,24.

Framtida riktningar för SIT-teknik och program expanderar naturligt till ytterligare medicinskt viktiga myggarter. Till exempel kan denna teknik lätt anpassas för att kontrollera Aedes albopictus, med tanke på den mycket liknande bionomiken hos Aedes aegypti och Aedes albopictus. Andra sjukdomsvektormyggarter av intresse inkluderar Culex quinquefasciatus, Culex tarsalis och olika Anopheles-arter. Att förbättra effektiviteten av denna teknik beror på att öka kapaciteten hos manliga puppor som produceras vid en viss tidpunkt, vilket kan uppnås genom genetisk manipulation eller artificiellt urval, och förbättra manlig konkurrenskraft, vilket kan uppnås genom att öka viriliteten, fertiliteten eller livslängden.

I slutändan är SIT-program inte en silverkula för att kontrollera myggor. De är istället ett verktyg i en svit av andra kontrolltekniker, till exempel IVM-program, som korskompenserar för svagheter bland tekniker. Kemisk kontroll erbjuder till exempel snabb och billig kontroll, men den främjar också utvecklingen av resistens och dödlighet som inte är målarter. och medan SIT är artspecifikt och sannolikt inte kommer att generera resistens, måste SIT-hanar produceras och släppas ut för all framtid för att kontrollera invandrande populationer utanför vektorkontrolldistriktet.

Disclosures

Samtliga författare har inte deklarerat några intressekonflikter.

Acknowledgments

Vi tackar Drs. R.-D. Xue, C. Bibbs, W. Qualls och V. Aryaprema från Anastasia Mosquito Control District, St. Augustine, Florida, för partnerskap i utvecklingen av SIT-programmet och expertinsikt om effektiv operativ frisättning av sterila manliga Aedes aegypti. Denna forskning stöddes av USDA-ARS och Florida Department of Agriculture and Consumer Services (FDACS). Omnämnande av handelsnamn eller kommersiella produkter i denna publikation är endast i syfte att tillhandahålla specifik information och innebär inte rekommendation eller godkännande av USDA eller FDACS.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-1/8" wrench (1" (1 inch) = 2.54 cm) Craftsman CMMT44707
1/2 pint cardstock cup (1/2 pint = 236.5 mL) Science Supplies WLE corp 1/2 pint
1/4" tubing - tygon Hudson Extrusions LLDPE1/8 X 1/4 BLK to attach to CO2 gas regulator
1/8" brass barb w/ MIP connection B&K BHB-85NLB to attach to CO2 gas regulator
1000 mL graduated plastic beakers with handle Thermo Scientific 1223-1000
3000 mL graduated plastic beakers with handle Thermo Scientific 1223-3000
Adult large cage Bioquip 1450D
Aspirator vials Bioquip 2809V
Bovine liver powder MP Biomedicals 290039601
Brewers yeast MP Biomericals 02903312-CF
CO2 regulator Randor 64003038
CO2 tank (20# canister) Praxair CDBEVCARB20
Collection basin Treasure Gurus KI-ENAMELBOWL for separator
Cotton balls - large Fisher Scientific 22-456-883
Deli cups w/lids - 470 mL Pactiv DELItainer PCTYSD2516
Deli cups w/lids - 1900 mL Berry Global T60764
DoseReader 4 ND0.5 and ND1.0 QA Filter Set standards
Dosimetry film Far West Technology, Inc.
Filter paper Millipore AP10045S0
Flashlight aspirator Bioquip 2809D
Forceps - fine featherweight Bioquip 4748 or 4750 featherweight
GAFchromic radiochromic film
Gammator M Radiation Machinery Corporation, Parsippany, NJ Cesium-137 irradiator
Hand held mechanical aspirator Clarke Mosquito 13500
Lambskin condoms Trojan Naturalamb
Large CO2 chamber Sterilite Walmart # 568789514
Larval rearing pans Blue Ridge Thermoforming  01-FG-400-3N-ABS Dimensions: 22.375 x 17.5 x 3 (inches)
Magnets - 20# pull Master magnetics MHHH20BX
Marking dye Dayglo ECO-11 Aurora Pink
Marking dye Dayglo ECO-17 Saturn Yellow
Mesh Falk T301
Pasture pipettes Thermo Scientific 02-708-006
Petri dishes - large VWR International 25384-090 CS
Petri dishes - small (60 mm x 15 mm) Fisher Brand FB0875713A
Pupa separator J.W. Hock 1512
Red rubber hose Welch 331040-5
Release containers Science Supplies WLE corp 1 gallon
Rubber bands - cross #19 Alliance ALL37196
Rubber bands - latitude #64 Skillcraft NSN0589974
Scale Ohaus H-4737
Seed germination paper - Heavy stock 76# Anchor Paper #76
Shipping coolers- 16 x 13 x 12.5" MrBoxonline.com Husky Foam Cooler kit
Sieve #20 Advantech 20BS8F
Sieve #30 Advantech 30BS8F
Small cage - Bug Dorm MegaView Bug Dorm-1
Small CO2 chamber Mainstays Walmart # 562922221
Souffle cup lid SOLO 41165277456
Souffle cups - 4 oz (1 oz = 29.6 mL) SOLO 41165024104
Sponge ocelo MMM7274FD
Squeeze bottle Dynalon 3UUP6
Stereoscope Meiji Techno EMZ-5
Stockinette BSN Medical 30-1006
Styrofoam extruded polystyrene foam
Tropical fish flake food Tetra 4.52 pound
Vaccum chamber - desiccator BelArt T9FB892757
Weigh boats Globe Scientific 3621

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Moyes, C. L., et al. Contemporary status of insecticide resistance in the major Aedes vectors of arboviruses infecting humans. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (7), 0005625 (2017).
  2. Baldacchino, F., et al. Control methods against invasive Aedes mosquitoes in Europe: a review. Pest Management Science. 71 (11), 1471-1485 (2015).
  3. Burkett, D. A., Cope, S. E., Strickman, D. A., White, G. B. The Deployed Warfighter Protection (DWFP) Research Program: Developing new public health pesticides, application technologies, and repellent systems. Journal of Integrated Pest Management. 4 (2), 1-7 (2013).
  4. Harwood, J. F., et al. Controlling Aedes aegypti in cryptic environments with manually carried ultra-low volume and mist blower pesticide applications. Journal of the American Mosquito Control Association. 32 (3), 217-223 (2016).
  5. Morrison, A. C., Zielinski-Gutierrez, E., Scott, T. W., Rosenberg, R. Defining challenges and proposing solutions for control of the virus vector Aedes aegypti. PLoS Medicine. 5 (3), 68 (2008).
  6. Klassen, W., Curtis, C. F. History of the sterile insect technique. Sterile insect technique: principles and practice in area-wide integrated pest management. InDyck, V. A., Hendrichs, J., Robinson, A. S. , Springer. Netherlands, Dordrecht. 3-36 (2005).
  7. Alphey, L., et al. Sterile-insect methods for control of mosquito-borne diseases: an analysis. Vector Borne and Zoonotic Diseases. 10 (3), 295-311 (2010).
  8. Dame, D. A., Curtis, C. F., Benedict, M. Q., Robinson, A. S., Knols, B. G. Historical applications of induced sterilisation in field populations of mosquitoes. Malaria Journal. 8, Suppl 2 (2009).
  9. FAO IAEA. Guidelines for colonization of Aedes mosquito species. Version 1.0. Maiga, H., et al. , Vienna, Austria. Available from: http://www.naweb.iaea.org/nafa/ipc/public/Guidelines-for-colonisation-of-Aedes-mosquito-species-v1.0.final.pdf (2018).
  10. Bond, J. G., et al. Optimization of irradiation dose to Aedes aegypti and Ae. albopictus in a sterile insect technique program. PloS One. 14 (2), 0212520 (2019).
  11. Bourtzis, K., Lees, R. S., Hendrichs, J., Vreysen, M. J. B. More than one rabbit out of the hat: Radiation, transgenic and symbiont-based approaches for sustainable management of mosquito and tsetse fly populations. Acta Tropica. 157, 115-130 (2016).
  12. Carvalho, D. O., et al. Mass production of genetically modified Aedes aegypti for field releases in Brazil. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , e3579 (2014).
  13. Carvalho, D. O., et al. Aedes aegypti lines for combined sterile insect technique and incompatible insect technique applications: the importance of host genomic background. Entomologia experimentalis et applicata. 168 (6-7), 560-572 (2020).
  14. FAO/IAEA. Guidelines for mass-rearing of Aedes mosquito species. Version 1.0. Maiga, H., et al. , Vienna, Austria. Available from: http://www-naweb.iaea.org/nafa/ipc/public/Guidelines-for-mass-rearingofAedes-mosquitoes_v1.0.pdf (2020).
  15. FAO/IAEA. Guidelines for mark-release-recapture procedures of Aedes mosquitoes. Bouyer, J., et al. , Vienna, Austria. Available from: http://www-naweb.iaea.org/nafa/ipc/public/Guidelines-for-MRR-Aedes_v1.0.pdf (2020).
  16. FAO/IAEA. Guidelines for Routine Colony Maintenance of Aedes Mosquito Species, Version 1.0. Maiga, H., et al. , Vienna, Austria. Available from: http://www-naweb.iaea.org/nafa/ipc/public/guidelines-for-routine-colony-maintenance-of-Aedes-mosquito-species-v1.0.pdf (2017).
  17. Mamai, W., et al. Aedes aegypti larval development and pupal production in the FAO/IAEA mass-rearing rack and factors influencing sex sorting efficiency. Parasite. 27, 43 (2020).
  18. Zheng, X., et al. Incompatible and sterile insect techniques combined eliminate mosquitoes. Nature. 572 (7767), 56-61 (2019).
  19. BEI Resources. Methods in Aedes Research. , Available from: https://www.beiresources.org/Portals/2/VectorResources/Methods%20in%20Aedes%20Research%202016.pdf (2016).
  20. Focks, D. A. An improved separator for the developmental stages, sexes, and species of mosquitoes (Diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. 17 (6), 567-568 (1980).
  21. International Atomic Energy Agency. Manual of Dosimetry in Radiotherapy. Technical Reports Series No. 110. , Vienna. (1970).
  22. Aldridge, R. L., et al. Gamma-irradiation reduces survivorship, feeding behavior, and oviposition of female Aedes aegypti. Journal of the American Mosquito Control Association. 36 (3), 152-160 (2020).
  23. Cianci, D., et al. Estimating mosquito population size from mark-release-recapture data. Journal of Medical Entomology. 50 (3), 533-542 (2013).
  24. Knipling, E. F. The basic principles of insect population suppression and management. , United States Department of Agriculture. Washington, DC. (1979).

Tags

Biologi utgåva 169 Aedes aegypti biologisk bekämpning integrerad vektorhantering mark-release-recapture bekämpningsmedelsalternativ resistenshantering steril insektsteknik (SIT)
Förbereda bestrålade och märkta manliga <em>Aedes aegypti-myggor</em> för frisättning i ett operativt sterilt insektsteknikprogram
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Moreno, B. J., Aldridge, R. L.,… More

Moreno, B. J., Aldridge, R. L., Britch, S. C., Bayer, B. E., Kline, J., Hahn, D. A., Chen, C., Linthicum, K. J. Preparing Irradiated and Marked Male Aedes aegypti Mosquitoes for Release in an Operational Sterile Insect Technique Program. J. Vis. Exp. (169), e62260, doi:10.3791/62260 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter