न्यूनतम नमूना लेकिन अधिकतम स्वचालन मोड में एनएमआर-आधारित टुकड़ा स्क्रीनिंग

Summary

एनएमआर द्वारा टुकड़ा-आधारित स्क्रीनिंग बायोमैक्रोमोलेक्यूल्स (डीएनए, आरएनए, या प्रोटीन) के लिए छोटे अणु बाइंडर्स की तेजी से पहचान करने के लिए एक मजबूत तरीका है। स्वचालन-आधारित नमूना तैयारी, एनएमआर प्रयोगों और अधिग्रहण की स्थितियों, और विश्लेषण वर्कफ़्लो का वर्णन करने वाले प्रोटोकॉल प्रस्तुत किए गए हैं। तकनीक पता लगाने के लिए ¹एच और ¹⁹एफ एनएमआर-सक्रिय नाभिक दोनों के इष्टतम शोषण की अनुमति देती है।

Abstract

फ्रैग्मेंट-आधारित स्क्रीनिंग (एफबीएस) शिक्षा और उद्योग दोनों में दवा की खोज प्रक्रिया के भीतर एक अच्छी तरह से मान्य और स्वीकृत अवधारणा है। एनएमआर-आधारित टुकड़ा स्क्रीनिंग का सबसे बड़ा लाभ न केवल आत्मीयता के परिमाण के 7-8 आदेशों पर बाइंडर्स का पता लगाने की क्षमता है, बल्कि टुकड़ों की शुद्धता और रासायनिक गुणवत्ता की निगरानी करने और इस प्रकार उच्च गुणवत्ता वाले हिट और न्यूनतम झूठे सकारात्मक या झूठे नकारात्मक का उत्पादन करने की क्षमता है। एफबीएस के भीतर एक शर्त टुकड़ा पुस्तकालय का प्रारंभिक और आवधिक गुणवत्ता नियंत्रण करना है, प्रासंगिक बफर में टुकड़ों की घुलनशीलता और रासायनिक अखंडता का निर्धारण करना है, और विभिन्न मैक्रोमोलेक्यूल लक्ष्य वर्गों (प्रोटीन / आरएनए / डीएनए) को समायोजित करने के लिए विविध मचानों को कवर करने के लिए कई पुस्तकालयों की स्थापना करना है। इसके अलावा, नमूना मात्रा, जैविक निर्माण/टुकड़ा-स्थान के स्तर पर अधिग्रहण और विश्लेषण की गति, स्थिति-स्थान (बफर, एडिटिव्स, आयन, पीएच और तापमान) और लिगैंड-स्पेस (लिगैंड एनालॉग्स, लिगैंड एकाग्रता) के संबंध में एक व्यापक एनएमआर-आधारित स्क्रीनिंग प्रोटोकॉल अनुकूलन की आवश्यकता है। कम से कम शिक्षा जगत में, ये स्क्रीनिंग प्रयास अब तक बहुत सीमित तरीके से मैन्युअल रूप से किए गए हैं, जिससे न केवल दवा विकास प्रक्रिया में बल्कि रासायनिक जांच विकास के संदर्भ में भी स्क्रीनिंग बुनियादी ढांचे की सीमित उपलब्धता हुई है। आर्थिक रूप से आवश्यकताओं को पूरा करने के लिए, उन्नत वर्कफ़्लो प्रस्तुत किए जाते हैं। वे नवीनतम अत्याधुनिक उन्नत हार्डवेयर का लाभ उठाते हैं, जिसके साथ तरल नमूना संग्रह को स्वचालित तरीके से एनएमआर-ट्यूबों में तापमान-नियंत्रित फैशन में भरा जा सकता है। ¹एच /¹⁹एफ एनएमआर लिगैंड-आधारित स्पेक्ट्रा तब किसी दिए गए तापमान पर एकत्र किए जाते हैं। उच्च-थ्रूपुट नमूना परिवर्तक (एचटी नमूना परिवर्तक) तापमान-नियंत्रित ब्लॉकों में 500 से अधिक नमूनों को संभाल सकता है। यह, उन्नत सॉफ्टवेयर टूल के साथ, डेटा अधिग्रहण और विश्लेषण को गति देता है। इसके अलावा, प्रोटीन और आरएनए नमूनों पर स्क्रीनिंग रूटीन के आवेदन को बायोमैक्रोमोलेक्यूलर अनुसंधान में व्यापक उपयोगकर्ता आधार के लिए स्थापित प्रोटोकॉल से अवगत कराने के लिए वर्णित किया गया है।

Introduction

टुकड़ा-आधारित स्क्रीनिंग अब सरल और कम आणविक भार अणुओं (एमडब्ल्यू <250 डीए) की पहचान करने के लिए आमतौर पर इस्तेमाल की जाने वाली विधि है जो प्रोटीन, डीएनए और आरएनए सहित मैक्रोमोलेक्यूलर लक्ष्यों के लिए कमजोर बंधन दिखाते हैं। प्राथमिक स्क्रीन से प्रारंभिक हिट हिट के व्यावसायिक रूप से उपलब्ध बड़े एनालॉग्स की द्वितीयक स्क्रीन का संचालन करने और फिर रसायन विज्ञान-आधारित टुकड़ा विकास या लिंकिंग रणनीतियों का उपयोग करने के आधार के रूप में काम करते हैं। एक सफल टुकड़ा-आधारित दवा खोज (एफबीडीडी) मंच के लिए, सामान्य तौर पर, कमजोर हिट, एक टुकड़ा पुस्तकालय, एक बायोमोलेक्यूलर लक्ष्य और अनुवर्ती रसायन विज्ञान के लिए एक रणनीति का पता लगाने और चिह्नित करने के लिए एक मजबूत बायोफिज़िकल विधि की आवश्यकता होती है। दवा खोज अभियानों के भीतर चार आमतौर पर लागू बायोफिज़िकल विधियां थर्मल शिफ्ट परख, सतह प्लास्मोन अनुनाद (एसपीआर), क्रिस्टलोग्राफी और परमाणु चुंबकीय अनुनाद स्पेक्ट्रोस्कोपी (एनएमआर) हैं।

एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी ने एफबीडीडी के विभिन्न चरणों के भीतर विभिन्न भूमिकाएं प्रदर्शित की हैं। एक अनुकूलित बफर सिस्टम में घुली हुई टुकड़े लाइब्रेरी में टुकड़ों की रासायनिक शुद्धता और घुलनशीलता सुनिश्चित करने के अलावा, लिगैंड देखे गए एनएमआर प्रयोग कम आत्मीयता वाले लक्ष्य के लिए टुकड़े बंधन का पता लगा सकते हैं और लक्ष्य देखे गए एनएमआर प्रयोग टुकड़े के बाध्यकारी एपिटोप को चित्रित कर सकते हैं, इस प्रकार विस्तृत संरचना-गतिविधि संबंध अध्ययन को सक्षम कर सकते हैं। एपिटोप मैपिंग के भीतर, एनएमआर-आधारित रासायनिक बदलाव परिवर्तन न केवल ऑर्थोस्टेरिक बाइंडिंग साइटों की पहचान नहीं कर सकते हैं, बल्कि एलोस्टेरिक साइटें भी हो सकती हैं जो क्रिप्टिक हो सकती हैं और केवल बायोमोलेक्यूलर लक्ष्य के तथाकथित उत्तेजित संवहन राज्यों में सुलभ हो सकती हैं। यदि बायोमोलेक्यूलर लक्ष्य पहले से ही एक अंतर्जात लिगैंड को बांधता है, तो पहचान किए गए टुकड़े हिट को एनएमआर-आधारित प्रतियोगिता प्रयोगों का प्रदर्शन करके आसानी से एलोस्टेरिक या ऑर्थोस्टेरिक के रूप में वर्गीकृत किया जा सकता है। लिगैंड-टारगेट इंटरैक्शन के पृथक्करण स्थिरांक (केडी) का निर्धारण एफबीडीडी प्रक्रिया में एक महत्वपूर्ण पहलू है। एनएमआर-आधारित रासायनिक शिफ्ट अनुमापन, या तो लिगैंड या लक्ष्य को _केडी निर्धारित करने के लिए आसानी से किया जा सकता है। एनएमआर का एक प्रमुख लाभ यह है कि बातचीत अध्ययन समाधान में और शारीरिक स्थितियों के करीब किया जाता है। इस प्रकार, अपने लक्ष्य के साथ लिगैंड / टुकड़ा बातचीत के विश्लेषण के लिए सभी संवहन राज्यों की जांच की जा सकती है। इसके अलावा, एनएमआर-आधारित दृष्टिकोण न केवल अच्छी तरह से मुड़े हुए घुलनशील प्रोटीन की स्क्रीनिंग तक सीमित हैं, बल्कि डीएनए, आरएनए, झिल्ली बद्ध और आंतरिक रूप से अव्यवस्थित प्रोटीन^सहित बड़े लक्ष्य स्थान को समायोजित करने के लिए भी लागू किए जा रहे हैं।

टुकड़ा पुस्तकालय एफबीडीडी प्रक्रिया का एक अनिवार्य हिस्सा हैं। सामान्य तौर पर, टुकड़े प्रारंभिक अग्रदूतों के रूप में कार्य करते हैं जो अंततः जैविक लक्ष्य के लिए विकसित नए अवरोधक का हिस्सा (उपसंरचना) बन जाते हैं। कई दवाओं (वेनेटोक्लेक्स², वेमुराफेनिब³, एर्डाफिटिनिब⁴, पेक्सिडार्टनिब⁵) को टुकड़ों के रूप में शुरू होने की सूचना मिली है और अब क्लीनिकों में सफलतापूर्वक उपयोग किया जाता है। आमतौर पर, टुकड़े उच्च जलीय घुलनशीलता और स्थिरता के साथ कम आणविक भार (<250 डीए) कार्बनिक अणु होते हैं। एक सावधानीपूर्वक तैयार टुकड़ा पुस्तकालय जिसमें आमतौर पर कुछ सौ टुकड़े होते हैं, पहले से ही रासायनिक स्थान के कुशल अन्वेषण का वादा कर सकते हैं। टुकड़ा पुस्तकालयों की सामान्य संरचना समय के साथ विकसित हुई है और अक्सर ज्ञात दवाओं को छोटे टुकड़ों में विच्छेदित करके या कम्प्यूटेशनल रूप से डिज़ाइन करके प्राप्त की गई थी। इन विविध टुकड़े पुस्तकालयों में मुख्य रूप से फ्लैट सुगंधित या हेटरोएटम होते हैं और 5 ⁶ के लिपिंस्की नियम या 3 ⁷ के वर्तमान वाणिज्यिक प्रवृत्ति नियम का पालन करते हैं, लेकिन प्रतिक्रियाशील समूहों से बचते हैं। कुछ टुकड़े पुस्तकालय भी अत्यधिक घुलनशील मेटाबोलाइट्स, प्राकृतिक उत्पादों और या उनके डेरिवेटिव⁸ से व्युत्पन्न या बने थे। अधिकांश टुकड़े पुस्तकालयों द्वारा उत्पन्न एक सामान्य चुनौती डाउनस्ट्रीम रसायन विज्ञान की आसानी है।

गोएथे-यूनिवर्सिटी फ्रैंकफर्ट में सेंटर फॉर बायोमोलेक्यूलर मैग्नेटिक रेजोनेंस (बीएमआरजेड) आईनेक्स्ट-डिस्कवरी (ट्रांसलेशनल रिसर्च-डिस्कवरी के लिए एनएमआर, ईएम और एक्स-रे के लिए बुनियादी ढांचा) का एक भागीदार है, जो जैव रासायनिक और जैव चिकित्सा अनुसंधान के सभी क्षेत्रों के सभी यूरोपीय शोधकर्ताओं के लिए संरचनात्मक अनुसंधान बुनियादी ढांचे के लिए एक संघ है। आईनेक्स्ट की पिछली पहल के भीतर, जो 2019 में समाप्त हुई थी, 768 टुकड़ों से युक्त एक टुकड़ा पुस्तकालय को एक बड़े रासायनिक स्थान को कवर करने वाले "न्यूनतम टुकड़े और अधिकतम विविधता" के उद्देश्य से तैयार किया गया था। इसके अलावा, किसी भी अन्य टुकड़ा पुस्तकालय के विपरीत, आईनेक्स्ट टुकड़ा पुस्तकालय को जटिल, उच्च आत्मीयता लिगेंड के डाउनस्ट्रीम संश्लेषण को आसान बनाने के उद्देश्य से "तैयार टुकड़े" की अवधारणा के आधार पर भी डिजाइन किया गया था और अब से इन-हाउस लाइब्रेरी (डायमंड, स्ट्रक्चरल जीनोमिक कंसोर्टियम और आईनेक्स्ट) के रूप में जाना जाता है।

एनएमआर द्वारा एफबीडीडी की स्थापना के लिए जनशक्ति, ज्ञान और इंस्ट्रूमेंटेशन की आवश्यकता होती है। बीएमआरजेड में, एनएमआर द्वारा खंड स्क्रीनिंग के लिए तकनीकी सहायता का समर्थन करने के लिए अनुकूलित वर्कफ़्लो विकसित किए गए हैं। इनमें खंड लाइब्रेरी ⁹ का गुणवत्ता नियंत्रण और घुलनशीलता मूल्यांकन, चुने हुए लक्ष्यों के लिए बफर अनुकूलन, 1 एच या ¹⁹एफ- अवलोकन किए गए ¹डी-लिगैंड आधारित स्क्रीनिंग, ऑर्थोस्टेरिक और एलोस्टेरिक बाइंडिंग के बीच अंतर करने के लिए प्रतियोगिता प्रयोग, एपिटोप मैपिंग के लिए 2 डी-आधारित लक्ष्य अवलोकन एनएमआर प्रयोग, और प्रारंभिक टुकड़ा हिट के डेरिवेटिव के द्वितीयक सेट के साथ बातचीत को चिह्नित करना शामिल है। बीएमआरजेड ने विश्लेषण के लिए स्वचालित दिनचर्या स्थापित की है, जैसा कि पहले छोटे अणु-प्रोटीन इंटरैक्शन के साहित्य ^10,11 में भी चर्चा की गई थी और एनएमआर-आधारित टुकड़ा स्क्रीनिंग के लिए सभी आवश्यक स्वचालित बुनियादी ढांचे हैं। इसने संतृप्ति हस्तांतरण अंतर एनएमआर (एसटीडी-एनएमआर), ग्रेडिएंट स्पेक्ट्रोस्कोपी (वाटरलॉजी) के माध्यम से देखे गए वाटर-लिगैंड और कैर-पर्सेल-मीबूम-गिल-आधारित (सीपीएमजी-आधारित) विश्राम प्रयोगों को लागू किया है ताकि आत्मीयता शासन की एक विस्तृत श्रृंखला के साथ-साथ अत्याधुनिक स्वचालित एनएमआर इंस्ट्रूमेंटेशन और दवा की खोज के लिए सॉफ्टवेयर की एक विस्तृत श्रृंखला के भीतर टुकड़ों की पहचान की जा सके। जबकि एनएमआर-आधारित टुकड़ा स्क्रीनिंग प्रोटीन के लिए अच्छी तरह से स्थापित है, यह दृष्टिकोण आमतौर पर आरएनए और डीएनए के साथ बातचीत करने वाले नए लिगेंड को खोजने के लिए कम उपयोग किया जाता है। बीएमआरजेड ने नए प्रोटोकॉल के लिए अवधारणा का प्रमाण स्थापित किया है जो छोटे अणु-आरएनए / डीएनए इंटरैक्शन की पहचान को सक्षम करता है। इस योगदान के निम्नलिखित खंडों में, प्रोटीन और आरएनए नमूनों पर स्क्रीनिंग रूटीन के आवेदन को बायोमैक्रोमोलेक्यूलर अनुसंधान में व्यापक उपयोगकर्ता आधार के लिए स्थापित प्रोटोकॉल से अवगत कराने के लिए सूचित किया गया है।

Protocol

1. टुकड़ा पुस्तकालय

1. इन-हाउस टुकड़ा पुस्तकालय
   नोट: आईनेक्स्ट की संयुक्त अनुसंधान गतिविधियों में से एक के ढांचे के भीतर, एक मजबूत और डाउनस्ट्रीम रसायन विज्ञान के अनुकूल पहली पीढ़ी के टुकड़े^{पुस्तकालय विकसित किया} गया था और बाद में पुस्तकालय की एक दूसरी पीढ़ी को एनामाइन के सहयोग से एक साथ रखा गया था और इसे डीएसआई (डायमंड-एसजीसी-आईनेक्स्ट) -तैयार टुकड़ा पुस्तकालय (अब से "इन-हाउस लाइब्रेरी" कहा जाता है) के रूप में जाना जाता है। यह पुस्तकालय स्क्रीनिंग उद्देश्यों के लिए बीएमआरजेड में उपलब्ध कराया जा सकता है।
   1. पहले रिपोर्ट किए गए एनएमआर-आधारित प्रोटोकॉल⁹ का उपयोग करके इसकी अखंडता और घुलनशीलता के लिए टुकड़ा लाइब्रेरी का आकलन करें।
      नोट: इन-हाउस लाइब्रेरी में बहुत अधिक रासायनिक विविधता (>200 सिंगलटन) के साथ 768 टुकड़े होते हैं। टुकड़े के मिश्रण में स्क्रीनिंग करने से स्क्रीनिंग अभियान में काफी तेजी आ सकती है; हालांकि, ¹एच-एनएमआर स्पेक्ट्रम में सिग्नल ओवरलैप के कारण मिश्रण में टुकड़ों की संख्या सीमित है। इन-हाउस लाइब्रेरी द्वारा पेश की गई उच्च रासायनिक विविधता ¹एच देखे गए एनएमआर स्पेक्ट्रा में किसी भी महत्वपूर्ण रासायनिक बदलाव ओवरलैप के बिना 12 अलग-अलग टुकड़ों वाले मिश्रण की तैयारी की अनुमति देती है।
   2. 768 टुकड़ों के भीतर 103 टुकड़ों में एक फ्लोरीन परमाणु होता है। ¹⁹एफ स्क्रीनिंग उद्देश्यों के लिए, फ्लोरीन समूह वाले सभी 103 टुकड़ों को न्यूनतम ¹⁹एफ रासायनिक शिफ्ट ओवरलैप के आधार पर 5 मिश्रणों में विभाजित करें। ¹⁹एफ स्क्रीनिंग में सिग्नल ओवरलैप को कम करने के लिए, अधिकतम टुकड़ों और न्यूनतम सिग्नल ओवरलैप के साथ मिश्रण डिजाइन करने के लिए एकल यौगिक माप से रासायनिक शिफ्ट जानकारी का उपयोग करें। प्रत्येक मिश्रण में 20-21 टुकड़े होते हैं, जिनमें अलग-अलग ¹⁹एफ रासायनिक बदलाव होते हैं जो टुकड़ों के स्पष्ट असाइनमेंट की अनुमति देते हैं।
2. उपयोगकर्ता द्वारा परिभाषित/प्रदान की गई टुकड़ा लायब्रेरी
   1. उपयोगकर्ता द्वारा परिभाषित या प्रदान की गई टुकड़ा लायब्रेरी के साथ स्क्रीनिंग अभियान निष्पादित करें; हालांकि, स्क्रीनिंग अभियान से पहले निम्नलिखित चरणों की आवश्यकता है।
   2. यदि उपयोगकर्ता द्वारा पहले से निर्दिष्ट नहीं किया गया है, तो टुकड़ों का एनएमआर-आधारित गुणवत्ता नियंत्रण करें (बीएमआरजेड में, इसके लिए उन्नत सॉफ्टवेयर टूल का उपयोग किया जाता है; ⁹, अध्याय 6.1.1)।
   3. उपयोग से पहले बायोमोलेक्यूलर लक्ष्य, संरचना अखंडता और टुकड़ों की एकाग्रता के लिए बफर-ऑफ-पसंद में टुकड़ों की घुलनशीलता की जांच करें।
   4. एनएमआर स्पेक्ट्रा और माप समय में सिग्नल ओवरलैप दोनों को कम करने के लिए मिश्रण को डिजाइन करें।
   5. चरण 4.2 के अनुसार मिश्रण डिजाइन करें।
   6. संपूर्ण लाइब्रेरी के बजाय एकल टुकड़े या मिश्रण का एक उप-समूह स्क्रीन करें।

2. नमूना तैयार करना

नोट: एनएमआर द्वारा उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग नमूना तैयारी के लिए एक पाइपिंग रोबोट का उपयोग करती है। एनएमआर स्पेक्ट्रा, लेकिन प्रोटीन, आरएनए और डीएनए के सिग्नल अधिग्रहण के कई दिनों में स्थिरता तापमान में उतार-चढ़ाव के प्रति बेहद संवेदनशील है और इसलिए तापमान-नियंत्रित स्वचालित सिस्टम पाइप किए जा रहे नमूनों की स्थिरता की सुविधा प्रदान करेगा। इस उद्देश्य के लिए, एक अतिरिक्त ऐड-ऑन डिवाइस, जो 4 से 40 डिग्री सेल्सियस के बीच काम करता है, तापमान-नियंत्रित वातावरण में एनएमआर नमूनों के तरल हैंडलिंग के लिए पाइपिंग रोबोट के साथ युग्मित है।

1. लिगैंड मिश्रण तैयार करना
   1. नमूना तैयारी रोबोट का उपयोग करके एनएमआर माप के लिए स्क्रीनिंग नमूने तैयार करें। रोबोट का लचीला विन्यास अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए अनुमति देता है (उदाहरण के लिए, एनएमआर ट्यूबों से नमूनों की वसूली भंडारण कंटेनर या सामान्य तरल हैंडलिंग कार्यों में वापस आती है)। विभिन्न व्यास (1.7, 2.0, 2.5, 3.0 और 5.0 मिमी) के साथ एनएमआर-ट्यूब का उपयोग किया जा सकता है। उन्नत नियंत्रण सॉफ्टवेयर के साथ नमूना रोबोट प्रणाली प्रत्येक कंटेनर प्रकार के लिए सौंपे गए बारकोड को पढ़ती है और तरल भरने के प्रोटोकॉल को बेहतर ढंग से निष्पादित करती है।
   2. इन-हाउस लाइब्रेरी लिगैंड मिश्रण की तैयारी के लिए, बारकोडेड शीशियों का उपयोग करें। बारकोडेड शीशियां नमूनों की विश्वसनीयता और इष्टतम ट्रेसबिलिटी के उच्चतम स्तर की गारंटी देती हैं।
   3. 768 यौगिकों को 96-अच्छी तरह से प्रारूप की 8 प्लेटों में वितरित करें। प्रत्येक व्यक्तिगत टुकड़े की स्टॉक एकाग्रता डी 6-डीएमएसओ / डी₂ओ (9: 1) में 50 एमएम है। कुल मिलाकर, 64 मिश्रण तैयार करें जिनमें से प्रत्येक में 12 टुकड़े हों। एक मिश्रण में प्रत्येक टुकड़े की अंतिम एकाग्रता 4.2 मिमी है।
      नोट: पाइपिंग रोबोट विभिन्न ज्यामिति (क्रायो- या ऑटो सैंपलर शीशियों, 96-वेल प्लेट्स गोल या चौकोर गहरी, बारकोडेड मानक शीशियों, माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों) के साथ विभिन्न प्रकार के कंटेनर प्रकारों को समायोजित कर सकता है और विभिन्न एनएमआर ट्यूबों और रैक में तरल हस्तांतरण के कुशल निष्पादन में सहायता करता है।

चित्र 1: (ए) बीएमआरजेड में स्थापित उच्च-थ्रूपुट एनएमआर नमूना तैयारी और एनएमआर-ट्यूब भरने वाला रोबोट। (बी) बीएमआरजेड सुविधा में 600 मेगाहर्ट्ज स्पेक्ट्रोमीटर पर स्थापित व्यक्तिगत तापमान-नियंत्रित रैक के साथ उच्च-थ्रूपुट नमूना परिवर्तक। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

2. स्क्रीनिंग नमूना तैयारी रिक्त (संदर्भ लिगैंड स्पेक्ट्रम) और लक्ष्य (लक्ष्य की उपस्थिति में लिगैंड) के साथ।
   1. एनएमआर स्क्रीनिंग नमूने की तैयारी के लिए, लक्ष्य बायोमोलेक्यूल (प्रोटीन / आरएनए / डीएनए) और लिगैंड मिश्रण की उपस्थिति में, मानक एनएमआर ट्यूबों के ब्रुकर एनएमआर पोर्टफोलियो से चुने गए 3 मिमी एनएमआर एचटी नमूना परिवर्तक ट्यूबों का उपयोग करें।
   2. बायोमोलेक्यूलर लक्ष्य (जैसे, ¹एच स्क्रीनिंग: 10 μM RNA या प्रोटीन) को परिभाषित स्क्रीनिंग बफर में 3 मिमी एनएमआर ट्यूब (200 μL की अंतिम मात्रा) में मैन्युअल रूप से या पाइपिंग रोबोट का उपयोग करके स्थानांतरित करें।
   3. रोबोटिक सिस्टम का उपयोग करके अगले चरण में लिगैंड मिश्रण के 10 μL (जैसे, ¹एच स्क्रीनिंग) को लक्ष्य बायोमोलेक्यूल युक्त बारकोडेड 3 मिमी एनएमआर ट्यूबों में स्थानांतरित करें और नियंत्रण सॉफ्टवेयर के इनबिल्ट प्रोटोकॉल का उपयोग करके मिश्रण करें।
      नोट: एनएमआर ट्यूब का बारकोड नंबर आसानी से और स्वचालित रूप से अधिग्रहित एनएमआर-डेटासेट में शामिल किया जाता है, इस प्रकार बिना किसी मिश्रण के आईडी उन्मुख वर्कफ़्लो सुनिश्चित करता है। पाइपिंग रोबोट तापमान नियंत्रण सहायक तैयार नमूने को एनएमआर ट्यूबों में निरंतर तापमान के तहत रखने की अनुमति देता है।
3. इन-हाउस परिभाषित शर्तें और पैरामीटर
   1. इन-हाउस टुकड़ा पुस्तकालय के खिलाफ आरएनए और प्रोटीन की स्क्रीनिंग करने के लिए इष्टतम बफर स्थितियां स्थापित करें। बीएमआरजेड में आरएनए के लिए निम्नलिखित नमूना वातानुकूलित का उपयोग किया जाता है: 25 एमएम केपीआई, 50 एमएम केसीएल, पीएच 6.2। Mg²⁺ वैकल्पिक है।
   2. प्रोटीन समाधान की स्थिति के लिए बेहद संवेदनशील हैं; पसंद के लक्ष्य के लिए इष्टतम बफर का उपयोग करें। उन बफर में से प्रत्येक के लिए, विश्लेषण के लिए रिक्त स्थान के रूप में सेवा करने के लिए लिगेंड के अतिरिक्त संदर्भ स्पेक्ट्रा प्राप्त करें।
4. उपयोगकर्ता द्वारा निर्दिष्ट शर्तें
   नोट: ऐसे मामलों में जिनमें इन-हाउस स्थापित स्थितियां संभावित उपयोगकर्ता से जांच किए जाने वाले लक्ष्यों के लिए उपयुक्त नहीं हैं, निम्नलिखित चरणों को लागू किया जाना चाहिए।
   1. लिगैंड देखे गए स्क्रीनिंग प्रयोगों के प्रदर्शन और विश्लेषण में बफर के घटकों से न्यूनतम हस्तक्षेप सुनिश्चित करने के लिए अकेले बफर के ¹एच-एनएमआर का प्रदर्शन करें। हस्तक्षेप करने वाले घटकों को उपयुक्त रूप से ड्यूरेटेड समकक्षों के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है।
5. नमूना उत्पादन (लक्षित मात्रा)/शर्तों और उपलब्धता में सीमाएं
   नोट: कुछ बायोमैक्रोमोलेक्यूल्स का अलगाव या पुनः संयोजक उत्पादन कुछ मामलों में चुनौतीपूर्ण साबित हो सकता है और इसके परिणामस्वरूप एक सफल दवा स्क्रीनिंग अभियान को आगे बढ़ाने के लिए लक्ष्य की सीमित उपलब्धता हो सकती है। लक्ष्यों की सीमित या असीमित उपलब्धता के मामलों में, एक सफल एनएमआर-आधारित टुकड़ा स्क्रीनिंग आयोजित करने के लिए निम्नलिखित विकल्पों का उपयोग किया जा सकता है।
   1. यदि सीमित है, तो ¹⁹एफ-एनएमआर आधारित स्क्रीनिंग का उपयोग करें। विशिष्ट फ्लोरिनेटेड लिगेंड में एक एकल ¹⁹एफ सिग्नल होता है; इसलिए, बिना किसी सिग्नल ओवरलैप के 25-30 टुकड़ों के साथ कॉकटेल का उपयोग करें। विश्लेषण करने के लिए कम सिग्नल हैं, बफर घटकों से कोई सिग्नल हस्तक्षेप नहीं है, और हिट पहचान के लिए भरोसा करने के लिए कम सिग्नल हैं।
   2. यदि असीमित है, तो ¹एच-एनएमआर जैसी बड़ी स्क्रीन का उपयोग करें। बड़े टुकड़े पुस्तकालय की जांच की जा सकती है। आमतौर पर, टुकड़े एक से अधिक प्रोटॉन से बने होते हैं, जिसका अर्थ है विश्लेषण के लिए अधिक संकेतों पर भरोसा करना।

3. एनएमआर अधिग्रहण की शर्तें

1. इन-हाउस आम तौर पर परिभाषित शर्तें
   1. एचटी नमूना परिवर्तक (स्वचालन) से लैस स्पेक्ट्रोमीटर
      1. उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग के लिए, 96-वेल प्लेटों का उपयोग करें जिन्हें केवल एचटी नमूना परिवर्तक का उपयोग करके मापा जा सकता है। एचटी नमूना परिवर्तक प्रत्येक रैक को व्यक्तिगत रूप से तड़का लगाने की संभावना भी प्रदान करता है।
      2. इष्टतम सिग्नल-टू-शोर के लिए, क्रायोजेनिक जांच के साथ एक स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग करें जो या तो हीलियम या नाइट्रोजन ठंडा है। स्वचालन के लिए एक स्वचालित ट्यूनिंग और मिलान मॉड्यूल (एटीएम) आवश्यक हैं।
   2. पैरामीटर सेट और पल्स अनुक्रम
      नोट: कई एनएमआर प्रयोग बाध्यकारी घटनाओं को चिह्नित कर सकते हैं। हिट पहचान प्रयोगात्मक सेटअप के आधार पर भिन्न होती है। बीएमआरजेड स्क्रीनिंग अभियानों में निम्नलिखित प्रयोगों का नियमित रूप से उपयोग किया जाता है। फिर भी, उपयोगकर्ता परिभाषित स्क्रीनिंग अभियानों के लिए और उपयोगकर्ता विनिर्देशों के अनुसार परिवर्तन किए जा सकते हैं।
      1. यदि TopSpin सॉफ़्टवेयर का उपयोग कर रहे हैं, तो लिगैंड-आधारित प्रयोगों के लिए पैरामीटर सेट शामिल करें: SCREEN_STD, SCREEN_T1R, SCREEN_T2, SCREEN_WLOGSY। पैरामीटर सेट में सभी आवश्यक पैरामीटर और पल्स अनुक्रम शामिल हैं: एसटीडी: stddiffesgp.3; टी_1: t1rho_esgp2d; टी₂: cpmg_esgp2d; और वाटरलॉजी: ephogsygpno.2.
      2. सभी सूचीबद्ध प्रयोगों के लिए, पानी के दमन के रूप में उत्तेजना मूर्तिकला¹³ का उपयोग करें। संदर्भ के लिए, 1 डी उत्तेजना मूर्तिकला (zgesgp) का उपयोग करें। स्कैन की संख्या सिस्टम की संवेदनशीलता (चुंबकीय क्षेत्र की ताकत और जांच सिर), नमूना एकाग्रता और प्रयोग की पसंद पर निर्भर करती है। एक सिफारिश है: एनएस = 64 के साथ 1 डी, एनएस = 128 के साथ टी_{1 :} और टी₂ , एनएस = 256 के साथ एसटीडी और एनएस = 384 या 512 के साथ वाटरलॉग्स।
      3. ¹⁹एफ स्क्रीनिंग के लिए, 1 डी और टी₂ दोनों प्रयोगों का उपयोग करें: 1 डी: 1 ⁹एफ {1 एच}-प्रोब हेड के लिए एफ 19 सीपीडी (पीपी = जेडगिग) और 19 एफ / ¹एच-प्रोब हेड के लिए एफ ¹⁹(पीपी = जेडजी); SCREEN_19F_T2 (पीपी = सीपीएमजीआईजीएसपी)।
      4. 220 पीपीएम की वर्णक्रमीय चौड़ाई और -140 पीपीएम पर एक उत्तेजना आवृत्ति का उपयोग करें। प्रयोग का समय 1 से 5 घंटे (बायोमैक्रोमोलेक्यूल की दीर्घकालिक स्थिरता सुनिश्चित करना) के बीच है जो हार्डवेयर और नमूना एकाग्रता पर निर्भर करता है। टी₂ के लिए, सीपीएमजी समय 0 एमएस और 200 एमएस के बीच वैकल्पिक होना चाहिए।
   3. संसाधन
      1. एसटीडी, टी_{1 और} टी 2 प्रयोगों को छद्म₂ डी के रूप में रिकॉर्ड करें। दो एकल 1 डी स्पेक्ट्रा को संसाधित करने के लिए, आइकनएनएमआर एयू-प्रोग्राम का उपयोग करता है proc_std या तो विकल्प आराम के साथ या बिना। पहला विकल्प संदर्भ 1 डी और दो स्पेक्ट्रा का अंतर प्रदान करता है। दूसरा विकल्प छोटे और लंबे विश्राम समय के साथ दो अलग-अलग स्पेक्ट्रा उत्पन्न करता है। वाटरलॉग्सवाई एक एकल 1 डी है जिसे विलायक संकेत के लिए नकारात्मक के साथ चरणबद्ध किया जाना चाहिए।
2. उपयोगकर्ता विशिष्ट शर्तें
   1. उपयोगकर्ता-परिभाषित स्थितियों के लिए पहले उल्लिखित मापदंडों में से किसी को भी अनुकूलित करें। उदाहरण के लिए, यदि कोई सुविधा उपयोगकर्ता द्वारा प्रदान किया गया प्रोटीन आम तौर पर उपयोग किए जाने वाले तापमान पर स्थिर नहीं है, तो अनुकूलन प्रयोग अलग-अलग तापमान, एकाग्रता, बफर स्थितियों आदि का संचालन किया जा सकता है।

4. डेटा विश्लेषण

1. खंड पुस्तकालय QC (d6-DMSO / विशिष्ट बफर) और परिमाणीकरण
   1. CMC-q
      नोट: स्क्रीनिंग अभियान शुरू करने से पहले टुकड़ा पुस्तकालयों का गुणवत्ता नियंत्रण आवश्यक है। इसके अलावा, कई स्क्रीनिंग अभियानों के आवेदन के लिए टुकड़ा पुस्तकालय की दीर्घकालिक स्थिरता सुनिश्चित करने की आवश्यकता है, यही कारण है कि पुस्तकालय की गुणवत्ता का आवधिक मूल्यांकन किया जाना चाहिए। इस उद्देश्य के लिए, टॉपस्पिन से एकीकृत सॉफ्टवेयर सीएमसी-क्यू और सीएमसी-ए का उपयोग गुणवत्ता और मात्रा मूल्यांकन के लिए किया जाता है। सीएमसी-क्यू और सीएमसी-ए टॉपस्पिन के भीतर सॉफ्टवेयर मॉड्यूल हैं जो छोटे ^{कार्बनिक अणुओं से} प्राप्त ¹एच-एनएमआर स्पेक्ट्रम का उपयोग करके संरचना सत्यापन सहित सुचारू अधिग्रहण, विश्लेषण को सक्षम करते हैं।
      1. अखंडता के लिए, डी 6-डीएमएसओ में 1 एमएम की टुकड़े एकाग्रता के साथ मूल्यांकन नमूने तैयार करें। 3 मिमी एनएमआर-ट्यूब में तरल नमूना संग्रह भरकर पाइपिंग रोबोट के साथ स्वचालित तरीके से नमूने तैयार करें।
      2. घुलनशीलता मूल्यांकन के लिए, पीएच 7.4, 150 एमएम सोडियम क्लोराइड, 90% एच 2 ओ / 10% डी 2 ओ और 1 एमएम 3-(ट्राइमेथिलसिलिल) प्रोपियोनिक -2,2,3,3-डी4 एसिड सोडियम नमक (टीएमएसपी-एनए) पर 50 एमएम सोडियम फॉस्फेट बफर में 1 एमएम यौगिक से युक्त नमूने का उपयोग करें।
      3. ट्रिपल रेजोनेंस 5 मिमी टीसीआई क्रायोजेनिक जांच और एचटी नमूना परिवर्तक से लैस 600 मेगाहर्ट्ज एनएमआर स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग करके 298 K या 293K पर एनएमआर स्पेक्ट्रा एकत्र करें, जो एक बार में 579 नमूनों को संभाल सकता है।
      4. सीएमसी-क्यू सॉफ्टवेयर स्थापित करने के लिए उपयोगकर्ता मैनुअल के निर्देशों का पालन करें, जो एक आइकन एनएमआर उपयोगकर्ता के निर्माण, फास्टलेनएनएमआर के सक्रियण और एचटी नमूना परिवर्तक को बदलने को लागू करता है।
      5. 90 ° पल्स को कैलिब्रेट करें और इसे टॉपस्पिन प्रोसोल टेबल में सहेजें।
      6. एचटी नमूना परिवर्तक में 5 रैक पदों में से एक में 96 नमूना वेल प्लेट रखें।
      7. एक एसडीएफ फ़ाइल (संरचना डेटा फ़ाइल) लोड करने के लिए जिसमें इसकी प्रस्तावित रासायनिक संरचना, एक अद्वितीय पहचानकर्ता और बैच में प्रत्येक नमूने के एचटी नमूना परिवर्तक में स्थिति होनी चाहिए, सीएमसी-क्यू सेटअप विंडो में ब्राउज़ करें पर जाएं और .sdf में समाप्त होने वाली फ़ाइल का चयन करने के बाद खोलें पर क्लिक करें।
      8. CMC.q बैच स्वचालन सेटिंग्स में, सत्यापन प्रकार सेट करें जो उस प्रयोग को परिभाषित करता है जिसे मापा जाएगा, आइकनएनएमआर उपयोगकर्ता और विलायक को परिभाषित करें।
      9. SDF फ़ाइल, अणु ID और नमूना स्थिति के लिए पथ के लिए SDF फ़ाइलें निर्धारित करें।
      10. प्रारंभ पर क्लिक करके अधिग्रहण प्रारंभ करें. फिर से अधिग्रहण प्रारंभ करें पर क्लिक करें. सीएमसी-क्यू सेटअप को सेव पर क्लिक करके भी सेव किया जा सकता है।
      11. CMC-q सेटअप चरणों के विस्तार से वर्णन के लिए, Bruker से उपयोगकर्ता मैनुअल निर्देशों का पालन करें।
   2. सीएमसी-ए
      1. सीएमसी-ए के लिए, टॉपस्पिन के भीतर सॉफ्टवेयर मॉड्यूल का उपयोग करें जो छोटे^{कार्बनिक अणुओं से} प्राप्त 1 एच-एनएमआर स्पेक्ट्रम का उपयोग करके संरचना सत्यापन सहित विश्लेषण को सक्षम बनाता है।
2. मिश्रण डिजाइन
   नोट: एक उचित मिश्रण डिजाइन एक मंच के रूप में एनएमआर का उपयोग करके स्क्रीनिंग के लिए एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। प्रति मिश्रण टुकड़ों की एक उच्च संख्या तेजी से स्क्रीनिंग की अनुमति देती है लेकिन झूठे सकारात्मक और नकारात्मक के जोखिम को बढ़ाती है। एक कम संख्या उस जोखिम को कम करती है लेकिन स्क्रीनिंग आयोजित करने में लगने वाले समय को बढ़ाती है। सामान्य तौर पर, मिश्रण बनाते समय सिग्नल ओवरलैप से बचना पड़ता है। इन-हाउस लाइब्रेरी का उपयोग करके, इसे ¹एच स्क्रीनिंग के लिए उपेक्षित किया जा सकता है क्योंकि लाइब्रेरी को विशेष रूप से विविध होने और उच्च रासायनिक विविधता को बनाए रखते हुए थोड़ा सिग्नल ओवरलैप दिखाने के लिए डिज़ाइन किया गया था। बदले में इसका मतलब है कि 64 मिश्रण बनाने के लिए कोई विशेष डिजाइन प्रक्रिया नहीं होनी चाहिए।
   1. चूंकि ¹⁹एफ स्क्रीनिंग इन-हाउस लाइब्रेरी के टुकड़ों पर निर्भर करती है जिसमें फ्लोरीन होता है और लाइब्रेरी को इन विशिष्ट टुकड़ों के लिए सिग्नल ओवरलैप को कम करने के लिए नहीं बनाया गया था, इसलिए एक उचित मिश्रण डिजाइन करें।
   2. ¹⁹एफ वाले सभी टुकड़ों के लिए एकल यौगिक स्पेक्ट्रा को मापें।
   3. प्रत्येक सिग्नल की रासायनिक बदलाव की जानकारी पर ध्यान दें।
   4. इस जानकारी के अनुसार, प्रति मिश्रण 20-21 टुकड़े चुनें। यह बदले में 5 मिश्रण देता है जिसमें प्रत्येक में 20-21 टुकड़े होते हैं जिनमें कोई सिग्नल ओवरलैप नहीं होता है और डेटा के अर्ध-स्वचालित विश्लेषण की अनुमति देता है।
3. लिगैंड देखे गए बायोमैक्रोमोलेक्यूल-लिगैंड इंटरैक्शन के भीतर हिट पहचान करें।
   नोट: ¹⁹एफ और ¹एच स्क्रीनिंग प्रक्रिया के बीच हिट की अलग-अलग परिभाषाएं हैं। निम्नलिखित हिट पहचान हमारे द्वारा स्थापित किए गए थे और विशिष्ट नियमों का पालन करते हैं। हिट निर्धारण का विषय एक बहुत ही व्यक्तिपरक तरीका है और उपयोगकर्ता से उपयोगकर्ता में भिन्न हो सकता है। फिर भी, यह अत्यंत महत्वपूर्ण है कि मान्यता और विश्वसनीयता बनाए रखने के लिए एक बार सहमत होने के बाद हिट पहचान के नियम नहीं बदलते हैं।
   1. ¹एच स्क्रीन
      1. हिट ्स को आत्मविश्वास से निर्धारित करने के लिए, बाइंडर्स की पहचान करने के लिए लक्ष्य की उपस्थिति और अनुपस्थिति दोनों में 1 डी ¹एच स्पेक्ट्रा, वाटरलॉग्सवाई और टी₂ विश्राम प्रयोग ों का अधिग्रहण करें। सभी तीन प्रयोगों में एक बाध्यकारी घटना दिखाने की क्षमता है। यदि रिक्त स्पेक्ट्रा की तुलना में नमूना स्पेक्ट्रा में 6 हर्ट्ज से अधिक का सीएसपी दिखाई देता है, तो इसे हिट के लिए एक संकेत माना जाता है। ऐसा ही होता है अगर वाटरलॉग्सी में एक मजबूत सकारात्मक संकेत के साथ-साथ नमूना स्पेक्ट्रा में 30% से अधिक टी₂ की कमी दिखाई देती है। बाइंडिंग घटनाओं को सभी तीन प्रयोगों में प्रदर्शित किया जा सकता है, जब स्पेक्ट्रा युक्त नमूने की तुलना उनके संबंधित रिक्त स्पेक्ट्रा के साथ की जाती है। हालाँकि, बाध्यकारी घटनाएँ सभी तीन प्रयोगों में दिखाई नहीं दे सकती हैं। इस वजह से यह सहमति हुई कि एक टुकड़े को बाध्यकारी हिट के रूप में वर्गीकृत करने के लिए पहले वर्णित घटनाओं में से कम से कम दो होनी चाहिए।
      2. टुकड़ों की स्थिति को बाध्यकारी, अस्पष्ट, अज्ञात, समुच्चय और गैर-बाध्यकारी में परिभाषित करने के लिए टॉपस्पिन में एफबीएस टूल का उपयोग करें।
      3. एक मिश्रण के साथ समाप्त होने पर, इसे एफबीएस टूल के भीतर अनुमोदित करें।
      4. एफबीएस प्रोजेक्ट के भीतर सारांश टैब में, स्क्रीनिंग रिपोर्ट बनाएं पर क्लिक करें। यह एक विंडो खोलेगा जो एक .xlsx फ़ाइल बनाता है। उपयोगकर्ता तब सभी लिगेंड, बाइंडिंग लिगैंड, केवल बाइंडिंग लिगैंड और स्प्रेडशीट में रिपोर्ट किए जाने वाले अस्पष्ट लिगैंड के बीच चयन करने का विकल्प चुन सकता है।
   2. ¹⁹एफ स्क्रीन
      1. नॉन-बाइंडर, वीक-बाइंडर और स्ट्रॉन्ग-बाइंडर के बीच अंतर करने के लिए, 200 एमएस लक्ष्य माप और 200 एमएस रिक्त माप के बीच एकीकरण भागफल को 0 एमएस लक्ष्य माप के भागफल से विभाजित करें और 0 एमएस रिक्त माप का उपयोग किया जाता है:
         
         नोट: यह 0 से ~ 1 (हिट-स्कोर) तक के मान देता है, जिससे प्रत्येक बाध्यकारी स्थिति के लिए थ्रेसहोल्ड असाइन करना संभव हो जाता है।
      2. संदर्भ 200 एमएस माप के औसत का उपयोग बेसलाइन सीमा के रूप में करें, उन मामलों को चिह्नित करने के लिए जहां हिट-स्कोर 1 से अधिक है। यह तब हो सकता है, जब आयातित इंटीग्रल में नकारात्मक मान होते हैं या संदर्भ माप लक्ष्य माप से अधिक होता है। 0.67 ≤ का हिट-स्कोर कमजोर-हिट माना जाता है, < 0.33 एक मजबूत हिट और 0.67 > कुछ भी नो-हिट माना जाता है। एक उदाहरण चित्र 2 में दिखाया गया है।

चित्रा 2: ¹⁹एफ स्क्रीनिंग के लिए हिट पहचान। एक अनुकरणीय यौगिक के ¹⁹एफ सीपीएमजी एनएमआर स्पेक्ट्रा का खंड। यह सचित्र प्रतिनिधित्व एक बाइंडर के गुणों की व्याख्या करता है। ¹⁹आरएनए की उपस्थिति और अनुपस्थिति में मिश्रण के नमूनों से प्राप्त एक यौगिक का एफ-सीपीएमजी स्पेक्ट्रा। मूल्य संबंधित शिखर के आदर्श अभिन्न मूल्यों का प्रतिनिधित्व करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

4. डेटा विश्लेषण
   1. विश्लेषण के लिए डेटा तैयार करें
      नोट: यह महत्वपूर्ण है कि अधिग्रहित डेटा में कोई दिखाई देने वाली खामियां नहीं हैं। इसका मतलब यह है कि डेटा जहां शिमिंग समस्याग्रस्त था, या पानी का दमन अपर्याप्त था, विश्लेषण के लिए विचार नहीं किया जाना चाहिए। इसके बजाय डेटा को फिर से रिकॉर्ड करने और यह सुनिश्चित करने की सिफारिश की जाती है कि नमूने के साथ सब कुछ ठीक है (जैसे, हवा के बुलबुले नहीं), तापमान, शिमिंग और पानी के दमन के साथ। डीएमएसओ संकेतों की तुलना करते समय डेटा शुद्धता का हमेशा आकलन किया जा सकता है।
   2. ¹एच स्क्रीनिंग;
      1. ¹H स्क्रीनिंग डेटा का विश्लेषण करने के लिए, TopSpin 4.0.9 में FBS उपकरण (अतिरिक्त लाइसेंस की आवश्यकता है) का उपयोग करें।
      2. डेटा विश्लेषण के साथ प्रारंभ करने के लिए FBS उपकरण मैनुअल में दिए गए निर्देशों का पालन करें। निम्नलिखित चरण मैनुअल में रिपोर्ट की गई प्रक्रिया को संक्षेप में प्रस्तुत करते हैं।
      3. स्क्रीनिंग अभियानों से बीएमआरजेड एनएमआर डेटा को स्टोर करें जैसे कि प्रत्येक अलग-अलग स्क्रीनिंग मिश्रण की अपनी निर्देशिका होती है जिसमें एक उपनिर्देशिका नमूने पर मापा गया विभिन्न प्रयोगों को रखती है।
      4. एफबीएस टूल का उपयोग करने के लिए, संदर्भ स्पेक्ट्रा को स्टोर करें जिसमें बायोमोलेक्यूलर लक्ष्य के बिना नमूनों से सहेजे गए सभी डेटा हैं, लेकिन मिश्रण के साथ-साथ विभिन्न / एनएमआर निर्देशिकाओं में मापा गया एकल यौगिक भी है। यह महत्वपूर्ण है क्योंकि एफबीएस टूल प्रत्येक के निर्देशिका पथ को व्यक्तिगत रूप से पूछेगा।
         नोट: एफबीएस उपकरण एक निर्देशिका को स्क्रीनिंग प्रोजेक्ट के रूप में पहचान लेगा यदि निम्नलिखित डेटासेट उसी निर्देशिका में संग्रहीत किए गए थे जहां स्क्रीनिंग नमूने के मिश्रण संग्रहीत हैं (सीएसवी, फ्रैग्मेंटस्क्रीन एक्सएमएल दस्तावेज़ और बीएके फ़ाइल)।
      5. TopSpin 4.0.9 का उपयोग करते समय, अधिग्रहित डेटा, तथाकथित DIR वाली निर्देशिका के लिए एक सीधा पथ बनाएँ। / nmr निर्देशिका चुनें जिसमें सभी मिश्रणों में एक अलग निर्देशिका होनी चाहिए।
      6. स्क्रीन किए गए नमूने के एफबीएस टूल को शुरू करने के लिए, प्रतीक एफबीएस प्रोजेक्ट को टॉपस्पिन विंडो के बीच में खींचें। चुनी हुई निर्देशिका में एफबीएस प्रोजेक्ट प्रतीक दिखाई देना चाहिए यदि पहले कहा गया डेटासेट इसमें कॉपी किया गया था।
      7. पहली बार एक नया एफबीएस प्रोजेक्ट लोड करते समय विंडो फ्रैग्मेंट आधारित स्क्रीनिंग विकल्प स्वचालित रूप से खुलना चाहिए। इस विंडो में कॉकटेल फ़ाइल चुनें. कॉकटेल फ़ाइल एक सीएसवी फ़ाइल है जिसमें मिश्रणों के नाम, प्रत्येक टुकड़े का नाम और मिश्रणों में उनका विभाजन होता है। एक संदर्भ लिगैंड स्पेक्ट्रा फ़ोल्डर को भी परिभाषित करें जिसमें एकल टुकड़ों के सभी मापा स्पेक्ट्रा हैं। अंत में, एक संदर्भ रिक्त प्रयोग फ़ोल्डर को परिभाषित करें, जो आमतौर पर जांच किए गए लक्ष्य के बिना मिश्रणों के डेटासेट वाला फ़ोल्डर होता है।
      8. फ्रैग्मेंट बेस्ड स्क्रीनिंग ऑप्शंस में स्पेक्ट्रा टाइप ्स नामक एक टैब होता है जो जांच किए गए स्पेक्ट्रा के साथ-साथ स्पेक्ट्रा को प्रदर्शित करने के लिए रंग को परिभाषित करने देता है। पहले से संसाधित डेटा के अनुसार स्पेकटाइप सेट करें। प्रदर्शन लेआउट टैब में, स्पेक्ट्रा को परिभाषित करें जिसे उनके स्पेकटाइप के अनुसार एक दूसरे के साथ तुलना की जाएगी।
      9. FBS प्रोजेक्ट को प्रारंभ करने के लिए OK दबाएँ ।
      10. डेटा को देखते समय, एक अलग विंडो खुल जाएगी, जिसमें सभी कॉकटेल मिक्स और एक टेबल में प्रत्येक मिश्रण के सभी लिगेंड को सारांशित किया जाएगा। एक सेल पर डबल क्लिक करके, संबंधित डेटासेट खुल जाएगा, उदाहरण के लिए लक्ष्य वाले डेटासेट के साथ 1 एच ¹डी ब्लैंक स्पेक्ट्रा की तुलना करें।
      11. बाइंडर्स असाइन करने से पहले सुनिश्चित करें कि संदर्भ चोटियां (सभी मापों के डीएमएसओ के साथ-साथ एकल यौगिक) एक दूसरे के साथ मेल खाती हैं और एक ही रासायनिक बदलाव है। यदि मतभेद देखे जाते हैं, तो टॉपस्पिन से सीरियल प्रोसेसिंग विकल्प का उपयोग करके उन्हें सही करें।
      12. सीरियल प्रोसेसिंग विकल्प उन्नत के तहत प्रक्रिया टैब के तहत है। यह डेटासेट से सभी चयनित स्पेक्ट्रा पर परिवर्तन लागू करता है। इस तरह, स्पेकटाइप्स को आसानी से प्रयोग संख्याओं को सौंपा जा सकता है और संदर्भ के साथ संरेखित करने के लिए सभी स्पेक्ट्रा को एक बार में स्थानांतरित किया जा सकता है।
   3. ¹⁹एफ स्क्रीनिंग।
      1. ¹⁹एफ मिश्रण के पहले विश्लेषण के लिए, प्रत्येक मिश्रण के लिए एक एकीकरण फ़ाइल बनाएं। एकीकरण क्षेत्र को परिभाषित करने के लिए, विश्लेषण टैब में एकीकृत फ़ंक्शन पर क्लिक करें। सुनिश्चित करें कि मिश्रण में प्रत्येक टुकड़े के लिए संबंधित ¹⁹एफ-सिंघल के लिए एक स्पष्ट एकीकरण क्षेत्र परिभाषित किया गया है।
      2. भविष्य के उपयोग के लिए एकीकरण-फ़ाइल निर्यात करने के लिए सहेजें/निर्यात एकीकरण क्षेत्र बटन का उपयोग करें. C:\Bruker\TopSpin4.0.9\exp\stan\nmr\lists\intrng, या TopSpin स्थापना निर्देशिका के संगत पथ में किसी भी उपयोग किए गए एकीकरण-फ़ाइलों को सहेजें.
      3. ¹⁹एफ डेटा के लिए, जांच किए गए लक्ष्य के साथ या उसके बिना एक डेटासेट खोलें।
      4. वर्तमान स्पेक्ट्रम में एकीकरण-फ़ाइल लोड करने के लिए, फिर से विश्लेषण करें टैब खोलें, एकीकृत करें पर जाएं और पढ़ें / आयात एकीकरण क्षेत्र बटन का उपयोग करके, संबंधित एकीकरण-फ़ाइल लोड करें। यह उस फ़ाइल के किसी भी परिभाषित क्षेत्रों को वर्तमान स्पेक्ट्रम में लोड करेगा।
      5. इंटीग्रल्स टैब में सभी एकीकृत क्षेत्रों की सूची खोजने के लिए सहेजें और वापस लौटें। इसे स्प्रेडशीट या डेटा के आगे के विश्लेषण के लिए उपयोग किए जाने वाले किसी अन्य उपकरण में कॉपी करें।
      6. लक्ष्य के साथ और बिना हर मिश्रण के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएं।
   4. डेटा प्रबंधन
      1. उपयोग और उत्पादकता में आसानी के लिए, अधिग्रहित डेटा के आगे के विश्लेषण और भंडारण के लिए एक समान कार्य-प्रवाह स्थापित करें। ¹एच और ¹⁹एफ स्क्रीनिंग दोनों के लिए, प्रत्येक के लिए विशेष रूप से डिज़ाइन की गई स्प्रेडशीट का उपयोग करें।
         नोट: ¹एच स्क्रीनिंग के लिए यह विशुद्ध रूप से डेटा प्रबंधन के लिए और प्रत्येक लक्ष्य को संक्षेप में प्रस्तुत करने के लिए उपयोग किया गया था, जबकि ¹⁹एफ स्क्रीनिंग के लिए इसने अध्याय 4.3 में समझाया गया भागफल का उपयोग प्रत्येक टुकड़े को स्वचालित रूप से हिट / नो हिट के रूप में लेबल करने के लिए किया था। यह विश्लेषण के दौरान मानव त्रुटि के जोखिम को कम करता है, यह मानते हुए कि फ़ाइल ठीक से स्थापित की गई थी, और जानकारी साझा करना आसान बनाता है, क्योंकि सभी महत्वपूर्ण जानकारी एक फ़ाइल में एक स्थान पर एकत्र की जाती है जिसे डेटा पर प्रारंभिक नज़र डालने के लिए आगे के कार्यक्रमों की आवश्यकता के बिना लगभग किसी के द्वारा खोला जा सकता है।

Representative Results

टुकड़ा पुस्तकालय का गुणवत्ता नियंत्रण
इन-हाउस लाइब्रेरी के टुकड़ों को 90% डी 6-डीएमएसओ और 10% डी 2 ओ में 50 एमएम स्टॉक समाधान के रूप में वितरित कियागया था (डी₂ओ का 10% बार-बार फ्रीज-पिघलने चक्र¹⁴ के कारण यौगिक गिरावट को कम करना सुनिश्चित करता है)। एकल यौगिक नमूनों में 50 एमएम फॉस्फेट बफर (25 एमएम केपीआई पीएच 6.2 + 50 एमएम केसीएल + 5 एमएम एमजीसीएल 2), पीएच 6.0 में 90% एच 2 ओ / 9% डी ₂ओ / 1% डी 6-डीएमएसओ में 1 एमएम लिगैंड शामिल था। ¹आईनेक्स्ट लाइब्रेरी से टुकड़ों के एच-एनएमआर प्रयोगों को 500/600 मेगाहर्ट्ज एनएमआर स्पेक्ट्रोमीटर पर मापा गया था। इस डेटा का उपयोग सीएमसी-क्यू सॉफ्टवेयर का उपयोग करके ¹एच स्क्रीनिंग अभियानों में एकल यौगिकों की पहचान करने के लिए किया गया था, जो उपयोगकर्ता को स्वचालित तरीके से स्पेक्ट्रा को पूरी तरह से प्राप्त करने की अनुमति देता है और विश्लेषण ऐडऑन सीएमसी-ए टुकड़ों की गुणवत्ता (घुलनशीलता और अखंडता) का आकलन किया गया था। सीएमसी-ए से स्वचालित विश्लेषण के परिणामों को चित्र 3 में दर्शाए गए ग्राफिकल आउटपुट के समान एक ग्राफिकल आउटपुट के रूप में दिखाया गया है। ग्राफिकल आउटपुट 96-वेल प्लेट का प्रतिनिधित्व दिखाता है। एक लाल रंग के सर्कल का मतलब है कि यह टुकड़ा संरचना या एकाग्रता में असंगति दिखाता है। हरे रंग के कुएं इंगित करते हैं कि टुकड़ा सुसंगत है।

चित्रा 3: टुकड़ा पुस्तकालय का गुणवत्ता नियंत्रण। सीएमसी-ए आधारित स्वचालित आउटपुट का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। एकाग्रता और संरचनात्मक अखंडता जैसे टुकड़े गुणों का आकलन किया जाता है। हरा रंग लगातार के लिए खड़ा है, इस मामले में नारंगी असंगत के लिए खड़ा है। दिखाए गए वर्कफ़्लो के बाद असंगत टुकड़े मैन्युअल रूप से संशोधित किए जाते हैं. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

डीएमएसओ और बफर दोनों में लगभग 65% और 35% टुकड़ों को क्रमशः सुसंगत और असंगत के रूप में वर्गीकृत किया गया था। इसके अलावा, स्पेक्ट्रा⁹ के सावधानीपूर्वक मैनुअल निरीक्षण के बाद असंगत वर्गीकृत लिगेंड का 30% सुसंगत हो गया।

¹⁹एफ मिश्रण डिजाइन
इन-हाउस लाइब्रेरी से एक या कई फ्लोरीन समूहों वाले 103 टुकड़ों को 5 मिश्रणों (ए, बी, सी, डी, ई) में विभाजित किया गया था। प्रत्येक मिश्रण में 20 से 21 टुकड़े होते हैं। इस मामले में सिग्नल ओवरलैप से बचने के लिए मिश्रण को सावधानीपूर्वक डिजाइन किया जाना था। ¹⁹सीपीएमजी पल्स ट्रेनों को लागू करने वाले प्रत्येक मिश्रण के लिए एफ अनुप्रस्थ विश्राम प्रयोगों को मापा गया था। इन प्रयोगों को विश्राम देरी को बदलकर संशोधित किया जा सकता है। मिश्रण ए-ई के ¹⁹एफ रासायनिक बदलाव को चित्र 4 में देखा जा सकता है।

चित्रा 4: इन-हाउस लाइब्रेरी से मिश्रण के नमूनों का ¹⁹एफ 1 डी-एनएमआर स्पेक्ट्रा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

नमूना तैयार करना
¹⁹एफ स्क्रीनिंग प्रक्रिया में नमूना तैयारी या तो मैन्युअल रूप से या एक पाइपिंग रोबोट का उपयोग करके स्वचालित पाइपिंग के साथ की गई थी। प्रत्येक मिश्रण के टुकड़ों में 90% डी 6-डीएमएसओ और 10% डी 2 ओ में_2.5एमएम की एकाग्रता थी। एक स्क्रीनिंग नमूने की अंतिम मात्रा लॉकिंग एजेंट के रूप में 5% डी₂ओ के साथ 170 μL थी। प्रत्येक मिश्रण को दो बार पाइप किया गया था, एक बफर युक्त समाधान (लक्ष्य के बिना) में और एक बफर समाधान वाले लक्ष्य में। लक्ष्य और टुकड़े का अनुपात 1: 1 पर सेट किया गया था, जिसके परिणामस्वरूप 50 μM का अंतिम लक्ष्य / लिगैंड एकाग्रता थी। इसके अतिरिक्त नियंत्रण नमूने लक्ष्य अखंडता सुनिश्चित करने के लिए मिश्रण के बिना स्क्रीनिंग बफर में लक्ष्य बायोमोलेक्यूल हैं और साथ ही बफर गुणवत्ता सुनिश्चित करने के लिए केवल बफर और डी₂ओ के साथ एक नियंत्रण नमूना है।

¹⁹एफ -1 डी और ¹⁹एफ-सीपीएमजी-टी₂ के एनएमआर स्क्रीनिंग डेटा को खंड 3.1 में वर्णित माप के रूप में मापा गया था। उदाहरण के लिए, आरएनए के मामले में बफर में एकल लक्ष्य नमूने के लिए एक जंप-रिटर्न इको अनुक्रम (पीपी = zggpjrse, ¹⁵) का अधिग्रहण किया गया था।

डेटा विश्लेषण
¹⁹एफ स्क्रीनिंग प्रक्रिया को ई कोलाई से टीपीपी राइबोस्विच थिएम और एम तपेदिक से प्रोटीन टायरोसिन किनेज (पीटीकेए) पर लागू किया गया था। ¹⁹एफ स्क्रीनिंग लाइब्रेरी में 103 टुकड़े हैं जिन्हें मिक्स ए से ई तक लेबल किए गए 5 मिक्स में विभाजित किया गया है। स्क्रीनिंग नमूने की तैयारी नमूना पाइपिंग रोबोट के उपयोग के बिना मैन्युअल रूप से की जा सकती है। मिश्रण से 3.2 μL युक्त समाधान (बफर स्थिति) युक्त 40 μM thiM RNA को मिलाया गया था। आगे के नियंत्रण नमूने तैयार किए गए थे जिसमें केवल बफर, डीएमएसओ के 5% के साथ बफर (पहले वांछित डीएमएसओ एकाग्रता की उपस्थिति में बायोमैक्रोमोलेक्यूल की स्थिरता सुनिश्चित करना) और आरएनए के साथ बफर शामिल थे। इन 13 स्क्रीनिंग नमूनों को तैयार किया गया और 3 मिमी एनएमआर-ट्यूबों में स्थानांतरित किया गया। एनएमआर ट्यूबों के बारकोड स्कैन किए जाते हैं और आरएनए की उपस्थिति और अनुपस्थिति में प्रत्येक मिश्रण, साथ ही नियंत्रण नमूने 298 K पर किए गए उपरोक्त ¹⁹F NMR प्रयोगों के अनुसार मापा गया था। सभी नमूनों के लिए अतिरिक्त रूप से मापा गया 1 एच ¹डी प्रयोगों की लाइन विस्तार और तीव्रता हानि के संदर्भ में सभी डीएमएसओ चोटियों की तुलना करके माप को पूरा करने के बाद उचित शिमिंग और पानी के दमन की निगरानी की गई। प्राप्त सीपीएमजी टी₂¹⁹एफ विश्राम स्पेक्ट्रा का प्रसंस्करण क्रमशः टॉपस्पिन में पहले से तैयार और स्वचालित मैक्रो का उपयोग करके किया गया था। प्रोटोकॉल अनुभाग में दिए गए निर्देशों का पालन करते हुए डेटा विश्लेषण किया गया था। टॉपस्पिन से प्राप्त अभिन्न डेटा (प्रोटोकॉल में निर्देशों का पालन करते हुए) का मूल्यांकन सही शर्तों और थ्रेसहोल्ड को सेट करके पूर्व-निर्मित स्प्रेडशीट या किसी भी समान प्रोग्राम का उपयोग करके जल्दी और आसानी से किया जा सकता है। जैसा कि पहले वर्णित है, थ्रेसहोल्ड बाइंडर, कमजोर बाइंडर या गैर-बाइंडर को परिभाषित करने में उपयोगी हैं। चित्रा 5 क्रमशः थिएम आरएनए और पीटीकेए के सीपीएमजी स्पेक्ट्रा के विशिष्ट परिणाम दिखाता है। कुछ मामलों में, आगे विशेषज्ञ संशोधन की आवश्यकता थी। 

चित्र 5: ^{सीपीएमजी}आधारित प्रयोगों के विभिन्न विलंब समय से प्राप्त तीव्रता परिवर्तनों को दर्शाते हुए 19 एफ सीपीएमजी एनएमआर स्पेक्ट्रा में से कटआउट। (ए) ई कोलाई से टीपीपी राइबोस्विच थिएम आरएनए पर किए गए ¹⁹एफ टुकड़े-आधारित स्क्रीनिंग में एक बाइंडर (हिट) और एक गैर-बाइंडर का प्रतिनिधित्व। (बी) एम. ट्यूबरकुलोसिस से पीटीकेए पर की गई ¹⁹एफ टुकड़ा-आधारित स्क्रीनिंग में एक बाइंडर और एक नॉन-बाइंडर का प्रतिनिधित्व। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

¹एच स्क्रीनिंग

मिश्रण डिजाइन
उपयोग की गई इन-हाउस लाइब्रेरी इतनी विविध है कि ¹एच स्क्रीनिंग उद्देश्यों के लिए कोई मिश्रण डिजाइन नहीं किया गया था। इसका मतलब है कि एक मिश्रण में मिश्रण करने के लिए यादृच्छिक रूप से 12 को चुनकर 64 मिश्रण तैयार किए गए थे।

नमूना तैयार करना
सार्स-सीओवी-2 आरएनए की ¹एच स्क्रीनिंग के लिए, नमूने तैयार करने के लिए पाइपिंग रोबोट का उपयोग करके स्वचालित पाइपिंग की गई थी। प्रत्येक मिश्रण के टुकड़ों में 90% डी 6-डीएमएसओ और 10% डी 2 ओ में_4.2एमएम की एकाग्रता थी। एक स्क्रीनिंग नमूने की अंतिम मात्रा लॉकिंग एजेंट के रूप में 5% डी₂ओ के साथ 200 μL थी। 25 एमएम केपीआई में एक अलग मिश्रण वाले 64 नमूने, पीएच 6.2 पर 50 एमएम केसीएल को लक्षित आरएनए के बिना पाइप किया गया था। क्रमशः, 64 नमूनों को लक्ष्य आरएनए के साथ पाइप किया गया था, प्रत्येक में एक अलग मिश्रण था। आरएनए: लिगैंड अनुपात 1: 20 पर सेट किया गया था, जिसके परिणामस्वरूप 10 μM की आरएनए एकाग्रता और 200 μM की लिगैंड एकाग्रता थी।

डेटा विश्लेषण
¹एच विश्लेषण के लिए, टॉपस्पिन में एफबीएस उपकरण का उपयोग किया गया था। यह निर्धारित करने के लिए कि क्या एक टुकड़ा हिट है, 1 डी रासायनिक बदलाव, वाटरलॉग्सवाई और टी₂ विश्राम प्रयोग आयोजित किए गए थे। टी₂ छूट के लिए, 30% से अधिक तीव्रता में कमी को हिट के रूप में गिना जाता था, जबकि रासायनिक बदलाव के लिए 6 हर्ट्ज से अधिक की शिफ्ट कट-ऑफ थी। वाटरलॉग्सी को एक महत्वपूर्ण संकेत परिवर्तन दिखाना पड़ा (इस मामले में नकारात्मक से सकारात्मक तक)। यदि इन तीन मानदंडों में से कोई भी दो सकारात्मक थे, तो एक टुकड़े को हिट के रूप में गिना जाता था। इसके लिए दो उदाहरण चित्र 6 में देखे जा सकते हैं।

चित्रा 6: ¹एच स्क्रीनिंग एक अनुकरणीय सार्स-सीओवी-2 आरएनए पर की गई जो हिट निर्धारण मानदंड दिखाती है। तीन अलग-अलग प्रयोगों का अधिग्रहण (1 एच टी₂ सीपीएमजी (5/100 एमएस), वाटरलॉजी, और 1 डी ¹एच)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

हिट -1 ~ 50% की टी₂ कमी और 6 हर्ट्ज ≥ सीएसपी दिखाता है। वाटरलॉग्सवाई सिग्नल में पर्याप्त परिवर्तन नहीं दिखाता है जिसे सकारात्मक के रूप में भी गिना जा सकता है। जैसा कि तीन में से दो प्रयोग सकारात्मक हैं, इस टुकड़े को हिट के रूप में गिना जाता है। हिट -2 के लिए, टी₂ ~ 80% सिग्नल तीव्रता की कमी दिखाता है और वॉटरलॉग्सवाई के लिए एक स्पष्ट संकेत परिवर्तन देखा जा सकता है। सीएसपी इस मामले में पर्याप्त नहीं है, लेकिन जैसा कि पिछले दो मानदंड सकारात्मक हैं, इसे अभी भी हिट के रूप में गिना जाता है।

Discussion

एनएमआर-आधारित टुकड़ा / दवा स्क्रीनिंग की बहुमुखी प्रतिभा। बीएमआरजेड ने अत्याधुनिक स्वचालित एनएमआर इंस्ट्रूमेंटेशन के साथ-साथ एसटीडी-एनएमआर, वाटरलॉग्सवाई और विश्राम प्रयोगों को सफलतापूर्वक लागू किया है ताकि दवा की खोज के लिए आत्मीयता शासन की एक विस्तृत श्रृंखला के भीतर टुकड़ों की पहचान की जा सके। स्थापित हार्डवेयर में एक उच्च-थ्रूपुट नमूना तैयारी रोबोट और उच्च-थ्रूपुट नमूना भंडारण, परिवर्तक और 600 मेगाहर्ट्ज स्पेक्ट्रोमीटर से जुड़े डेटा अधिग्रहण इकाई शामिल हैं। ¹एच, 19 एफ, ¹³सी और 15 एन के लिए हाल ही में खरीदी गई क्रायोजेनिक जांच प्रस्तावित माप के लिए आवश्यक संवेदनशीलता सुनिश्चित करती है और ¹⁹एफ डिटेक्शन के दौरान 1 एच (1) डिकपलिंग की अनुमति देती है। यह जांच एनएमआर कंसोल की नवीनतम पीढ़ी से जुड़ी है जो ब्रूकर से उन्नत सॉफ्टवेयर टूल का उपयोग करने की संभावना प्रदान करती है, जिसमें सीएमसी-क्यू, सीएमसी-असिस्ट, सीएमसी-एसई और एफबीएस (टॉपस्पिन में शामिल) शामिल हैं। टुकड़ा-आधारित स्क्रीनिंग (एफबीएस) उपकरण टॉपस्पिन के नवीनतम संस्करण में शामिल है और एसटीडी, वाटरलॉजी, टी₂ / टी_{1आर-विश्राम} प्रयोगों सहित उच्च-थ्रूपुट डेटा का विश्लेषण करने में मदद करता है। तरल 1 डी 1 एच नमूना संग्रह नमूना भरने वाले रोबोट का उपयोग करके स्वचालित तरीके से एनएमआर-ट्यूबों में भरा जा सकता है। आमतौर पर, 96 ट्यूबों (3 मिमी) का एक ब्लॉक लगभग दो घंटे में भर जाता है। 96-वेल-प्लेट-रैक सीधे एचटी नमूना परिवर्तक में तैनात हैं, जो ब्लॉक के बारकोड को पढ़ता है और स्वचालन सॉफ्टवेयर (आईकॉनएनएमआर) द्वारा नियंत्रित प्रयोगों के लिए एनएमआर ट्यूबों को असाइन करता है। पांच 96-वेल-प्लेट-रैक को एक ही समय में एचटी नमूना परिवर्तक में संग्रहीत और प्रोग्राम किया जा सकता है। प्रत्येक व्यक्तिगत रैक के तापमान को अलग से नियंत्रित और विनियमित किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, प्रत्येक व्यक्तिगत नमूने को माप से पहले वांछित तापमान पर पूर्व शर्त (संघनित आर्द्रता को हटाने के लिए प्रीहीटिंग और ट्यूब सुखाने) किया जा सकता है।

अनुप्रयोगों की विस्तृत श्रृंखला के लिए उपयुक्तता। इस स्वचालित एनएमआर-आधारित स्क्रीनिंग के व्यापक अनुप्रयोगों में से एक बायोमैक्रोमोलेक्यूलर लक्ष्य (डीएनए / आरएनए / प्रोटीन) के लिए बाध्यकारी नए लिगेंड की पहचान करना और विकसित करना है। इन लिगेंड में ऑर्थोस्टेरिक और एलोस्टेरिक इनहिबिटर शामिल हो सकते हैं जो आमतौर पर गैर-सहसंयोजक रूप से बंधते हैं। इसके अलावा, एनएमआर द्वारा एफबीडीडी का उपयोग आमतौर पर आशाजनक यौगिकों का चयन करने के लिए पहले कदम के रूप में किया जाता है, आवश्यकताओं को पूरा करने के लिए पर्याप्त मात्रा में बायोमोलेक्यूलर लक्ष्य की उपलब्धता है। इस उद्देश्य को दो प्रमुख कार्यों में विभाजित किया गया है।

कार्य एक निम्नलिखित कारणों से एक इन-हाउस टुकड़ा पुस्तकालय को विकसित और चिह्नित करना है: प्रारंभिक और आवधिक गुणवत्ता नियंत्रण, लक्षण वर्णन, और 1000 से अधिक टुकड़ों का परिमाणीकरण; प्रत्येक लक्ष्य के लिए अनुकूलित बफर में टुकड़ों की घुलनशीलता का निर्धारण, विशेष रूप से प्रोटीन लक्ष्यों के लिए; और विविध मचानों को समायोजित करने और अन्य मैक्रोमोलेक्यूल वर्गों की ओर विस्तार करने के लिए कई पुस्तकालयों की स्थापना। कार्य दो एनएमआर द्वारा टुकड़ा-आधारित दवा डिजाइन (एफबीडीडी) के लिए वर्कफ़्लो को एकीकृत करना है: स्वचालित 1 डी-लिगैंड अवलोकन स्क्रीनिंग (¹एच और ¹⁹एफ देखा गया); ऑर्थोस्टेरिक और एलोस्टेरिक बाइंडिंग को अलग करने के लिए स्वचालित प्रतिस्थापन परख ((प्राकृतिक) लिगैंड के साथ प्रतियोगिता प्रयोग); कई टुकड़ों के साथ स्वचालित माध्यमिक स्क्रीनिंग; स्वचालित 2 डी-प्रोटीन स्क्रीनिंग, और यूरोपीय संघ-ओपनस्क्रीन लाइब्रेरी या किसी अन्य लाइब्रेरी का उपयोग करके प्रारंभिक हिट के आसपास डेरिवेटिव के एक सेट की द्वितीयक स्क्रीनिंग; और चुने हुए लक्ष्यों के खिलाफ एफडीए-लाइब्रेरी की फिर से प्रोफाइलिंग स्क्रीनिंग।

इसके अतिरिक्त, सेल चक्र नियंत्रण और चयापचय को जोड़ने वाले नियामक तंत्र को उजागर करने के लिए विभिन्न सेल लाइनों (रोग प्रासंगिक) के मेटाबोटाइपिंग का आयोजन किया जा सकता है। डोमेन अनुकूलन (संरचनात्मक जांच (बफर, पीएच, तापमान और नमक स्क्रीनिंग के लिए स्थिरता अनुकूलन) के अनुकूलन के लिए विवो और इन विट्रो में आरएनए / डीएनए / प्रोटीन विनियमन तत्वों का कार्यात्मक लक्षण वर्णन है, और झिल्ली प्रोटीन और आंतरिक रूप से अव्यवस्थित प्रोटीन के लिए एनएमआर-आधारित टुकड़ा स्क्रीनिंग का विस्तार है, जो आम तौर पर अन्य तकनीकों के लिए दुर्गम हैं।

सीमाओं। ¹⁹एफ और ¹एच टुकड़े पुस्तकालयों के उपयोग के अपने पेशेवरों और विपक्ष हैं, जिनमें से कुछ का उल्लेख निम्नलिखित में किया जाएगा। ¹⁹एफ बनाम ¹एच माप का सबसे बड़ा लाभ वास्तविक मापने के समय और बाद के विश्लेषण दोनों की गति है, क्योंकि मिश्रण में टुकड़ों की संख्या लगभग दोगुनी होती है और कम प्रयोग किए जाने चाहिए। ¹⁹एफ स्क्रीनिंग के लिए अनुवर्ती विश्लेषण भी आसान है, क्योंकि बफर से कोई हस्तक्षेप नहीं है और इसके अतिरिक्त एक व्यापक रासायनिक बदलाव रेंज प्रदान करता है जिसमें बेहतर रूप से डिज़ाइन किए गए टुकड़े मिश्रण के लिए लगभग कोई सिग्नल ओवरलैप नहीं होता है। स्पेक्ट्रा स्वयं बहुत सरल हैं, आमतौर पर फ्लोरीन परमाणुओं की संख्या के आधार पर प्रति टुकड़ा केवल एक या दो संकेत होते हैं। इसलिए इन स्पेक्ट्रा का विश्लेषण स्वचालित किया जा सकता है, फिर से समय में कटौती की जा सकती है। यह रासायनिक विविधता की कीमत पर आता है, कम से कम इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले पुस्तकालय के लिए। चूंकि पुस्तकालय के केवल ~ 13% में 19 एफ है, लेकिन स्वाभाविक रूप से वे सभी ¹एच स्क्रीनिंग में उपयोग करने योग्य हैं, ¹⁹एफ स्क्रीनिंग टुकड़ों की विविधता कम होगी। इसे विशेष रूप से डिज़ाइन किए गए ¹⁹एफ पुस्तकालयों का उपयोग करके अधिक टुकड़ों और बड़ी रासायनिक विविधता के साथ दरकिनार किया जा सकता है। ¹⁹एफ स्क्रीनिंग के लिए एक और नुकसान प्रति टुकड़ा संकेतों की कम संख्या है। टुकड़े आम तौर पर एक से अधिक हाइड्रोजन परमाणु से बने होते हैं। इसलिए, ¹एच देखे गए स्क्रीनिंग प्रयोग बाइंडिंग का पता लगाने के लिए एक ही टुकड़े के लिए अलग-अलग संकेतों पर भरोसा कर सकते हैं। ^{यह 1}एच स्क्रीनिंग के लिए हिट की पहचान करते समय उच्च स्तर का आत्मविश्वास देता है, जबकि ¹⁹एफ स्क्रीनिंग को प्रति टुकड़े दिए गए एक या दो संकेतों पर भरोसा करना चाहिए।

आधुनिक स्वचालित एनएमआर-आधारित टुकड़ा स्क्रीनिंग इंस्ट्रूमेंटेशन, सॉफ्टवेयर और विश्लेषण विधियों और उनके प्रोटोकॉल पर एक विस्तृत विवरण प्रस्तुत किया गया है। स्थापित हार्डवेयर में एक उच्च-थ्रूपुट नमूना तैयारी रोबोट और 600 मेगाहर्ट्ज स्पेक्ट्रोमीटर से जुड़े उच्च-थ्रूपुट नमूना भंडारण, परिवर्तक और डेटा अधिग्रहण इकाई शामिल हैं। ¹एच, 19 एफ, 13 सी और ¹⁵एन के लिए हाल ही में स्थापित क्रायोजेनिक प्रोब हेड प्रस्तावित माप के लिए आवश्यक संवेदनशीलता सुनिश्चित करता है और ¹⁹एफ डिटेक्शन के दौरान 1 एच डिकपलिंग की अनुमति देता है। इसके अलावा, एनएमआर कंसोल की नवीनतम पीढ़ी अधिग्रहण और ऑन-द-फ्लाई विश्लेषण की सहायता के लिए उन्नत विश्लेषणात्मक सॉफ्टवेयर का उपयोग करने की संभावना प्रदान करती है। उपरोक्त चर्चा की गई तकनीक, वर्कफ़्लोज़ और वर्णित प्रोटोकॉल को एनएमआर द्वारा एफबीएस का पीछा करने वाले उपयोगकर्ताओं के लिए उल्लेखनीय सफलता को बढ़ावा देना चाहिए।

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bruker Avance III HD		Bruker	600 MHz NMR Spectrometer
Matrix Clear Polypropylene 2D Barcoded Open-Top Storage Tubes	3731-11 0.75ML V-BOTTOM TUBE/LATCH RACK	ThermoFisher Scientific	Barcoded Tubes
Matrix SepraSeal und DuraSeal&	4463 Cap Mat, SeptraSeal 10/CS	ThermoFisher Scientific
SampleJet		Bruker	HT Sample Changer
SamplePro Tube		Bruker	Pipetting Robot