Summary
ここでは、100 μmから数ミリメートルの範囲の固定3次元細胞培養モデルの染色および細胞内分解能イメージングを実行するための詳細で堅牢で補完的なプロトコルを提供し、それらの形態、細胞タイプの組成、および相互作用の視覚化を可能にします。
Abstract
オルガノイドやスフェロイドなどのin vitro三次元(3D)細胞培養モデルは、開発や疾患モデリング、創薬、再生医療など、多くのアプリケーションにとって貴重なツールです。これらのモデルを十分に活用するには、細胞レベルおよび細胞内レベルで研究することが重要です。ただし、このようなin vitro 3D細胞培養モデルの特性評価は技術的に困難な場合があり、効果的な分析を実行するには特定の専門知識が必要です。ここでは、この論文は、100 μmから数ミリメートルの範囲の固定in vitro 3D細胞培養モデルの染色および細胞内分解能イメージングを実行するための詳細で堅牢で補完的なプロトコルを提供します。これらのプロトコルは、起源細胞、形態、および培養条件が異なる多種多様なオルガノイドおよびスフェロイドに適用できます。3D構造収集から画像解析まで、これらのプロトコルは4〜5日以内に完了することができます。簡単に説明すると、3D構造を収集して固定し、パラフィン包埋および組織学的/免疫組織化学的染色によって処理するか、直接免疫標識して共焦点顕微鏡による光学的透明化および3D再構成(深さ200μm)のために調製することができます。
Introduction
過去数十年にわたって、幹細胞生物学とin vitro 3D培養技術の進歩は、生物学と医学の革命を告げてきました。3Dのより複雑な細胞モデルは、細胞が成長し、周囲の細胞外フレームワークと相互作用し、その構造、細胞組織と相互作用、さらには拡散特性を含む生体組織の側面を密接に再現できるため、非常に人気があります。そのため、3D細胞培養モデルは、in vitroで発生中の組織または病変組織における細胞の挙動に関する独自の洞察を提供することができます。オルガノイドとスフェロイドはどちらも数マイクロメートルからミリメートルの範囲の多細胞3D構造であり、in vitroで最も顕著な3D構造です。どちらも、(i)動物由来のヒドロゲル(基底膜抽出物、コラーゲン)、植物(アルギン酸塩/アガロース)、または化学物質から合成された、または(ii)細胞の増殖と成長を促進する細孔を含む不活性マトリックスを含む支持足場内で培養できます。
オルガノイドとスフェロイドは、細胞に依存してクラスターに自己組織化することにより、支持足場の存在なしに発達することもできます。これは、細胞の付着、表面張力および重力を阻害するための非接着材料の使用(例えば、ハンギングドロップ技術)、または血管の一定の円回転(例えば、スピナー培養)などの異なる技術に依存している。いずれの場合も、これらの技術は細胞間および細胞マトリックスの相互作用を促進し、従来の単層細胞培養の限界を克服します1。「オルガノイド」と「スフェロイド」という用語は過去に同じ意味で使用されてきましたが、これら2つの3D細胞培養モデルには重要な違いがあります。オルガノイドは、多能性幹細胞または組織特異的幹細胞に由来するin vitro3D細胞クラスターであり、細胞は自発的に前駆細胞および分化細胞型に自己組織化し、目的の器官の少なくともいくつかの機能を再現します2。スフェロイドは、非接着条件下で形成されたより広い範囲の多細胞3D構造を含み、不死化細胞株や初代細胞などの多種多様な細胞タイプから生じる可能性があります3。したがって、その固有の幹細胞起源に固有のオルガノイドは、スフェロイドよりも自己組織化、生存率、および安定性の傾向が高くなります。
それにもかかわらず、本質的に、これら2つのモデルは複数の細胞で構成される3D構造であり、それらを研究するために開発された技術は非常に似ています。例えば、オルガノイドとスフェロイドの両方の細胞の複雑さを調べるには、単一細胞分解能レベルでの強力なイメージングアプローチが必要です。本稿では、本研究グループの知見とオルガノイド分野のリーダーの知見をまとめて4、100μmから数mmの範囲のオルガノイドやスフェロイドの細胞・細胞内組成や空間構成を2次元(2D)・3Dホールマウント染色、イメージング、解析する詳細な手順について述べる。実際、この手順では、さまざまなサイズとタイプのin vitro 3D細胞培養モデルを分析するための、2つの異なる補完的なタイプの染色およびイメージング取得が提示されます。一方(3Dホールマウント解析)または他方(2D断面解析)のどちらを使用するかは、調査したモデルと求められる答えによって異なります。共焦点顕微鏡による3Dホールマウント分析は、例えば、3D構造の全体的なサイズに関係なく、深さ200μmまでの3D培養中の細胞を視覚化するために適用できますが、2Dセクションの分析は、2Dレベルではありますが、あらゆるサイズのサンプルへの洞察を提供します。この手順は、さまざまなオルガノイド4,5、およびさまざまな胚胚葉に由来するヒトおよびマウス細胞由来のスフェロイドにうまく適用されています。手順の概要を図 1 に示します。主要な段階、それらの間の関係、決定的なステップ、および予想されるタイミングが示されます。
図1:手順の概略図。In vitro 3D細胞培養モデルを収集して固定し、3Dホールマウント染色用に調製するか(オプションa)、2D切片作成および染色のためにパラフィンに包埋します(オプションb)。3Dホールマウント染色実験では、固定された3D構造は固定ステップの後に免疫標識されます。オプションの光学クリアリングステップを実行して、画像処理中の光散乱を低減することにより、光学顕微鏡のイメージング品質と深度を向上させることができます。画像は倒立共焦点顕微鏡または共焦点ハイコンテンツシステムでキャプチャされ、適切なソフトウェアを使用して分析されます。パラフィン包埋の場合、3D構造は直接処理されるか(400 μm≥大きな構造の場合はオプションb.1)、脱水およびパラフィン包埋のためにゲルに含まれます(b.2、 400 μm≤小さな構造)。次に、パラフィンブロックを切断して染色します(組織学的または免疫化学的染色)。2D切片の画像は、デジタルスライドスキャナーまたは正立顕微鏡で取得され、高速デジタル定量分析を使用して画像分析プラットフォームで分析されます。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
Protocol
注:以下の手順の試薬交換と洗浄を含むステップでは、3D構造の初期数の≤25%の損失が予想されます。定性的および定量的な画像分析を実行するために、テストされた条件ごとに、100〜500μmの範囲のサイズの少なくとも10個の3D構造の最終的な数を使用することを計画します。必要に応じて、より大きな構造の場合は、構造が壊れないように1 mLピペットチップの端を切断します。すべてのステップで、3D構造の沈降が長すぎる場合は、室温(RT)で5分間、50 × g で細胞を穏やかに回転させることができます。調査する問題に応じて、遠心分離は3D構造の形状を損なう可能性があるため、このようなスピニングステップの利点/欠点を考慮する必要があります。>100 × gでの回転は避けてください。
1. 3次元細胞培養モデルの収集と固定
注意: チューブの壁に緩く取り付けられるだけの3D構造を吸引しないように注意してください。
- マトリックスに埋め込まれた3D細胞培養モデルの収集
注:このセクションでは、マウスエンゲルブレス-ホルム-スウォーム肉腫(BME)からの基底膜抽出物の滴で成長した3D構造の回復について説明しますが、他のマトリックスに適合させることができます。ECMに関する重要なポイントについては、ディスカッションを参照してください。- 3Dマトリックスを乱すことなく、ウェルから培地を除去します。1 mLピペットチップの内側と外側をタンパク質(以下、 プレコート 1 mLチップと呼びます)の0.1%ウシ血清アルブミン(BSA)にリン酸緩衝生理食塩水(以下、 PBS-BSA0.1% 溶液と呼びます)に浸し、この溶液1 mLを上下に2回ピペッティングします。
注意: このプレコーティングは、細胞が先端に付着するのを防ぎ、損失を最小限に抑えます。 - PBS-BSA 0.1%溶液を充填し、チューブを空にすることで、遠心分離機(15 mL)チューブ(以下、プレコート遠心チューブと呼びます)の内部にタンパク質を プレコート します。
注意: これにより、細胞がチューブに付着するのを防ぎ、損失を最小限に抑えます。 - プレコートされた1 mLチップを使用して、1 mLの氷冷1x PBSを使用してウェルの3D構造を注意深く再懸濁し、3D構造を含む懸濁液をプレコート遠沈管に静かに移します。
- 氷冷した1x PBS13 mLを穏やかに加え、3D構造を氷上に少なくとも10分間沈降させます。
注:必要に応じて、4°Cで50 × g で5分間回転します。 >100 × gの回転は、3D構造の形状を損なうため、避けてください。 - 上清を取り除きます。プレコートされた1 mLチップを使用して、3D構造を1 mLの氷冷1x PBSに静かに再懸濁します。手順1.1.4〜1.1.5を繰り返して、3Dマトリックス残渣のない均質なペレットを取得します。
注:効率的なマトリックス除去は、マトリックスの種類、3D構造の数、サイズに影響され、さまざまな培養条件に合わせて最適化する必要があります。BMEで成長した3D構造の場合、マトリックス除去からの回復には通常45〜60分かかります。 - プレコートされた1 mLチップを使用して、3D構造を含む1 mL 1x PBS懸濁液をプレコートされた1.5 mL遠沈管に移し、セクション1.3に進みます。
- 3Dマトリックスを乱すことなく、ウェルから培地を除去します。1 mLピペットチップの内側と外側をタンパク質(以下、 プレコート 1 mLチップと呼びます)の0.1%ウシ血清アルブミン(BSA)にリン酸緩衝生理食塩水(以下、 PBS-BSA0.1% 溶液と呼びます)に浸し、この溶液1 mLを上下に2回ピペッティングします。
- フローティング3D細胞培養モデルの収集
- プレコートされた1 mLチップを使用して、3D構造を注意深く収集し、プレコートされた1.5 mL遠沈管に移します。3D構造を沈降させるか、RTで50 × g で5分間回転させます。
- 上清を取り除きます。プレコートされた1 mLチップを使用して、1 mLの1x PBSで3D構造を再懸濁します。セクション1.3に進みます。
- 3D細胞培養モデルの固定
- 3D構造物を堆積させます。上清を慎重に取り除きます。ドラフトフードの下で、プレコートされた1 mLチップを使用して、3D構造を1 mLのホルマリンに静かに再懸濁します。
注:ホルマリンには危険なホルムアルデヒドが含まれています。化学フードで化学物質を操作します。ゴム手袋と安全アイゴーグルを着用してください。 - 3D構造をRTで30分間インキュベートします。
注:ホルマリンによる30分の固定ステップは、広範囲の3D構造(サイズ、形状、および起源が異なる)の免疫染色に必要です。ただし、一般に、より長い固定時間(>3時間)は、レポータータンパク質の蛍光を保存するのに適しています。 - 3D構造を沈降させるか、RTで50 × g で5分間回転させます。 ホルマリンを静かに除去し、1 mLの1x PBSと交換します。この洗浄ステップを1x PBSで2回繰り返します。サンプルを4°Cで保存し、セクション2またはセクション3に進みます。
注:プロトコルはここで一時停止することができ、細胞は長期保存(>1年)のために4°Cに維持することができます。
- 3D構造物を堆積させます。上清を慎重に取り除きます。ドラフトフードの下で、プレコートされた1 mLチップを使用して、3D構造を1 mLのホルマリンに静かに再懸濁します。
2.3D 3D細胞培養モデルのホールマウント染色、イメージング、解析
注:オルガノイドはチューブ壁に緩く付着しているため、試薬の変更後にサンプルが失われる可能性があるため、オルガノイドは穏やかに取り扱ってください。開始する前に、染色のための正しいコントロールが利用可能であることを確認してください。ポジティブコントロールおよびネガティブコントロールは、目的のタンパク質がそれぞれ過剰発現または存在しないことが知られている細胞であり得る。一次抗体を含まないサンプルをインキュベートして、観察されたシグナルが二次抗体の非特異的結合によるものであるかどうかを判断します。一部の細胞は高レベルの自己蛍光を示す傾向があるため、二次抗体を含まないコントロールを使用して、観察された蛍光がバックグラウンドの自家蛍光に由来するかどうかを判断します。免疫標識と蛍光レポーターの可視化を組み合わせることができます。
- 3Dホールマウント染色
- 1x PBSに0.1%〜1%の非イオン性界面活性剤( 材料の表を参照)、1%ジメチルスルホキシド、1%BSA、および1%のロバ血清(または二次抗体を産生させた動物から)を補充することにより、透過処理遮断(PB)溶液を調製します。
注:ターゲットの局在に応じて、非イオン性界面活性剤の濃度を慎重に最適化します:膜(0-0.5%)、細胞質(0.5-1%)、および核(1%)。この溶液は、4°Cで最大1ヶ月間保存できます。BSAは通常、ブロッキングステップに適していますが、バックグラウンドノイズが高い場合は、経験的テストを実行して、抗体の特定の組み合わせに対して可能な限り最良の結果を取得します。 - プレコートされた1 mLチップを使用して、オルガノイドを1.5 mL遠沈管から0.5 mLチューブに移します。オルガノイドを沈降させ、1x PBSを静かに除去し、0.5 mLのPB溶液と交換します。オルガノイドを穏やかな水平攪拌(30〜50 rpm)でRTで1時間インキュベートします。
- オルガノイドを沈降させ、PB溶液を穏やかに除去し、1 mL PBS-BSA 0.1%で3分間2回洗浄します。
注意: 3分間待つと、構造がチューブの底に沈殿する可能性があります。 - PBS-BSAを0.1%穏やかに除去し、適切な濃度に希釈した一次抗体250 μLをPB:1x PBS(1:10)溶液に加えます。10 mL の PB:1x PBS (1:10) 溶液を調製するには、1 mL の PB 溶液を 9 mL の 1x PBS で希釈します。4°Cで穏やかな水平攪拌(30〜50 rpm)で2〜3日間インキュベートします。
注:3D構造は大きなサイズに達することがあるため、適切な抗体のインキュベーション時間は適切な抗体の浸透に不可欠です。 - オルガノイドを沈降させ、一次抗体溶液を穏やかに除去します。PBS-BSA 0.1%で5回洗浄し、1回の洗浄で3分間洗浄し、次に1 mL PBS-BSAで2回、洗浄ごとに15分間、穏やかな水平攪拌を行います。
- PB:1x PBS(1:10)溶液中で1:250で希釈した二次抗体250 μLを追加します。穏やかな水平攪拌(30-50 rpm)で4°Cで24時間インキュベートします。このステップでは、サンプルを光から保護します。
- PB:1x PBS(1:10)溶液で1:1000に希釈した250 μLのHoechst 33342(20 μMストック溶液)を加え、穏やかな水平攪拌(30-50 rpm)で4°Cでさらに2時間インキュベートします。
- オルガノイドを沈降させ、二次抗体+ Hoechst 33342を含む溶液を静かに除去します。オルガノイドを1 mLの1 mLの1x PBSで3分間洗浄し、次に1 mLの1x PBSで2回、1回の洗浄で15分間、穏やかな水平攪拌(30〜50 rpm)で洗浄します。
注意: バックグラウンドノイズや信号の損失を避けるために、サンプルを広範囲に洗浄することが重要です。 - 画像取得までサンプルを4°CでPBSに保存します。セクション2.2に進みます。
注:プロトコルはここで一時停止することができ、サンプルは光から保護されて4°Cで数ヶ月間保存することができます。
- 1x PBSに0.1%〜1%の非イオン性界面活性剤( 材料の表を参照)、1%ジメチルスルホキシド、1%BSA、および1%のロバ血清(または二次抗体を産生させた動物から)を補充することにより、透過処理遮断(PB)溶液を調製します。
- 共焦点イメージングのためのサンプル調製
- プレコートされた1 mLチップを使用して、96ウェルの黒色ポリスチレンマイクロプレートでウェルあたり50 μLの1x PBSにオルガノイドを注意深く移します。手順 2.2.3 またはセクション 2.3 に進みます。
注:この段階では、サンプルを光から保護し、4°Cで数週間保存できます。 - 消去
注:透明化ステップはオプションであり、オルガノイドの免疫標識または内因性蛍光の検出に使用できます。クリアリングは3D構造の収縮を引き起こす可能性がありますが、大きなルーメンを持つ球状の単層オルガノイドを除いて、一般的な形態は変化しません4。これらの嚢胞性オルガノイドについては、透明化工程をスキップし、深部組織イメージングを行う6。- 50%v/vグリセロール、11%v/vの蒸留水、および45%w/vフルクトースを含む2.5Mグリセロール-フルクトース透明溶液を、溶液が完全に可溶化して均質になるまで少なくとも一晩マグネチックスターラーで混合することにより調製します。暗所で4°Cで最大1か月間保管します。
- オルガノイドに触れずに、できるだけ多くの1x PBSを除去します。末端を取り除いた後、1 mLのピペットチップを使用して200 μLの透明化溶液を加え、気泡の形成を防ぐために穏やかに再懸濁します。RTで少なくとも12時間インキュベートし、セクション3に進みます。
注:清澄液は粘性があるため、少量を扱うのは困難です。取り扱いを容易にするために、溶液がRTにあることを確認し、ゆっくりとピペットで動かします。最適な透明化のために、イメージングの前に、サンプルを透明化溶液に少なくとも24時間沈降させます。取得時に3D構造が浮いている場合は、RTで<100 × g で10分間オプションのスピンを実行するか、さらに時間(1〜数日)待って堆積させます。プロトコルは、光から保護され、4°C(数週間)または-20°C(数ヶ月間)で保存されている場合、イメージングに進む前にこのステップで一時停止できます。
- プレコートされた1 mLチップを使用して、96ウェルの黒色ポリスチレンマイクロプレートでウェルあたり50 μLの1x PBSにオルガノイドを注意深く移します。手順 2.2.3 またはセクション 2.3 に進みます。
- 画像の取得と解析
注:3D構造を画像化するには、画像セクショニング技術が必要になります。- 共焦点顕微鏡を使用し、空気と比較して開口数(NA)の高い液浸対物レンズを優先します。3D構造のサイズ、画像再構成(スティッチング)、および分析に使用するソリューションに応じて、倍率対物レンズ(10倍、20倍、40倍)を選択します。
- 取得モードを選択するときは、Zスタッキングのステップを定義するために使用される対物レンズの焦点深度を考慮してください。最適な3Dレンダリングを可能にします。
注:画像解析ソリューションはさまざまであり、使用するソフトウェアに合わせて解析を調整する必要があります。たとえば、この分析プロトコルは、ハイコンテント分析ソフトウェア(詳細については、 材料の表 と 補足図1 を参照)で確立され、3D再構成オブジェクト内のオブジェクトのセグメンテーション、プロパティの計算、および細胞集団の選択に関するデータを提供します。
3. 3D細胞培養モデルの2Dセクショニング、染色、イメージング、解析
注:3D細胞培養モデルのサイズはさまざまです。パラフィンの効率的な包埋のためにセクション3.1または3.2に進みます(図2)。洗浄や試薬交換の前に、3D構造の沈降に十分な時間を取ってください。チューブの底に浮かぶオルガノイドを吸引しないように注意してください。パラフィン包埋については、 図2 を参照してください。
- 大型(Ø ≥ 400 μm)3D細胞培養モデルのパラフィン包埋
- 包埋の前日に、パラフィン(パラフィン浴)を満たした2つの150mLフラスコ、サンプルごとに小さな金属包埋型、および細かい鉗子を65°Cに予熱した。
- プレコートされた1 mLチップを使用して、1x PBSのオルガノイドを、ポリテトラフルオロエチレンで裏打ちされたボトルキャップ付きの平底ガラスチューブに慎重に移します。オルガノイドを沈降させ、1x PBSを注意深く除去し、70%エタノールと交換します。少なくとも30分間インキュベートします。
- オルガノイドを沈降させ、70%エタノールを注意深く除去する。すぐに使用できるエオジンY溶液1mLと交換してください。チューブをフリックし、少なくとも30分間染色します。エオジン溶液を慎重に除去し、1 mLの100%エタノールで3回連続洗浄してオルガノイドをそれぞれ~30分間脱水します。
注意: 可燃性で揮発性の液体であるエタノールは、重度の眼および気道の炎症を引き起こします。ヒュームフードで操作し、保護アイゴーグルを着用してください。 - 100%エタノールを慎重に除去し、ケミカルフードの下で、1 mLのキシレンで3回連続洗浄し、それぞれ~30分間オルガノイドを除去します。
注意: キシレンは有毒な液体可燃性であり、その蒸気は刺激を引き起こす可能性があります。ヒュームフードで操作します。皮膚に直接触れないようにし、ゴム手袋と保護眼鏡を着用してください。 - 化学フードの下で、カセットのコンパートメントの1つの内側に生検パッド(以前はキシレンに浸していた)を配置して、白いマイクロツイン組織カセットを準備します。プレコートされた2 mLプラスチックパスツールピペットを使用して、3D構造を生検パッドに慎重に移します。オルガノイドが動かないようにキシレンに浸した別の生検パッドでそれらを覆い、カセットを閉じます。
- 複数のサンプルが処理される場合は、カセットをキシレン浴に入れて、さらなる処理を待ちます。すべてのサンプルをカセットに移したら、カセットを予熱したパラフィンバスに65°Cで30分間入れます。 カセットを新鮮な予熱パラフィンバスに一晩移します。
- パラフィン含浸後、予熱した埋め込み型を取り、加熱したパラフィンを加えます。3D構造を含む生検パッドを型に入れ、すべてのオルガノイドが型底に落ちるまでゆっくりと攪拌します。予熱した細かい鉗子を使用して、金型の中央に3D構造を非常に慎重に配置します。セクション3.3に進みます。
注意: 鉗子で3D構造を乱さないように注意してください。押しますが、つままないでください。
- 小型(Ø ≤ 400 μm)3D細胞培養モデルのパラフィン包埋
- 包埋の前日に、パラフィン(パラフィン浴)を満たした2つの150mLフラスコ、サンプルごとに小さな金属包埋型、および細かい鉗子を65°Cに予熱した。
- 1x PBSをオルガノイド懸濁液から慎重に取り外します。1 mLの1xトリス緩衝生理食塩水(TBS)で3回の洗浄を穏やかに行います。オルガノイドに触れずにできるだけ多くの1x TBSを除去します。
注意: サンプルを吸引しないように注意してください。必要に応じて、RTで50 x gで5分間スピンを実行します。 残りの微量のリン酸塩は、次のステップを妨げ、特にゲル重合を妨げます。したがって、処理ステップ中にPBSソリューションを使用しないでください。このステップでは、カセット、試薬#1(透明液)、および試薬#2(着色液)を含む市販のキットを使用して、小さな断片を失うことなくパラフィン包埋手順を容易にしました( 材料の表を参照)。キットの指示に従ってください。カセットは、すでに所定の位置にバッキングペーパーとボードインサートで事前に組み立てられています。 - 試薬#2を2滴チューブに加え、チューブを軽くたたいて穏やかに混ぜます。試薬#1を2滴加え、軽くたたいてもう一度混ぜてゲルを固めます。細かい鉗子を使用して、チューブからゲルを取り出し、カセットのウェルに入れます。
- ヒュームフードの下で、次のようにカセットを連続した浴に入れてサンプルを脱水します(150 mLフラスコを使用し、各浴に新鮮なエタノールまたはキシレンを使用します):エタノール70%、30分;エタノール96%、30分;エタノール100%、3回の洗浄、各30分;キシレン、3回の洗浄、各30分。
- カセットを予熱したパラフィン浴に65°Cで30分間入れ、新鮮な予熱したパラフィン浴に一晩移します。パラフィン含浸後、予熱した埋め込み型を取り、加熱したパラフィンを加えます。カセットを開き、細かい鉗子でゲルを慎重に取り除き、3D構造を含むゲルを埋め込み型の中心に置きます。セクション3.3に進みます。
- パラフィン包埋の一般的な手順
- 金型を冷たい場所にそっと移して、パラフィンを薄層に固化させ、3D構造を適切な位置に維持します。金型の上にティッシュカセットを追加し、このプラスチックカセットを覆うためにホットパラフィンを追加します。完全に固まったら金型を取り外し、セクション3.4に進みます。
注意: パラフィンブロックは室温で何年も保存できます。
- 金型を冷たい場所にそっと移して、パラフィンを薄層に固化させ、3D構造を適切な位置に維持します。金型の上にティッシュカセットを追加し、このプラスチックカセットを覆うためにホットパラフィンを追加します。完全に固まったら金型を取り外し、セクション3.4に進みます。
図2:大小のin vitro 3D細胞培養モデルのパラフィン包埋手順の概要。
(A)パラフィン包埋の標準的な手順。固定および脱水後、3D構造をエオジンで染色して視覚化を容易にします(左上と左下)。3D構造は、2 mLパスツールピペット(中央)を使用して、カセットの生検パッド(青)に注意深く配置されます。パラフィン含浸後、3D構造を鉗子を使用して流動パラフィンに穏やかに滴下し、生検パッド内で穏やかに攪拌します。小さな3D構造は、パッドから解放できないため、このステップで失われます(右下:埋め込みに失敗しました)。大きな3D構造のみが埋め込まれます(右上:埋め込みが成功)。矢印は 3D カルチャを指しています。(B)標準的なパラフィン包埋プロトコルの代替。小さな3D構造を固定した後、市販のキットを使用して細胞をゲルに維持し、パラフィン含浸後の金型への細胞の移動を容易にします(右:埋め込みに成功)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
- ブロック切片作成と染色
- 標準的なミクロトームを使用して4 μm切片を切断し、標準的な組織学的および免疫組織化学的手法を実行します。セクション3.5に進みます。
注意: セクションの接着性を高めるために、特定のスライド( 材料の表を参照)が使用されました。スライドは室温または4°Cで数年間保存できます。
- 標準的なミクロトームを使用して4 μm切片を切断し、標準的な組織学的および免疫組織化学的手法を実行します。セクション3.5に進みます。
- 画像の取得と解析
- デジタルスライドスキャナーまたは正立顕微鏡を使用してイメージングを実行し、3D構造セクション全体にわたって細胞ごとに形態学的および多重化された発現データを報告する高速デジタル定量分析のためのプラットフォームを使用してデータを解析します(詳細については 補足図2 を参照)。
注:20倍の対物レンズは、このグループによって日常的に使用されています。
- デジタルスライドスキャナーまたは正立顕微鏡を使用してイメージングを実行し、3D構造セクション全体にわたって細胞ごとに形態学的および多重化された発現データを報告する高速デジタル定量分析のためのプラットフォームを使用してデータを解析します(詳細については 補足図2 を参照)。
Representative Results
このプロトコルでは、2Dおよび3Dホールマウント染色の重要なステップの概要、および3D細胞培養モデルのイメージングおよび定量分析を提供します(図3および図4)。スフェロイドから異なる宿主種や組織のオルガノイドまで、幅広い3D細胞培養モデルに適用でき、細胞および細胞内レベルでの構造、細胞組織、相互作用に関する正確かつ定量的な情報を取得できます(図3および図4)。ラボは、独自のニーズに応じて、2D組織学的および免疫組織化学的手法と抗体濃度を最適化する必要がある場合があります。
どちらの方法も貴重な生物学的情報をもたらします。3Dホールマウント染色と共焦点顕微鏡は、最大200 μmの深さの視野で細胞組成と空間位置に関する視覚情報を提供します(図3B)。ただし、2Dセクショニングは、より大きな3D構造が3D構造のセクション全体で詳細な細胞形態学的特徴を明らかにするのに便利ですが、より大きなサンプルでは分解能を損なう光散乱のために、その場で観察することは困難です。さらに、どちらの手法も定量的データを提供できます。実際、得られた分解能により、細胞数の定量化および異なる細胞サブタイプにおける様々な細胞マーカーの存在の検出のための細胞および細胞内セグメンテーションアルゴリズムの適用が可能になる(図3Fおよび図4)。要約すると、ここで説明するイメージング技術は、再現性があり、単純で、補完的であり、細胞の不均一性を研究するための貴重なツールを表しています。
図3:3Dおよび2D光学セクションの3Dホールマウント、イメージング、および解析の代表的な結果。 (A)ヒト(h)高悪性度神経膠腫スフェロイドを1週間培養し、ヘキスト(青)、Olig2(黄色)、アクチン(赤)(20倍の水対物レンズ)で標識した共焦点画像。取得したすべての画像について、ポジティブコントロール(上)を使用して顕微鏡設定を確立し、次に、一次抗体の非存在下での蛍光の欠如を制御するために同じ設定を使用してネガティブコントロールを画像化しました(下)。(B)1週間培養した高悪性度グリオーマスフェロイドで行われたKi67染色の直交3Dホールマウント表現(グリセロール-フルクトースクリアリング;20倍水対物レンズ、共焦点)。(C)(h)高悪性度神経膠腫スフェロイドを1週間培養し、ヘキスト(青)、Olig2(黄色)、およびファロイジン-488(緑)で標識した共焦点画像(グリセロール-フルクトースクリア;20倍対水レンズ)。(D)ヒト(h)横紋筋肉腫(上)およびマウス(m)神経堤細胞(下)スフェロイドを1週間培養し、それぞれヘキスト(青)、アクチン(赤)、Ki67(緑)で標識した共焦点画像(グリセロール-フルクトースクリアリング;20倍乾燥対物レンズ)。(E)(h)高悪性度神経膠腫スフェロイドを1週間培養し、ヘキスト(青)およびKi67(緑)で標識した共焦点画像(グリセロール-フルクトース透明化;40倍水対物レンズ)(左上)。ヘキストチャネルのセグメント化された画像と緑チャネルのKi67陽性(+)核領域は、ハイコンテント分析ソフトウェアを使用して生成されました(補足図1および材料表を参照)(下)。与えられた出力は、セグメント化された3D構造あたりのKi67+核の割合です(右上)。スケールバー = 100 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:2D光学切片のイメージングと分析の代表的な結果。 (A、D)デジタルスライドスキャナーで取得した3D細胞モデル(ヒト横紋筋肉腫スフェロイドを1ヶ月間培養し、高速デジタル定量分析のためのプラットフォームで分析した2D断面画像。(A)細胞の大きさに応じたH&E染色と検出。スケールバー= 500μm。 (B)ヒストグラムは、高速デジタル定量分析(左:Halo)または手動カウント(右:MC)用のソフトウェアを使用して検出された100μm2および>100μm2<細胞の割合を示しています。(C)Ki67染色およびそれらの3,3'-ジアミノベンジジン(DAB)シグナルの強度による細胞の検出。ネガティブ(青)、弱ポジティブ(黄色)、ポジティブ(赤)。スケールバー= 500μm。 (D)ヒストグラムは、Ki67陰性、弱陽性、陽性の細胞の割合を示す。略語:H&E =ヘマトキシリンとエオジン;MC =手動カウント。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
補足図1:イメージング解析ソフトウェアの手順の概要。 分析は、ビルディングブロックの関連付けに基づいています。関数(セグメンテーション、計算、関連付け、出力定義)に対応する各ビルディングブロックは、画像化される生物学的サンプルに一致する複数のアルゴリズムと変数選択を提供します。このソフトウェアは、簡単に使用および変更できる複数のRMS(既製ソリューション)分析プロトコルを提供します。統合された画像解析プロトコルを保存したり、さまざまなデータセットに適用したり、ユーザー間で共有したりできます。簡単に言えば、分析プロトコルは、回転楕円体、核、そして最後にKi67ポケット(A488)の連続したオブジェクトセグメンテーションを意味します。次に、Ki67ポケットの平均強度を計算して、陽性イベントをさらに識別します。最後に、Ki67ポジティブポケットを含む核がポジティブに選択されます。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図2:定量分析ソフトウェアの手順ステップの概要。 ステップ1.[スタディ] タブを使用してファイルをアップロードします。ファイルは[画像アクション]セクションで開きます。ステップ2.[注釈]タブを開き、[レイヤーアクション]をクリックして、ツールバーの円ツールを使用して構造全体に新しいレイヤーを設計します。非円形構造の場合は、代わりにペンツールを使用できます。ステップ3.ツールバーを使用して、アノテーションを設計し、ツールで
定量化を視覚化できます。ステップ4.分析タブを開き、サンプルの分析に最適な条件を選択します(ここではいくつかの試行が必要になる場合があります)。ステップ 4.1.[染色の選択]セクションを使用して、染色条件を設定します。複数の汚れが発生した場合は、これらを追加して名前を変更したり、仮想色を変更したりできます。局在検出は、核染色または細胞質染色を指定することができる。ステップ 4.2.[セル検出] セクションを使用して、セル検出を設定します。このセクションは、分析にとって最も重要になります。核コントラスト閾値セクションでは、すべての核の検出が可能になります。複数の母集団サイズがある場合には注意を払う必要があり、ソフトウェアは一意の大きな細胞ではなく複数の細胞を検出できます。核サイズおよび核セグメンテーションの攻撃性のセクションは、細胞サイズの集団範囲を定量化するために使用できます。ステップ5.サンプル分析の実行方法の説明。図に示す手順に従います。[注釈レイヤー]セクションでは、このスライドでのみ設定が実行されます。定量化は、ツールを使用して視覚化できます。適切な定量が得られるまで、手順4.1〜5を繰り返します。ステップ6-6.1。これらの手順により、ソフトウェアを使用して図形を描くことができます。ステップ7。ソフトウェアで取得した定量グラフィックを保存することができます。ステップ8。データをエクスポートできます。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
Discussion
細胞培養は、組織や臓器の発生、機能、再生と破壊、および疾患に関与する基本的な生物学的メカニズムを明らかにするために不可欠なツールです。単層2D細胞培養が主流でしたが、最近の研究では、特に遺伝子発現と細胞挙動に影響を与える追加の空間組織化と細胞間接触により、in vivo細胞応答をより反映した3D構造を生成する培養にシフトしており、したがって、より多くの予測データを提供する可能性があります7。それにもかかわらず、細胞および細胞内レベルでの複雑な3D構造の詳細な顕微鏡的視覚化および評価のためのユーザーフレンドリーな染色およびイメージング技術の必要性など、多くの課題が残っています。これに関連して、100 μmから数ミリメートルのサイズの固定in vitro 3D細胞培養モデルの染色および細胞および細胞内分解能イメージングを実行するための、詳細で堅牢で補完的なプロトコルが提供されてきました。
この手順では、さまざまなサイズとタイプのin vitro 3D細胞培養モデルに対処するための2つの異なる戦略を提示します。どちら(3Dホールマウント解析)か、もう一方(2Dセクショニング解析)を選択するかは、使用するモデルと調査した問題によって異なります。共焦点顕微鏡による3Dホールマウント分析は、3D構造の全体的なサイズに関係なく、最大200μmの深さのフィールドの細胞の視覚化を可能にしますが、2Dセクショニングはあらゆるサイズのサンプルに適用できますが、視覚化は2D次元のままです。以下は、トラブルシューティングと技術的な考慮事項に関するいくつかの提案です。
ワークフロー中の3D構造の損失は、最も一般的な欠点です。チップやチューブに付着し続けることができるため、チップやチューブをPBS-BSA 0.1%溶液でプレコーティングすることが重要です。さらに、試薬交換の間に3D構造の沈殿物を発生させ、すべてのピペッティングを非常に慎重に行うことが重要です。手順で述べたように、すべてのステップで、3D構造の沈降が長すぎる場合は、細胞を50 × g でRTで5分間穏やかに回転させることができます。 研究の目的に応じて、遠心分離は3D構造の形状を損なう可能性があるため、このような紡糸ステップの長所と短所を考慮する必要があります。さらに、嚢胞性オルガノイドは崩壊する傾向があるため、固定ステップ中にこの形態を維持するように注意する必要があります。400μm以下の構造物を固定することで、構造変化を防ぐことができます。
最適な免疫標識のためには、3Dマトリックスからのオルガノイドの回収が重要なステップです。3Dマトリックスは、マトリックスへの非特異的結合のために、適切な抗体浸透を妨げたり、高いバックグラウンド染色を引き起こしたりする可能性があります。ECMの除去は、オルガノイドの外側セグメントの形態を変化させ(特に、研究された3D構造から伸びる小さな細胞突起の場合)、分析を部分的に妨げる可能性があります。このような3D構造の場合、マトリックスは手順全体を通して保持できます。ただし、溶液および抗体の不十分な浸透を防ぎ、過度のバックグラウンドノイズを低減することを目的とした連続した洗浄ステップを回避するために、培養条件は最小量のマトリックスで細胞を増殖するように注意深く適合させる必要があります6,8。
このプロトコルの3Dホールマウント染色セクションで説明されている光学的クリアリングステップは、クリアせずに50〜80μmではなく、深さ150〜200μmまでの3D構造のイメージングに適しています。しばしば数週間を必要とし、有毒な清算剤を使用する他の清算方法論と比較して、以前に公開された迅速で安全な清算ステップがこのプロトコル4,9で使用された。さらに、この透明化ステップは可逆的であり、分解能や輝度を失うことなく、新しい抗体を初期染色に追加することができます4。それにもかかわらず、研究された3D細胞培養モデルによっては、150〜200μmの深さでは有益な方法で3D構造を画像化するのに十分ではない可能性があり、このクリアリングプロトコルは、大きなルーメンを持つ球状の単層オルガノイドの一般的な形態に変化を引き起こす可能性があります4。ユーザーは実験を慎重に設計し、必要に応じて、透過処理/ブロッキングステップ(抗体と溶液の浸透を可能にするため)、透明化ステップ(200μmより深く浸透するには、検体を完全に透明にする必要があります)、および画像取得のタイミングを最適化する必要があります。コア施設で利用できる2つの最も一般的な技術は、ライトシート顕微鏡と共焦点顕微鏡です。ユーザーは、3D構造のサイズと生物学的な質問10に基づいてテクノロジーを慎重に選択する必要があります。しかしながら、共焦点顕微鏡と比較して、そのような深部構造について得られるライトシート顕微鏡分解能は、細胞内分解能を得るには最適ではないままである。
ここでは、単一サンプルのパラフィン包埋に特化した詳細で堅牢なプロセスが報告されています。興味深いことに、Gabrielらは最近、スループットを向上させたパラフィンに3D細胞培養を埋め込むプロトコルを開発しました。彼らは、ポリジメチルシロキサン(PDMS)モールドを使用して、96の3D構造をマイクロアレイパターンで1つのブロックに閉じ込め、より多くのグループ、時点、治療条件、および複製を含む3D腫瘍モデルに関する研究に新しい視点を提供しました11。ただし、この方法では、特にPDMS金型の作成に使用されるプリモールドの製造には、広範なスキルと機械が必要です。
要約すると、この論文では、3D細胞モデルのアーキテクチャおよび細胞構成に関する正確で定量的な情報を取得できるようにする2つの異なる補完的で適応可能なアプローチについて説明します。両方のパラメータは、腫瘍内細胞の不均一性や治療に対する耐性におけるその役割などの生物学的プロセスを研究するために重要です。
Disclosures
著者は開示するものは何もありません。
Acknowledgments
この作業は、セントボールドリックのロバートJ.アルセシイノベーションアワード#604303によってサポートされました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Biopsy pad Q Path blue | VWR | 720-2254 | |
| Cassettes macrostar III Blc couv. Char. x1500 | VWR | 720-2233 | |
| Cassette microtwin white | VWR | 720-2183 | |
| Chemical hood | Erlab | FI82 5585-06 | |
| Filter tips 1000 µL | Star lab Tip-One | S1122-1730 | |
| Fine forceps | Pyramid innovation | R35002-E | |
| Flat-bottom glass tubes with PTFE lined 2 mL | Fisher Scientific | 11784259 | Excellent for environmental samples, pharmaceuticals and diagnostic reagents. PTFE is designed for the ultimate in product safety. PTFE provides totally inert inner seal and surface facing the sample or product. |
| Glass bottom dish plate 35 mm | Ibedi | 2018003 | |
| Horizontal agitation | N-BIOTEK | NB-205 | |
| Incubator prewarmed to 65 °C | Memmert Incubator | LAB129 | |
| Inox molds 15x15 | VWR | 720-1918 | |
| Microscope Slides Matsunami TOMO-11/90 | Roche diagnostics | 8082286001 | these slides are used for a better adhesion of sections |
| Microtome | Microm Microtech France | HM340E | |
| Panoramic scan II | 3dhistech | 2397612 | |
| Paraffin embedding equipment | Leica | EG1150C | |
| Plastic pipette Pasteur 2 mL | VWR | 612-1681 | |
| Q Path flacon 150mL cape blanc x250 | VWR | 216-1308 | Good for environmental samples, pharmaceuticals and diagnostic reagents. Polypropylene (PP) are rigid, solid, provide excellent stress crack and impact resistance and have a good oil and alcohol barrier and chemical resistance. PE-lined cap is stress crack resistant and offers excellent sealing characteristics. |
| Set of micropipettors (p200, p1000) | Thermo Scientific | 11877351 (20-200) 11887351(p1000) | |
| OPERA PHENIX | PerkinElmer | HH14000000 | |
| SP5 inverted confocal microscope | Leica | LSM780 | |
| Tissue cassette | VWR | 720-0228 | |
| Zeiss Axiomager microscope | Leica | SIP 60549 | |
| Reagent | |||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7030-100G | |
| Cytoblock (kit) | Thermofisher Scientific | 10066588 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 57648266 | CAUTION: toxic and flammable. Vapors may cause irritation. Manipulate in a fume hood. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves, protective eye goggles. |
| Eosin aqueous 1% | Sigma-Aldrich | HT110316 | |
| Ethanol 96% | VWR | 83804.360 | CAUTION: Causes severe eye irritation. Flammable liquid and vapor. Causes respiratory tract irritation. Manipulate in a fume hood. Wear protective eye goggles. |
| Ethanol 100% | VWR | 20821.365 | CAUTION: Causes severe eye irritation. Flammable liquid and vapor. Causes respiratory tract irritation. Manipulate in a fume hood. Wear protective eye goggles. |
| Formalin 4% | Microm Microtech France | F/40877-36 | CAUTION: Formalin contains formaldehyde which is hazardous. Manipulate in a fume hood. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves and protective eye goggles. |
| Fructose | Sigma-Aldrich | F0127 | |
| Gill hematoxylin type II | Microm Microtech France | F/CP813 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | 500 mL |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | CAUTION: Suspected of causing genetic defects. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves and protective eye goggles. |
| Normal donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | 10 mL |
| Paraffin Wax tek III | Sakura | 4511 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) 1 X | Gibco | 14190-094 | |
| Tris-Buffered Saline (TBS) 10X | Microm Microtech France | F/00801 | 100 mL |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8532 | CAUTION: Triton X100 is hazardous. Avoid contact with skin and eyes. |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 534056 | CAUTION: Xylene is toxic and flammable. Vapors may cause irritation. Manipulate in a fume hood. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves, protective eye goggles. |
| Solutions | |||
| Clearing solution | Glycerol-Fructose clearing solution is 60% (vol/w) glycerol and 2.5 M fructose. To prepare 10 mL of this solution, mix 6 mL of glycerol and 4.5 g of fructose. Complete to 10 mL with dH2O. Use a magnetic stirrer overnight. Refractive index = 1.4688 at room temperature (RT: 19–23 °C). Store at 4 °C in dark for up to 1 month. | ||
| PBS-BSA 0,1% solution | To prepare 0,1% (vol/wt) PBS-BSA 0,1% solution, dissolve 500 mg of BSA in 50 mL of PBS-1X (store at 4°C for up to 2 weeks). And dilute 1mL of this solution into 9mL of PBS-1X. This solution can be used to precoat the tip and centrifugation tube. | ||
| Permeabilisation-blocking solution (PB solution) | The PBSDT blocking solution is PBS-1X supplemented with 0.1% – 1% Tritonx-100 (depending on the protein localization membrane/nucleus), 1% DMSO, 1% BSA and 1% donkey serum (or from the animal in which the secondary antibodies were raised). This solution can be stored at 4°C for up to 1 month. | ||
| PB:PBS-1X (1:10) solution | PB:PBS-1X (1:10) solution is a 10 time diluted PB solution. To prepare 10 mL of this solution dilute 1 mL of PB solution in 9 mL of PBS-1X. | ||
| Software | |||
| Halo software | Indicalabs | NM 87114 | |
| Harmony software | PerkinElmer | HH17000010 |
References
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- Bartfeld, S., Clevers, H. Stem cell-derived organoids and their application for medical research and patient treatment. Journal of Molecular Medicine. 95 (7), 729-738 (2017).
- Cui, X., Hartanto, Y., Zhang, H.
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- Broutier, L., et al. Culture and establishment of self-renewing human and mouse adult liver and pancreas 3D organoids and their genetic manipulation. Nature Protocols. 11 (9), 1724-1743 (2016).
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- McCray, T., Richards, Z., Marsili, J., Prins, G. S., Nonn, L. Handling and assessment of human primary prostate organoid culture. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (143), e59051 (2019).
- Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nature Reviews: Neuroscience. 21 (2), 61-79 (2020).
- Lazzari, G., et al. Light sheet fluorescence microscopy versus confocal microscopy: in quest of a suitable tool to assess drug and nanomedicine penetration into multicellular tumor spheroids. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 142, 195-203 (2019).
- Gabriel, J., Brennan, D., Elisseeff, J. H., Beachley, V. Microarray embedding/sectioning for parallel analysis of 3D cell spheroids. Scientific Reports. 9, 16287 (2019).
