Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

En prøveforberedelsespipeline til mikrokrystaller på VMXm Beamline

Published: June 17, 2021 doi: 10.3791/62306
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1,3, 1, 1, 1,4
1Diamond Light Source Ltd, Harwell Science and Innovation Campus, 2Paul Scherrer Institut, 3Central Laser Facility, Science and Technologies Facilities Council, Harwell Science and Innovation Campus, 4Rosalind Franklin Institute, Harwell Science and Innovation Campus

Summary

Signal-til-støj-forholdet mellem data er en af de vigtigste overvejelser i udførelsen af X-ray diffraktion målinger fra mikrokrystaller. VMXm-beamline giver et støjsvagt miljø og mikrobjælke til sådanne eksperimenter. Her beskriver vi prøveforberedelsesmetoder til montering og afkøling af mikrokrystaller til VMXm og andre mikrofokus makromolekylær krystallografistrålelinjer.

Abstract

Montering af mikrokrystaller (<10 μm) til enkelt krystal kryo-krystallografi udgør en ikke-triviel udfordring. Forbedringer i datakvaliteten er set for mikrokrystaller med udvikling af beamline optik, stråle stabilitet og variabel stråle størrelse fokus fra submicron til mikron, såsom på VMXm beamline på Diamond Light Source1. Der vil blive opnået yderligere forbedringer af datakvaliteten gennem forbedringer af stikprøvemiljøet og prøveforberedelse. Mikrokrystaller i sagens natur generere svagere diffraktion, derfor forbedre signal-til-støj er nøglen til at indsamle kvalitet X-ray diffraktion data og vil overvejende komme fra reduktioner i baggrundsstøj. Større kilder til røntgen baggrundsstøj i et diffraktionseksperiment er fra deres interaktion med luftvejen før og efter prøven, overskydende krystalliseringsopløsning omkring prøven, tilstedeværelsen af krystallinsk is og scatter fra enhver anden stråleinstrumentering eller røntgenvinduer. VMXm-beamlinen omfatter instrumentering og en protokol til forberedelse af prøver for at reducere alle disse støjkilder.

For det første fjerner et in-vacuum prøvemiljø ved VMXm luftvejen mellem røntgenkilde og prøve. Dernæst bruger prøveforberedelsesprotokoller til makromolekoøg krystallografi ved VMXm en række processer og værktøjer tilpasset fra kryoTEM. Disse omfatter kobbergitre med holey carbon støtte film, automatiseret blotting og springet køling robotteknologi gør brug af flydende ethan. Disse værktøjer gør det muligt at forberede hundredvis af mikrokrystaller på et enkelt kryoTEM-gitter med minimal omgivende væske på en støjsvag støtte. De minimerer også dannelsen af krystallinsk is fra enhver resterende væske omkring krystallerne.
Vi præsenterer processen til fremstilling og vurdering af kvaliteten af opløselige proteinmikrokrystaller ved hjælp af synligt lys og scanning af elektronmikroskopi, før prøverne monteres på VMXm-strålelinjen til røntgen diffraktionsforsøg. Vi vil også give eksempler på eksempler på god kvalitet prøver samt dem, der kræver yderligere optimering og strategier til at gøre det.

Introduction

En stor barriere for bestemmelse af højopløselige strukturer af biologiske molekyler ved makromolekylær krystallografi (MX) er fortsat produktionen af godt diffrakerende krystaller i en modtagelig størrelse. Der er mange strategier for at nå dette mål fra rekombinant protein gen konstruere design gennem store sparsomme matrix søgninger efter kemiske cocktails, der kan generere indledende krystaller2. For sidstnævnte er det ofte sådan, at krystallographeren bliver nødt til at optimere eventuelle indledende hits for at opnå krystaller med tilstrækkelig diffraktionskvalitet og størrelse til strukturbestemmelsesundersøgelser3. På trods af disse muligheder kan nogle målmolekyler aldrig generere store (>10 μm), godt diffrakerende krystaller, og som følge heraf skal krystallographeren fortsætte med deres mikrokrystaller og de udfordringer, som sådanne prøver præsenterer. Disse omfatter passende montering og kryo-beskytte krystaller, styring i sagens natur svagere diffraktion og øget stråling følsomhed. Mikrokrystaller dannes af færre enhedsceller og molekyler end større krystaller, og som sådan forstærkes diffraktionen ikke i samme omfang sammenlignet med større krystaller, hvilket resulterer i i sagens natur svagere diffraktionsintensiteter. Det er vigtigt, at baggrundssignalet ikke maskerer disse refleksioner, især ved højere opløsning, hvor svage refleksionsintensiteter kan gå tabt4. Derudover er mikrokrystaller mere følsomme over for strålingsskader, og på trods af registrering diffraktion ved flydende nitrogentemperaturer5, er det muligvis ikke muligt at indsamle komplette data fra en enkelt krystal, hvilket gør det nødvendigt at indsamle data fra et meget stort antal krystaller for at producere et enkelt komplet datasæt6.

Den stigende tilgængelighed af røntgenfri elektronlasere (XFELs) og udviklingen af seriel krystallografi metoder (SFX)7 har givet ruter til indsamling af data fra mindre mikrokrystaller. Der er dog tale om skræddersyede prøveleveringsmetoder, som kræver en betydelig mængde hardware- og softwareekspertise, hvor eksperimenter er begrænset til stuetemperatur og typisk er et prøveforbrug højt (hundredvis af mikroliters) og stadig kan kræve yderligere optimering8. Som sådan er projekter, hvor der kun kan laves en begrænset mængde mikrokrystaller, ikke egnede til SFX.

I mellemtiden har synkrotron beamline teknologi i de seneste årtier udviklet sig til at producere mindre, mere stabilebjælker 9 med en glans, der har tilladt dataindsamling fra stadig mindre krystaller10,11. Microfocus beamlines såsom FMX på NSLS-II og I24 på Diamond Light Source har været i stand til at bestemme nye strukturer fra krystaller med maksimale dimensioner på ~ 3 μm12 og demonstrere evnen til at indsamle brugbare data fra endnu mindre krystaller måler ~ 1 μm13. Beamline skal være præcist konfigureret, med fremragende, høj opløsning on-axis-visning optik, en minimal kugle af forvirring for prøve rotation og en præcist justeret rotation akse, der er sammenfaldende med X-ray stråle. Det er vigtigt at nøje matche røntgenstråleprofilen med krystalvolumenet og sikre, at krystallen er præcist justeret i røntgenstrålen - en udfordring for krystaller < 5 μm14. Opfyldelse af disse eksperimentelle forhold på beamline er afgørende for at registrere de bedste kvalitetsdata fra mikrokrystaller.

Det resterende og muligvis vigtigste aspekt af dataindsamling fra mikrokrystaller er præsentationen af krystallen til røntgenstrålen. Mikrokrystaller er ofte blevet monteret på micromesh prøve mounts, fremstillet af polyimid, en lav X-ray spredning materiale med åbninger så små som 10 μm15,16. Polyimid mesh er monteret på en standard pin, der er sat i en magnetisk SPINE base, hvilket gør det kompatibelt med de fleste MX strålelinjer17. Mesh mount bruges til at fiske krystaller fra krystallisering drop ofte efter samme procedure som montering af en 100 μm krystal ved hjælp af en standard loop stil mount. Krystallerne kan fordeles over masken, men en væsentlig ulempe er, at en relativt stor mængde væske kan bæres af masken og stiften under høsten (Figur 1C,D). Denne mængde væske, der kan være mange gange større end krystallerne selv, vil bidrage til baggrundsstøj, når den belyses med røntgenstråler. Denne baggrund scatter kan være endnu stærkere, hvis væsken danner krystallinsk is under flash køling, mindske signal-til-støj forholdet mellem allerede svage intensiteter inden for opløsninger af is diffraktion. Derfor er det vigtigt, at overskydende væske fjernes fra prøven for at sikre, at alle mulige signaler kan registreres. Denne udfordring er endnu større i tilfælde af membranproteinkrystaller dannet inden for lipidkabinefasen (LCP), hvor LCP genererer stærk baggrundsspredning og også er vanskelig at fjerne fra omkring krystallerne 18.

Den nye alsidige MAKROMOEkulære Krystallografi mikrofokus (VMXm) strålelinje på Diamond Light Source giver betingelserne for at indsamle data fra krystaller potentielt måle mindre end et mikron i størrelse. Beamline er designet til at levere en stråleprofil, der måler 0,3 μm x 0,5 μm (VxH)1, et goniometer med en forvirringssfære på højst 60 nm og et in vacuo-prøvemiljø. Disse designfunktioner i VMXm-endstationen minimerer strålingsapparatets generering af røntgenstøj i baggrunden under dataindsamlingen med den største resterende baggrundskilde, der genereres af stikprøven14.

Specifikke prøveforberedelsesmetoder, der er designet til VMXm-strålelinjen, giver mulighed for at reducere denne baggrund og yderligere forbedre signal-til-støj af diffraktionsdata, hvilket maksimerer kvaliteten af de data, der kan registreres fra mikrokrystaller, der måler <10 μm. Mange af de krav, der er skitseret her for lav baggrund diffraktion fra mikrokrystaller er også fælles for kryogen transmission elektronmikroskopi (cryoTEM)19 og mikrokrystal elektron diffraktion (microED)20. Som følge heraf er mange af de værktøjer, der allerede er udviklet til fremstilling af kryoTEM-prøver, egnede til fremstilling af mikrokrystaller med nogle tilpasninger. Ved fremstilling af prøver til enkeltpartikel kryoTEM er de undersøgte partikler indlejret i meget tynde lag (typisk < 100 nm) glasis, således at elektroner er i stand til at overføre gennem prøven. Det tynde ensartede lag opnås ved at fjerne overskydende væske, og vitrifikation af prøven opnås ved hurtig afkøling af prøven (~104 K s-1)21 ved at kaste i flydende ethan, der holdes ved ~ 93 K22. I modsætning hertil er flydende nitrogen, som anvendes rutinemæssigt til MX-prøvepræparat, en mindre effektiv kryogen end ethan og har en større tilbøjelighed til krystallinsk isdannelse i prøve21. Dannelsen af krystallinsk is, som kan nedbryde diffraktion og generere baggrundsstøj, afbødes normalt ved brug af kryo-protectant forbindelser23. Lav molekylvægt polymerer såsom poly-ethylenglycol (PEG) 400 og methyl-2,4-pentanediol (MPD), sukker, olier eller mættede salte kan tilsættes til en aliquot af krystallisering løsning i lave koncentrationer24- der er ikke en 'one size fits all' løsning til at vælge den mest hensigtsmæssige kryobeskyttende middel, og dette kræver ofte optimering25 . Krystallen gennemgår også flere manipulationer under høsten og kryobeskyttelsesprocessen, hvilket kan resultere i skade på krystallen, muligheden for at udnytte flydende ethan tillader udeladelse af dette trin og hjælper med at beskytte krystallens integritet.

Mens flydende ethan er en effektiv kryogen for mikrokrystaller (<10 μm) på grund af prøvens tyndhed, er der alternative metoder til forebyggelse af krystallinsk idannelse, især i større krystaller, herunder reduktion af krystalens vandindhold ved brug af et stramt kontrolleret fugtigt miljø26, eller gennem fugttransport af overskydende væske væk fra både løkken og overfladen afkrystallen 27 , men disse kræver igen større manipulation af prøven. Brugen af automatiseret blotting og dyk frysning med flydende ethan, som i cryoTEM, tilsammen fjerne overskydende krystallisering løsning og give et middel til at blinke kølige mikrokrystaller på en kontrolleret måde, mens du forsøger at minimere manipulation.

Her præsenterer vi en protokol, der kan udnyttes ikke kun af både brugere af VMXm beamline og på andre mikrofokusstrålelinjer for at indsamle høje signal-til-støj diffraktionsdata, men kan også være nyttige for dem, der forbereder opløselige proteinkrystaller og vaskemiddelbaserede membranproteinkrystalprøver til mikroED-eksperimenter. Mens alle faciliteter til at forberede og vurdere prøver er tilgængelige på VMXm, er mange strukturelle biologilaboratorier i stigende grad udstyret til kryoTEM-prøvepræparat. Som et resultat, vi forestiller os, at nogle brugere kan ønske at bruge deres egne faciliteter til at forberede deres prøver til stråletid på VMXm.

Protocol

1. Opsætning af udstyr

BEMÆRK: De metoder, der er beskrevet her, bruger et dytfrysningsinstrument med en enkelt blottingarm. Nogle instrumenter er udstyret med to blotting arme, og vi råder brugeren til at kontrollere producenternes anvisninger for at justere instrumentet, så kun én blotting arm er i brug.

  1. Sørg for, at et let mikroskop er placeret tæt på det springende fryseinstrument, ideelt set så både mikroskopet og frysefryseren er inden for brugerens rækkevidde.
  2. Sæt den automatiske stempelfryser op og afkøles i overensstemmelse med producentens anvisninger.
    BEMÆRK: Prøvekammertemperaturen skal indstilles til den temperatur, hvor krystallerne blev dyrket. Anbring ikke blottingpapir i prøvekammeret.
    FORSIGTIG: Flydende ethan er et meget brandfarligt sprængstof og må kun anvendes i et godt ventileret område væk fra potentielle gnistkilder.
  3. Mærk gitterkasserne korrekt og afkøle dem i en lille dewar ved hjælp af flydende nitrogen.
  4. Placer forsigtigt gitre, carbonfilm side op, på en passende bærer til glød udledning (såsom et glas mikroskop dias indpakket i parafilm).
  5. Glow udledning cryoTEM gitre til 25 s ved 0,39 mBar, ved hjælp af en strøm på 15 mA. Glød udledning lige før gitre vil blive brugt. Hold gløden udledte gitre i en overdækket petriskål, indtil den er klar; hvis 30 min bortfalder efter glød udledning, gentag gløden afladning.
    BEMÆRK: Når frysefryseren er klar og gitrene er forberedt, kan opmærksomheden rettes mod prøven.

2. Bestemmelse af indledende blotting parametre

  1. Indstil prøvekammerets relative luftfugtighed til 90 % og blottingtiden til 5 s, og sørg for, at frysefryseren automatisk kaster prøven, når blotting er afsluttet.
    BEMÆRK: Disse startparametre er bedst egnede til Leica GP-frysefryseren, andre parametre såsom blotting force er tilgængelige på FEI Vitrobot. Men efter vores erfaring er det mere sandsynligt, at krystalintegritet opretholdes ved hjælp af en enkelt blottingarm.
  2. For at kunne forsegle krystalliseringsbakken, når brønden af interesse er åbnet, skal du skære en lille strimmel tape og folde over den ene ende for at skabe en fane for at lette åbningen af forseglingen og forsigtigt placere til den ene side.
  3. Skær tætningen op over krystalliserings godt, herunder reservoiret. Hvis du arbejder hurtigt, påføres 2-5 μL reservoiropløsning på det krystalholdige fald for at opretholde væskevolumen i dråben.
  4. Brug fanen tape til derefter reseal brønden og sikre, at krystallisering drop ikke tørre ud.
  5. Mens du kortvarigt holder båndet åbent over krystalliseringsbønderne, overføres 10 μL af reservoiropløsningen til et 0,5 mL-rør, der skal bruges til senere trin.
  6. Reseal brønden.
  7. Placer et stykke forskåret blotting papir på blotting arm af springet fryseinstrument.
  8. Placer en enkelt glød udledt gitter i springet frysende sammenkværn og belastning i instrumentet, således at kulstofsiden vender væk fra blotting arm.
  9. Sørg for, at den relative luftfugtighed i blottingkammeret er på 90%.
  10. Roter sammentrerne, så kulfilmsiden vender mod den blottende arm.
  11. Ved hjælp af en 2,5 μL pipette påføres 2 μL reservoiropløsning fra 0,5 mL-røret til den ikke-understøttende (skinnende kobber) side af kryoTEM-gitteret.
  12. Roter gitteret, så kulstofstøttesiden vender væk fra blottingarmen, og gentag processen, og påført forsigtigt væsken på kulstoffilmens støtteside af nettet. Undgå at røre carbon-filmen med pipettespidsen for ikke at beskadige carbonfilmen. Væsken skal spredes over nettet på grund af den opladning, der deponeres under glødafladning.
  13. Start blotting-processen, mens du observerer gitteret. Et visningsområde er tilgængeligt på Leica GP2 til dette formål.
  14. Overhold, om væsken trækkes fra gitterets kulstofoverflade i løbet af denne tid, dette starter med, at størstedelen af den flydende bolus på gitteret udfladning ud som væsken er ond gennem nettet. Da væsken i hvert gitter kvadrat reduceres yderligere, en bølge af 'popping' over overfladen af nettet kan observeres. Hvis denne effekt observeres, kan blotting stoppes inden for 2-3 s af popping effekt slutter. Det er ikke nødvendigt at kaste testgitteret, som kan kasseres.
  15. Hvis den såkaldte 'popping' effekt ikke overholdes, gentages trin 2.11-2.14, hver gang du forlænger blotting tid med 1-2 s, indtil popping effekt er observeret lige før blotting arm trækker sig tilbage fra nettet. Bemærk denne gang for trin 3.
    BEMÆRK: Det er vigtigt, at blotting stopper, så snart denne popping effekt er opstået for at sikre, at under processen, krystaller ikke bliver dehydreret fra over-blotting. Brug krystalliseringsopløsningen fra reservoiret til tilbage blotting og fortynding af prøven, da det sikrer, at krystallerne er underlagt en ensartet opløsning, hvilket reducerer risikoen for destabilisering af krystallerne.

3. Høst af krystaller

  1. Placer krystalliseringspladen under lysmikroskopet, og placer målet godt inden for synsfeltet.
  2. Placer en frisk, glød udledt gitter i springet fryser sammenkværn og montere sammenkværnet i springet fryser, med carbon-film side vender væk fra blotting arm.
  3. Roter sammentrerne, så kulfilmsiden vender mod den blottende arm.
  4. Ved hjælp af en 2,5 μL pipette påføres 2 μL reservoiropløsning fra 0,5 mL-røret til den ikke-støttende side af kryoTEM-gitteret, og gitteret drejes, så støttesiden for carbonfilm vender ud mod prøveporten på dybfryseren.
  5. Skræl den midlertidige forsegling tilbage, og med pipetten indstillet til 2 μL, skal du forsigtigt aspirere krystalliseringsdråben gentagne gange for at suspendere mikrokrystallerne (det er vigtigt ikke at introducere luftbobler til dråben).
    BEMÆRK: Det er vigtigt at observere denne proces under det lette mikroskop for at sikre, at krystaller frigives fra enhver overflade hud eller bunden af brønden. Hvis krystallerne sidder fast og ikke er udarbejdet med aspiration, kan enten pipettespidsen eller andre krystalliseringsværktøjer som en akupunkturnål bruges til forsigtigt at løsne krystallerne. Afhængigt af krystallernes størrelse og dybdeskarphed af lysmikroskopet er det nogle gange muligt at se krystallerne, der kommer ind i pipettespidsen, ved hjælp af mikroskopet.
  6. 2 μL af den indsugningsmikrokrystalslam til frysefryseren og påfør al prøven på kulstofsiden af kryoTEM-gitteret.
  7. Blot for den tid, der bestemmes i trin 2 og straks indlede springet-frysning. Mens blotting, observere for forekomsten af en popping bølge effekt på tværs af nettet og bemærk, om dette skete helt på tværs af nettet. Tilstedeværelsen af krystaller kan påvirke den indledende blotting tid, og dette kan være nødvendigt at justere for efterfølgende gitre med 1-2 s.
  8. Arbejde hurtigt, overføre nettet fra den flydende ethan til gitteret boksen nedsænket i flydende nitrogen. Resterende ethan kan henvende sig til en uigennemsigtig hvidt fast stof på nettet, når det kommer ind flydende nitrogen. For at reducere dette skal du fjerne gitteret støt fra den flydende ethan og derefter hurtigt overføre til det flydende nitrogenreservoir.
  9. Når der er anbragt 4 gitre i gitterkassen, skal du fastgøre låget på kassen med skruen og overføre den enten til en skumdråning af flydende nitrogen for at muliggøre yderligere prøvevurdering med et scanningselektronmikroskop (SEM) eller til en flydende nitrogenopbevaringsdeforvaring ved hjælp af en passende opbevaringsbeholder.

4. Vurdering af prøvetæthed ved let mikroskopi

FORSIGTIG: Denne metode er destruktiv. Hvis der er begrænset tilgængelighed af prøve, f.eks. Efter frysning af dyk (trin 3.7) kan fordelingen af krystaller på tværs af nettet vurderes.

  1. Monter et tørt kryoTEM-gitter med stuetemperatur i stempelfrysertrerne, og placer sammenkrøpperne på deres side på det lette mikroskop med gitteret i synsfeltet. Angiv en passende forstørrelse og fokus, så hele gitteret og de enkelte gitter firkanter kan løses.
  2. Følg trin 3.1-3.7.
  3. I stedet for at overføre gitteret til gitterboksen (trin 3.8) trækkes det uddykkede gitter tilbage fra den flydende ethan ved at nulstille frysefryseren.
    FORSIGTIG: Gitteret og prøven vil blive varme til stuetemperatur og kan ikke bruges til yderligere diffraktionsforsøg.
  4. Fjern sammenknene fra det springende fryseinstrument.
  5. Mens du holder gitteret inden for sammentakkerne, skal du placere gitteret under lysmikroskopet - fokus vil allerede være groft indstillet.
  6. Udfør et fint fokus og vurder tætheden af krystallerne på tværs af gitteret. Et godt gitter vil indeholde flere isolerede krystaller væk fra gitterstængerne inden for hver gitter firkant og klumpning af krystaller er minimal.
  7. Hvis tætheden af krystaller i gitteret resulterer i klumpning af krystaller med kun et par isolerede krystaller, fortyndes krystallammen yderligere med reservoiropløsning og gentages trin 3. Vær forsigtig ved fortynding af prøver, så fortyndingen ikke resulterer i opløsning af krystallerne.
  8. Fortynd krystallerne i trin ved hjælp af små mængder på 0,5-1 μL.

5. Prøvevurdering ved scanning af elektronmikroskopi

BEMÆRK: Mikrokrystalpræparat på kryoTEM-gitre vurderes bedst med en scanningselektronmikroskopi (SEM) under kryogene forhold, dette kan opnås med en SEM udstyret med et kryostadium. På VMXm, en JEOL JSM-IT100 SEM (wolfram kilde) med et quorum PP3006 luftsluse og cryostage udnyttes. For at sikre minimal strålingsskade ved visning af prøver på VMXm28,29bruges følgende indstillinger: 5 kV accelererende spænding; en spotstørrelse på 40 (vilkårlige enheder på JEOL JSM-IT100) 10 mm arbejdsafstand. Billeder optages ved hjælp af den sekundære elektrondetektor, til prøvejustering og fokusering af en opholdstid på 0,8 μs, mens billeder i høj opløsning af enkelte krystaller optages ved hjælp af en opholdstid på 16 μs. Det er vigtigt, før du lægger en prøve i SEM'en, at mikroskopet justeres i henhold til producentens anvisninger. Det anbefales, at kun et enkelt gitter indlæses i SEM, mens eventuelle resterende gitre, der er forberedt med de samme parametre, er forbeholdt røntgen diffraktionseksperimenter.

  1. SEM'en forberedes ved at køle prøve kryostadiet til -180 °C i henhold til fabrikantens instruktion. Følg vejledningen til indlæsning af cryoTEM-gitre i det specifikke system, der er tilgængeligt.
  2. Når prøven er indlæst i SEM'en, skal elektronstrålen tændes, prøven justeres og sættes i fokus ved hjælp af en høj forstørrelse (0,8 μs dvæle tid).
  3. Udfør først den indledende vurdering med hele gitteret i visning ved lav forstørrelse (x45). Optag et billede ved denne forstørrelse.
  4. Forøg forstørrelsen for at tillade nærmere inspektion af individuelle gitter firkanter, individuelle krystaller bør være meget klart observerbare.
  5. Flyt rundt i gitteret og tag stillbilleder (16 μs dvæletid) af krystaller, så de opfylder følgende krav, før du fortsætter:
    1. Sørg for, at gitre er flade, og carbon support filmen er stort set intakt.
    2. Sørg for, at der er mange enkelte krystaller med en smal glorie af vitrified væske omkring krystallen.
    3. Sørg for, at hullerne i carbon-støttefilmen er synlige.
    4. Sørg for, at der ikke er store områder af vitrified væske som defineret af et mørkt og glat udseende.
    5. Sørg for, at der er lidt eller ingen sekskantet is eller overfladeis spredt over gitteret.
    6. Sørg for, at krystallerne er jævnt fordelt på tværs af støttefilmen og ikke overlapper hinanden.
  6. På dette tidspunkt, præcist måle dimensionerne af en række krystaller til at give mulighed for en nøjagtig X-ray stråle størrelse korrelation under senere diffraktion eksperimenter.
  7. Prøver, der pålideligt kan hentes fra SEM og vedligeholdes ved kryogene temperaturer, kan senere bruges til røntgen diffraktionsforsøg. Hvis dette ikke er muligt, skal disse prøver bortskaffes.
    BEMÆRK: Mens der billeddannelse både hele nettet og individuelle mikrokrystaller (ca x45 og x700 forstørrelse henholdsvis), bør der foretages en vurdering af, om at gå videre til beamline med gitre udarbejdet ved hjælp af de samme parametre, eller om nogle parametre kan være nødvendigt at justere i løbet af trin 3. Gitrene skal opfylde de test, der er beskrevet i trin 5.5. Hvis gitrene ikke opfylder disse kriterier, kræves der yderligere optimering i trin 3, før trin 5 gentages.

6. Forberedelse af gitter til diffraktion eksperimenter på VMXm

  1. Det krævede antal VMXm-prøveholdere (Figur 4A) (op til 5), der er lagt i prøvepatronen (med låg) med prøvelæsseren i en stor skumdeskrig (Figur 4B) ved hjælp af flydende nitrogen - dette kan kræve en stor mængde flydende nitrogen. Det flydende nitrogenniveau skal ligge lige over prøvepositionen på prøvelæsseren.
  2. Forbered circlips og værktøjer.
  3. Placer værktøjer, herunder klipning værktøj, sammenkædning og VMXm prøve sammenkrammer, i huller i prøven loader at køle. Det kan være nyttigt at arrangere et spotlight over dewar.
  4. Overfør hurtigt gitterkassen, der indeholder de mikrokrystalbelastede gitre, til gitterkassepakningen på prøvelæsseren, og skru låget af, så det er løst og drejeligt (fjern ikke).
  5. Under flydende nitrogen fjernes låget fra prøvepatronen med store sammentrevne og læg det under prøvelæsseren.
  6. Brug VMXm-prøvedetikkerne til at løfte prøveholderen op på prøvelæsseren, så holderen vender opad, så den kan acceptere et gitter. Når en lille nål på prøvelæsseren er i den rigtige position, vil den gå i indgreb med det lille hul midt i prøveholderen.
  7. Med de afkølede fine sammenkr vil du forsigtigt løfte gitteret fra gitterboksen og overføre tæt på gitteråbningen på prøveholderen. Roter gitteret, så det lægger fladt (det er ligegyldigt, hvilken vej støttefilmsiden vender).
  8. Sænk forsigtigt sammentræberne, så gitteret er så tæt som muligt over gitteråbningen (pas på ikke at bøje nettet) og slip gitteret i åbningen. Hvis gitteret ikke sidder ordentligt, skal du forsigtigt bruge de fine sammentømninger til at skubbe gitteret på plads eller forsigtigt trykke på prøveholderen med de større sammentvingere.
  9. Placer hurtigt det forkølede circlip-værktøj over gitteret i gitteråbningen, og sæt circlip'en ved at trykke på knappen. Det kan være nyttigt at anvende 2 fordybninger af knappen for at sikre circlip er korrekt siddende.
  10. Fyld det flydende nitrogen op, så niveauet er ~1,5 cm over prøveholderen. Løft forsigtigt den indlæste prøveholder op og over den lille nål på prøvelæsseren og tilbage til prøvepatronen ved hjælp af VMXm-prøveaksen. Bemærk prøveholderens positionsnummer i prøvepatronen.
  11. Fortsæt med at indlæse gitre i prøveholderne, indtil alle prøver er indlæst.
  12. Returner gitterkasserne til opbevaringsafvarsleren, hvis prøverne forbliver inde, og fjern prøvelæsseren fra dewar for at skabe mere plads.
  13. Udskift patronlåget på patronen, så stiften på toppen af patronen går i indgreb med hullet i låget.
  14. Afkøle og fylde VMXm luftsluse dewar med flydende nitrogen og sted ved siden af skum dewar indeholder den lastede prøve patron.
  15. Brug VMXm-patronværktøjet til forsigtigt at aktivere værktøjet i højderne på siden af patronen og løft hurtigt patronen ind i luftslusen.
  16. Sørg for, at det flydende nitrogenniveau dækker patronen.
  17. Læg låg på luftslusen, og fortsæt til VMXm-endstationen med den indlæste prøvepatron.
    BEMÆRK: Indlæsning af prøvepatronen i VMXm-endstationen udføres af beamlinepersonalet.

Representative Results

Formålet med denne protokol er at opnå vitrified mikrokrystaller med en minimal mængde væske omkring krystal, der muliggør X-ray diffraktion eksperimenter med minimal baggrund scatter at forbedre diffraktion signal. Eksempel SEM-billeder af mikrokrystaller, der er fremstillet på kryoTEM-gitre for minimal baggrundsspredning, vises i figur 1A, B og Figur 2. Gitre med jævnt fordelte enkeltkrystaller vil give den mest effektive udnyttelse af nettet med god signal-til-støj. Dette er dog normalt ikke muligt på tværs af hele gitteret, og nogle områder kan vise en vis mængde klumpning (Figur 2A,B). På trods af denne klumpning viser disse eksempler stadig et nyttigt antal enkelte isolerede krystaller, der giver diffraktion med lav baggrund (Figur 5). Niveauet af blotting, der stadig opretholder lav baggrund scatter kan variere. Stærk blotting sådan, at hullerne i kulstof støtte film er tydeligt synlige, men krystallerne forbliver hydreret er målet (Figur 2C, D). Net af god kvalitet kan dog stadig vise noget væske i hullerne i støttefilmen, selvom hullernes position stadig skal kunne identificeres (Figur 2A,B). Vigtigere, alle disse eksempler viser enkelt, isolerede krystaller med en vitrified glorie af væske omkring krystal for at opretholde hydrering mellem blotting og springet frysning.

Mange prøver kan kræve yderligere optimering (Figur 3), som kan omfatte variation af blotting tid eller koncentrationen af mikrokrystaller. Gitre overbelastet med krystaller vil demonstrere reduceret blotting effektivitet og kan resultere i flere låse registreres i enkelt diffraktion billeder (Figur 3A, B). Mere tyktflydende krystalliseringsforhold, såsom for trypsin, som indeholder 8% PEG 4000 og 15% ethylenglycol (figur 3C), kan resultere i behov for længere blotting gange (>10 s). Omvendt kan krystalliseringsforhold med meget lav viskositet, der blotter meget hurtigt, lide af distributionsproblemer på grund af tyngdekraften, der forårsager afregning, før blotting opstår, hvilket resulterer i, at alle mikrokrystallerne bosætter sig langs den ene side af gitteret (Figur 3D).

Optimal forberedelse af prøver gør det muligt at udnytte VMXms fulde kapacitet til at indsamle røntgen diffraktionsdata af høj kvalitet ved den højest mulige opløsning med høj signal-til-støj (Figur 5). Disse prøver drager fordel af at være kompatible med det in-vacuo-prøvemiljø, hvilket resulterer i meget lave eller nul gennemsnitlige baggrundstællinger i diffraktionsbilleder. Brugen af flydende ethan, uden kryo-protectant, resulterer i fravær af is-ringe (Figur 5), men hvor krystaller lå tæt på kobber gitter barer, X-ray stråle kan blik stængerne resulterer i kobber pulver diffraktion ringe på ~ 2,1 Å og ~ 1,8 Å.

Figure 1
Figur 1: Sammenligning af mikrokrystalmontering på mikromeshbeslag og cyoTEM-net. Scanning af elektronmikrografer af dybfrosne mikrokrystaller af viruspolyhedral, der måler 2,5 μm på tværs (A, B) 5 kV accelererende spænding, en spotstørrelse på 39 (vilkårlige enheder) og opholdstid på 16 μs. Gitteret er fri for overskydende væske (A), der observeres en smal glorie af væske omkring krystallerne (B). De samme prøver monteret på et mikromesh (20 μm åbninger) før flashkøling i flydende nitrogen og observeret ved hjælp af on-axis-visning system på beamline I24 face-on (C) og side på (D). De optiske forvrængninger (C) ved visning med forsiden giver en indikation af omfanget af væsketykkelsen på tværs af mikroklokkesvinet, dette er klarere, når du ser mikromekanikmen side-on (D). Det røde mål i C og D repræsenterer røntgenstrålens position og størrelse. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Eksempler på eksempler på god kvalitet prøver. Polyhedra krystaller (A) observeret på tværs af en enkelt ~ 100 μm gitter firkant. Mens nogle af krystallerne er lidt klumpet og viser en vis forbindelse af den omgivende væske, der er en række isolerede enkelt krystaller med en lille glorie af væske omkring krystallen. Lidt større insulinkrystaller (B), der måler ~ 5 x 5 μm, viser også nogle klumpning, men igen er der godt isolerede individuelle krystaller. Nålekrystaller kan have en meget smal dimension og kræve en mikrobjælke, såsom disse nåleformede lysozymkrystaller (C). En smal væskebånd kan ses omkring disse krystaller (lysegrå glorie). Større mikrokrystaller op til snesevis af mikron kan også være godt monteret på cryoTEM gitre, såsom disse ~ 7 μm proteinase K krystaller (D). I både (C) og (D) og i mindre grad i (A) er hullerne i kulstofstøttefilmen tydeligt synlige, hvilket viser tilstedeværelsen af meget lidt/ingen væske. I eksempel B, mens der ikke observeres tomme huller, kan hullernes position stadig identificeres, hvilket indikerer, at væsken kun fylder hullerne i støttefilmen. I alle disse eksempler kan en glorie af væske ses omkring kanten af gitterpladsen (en afrundet indre firkant), hvor hullerne har et lysere gråt udseende. Dette er et fælles træk ved velforberedte gitre. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Eksempler på prøver, der kræver yderligere optimering. Gitre overbelastet med mikrokrystaller (A, B) kan øge baggrundsspredningen, da prøverne blokerer hullerne i støttefilmen, hvilket reducerer blottingeffektiviteten, og med en højere overfladespænding mellem krystallerne forbliver der mere væske. Ud over en forringelse af signal-til-støj, der resulterer i tab af information, er det sandsynligt, at flere lattices vil blive registreret. Brug af en blotting tid, der ikke er lang nok, eller en meget tyktflydende krystallisering løsning kan resultere i en alt for våd prøve (C), også producerer lav signal-til-støj. Krystalliseringsforhold uden bundfald, såsom for kvæginsulin (D), har en meget lav viskositet. Mens dette resulterer i en meget kort blotting tid, det kan også resultere i bevægelse af krystaller på tværs af nettet før og under blotting på grund af virkningerne af tyngdekraften. Dette resulterer normalt i et stort set tomt gitter med en høj koncentration af krystaller langs den ene kant (D). Det kan være en fordel at tilføje et tyktflydende middel som ethylenglycol til krystallamlykolen kort før de påføres gitteret for at reducere krystalstrømmen og forbedre fordelingen af krystallerne. Dette kan også forlænge blotting tid, hvilket gør det lettere at observere blotting. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Værktøjer til prøveindlæsning ved VMXm. Et skræddersyet sæt værktøjer er designet til at indlæse VMXm-prøveholderne (A). Prøveindlæseren (B) har plads til en enkelt VMXm-prøveholder, gitterboks og værktøjslager, mens du arbejder. Den er også designet til at tillade arbejde lige under overfladen af det flydende nitrogen og lade prøvepatronen passe under(B). Luftslusen dewar(C),som passer til luftslusen nitrogen gas boks på VMXm endstation, bruges til at tage den lastede prøve patron fra laboratoriet til beamline eksperimentelle hutch. For at få vist prøver i offline SEM er der foretaget en skræddersyet shuttle (D), der består af VMXm-prøveholderen uden base, for at gøre det muligt at vurdere i den prøveholder, der anvendes på strålelinjen. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Eksempel diffraktion fra mikrokrystaller på VMXm. En enkelt diffraktion billede optaget ved hjælp af en Pilatus 3 6M detektor på VMXm af en ~ 3 μm virus polyhedral krystal monteret på en cryoTEM gitter ved hjælp af springet frysning metode. Diffraktion observeres til over 1,7 Å og en refleksion (blå firkant) på 1,74 Å er indsat, der viser den lave baggrund scatter, med et stort antal pixels med nul tæller. Ethylenglycol til en endelig koncentration på 50% v/v blev tilsat til krystallamuren, før den blev anvendt på gitteret. Den lave baggrund karakter af VMXm prøve position er demonstreret af den konstante baggrund på tværs af billedet som vist ved intensiteter afbildet under den blå stiplede linje, selv i nærheden af strålen center. De afbildede intensiteter viser, at baggrunden forbliver under 3 tæller. To svage ringe observeres ved 2.15 Å og 1.86 Å, som genereres af pulver diffraktion af kobberet i kryoTEM-gitteret. Der er ingen påviselige isringe, der viser effektiviteten af blotting efterfulgt af afkøling med flydende ethan. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Denne protokol viser, hvordan værktøjer fra kryoTEM prøve forberedelse kan bruges til fremstilling af mikrokrystaller til X-ray diffraktion eksperimenter på mikrofokus strålelinjer. Standard beamline instrumentering er centreret omkring en pin monteret prøve, og mens der er gjort en indsats for at yde en prøve støtte på disse mounts for mikrokrystaller, er de ofte udfordrende at indlæse med prøve og samtidig sikre, at den højeste signal-til-støj opnås (Figur 1C, D). Mange af disse prøver kan også kræve optimering af kryobeskyttelsesbetingelserne for at sikre, at prøven er glasagtig. Frysningsmetoden for dyk giver en repeterbar måde at fjerne overskydende væske på og blinke med at afkøle prøven i et effektivt kryogen (Figur 1A,B). Mens gitteret derefter kan monteres på en standard beamline med en pin pin mount, VMXm prøve indehavere er specielt designet til at acceptere gitre og holde dem under glasset overgang temperatur i et vakuum miljø via ledende køling. Prøven miljø VMXm muliggør lav baggrund dataindsamling, hvor prøven er den resterende kilde til baggrund, og giver en mikrostråle, der kan bruges til at matche krystaller med dimensioner mindre end 10 μm. Denne prøveforberedelsesmetode kan også anvendes til at forberede nanokrystaller til elektron diffraktion, hvor der også er behov for meget lidt overskydende væske og en glasagtig prøve på grund af den svage indtrængen af elektroner. Mens cryoTEM gitre er skrøbelige, dem, der opleves i høst af krystaller i sløjfer vil hurtigt tilpasse sig håndteringen af gitre. Med en lille mængde erfaring vil få gitre gå tabt under blotting, frysning og indlæsning af faser af protokollen. Optimeringstrinnene er dog afgørende for denne succes, og omhyggelig forberedelse vil reducere chancerne for at miste krystaller eller reducere krystalintegriteten.

CryoTEM gitre giver en relativt stor enkelt mount, der kan indeholde mange hundrede krystaller, hvilket forbedrer gennemløb, hvor det kun kan være muligt at registrere en lille kile af diffraktion data. Et enkelt gitter kan også give nok krystaller til at bestemme proteinstrukturen, især i krystaller med høj symmetri. Hvor kun en eller to enkelt krystallisering dråber har genereret mikrokrystaller, forsøg blotting af krystallisering tilstand alene kan bidrage til at sikre, at når mikrokrystaller er blottet, de anvendte tider er så tæt som muligt på dem, der er nødvendige for at generere indledende god kvalitet prøver. Carbon-film understøtter er usynlige for røntgenstråler og fås med forskellige hulafstand, som kan bruges til at passe til en bestemt morfologi. Vi bruger oftest støttefilm med 2 μm huller med en afstand på 2 μm, men mindre huller med større afstand kan være mere passende for krystaller mindre end 2 μm. Andre støttefilm som dem med 1 μm huller med en afstand på 4 μm samt støttefilm med forskellige formede huller er tilgængelige, som alle vil påvirke blottingtiden. Et gitter kvadratisk mesh størrelse på 200 (200 kvadrater per tomme) giver også nok plads (~ 100 μm) mellem kobber gitter barer, således at røntgenstrålen ikke stærkt interagere med kobber og samtidig give nok strukturel støtte til kulstof-film fyldt med krystaller. Brugen af flydende ethan ophæver behovet for kryobeskyttende midler, hvilket igen reducerer kravet om prøvevolumen, der ville have været brugt til optimering af kryobeskyttende forhold.

De vigtigste parametre, der skal optimeres under processen, er blotting gange og prøve fortynding. Blotting gange bør være lang nok til at observere 'popping' effekt på tværs af hele nettet, før springet frysning. Over blotting kan resultere i dehydrering af krystallerne, men kontrol af fugtigheden i prøvekammeret bruges til at minimere denne effekt. Mens det foreslås, at en relativ luftfugtighed på 90% anvendes, nogle prøver kan drage fordel i optimering af fugtigheden. Fugtigheden kan påvirke blotting effektiviteten af blotting papir, som langsomt kan blive mættet med vand. Derudover kan fugtighedskontrol i prøvekammeret anvendes til at forbedre diffraktionskvaliteten af krystallerne30. Det anbefales, at der foretages små ændringer (<5 %) i fugtigheden, før diffraktionsintegriteten kontrolleres for at sikre, at diffraktionskvaliteten ikke forringes.

Optimering af ikke-dyrebare prøver kan udføres ved hjælp af et lysmikroskop i stedet for en SEM. Selvom det er destruktivt, er det nyttigt til at vurdere tætheden af krystaller på tværs af nettet og for at muliggøre beslutningstagning om, hvorvidt en prøve skal fortyndes eller koncentreres for bedre at sprede krystaller over gitteret. Dette trin er mest nyttigt, når der er et stort antal krystaller til rådighed og særligt stærkt koncentrerede prøver. Klumpning sammen af krystaller bør undgås (Figur 3), som om det ikke er et væsentligt problem, hvis to krystaller lyser på samme tid under dataindsamling6, vil der sandsynligvis være en større mængde væske omkring klumpen, hvilket reducerer signal-til-støj (figur 5). Mens det er muligt at observere store udskejelser af væske globalt på tværs af nettet ved hjælp af et let mikroskop, kan vurdering af væskemængden omkring mikrokrystallerne og tilstedeværelsen af krystallinsk is kun foretages ved hjælp af et elektronmikroskop udstyret med et kryogent vakuumoverførselssystem og -stadium. Nogle gange, efter påføring af krystallerne til gitteret, og før blotting opstår, kan krystaller i lave viskositetsløsninger bosætte sig langs den ene kant af gitteret. Vi har konstateret, at tilføje op til en 50% endelig koncentration af ethylenglycol kan bremse bevægelsen af krystaller gennem dråben, sikre en bedre fordeling af mikrokrystaller på tværs af nettet samt give større kontrol over blotting ved at øge blotting tid (Figur 3D).

Nogle krystalliseringsløsninger, der indeholder tyktflydende udfældende midler såsom høj molekylvægt PEGs kan vise sig udfordrende at blot, kræver stadig længere blotting gange (>10 s). I sådanne tilfælde kan det være nyttigt at reducere mængden af væske deponeret på bagsiden af nettet samt mængden af krystal indeholdende opløsning til støttefilmsiden af gitteret. Strategier såsom brug af 2 lag blotting papir eller glasfiber kan også støtte blotting i disse vanskelige tilfælde31.

Mens denne rørledning er velegnet til opløselige proteinkrystaller, udgør de, der dannes i meget tyktflydende medier som membranproteiner i LCP, en anden udfordring, som denne protokol ikke er egnet til. Der er imidlertid ved at opstå strategier til forberedelse af LCP-krystaller på kryoTEM-net til mikroED, som omfatter reduktion af prøvernes viskositet ved at fremkalde en faseændring af LCP. Dette gør det muligt at anvende prøverne på gitre på samme måde som dem, der er beskrevet i denne artikel. Endelig kan prøven fræses med en fokuseret ionstråle for at fjerne overskydende ikke-krystalmateriale32,33,34.

Samlet set vil denne rørledning generelt tage 1-2 timer (herunder udstyr setup tid) til at følge fra prøven ankommer til VMXm til at give optimerede gitre med godt spredte, vitrified prøver, afhængigt af prøvens tilgængelighed, koncentrationen af krystaller og viskositet af krystallisering løsning. Disse metoder er allerede med succes blevet anvendt til fremstilling af mikrokrystaller til røntgen diffraktionsforsøg , der undersøger strålingsskader på mikrokrystaller, hvor en minimal mængde væske omkring prøven var afgørende28,35. Det skal bemærkes, at protokollen kan anvendes på alle opløselige mikrokrystalprøver, ikke kun for godt diffrakting prøver, der allerede er optimeret. Et krystalliseringseksperiment, der producerer mikrokrystallinsk materiale, ville traditionelt være et mål for optimering med det formål at opnå større krystaller, men denne prøveforberedelsesmetode og VMXM's evner kan tillade, at der indsamles tilstrækkelige data fra sådanne prøver uden yderligere optimering. Alternativt, hvis sådanne mikrokrystallinske prøver diffract dårligt, de data, der indsamles fra VMXm ved hjælp af denne prøve forberedelse metode kan stadig fungere som en nyttig vejledning for yderligere optimering af krystallisering betingelser. Værktøjerne til klarning af gitre, herunder glødeudladning og dykfrysning, er nu bredt tilgængelige i forskningsinstitutter, der er udstyret til kryoTEM-eksperimenter, og vil være tilgængelige for mange brugere, der gør det muligt for dem at forberede prøver forud for stråletid på VMXm.

Disclosures

Ingen interessekonflikter at erklære.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne takke Jeremy Keown, Jon Grimes, Geoff Sutton og Dave Stuart, STRUBI University of Oxford og Rachel Bolton, University of Southampton for venligt at give microcrystal prøver til udvikling og demonstration af prøveforberedelse metoder til VMXm beamline ud over at muliggøre idriftsættelse af beamline. Forfatterne vil også gerne takke iNEXT-Discovery (projektnummer 871037) for muligheden og støtten til at offentliggøre dette manuskript.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Automated Cryo-EM plunge freezing instrument Leica or ThermoFisher Various
Benchtop light microscope with light source Various Various
Blade/Scalpel Fisher Scientific Various
CryoTEM Copper 200 mesh grids with carbon support film with 2 µm holes Quantifoil N1-C16nCu20-50
CryoTEM grid storage boxes Agar Scientific AGG3727
ddH2O n/a n/a
Ethane gas supply n/a n/a
Ethylene Glycol Acros Organics 146750010
Glass microscope slides FisherBrand 12383118
Glass petri dish FisherBrand 455732
Glow discharging device Pelco 91000S
Laboratory wrapping film (Parafilm) Bemis HS234526B
Large and small, fine forceps Agar Scientific Various
Liquid nitrogen supply n/a n/a
Pipette tips Various Various
Pipetting devices Various Various
Sealing tape for crystallisation plates. Molecular Dimensions MD6-01
Small/medium liquid nitrogen dewars Spearlab Various
Sprung circlip clipping tool Subangstrom SCT08
Whatmann No.1 pre-cut filter paper Leica 16706440

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Laundy, D., et al. Development of a multi-lane X-ray mirror providing variable beam sizes. Review of Scientific Instruments. 87 (5), 051802-051806 (2016).
  2. McPherson, A., Gavira, J. A. Introduction to protein crystallization. Acta crystallographica. Section F, Structural biology communications. 70, Pt 1 2-20 (2014).
  3. McPherson, A., Cudney, B. Optimization of crystallization conditions for biological macromolecules. Acta crystallographica. Section F, Structural biology communications. 70 (11), 1445-1467 (2014).
  4. Holton, J. M., Frankel, K. A. The minimum crystal size needed for a complete diffraction data set. Acta Crystallographica Section D. 66, Pt 4 393-408 (2010).
  5. Garman, E. F., Owen, R. L. Cryocooling and radiation damage in macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D. 62 (1), 32-47 (2005).
  6. Gildea, R. J., et al. New methods for indexing multi-lattice diffraction data. Acta Crystallographica Section D. 70, Pt 10 2652-2666 (2014).
  7. Chapman, H. N. X-Ray Free-Electron Lasers for the Structure and Dynamics of Macromolecules. Annual Review of Biochemistry. 88 (1), 35-58 (2019).
  8. Beale, J. H., et al. Successful sample preparation for serial crystallography experiments. Journal of Applied Crystallography. 52, 1385-1396 (2019).
  9. Smith, J. L., Fischetti, R. F., Yamamoto, M. Micro-crystallography comes of age. Current Opinion in Structural Biology. 22 (5), 602-612 (2012).
  10. Owen, R. L., Juanhuix, J., Fuchs, M. Current advances in synchrotron radiation instrumentation for MX experiments. Archives of Biochemistry and Biophysics. 602, 21-31 (2016).
  11. Miller, M., et al. Getting the Most Out of Your Crystals: Data Collection at the New High-Flux, Microfocus MX Beamlines at NSLS-II. Molecules. 24 (3), 496 (2019).
  12. Axford, D., Ji, X., Stuart, D. I., Sutton, G. In cellulo structure determination of a novel cypovirus polyhedrin. Acta Crystallographica Section D. 70, Pt 5 1435-1441 (2014).
  13. Ji, X., et al. Polyhedra structures and the evolution of the insect viruses. Journal of structural biology. 192 (1), 88-99 (2015).
  14. Evans, G., Axford, D., Owen, R. L. The design of macromolecular crystallography diffraction experiments. Acta Crystallographica Section D. 67, Pt 4 261-270 (2011).
  15. MiTeGen. MiTeGen. , Available from: https://www.mitegen.com/product/micromeshes/ (2020).
  16. Guo, G., et al. Sample manipulation and data assembly for robust microcrystal synchrotron crystallography. IUCrJ. 5, 238-246 (2018).
  17. Cipriani, F., et al. Automation of sample mounting for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D. 62 (10), 1251-1259 (2006).
  18. Caffrey, M. A comprehensive review of the lipid cubic phase or in mesomethod for crystallizing membrane and soluble proteins and complexes. Acta crystallographica. Section F, Structural biology communications. 71 (1), 3-18 (2015).
  19. Thompson, R. F., Walker, M., Siebert, C. A., Muench, S. P., Ranson, N. A. An introduction to sample preparation and imaging by cryo-electron microscopy for structural biology. Methods. 100, 3-15 (2016).
  20. Nannenga, B. L. MicroED methodology and development. Structural Dynamics. , 1-8 (2020).
  21. Dubochet, J., et al. Cryo-electron microscopy of vitrified specimens. Quarterly Reviews of Biophysics. 21 (2), 129-228 (1988).
  22. Tivol, W. F., Briegel, A., Jensen, G. J. An improved cryogen for plunge freezing. Microscopy and Microanalysis. 14 (5), 375-379 (2008).
  23. Garman, E. F., Schneider, T. R. Macromolecular Cryocrystallography. Journal of Applied Crystallography. 30 (3), 211-237 (1997).
  24. Pflugrath, J. W. Practical macromolecular cryocrystallography. Acta Crystallographica Section F. 71 (6), 622-642 (2015).
  25. Alcorn, T., Juers, D. H. Progress in rational methods of cryoprotection in macromolecular crystallography. Acta crystallographica Section D. 66, Pt 4 366-373 (2010).
  26. Bowler, M. W., Montgomery, M. G., Leslie, A. G. W., Walker, J. E. Reproducible improvements in order and diffraction limit of crystals of bovine mitochondrial F(1)-ATPase by controlled dehydration. Acta Crystallographica Section D. 62, Pt 9 991-995 (2006).
  27. Pellegrini, E., Piano, D., Bowler, M. W. Direct cryocooling of naked crystals: are cryoprotection agents always necessary. Acta Crystallographica Section D. 67, Pt 10 902-906 (2011).
  28. Beale, E. V., et al. Scanning electron microscopy as a method for sample visualization in protein X-ray crystallography. IUCrJ. , 1-9 (2020).
  29. Hattne, J., et al. Analysis of Global and Site-Specific Radiation Damage in Cryo-EM. Structure. 26 (5), 759-766 (2018).
  30. Sanchez-Weatherby, J., et al. Improving diffraction by humidity control: a novel device compatible with X-ray beamlines. Acta crystallographica Section D. 65 (12), 1237-1246 (2009).
  31. Tan, Y. Z., Rubinstein, J. L. Through-grid wicking enables high-speed cryoEM specimen preparation. Acta Crystallographica Section D. 76 (11), 1092-1103 (2020).
  32. Martynowycz, M. W., Khan, F., Hattne, J., Abramson, J., Gonen, T. MicroED structure of lipid-embedded mammalian mitochondrial voltage-dependent anion channel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (51), 32380-32385 (2020).
  33. Zhu, L., et al. Structure Determination from Lipidic Cubic Phase Embedded Microcrystals by MicroED. Structure. 28 (10), 1149-1159 (2020).
  34. Polovinkin, V., et al. Demonstration of electron diffraction from membrane protein crystals grown in a lipidic mesophase after lamella preparation by focused ion beam milling at cryogenic temperatures. Journal of Applied Crystallography. 53 (6), 1416-1424 (2020).
  35. Storm, S. L. S., et al. Measuring energy-dependent photoelectron escape in microcrystals. IUCrJ. 7 (1), 129-135 (2020).

Tags

Biokemi udgave 172 Kryo-krystallografi mikrokrystallografi makromolektær krystallografi mikrokrystal elektron diffraktion.
En prøveforberedelsespipeline til mikrokrystaller på VMXm Beamline
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Crawshaw, A. D., Beale, E. V.,… More

Crawshaw, A. D., Beale, E. V., Warren, A. J., Stallwood, A., Duller, G., Trincao, J., Evans, G. A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline. J. Vis. Exp. (172), e62306, doi:10.3791/62306 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter