Summary
As células-tronco de glioma (GSCs) são uma pequena fração de células cancerosas que desempenham papéis essenciais na iniciação do tumor, angiogênese e resistência a medicamentos no glioblastoma (GBM), o tumor cerebral primário mais prevalente e devastador. A presença de GSCs torna o GBM muito refratária para a maioria dos agentes alvos individuais, de modo que métodos de triagem de alto rendimento são necessários para identificar potenciais terapêuticas de combinação eficaz. O protocolo descreve um fluxo de trabalho simples para permitir uma triagem rápida para terapia de combinação potencial com interação sinérgica. As etapas gerais deste fluxo de trabalho consistem em estabelecer GSCs com marca de luciferase, preparar placas revestidas de matrigel, triagem combinada de medicamentos, analisar e validar os resultados.
Abstract
As células-tronco de glioma (GSCs) são uma pequena fração de células cancerosas que desempenham papéis essenciais na iniciação do tumor, angiogênese e resistência a medicamentos no glioblastoma (GBM), o tumor cerebral primário mais prevalente e devastador. A presença de GSCs torna o GBM muito refratária para a maioria dos agentes alvos individuais, de modo que métodos de triagem de alto rendimento são necessários para identificar potenciais terapêuticas de combinação eficaz. O protocolo descreve um fluxo de trabalho simples para permitir uma triagem rápida para terapia de combinação potencial com interação sinérgica. As etapas gerais deste fluxo de trabalho consistem em estabelecer GSCs com marca de luciferase, preparar placas revestidas de matrigel, triagem combinada de medicamentos, analisar e validar os resultados.
Introduction
Glioblastoma (GBM) é o tipo mais comum e agressivo de tumor cerebral primário. Atualmente, a sobrevida geral de pacientes com GBM que receberam tratamento máximo (uma combinação de cirurgia, quimioterapia e radioterapia) ainda é menor que 15 meses; por isso terapias novas e eficazes para GBM são urgentemente necessárias.
A presença de células-tronco de glioma (GSCs) no GBM constitui um desafio considerável para o tratamento convencional, uma vez que essas células-tronco desempenham papéis pivôs na manutenção do microambiente tumoral, resistência a medicamentos e recorrência do tumor1. Portanto, direcionar GSCs pode ser uma estratégia promissora para o tratamento GBM2. No entanto, uma grande desvantagem para a eficácia da droga no GBM é sua natureza heterogenética, incluindo, mas não se limitando à diferença de mutações genéticas, subtipos mistos, regulação epigenética e microambiente tumoral, o que os torna muito refratários para o tratamento. Depois de muitos testes clínicos fracassados, cientistas e pesquisadores clínicos perceberam que a terapia-alvo de um único agente é provavelmente incapaz de controlar totalmente a progressão de cânceres altamente heterogêneos, como o GBM. Considerando que, combinações de medicamentos cuidadosamente selecionadas foram aprovadas para sua eficácia, aumentando sinérgicamente o efeito uns dos outros, fornecendo assim uma solução promissora para o tratamento de GBM.
Embora existam muitas maneiras de avaliar as interações medicamentosa-droga de uma combinação de drogas, como o CI (Índice de Combinação), HSA (Highest Single Agent) e os valores bliss, etc.3,4, esses métodos de cálculo são geralmente baseados em múltiplas combinações de concentração. De fato, esses métodos podem fornecer avaliação afirmativa da interação medicamentosa-droga, mas podem ser muito trabalhosos se forem aplicados na triagem de alto rendimento. Para simplificar o processo, foi desenvolvido um fluxo de trabalho de triagem para identificar rapidamente as combinações potenciais de medicamentos que inibem o crescimento de GSCs originados de biópsias cirúrgicas do GBM do paciente. Um Índice de Sensibilidade (SI) que reflete a diferença do efeito combinado esperado e o efeito combinado observado foi introduzido neste método para quantificar o efeito sinérgico de cada droga, de modo que os candidatos potenciais podem ser facilmente identificados pelo ranking SI. Enquanto isso, este protocolo demonstra uma tela de exemplo para identificar os potenciais candidatos que podem sinergizar o efeito anti-glioma com temozolomide, a quimioterapia de primeira linha para o tratamento de GBM, entre 20 pequenos inibidores moleculares.
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Protocol
A amostra GBM foi adquirida de um paciente durante uma operação de rotina após obter o consentimento totalmente informado pelo comitê de ética em pesquisa humana do Primeiro Hospital Afiliado da Universidade Médica de Nanjing.
1. Isolamento e cultura de GSCs derivados do paciente
- Coloque tecido glioblastoma ressecado cirurgicamente fresco em um tubo de centrífuga de 15 mL cheio de PBS estéril e armazene o tecido no gelo até uma nova operação.
- Pique o tecido GBM em peças de aproximadamente 0,5 a 1 mm de diâmetro usando uma tesoura de dissecção e lave as amostras de tecido com meio basal neuronal para remover detritos celulares em um armário de biossegurança.
- Digerir os fragmentos de tecido com colagenase de 1 mg/mL A 37 °C por 30 min e centrífuga a 400 x g por 5 min a 4 °C.
- Remova o supernatante e suspenda a pelota com meio basal neuronal em branco e dissocia a pelota mecanicamente por tubos repetitivos no gelo.
- Cultura a mistura em ultra-baixo apego 6-bem placas de cultura preenchidas com meio de cultura GSC (ver Tabela 1 para a receita) em uma incubadora celular estéril com 5% de CO2 e 90% de umidade a 37 °C até a formação da neurosfera.
- Em formação de neurosfera suficiente, colete-os usando uma pipeta em um microtubo de 1,5 mL e centrífuga a 800 x g por 5 min à temperatura ambiente.
- Resuspenque a pelota e divida-a em vários frascos preenchidos com o meio de cultura acima para manter os GSCs primários.
NOTA: Os GSCs derivados do paciente utilizados no exemplo foram derivados de biópsias cirúrgicas de um paciente do sexo masculino de 34 anos com GBM recorrente grau IV da OMS. Os GSCs foram nomeados como XG387 para os experimentos futuros. Foram realizados testes de mycoplasma baseados em PCR para os GSCs acima para confirmar que não há contaminação por micoplasma. Todos os experimentos envolvendo GSCs utilizados neste protocolo foram realizados <15 passagens.
2. Preparando GSCs com marca de luciferase
- Colete os GSCs da cultura média e centrifuá-los a 70 x g por 3 min a temperatura ambiente.
- Retire o supernasce, digera as células com accutase por 4 min a 37 °C. Use uma ponta de 200 μL e pipeta repetidamente para dissociar e resuspensar a pelota celular.
- Diluir as células para 2 x 105 células por poço em uma placa de cultura de 12 poços e cultivar as células durante a noite.
- Adicione 30 μL de luciferase-EGFP vírus supernante (titer >108 TU /mL) em cada poço na placa e, em seguida, centrifugar as células a 1.000 x g por 2 h a 25 °C. Cultume as células da noite para o dia.
- Refrescar o meio no dia seguinte e cultivar as células por mais 48 h.
- Observe as células sob um microscópio florescente para confirmar o aparecimento das células positivas do GFP.
- Use um classificador de células de fluxo para classificar e selecionar os GSCs com alta fluorescência de GFP para cultivar ainda mais as células.
3. Medição baseada em biolumescência da viabilidade celular
- Placas de revestimento com a mistura de matriz extracelular (ECM) (por exemplo, Matrigel): Adicione 40 μL de mistura de 0,15 mg/mL ECM a cada poço e incubar a placa por 1 h a 37 °C. Retire o excesso de mistura de ECM e enxágue delicadamente uma vez com PBS.
- Adicionar 100 μL meio de cultura contendo 15.000, 10.000, 8.000, 6.000, 4.000, 2.000, 1.000, e 500 células XG387-Luc juntamente com 100 μL médio em branco como controle em cada poço para 6 réplicas em uma placa de fundo óptica de 96 poços e cultura as células durante a noite a 37 °C.
- Remova o supernasciante, adicione 50 μL de cultura média contendo 150 ng/μL D-luciferin em cada poço e incubar as células por 5 min a 37 °C.
- Tire imagens da biolumescência celular na placa usando o sistema de imagem de espectro IVIS. Use o software incorporado para criar múltiplas áreas circulares da região de interesse (ROI) e quantificar a biolumescência celular.
4. Tratamento temozolomide e triagem de combinação
- Precoat quatro placas de 96 poços como descrito acima, antes do tratamento.
- Células sementes XG387-Luc a uma densidade de 1.000 células em 100 μL cultura média em cada poço de uma placa de fundo óptica de 96 poços e cultura as células durante a noite.
- Prepare a temozolomide e os agentes-alvo da solução de estoque com antecedência. Prepare uma série de concentração composta por 800 μM, 600 μM, 400 μM, 300 μM, 200 μM, 100 μM e 50 μM temozolomide em meio de cultura para o tratamento de um único agente. Temozolomida diluída e os agentes-alvo em solução de estoque no meio da cultura, respectivamente, para obter concentrações finais de 200 μM e 2 μM para triagem combinada de medicamentos(Tabela 2).
- Remova o meio de cultura quando a maioria dos GSCs aderir à parte inferior das placas; adicione o meio acima preparado contendo temozolomida em cada poço para três réplicas técnicas por tratamento.
- Para tratar temozolomide e para tela as combinações de drogas removam o meio em branco e adicionem o meio acima preparado contendo temozolomida de 200 μM, ou 2 μM agente-alvo, ou uma combinação de ambos em cada poço para três réplicas técnicas por tratamento.
- Incubar todas as placas a 37 °C, 5% de CO2 durante 3 dias.
- Remova o meio contendo a droga, adicione 50 μL de meio em branco contendo 150 ng/μL D-luciferin em cada poço e incubar as células por 5 min a 37 °C.
- Tire imagens da biolumescência celular na placa usando o sistema de imagem de espectro IVIS. Use o software incorporado para criar VÁRIOS ROIs circulares e quantificar a biolumescência celular.
5. Tratamento combinado de temozolomida e umi-77 em linhas celulares XG387-Luc e XG328-Luc
- Precoat três placas de 96 poços como descrito acima, antes do tratamento.
- Células seed XG387-Luc e XG328-Luc a uma densidade de 1.000 células, respectivamente, em 100 μL de cultura média em cada poço de uma placa de fundo óptica de 96 poços e cultura das células durante a noite.
- Prepare uma série de concentração composta de 600 μM, 400 μM, 300 μM, 200 μM, 100 μM, 50 μM, e 0 μM temozolomide e uma série de concentração composta por 6 μM, 4 μM, 3 μM, 2 μM, 1 μM, 0,5 μM e 0 μM UMI-77 no meio de cultura para tratamentos de matriz de mama de seis por seis doses.
- Remova o meio em branco quando a maioria dos GSCs aderir à parte inferior da placa; adicione o meio acima preparado em cada poço para três réplicas técnicas por tratamento.
- Incubar essas placas por 3 dias a 37 °C, 5% de CO2.
- Remover o meio contendo drogas; adicionar 50 μL de meio em branco contendo 150 ng/μL D-luciferin em cada poço e incubar as células por 5 min a 37 °C para medição de bioluminescência.
6. Análise de dados
- Calcular o escore de Índice de Sensibilidade (SI) de temozolomida e agente-alvo de acordo com a fórmula da Figura 2A.
NOTA: A pontuação si é quantificar a influência da adição de outra droga. Variou de -1 a +1, com valores positivos indicando efeitos sinergísticos temozolomide. - Calcule os valores do índice de combinação (CI) entre temozolomide e UMI-77 usando o software CompuSyn para analisar suas interações combinadas. O valor de CI <1 indica sinergia; O valor de CI >1 indica antagonismo.
- Calcule os altos valores de agente único (HSA) entre temozolomide e UMI-77 usando o software Combenefit. O valor do HSA indica o efeito inibidor combinado. O valor do HSA >0 indica sinergia e o valor HSA <0 indica antagonismo.
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Representative Results
As células XG387 formaram neuroesferas no meio de cultura descrito na Tabela 1 em uma placa de cultura de 6 poços de apego ultra-baixa ou uma placa não revestida5 (Figura 1A). Primeiro, foi realizado um teste para verificar se a intensidade de biolumescência das células XG387-Luc era proporcional ao número celular. Como mostrado na Figura 1B,a intensidade da biolumescência aumentou proporcionalmente à densidade celular e resultou em uma correção linear entre eles (Pearson r = 0,9872; p < 0,0001; Figura 1C). Uma vez que a biolumescência das células marcadas pela luciferase é fácil e rápida de medir, isso fornece um método simples para medir a densidade de GSCs viáveis. Em seguida, foi avaliada a atividade anti-proliferativa da temozolomida. Como mostrado na Figura 1D, 400 μM temozolomida causou aproximadamente 20% de inibição de proliferação de células XG387-Luc, sugerindo que é útil, mas seu efeito anti-GBM pode ser melhorado ainda mais. A concentração de 200 μM foi selecionada para a triagem combinada.
Para dar um exemplo, 20 inibidores de pequenas moléculas seletivas foram utilizados para a triagem da combinação de medicamentos para identificar o potencial candidato que aumenta o efeito anti-GBM do temozolomide. Como resultado, os valores do índice sensível (SI) de 13 agentes-alvo estavam acima de 0, sendo 5 deles acima de 0,1 (Figura 2B,C). Especialmente, o SI dos dois principais candidatos drogas UMI-77 e A 83-01 foram superiores a 0,25, sugerindo seu potencial de sinergizar com temozolomide.
Para validar o achado acima, os modelos clássicos de sinergia de HSA e Bliss3,4,6 foram aplicados para determinar o efeito combinado de temozolomide e UMI-77 em GSCs. Além disso, o XG328- outro modelo GSC derivado do paciente estabelecido precocemente - foi utilizado para realizar a mesma avaliação. O ensaio anti-proliferativo do tratamento combinado de temozolomida e UMI-77 foi realizado em uma matriz de titulação de seis por seis doses. Os resultados foram analisados para adquirir os valores HSA e Bliss que são leituras para inibição sinérgica e retratam a diferença entre a inibição esperada e a inibição observada. Como mostrado na Figura 3B-D,o índice de combinação (CI) valoriza <1 e os valores de agente único elevado (HSA) >0 para a maioria das combinações de temozolomide e UMI-77 em diferentes concentrações, sugere uma interação sinérgica geral de temozolomide e UMI-77 em ambos os GSCs XG387 e XG328.
Figura 1: GSCs derivados do paciente GBM XG387. (A) Formação da neurosfera. (B) A geração de biolumescência de GSCs marcados por luciferase. (C) A biolumescência gerada pelas células XG387-Luc foi proporcional à densidade celular. (D) Tratamento temozolomide de XG387. Cada tratamento foi realizado em triplicado com dois experimentos independentes. Os dados são expressos como a média ± SD. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Triagem de combinação de drogas usando GSCs. (A) A fórmula para calcular o SI (índice de sensibilidade) de 20 agentes-alvo com temozolomide (TMZ) na tela de combinação. (B) A distribuição dos valores de SI de 20 agentes-alvo. Pontos vermelhos: as cinco melhores drogas candidatas. (C) Informações dos cinco principais agentes-alvo do candidato. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Tratamento combinado de temozolomida (TMZ) e UMI-77 em linhas celulares XG387-Luc e XG328-Luc. (A) Titulação única e combinatória de temozolomida e UMI-77 em um ensaio de proliferação nas linhas celulares XG387-Luc e XG328-Luc. (B) Isobolograma e análise do índice de combinação da inibição de proliferação nas células XG387-Luc e XG328-Luc tratadas com temozolomida e UMI-77. CI <1 indica um efeito sinérgico. (C,D) Parcelas de sinergia geradas pela Combenefit mostrando a interação entre temozolomide e UMI-77. A análise da interação resultou em valores de HSA (agente único elevado) e valores de Felicidade, indicando eficácia sinérgica calculada a partir do esperado. Os valores de HSA e Bliss >0 indicam efeitos sinérgicos. Cada tratamento foi realizado em triplicado com dois experimentos independentes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
No presente estudo, foi descrito um protocolo que pode ser aplicado para identificar uma potencial terapia de combinação para GBM usando GSCs derivados do paciente. Ao contrário do modelo métrico de sinergia/aditividade padrão, como os métodos Loewe, BLISS ou HSA, foi utilizado um fluxo de trabalho simples e rápido que não requer que um par de drogas seja combinado em múltiplas concentrações de forma fatorial completa como os métodos tradicionais. Neste fluxo de trabalho, o SI (índice de sensibilidade) que é originado de um estudo para avaliar o efeito sensibilizador dos siRNAs em combinação com pequeno inibidor molecular foi introduzido para quantificar o efeito sinérgico da droga de dois pequenos inibidores moleculares7. A faixa de valores si é de -1 para 1, e o valor positivo do SI indica um efeito sensibilizador entre cada um dos medicamentos. Quanto maior o valor si alcançado, mais forte foi a sinergia. Embora o valor si por si seja incapaz de fornecer uma resposta afirmativa sobre o tipo (sinérgico, aditivo ou antagônico) da interação droga-droga, esses candidatos mais bem classificados têm alta probabilidade de sinergizar com a droga de interesse e, portanto, são dignos de uma validação adicional. Em comparação, a maioria das metodologias atuais de triagem de combinações de drogas de alto rendimento ainda são laboriosas e envolvem algoritmos difíceis8,9.
Para exemplificar a viabilidade desse método, foi realizada uma tela de teste em pequena escala. Como resultado, foi possível identificar o UMI-77, um inibidor seletivo do MCL1, como o principal candidato entre 20 agentes-alvo para sinergizar com temozolomide na supressão de crescimento dos GSCs. De fato, em um estudo anterior, o UMI-77 também foi encontrado para aumentar sinérgicamente a atividade anti-glioma da temozolomida em células GBM estabelecidas10. No presente estudo, a interação sinérgica entre UMI-77 e temozolomide foi aprovada novamente em GSCs usando o índice clássico de combinação Chou-Talalay, métodos BLISS ou HSA. Outra vantagem deste protocolo é o uso de GSCs com marca de luciferase para medir a proporção viável das células. A atividade luciferase das células pode ser facilmente medida pela adição da luciferina, o substrato da luciferase, e capturar a luminescência por qualquer instrumento com a função de medição luminométrica. Como a reação luciferase-luciferina é rápida, aqui fornece uma solução barata e rápida em comparação com o MTT tradicional (4-(4,5-Dimetilthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium brometo), MTS(3-((3-((3-(4,5-dimetilthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H tetrazolium), ou CCK-8 (kit de contagem celular-8), todos os quais requerem longos tempos de incubação. Juntos, o protocolo apresenta uma triagem de alto rendimento de combinação potencial de drogas para GBM. O protocolo também fornece solução rápida e simples opcional para a tela de combinação de medicamentos, além dos métodos de avaliação de sinergia padrão.
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Disclosures
Os autores não declaram conflitos para divulgar.
Acknowledgments
Agradecemos à Fundação Nacional de Ciência Natural da China (81672962), à Fundação do Programa de Inovação Provincial de Jiangsu e à Joint Key Project Foundation da Universidade do Sudeste e à Universidade Médica de Nanjing pelo apoio.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B-27 | Gibco | 17504-044 | 50X |
| EGF | Gibco | PHG0313 | 20 ng/ml |
| FGF | Gibco | PHG0263 | 20 ng/ml |
| Gluta Max | Gibco | 35050061 | 100X |
| Neurobasal | Gibco | 21103049 | 1X |
| Penicillin-Streptomycin | HyClone | SV30010 | P: 10,000 units/ml S: 10,000 ug/ml |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 2088876 | 100 mM |
| Table 1. The formulation of GSC complete culture medium. | |||
| ABT-737 | MCE | Selective and BH3 mimetic Bcl-2, Bcl-xL and Bcl-w inhibitor | |
| Adavosertib (MK-1775) | MCE | Wee1 inhibitor | |
| Axitinib | MCE | Multi-targeted tyrosine kinase inhibitor | |
| AZD5991 | MCE | Mcl-1 inhibitor | |
| A 83-01 | MCE | Potent inhibitor of TGF-β type I receptor ALK5 kinase | |
| CGP57380 | Selleck | Potent MNK1 inhibitor | |
| Dactolisib (BEZ235) | Selleck | Dual ATP-competitive PI3K and mTOR inhibitor | |
| Dasatinib | MCE | Dual Bcr-Abl and Src family tyrosine kinase inhibitor | |
| Erlotinib | MCE | EGFR tyrosine kinase inhibitor | |
| Gefitinib | MCE | EGFR tyrosine kinase inhibitor | |
| Linifanib | MCE | Multi-target inhibitor of VEGFR and PDGFR family | |
| Masitinib | MCE | Inhibitor of c-Kit | |
| ML141 | Selleck | Non-competitive inhibitor of Cdc42 GTPase | |
| OSI-930 | MCE | Multi-target inhibitor of Kit, KDR and CSF-1R | |
| Palbociclib | MCE | Selective CDK4 and CDK6 inhibitor | |
| SB 202190 | MCE | Selective p38 MAP kinase inhibitor | |
| Sepantronium bromide (YM-155) | MCE | Survivin inhibitor | |
| TCS 359 | Selleck | Potent FLT3 inhibitor | |
| UMI-77 | MCE | Selective Mcl-1 inhibitor | |
| 4-Hydroxytamoxifen(Afimoxifene) | Selleck | Selective estrogen receptor (ER) modulator | |
| Table 2. The information of 20 targeted agents used in the test screen. All of these are target selective small molecular inhibitors. The provider, name, and targets were given in the table. |
References
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