Summary
Gliom stamceller (GSCs) är en liten del av cancerceller som spelar väsentliga roller i tumörinitiering, angiogenes och läkemedelsresistens i glioblastom (GBM), den vanligaste och förödande primära hjärntumören. Förekomsten av GSCs gör GBM mycket eldfast för de flesta enskilda riktade agenter, så screeningmetoder med hög genomströmning krävs för att identifiera potentiella effektiva kombinationsterapier. Protokollet beskriver ett enkelt arbetsflöde för att möjliggöra snabb screening för potentiell kombinationsterapi med synergistisk interaktion. De allmänna stegen i detta arbetsflöde består i att upprätta luciferasmärkta GSCs, förbereda matrigelbelagda plattor, kombinera läkemedelsscreening, analysera och validera resultaten.
Abstract
Gliom stamceller (GSCs) är en liten del av cancerceller som spelar väsentliga roller i tumörinitiering, angiogenes och läkemedelsresistens i glioblastom (GBM), den vanligaste och förödande primära hjärntumören. Förekomsten av GSCs gör GBM mycket eldfast för de flesta enskilda riktade agenter, så screeningmetoder med hög genomströmning krävs för att identifiera potentiella effektiva kombinationsterapier. Protokollet beskriver ett enkelt arbetsflöde för att möjliggöra snabb screening för potentiell kombinationsterapi med synergistisk interaktion. De allmänna stegen i detta arbetsflöde består i att upprätta luciferasmärkta GSCs, förbereda matrigelbelagda plattor, kombinera läkemedelsscreening, analysera och validera resultaten.
Introduction
Glioblastoma (GBM) är den vanligaste och aggressiva typen av primär hjärntumör. För närvarande är den totala överlevnaden för GBM-patienter som fick maximal behandling (en kombination av kirurgi, kemoterapi och strålbehandling) fortfarande kortare än 15 månader; så nya och effektiva terapier för GBM är brådskande.
Förekomsten av gliom stamceller (GSCs) i GBM utgör en betydande utmaning för den konventionella behandlingen eftersom dessa stamliknande celler spelar pivot roller i underhållet av tumör microenvironment, läkemedelsresistens och tumör återkommande1. Därför kan inriktning på GSCs vara en lovande strategi för GBM behandling2. En stor nackdel för läkemedlets effekt i GBM är dock dess heterogenetiska natur, inklusive men inte begränsat till skillnaden i genetiska mutationer, blandade subtyper, epigenetisk reglering och tumörmikromiljö som gör dem mycket eldfasta för behandling. Efter många misslyckade kliniska prövningar insåg forskare och kliniska forskare att målinriktad behandling med en enda agent förmodligen inte helt kan kontrollera utvecklingen av mycket heterogena cancerformer som GBM. Noggrant utvalda läkemedelskombinationer har godkänts för deras effektivitet genom att synergistiskt förbättra effekten av varandra, vilket ger en lovande lösning för GBM-behandling.
Även om det finns många sätt att utvärdera läkemedelsinteraktionerna i en läkemedelskombination, såsom CI (Kombinationsindex), HSA (Högsta enskilda medel) och Bliss-värden, etc.3,4, baseras dessa beräkningsmetoder vanligtvis på flera koncentrationskombinationer. Dessa metoder kan faktiskt ge bekräftande bedömning av läkemedelsinteraktion men kan vara mycket mödosamma om de tillämpas vid screening med hög genomströmning. För att förenkla processen utvecklades ett screeningarbetsflöde för att snabbt identifiera de potentiella läkemedelskombinationer som hämmar tillväxten av GSCs från kirurgiska tarmbiopsier av patienten GBM. Ett känslighetsindex (SI) som återspeglar skillnaden mellan den förväntade kombinerade effekten och den observerade kombinerade effekten infördes i denna metod för att kvantifiera synergiseringseffekten av varje läkemedel, så att de potentiella kandidaterna lätt kan identifieras av SI-rankningen. Under tiden visar detta protokoll en exempelskärm för att identifiera den potentiella kandidaten/kandidaterna som kan synergisera anti-gliom-effekten med temozolomid, första linjens kemoterapi för GBM-behandling, bland 20 små molekylära hämmare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
GBM-exemplaret förvärvades från en patient under en rutinoperation efter att ha fått fullt informerat samtycke från human research ethics committee vid The First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University.
1. Isolering och odling av patientbaserade GSCs
- Placera färsk kirurgiskt rekterad glioblastomvävnad i ett 15 ml centrifugeringsrör fyllt med steril PBS och förvara vävnaden på is tills den är vidare.
- Hacka GBM-vävnaden i bitar med en diameter på cirka 0,5 till 1 mm med hjälp av dissekeringssax och tvätta vävnadsproverna med neuronalt basalt medium för att avlägsna cellulärt skräp i ett biosäkerhetsskåp.
- Smält vävnadsfragmenten med 1 mg/ml kollagenas A vid 37 °C i 30 min och centrifug vid 400 x g i 5 min vid 4 °C.
- Ta bort supernatanten och suspendera pelleten med blankt neuronalt basalt medium och dissociera pelleten mekaniskt genom repetitiv pipetting på is.
- Odla blandningen i ultralåga 6-brunns odlingsplattor fyllda med GSC-odlingsmedium (se tabell 1 för receptet) i en steril cellinkubator med 5% CO2 och 90% luftfuktighet vid 37 °C fram till neurosfärbildning.
- På tillräcklig neurosfärbildning, samla dem med en pipett i en 1,5 ml mikrorör och centrifugera vid 800 x g i 5 min vid rumstemperatur.
- Återanvänd pelleten och dela upp den i flera flaskor fyllda med ovanstående odlingsmedium för att bibehålla de primära GSC: erna.
OBS: Patient-härledda GSCs som används i exemplet härleddes från kirurgiska tarmbiopsier av en 34-årig manlig patient med WHO grad IV återkommande GBM. GSCs namngavs som XG387 för de framtida experimenten. PCR-baserade mycoplasma tester utfördes för ovanstående GSCs för att bekräfta att ingen mycoplasma förorening finns. Alla experiment som omfattade GSC som används i detta protokoll utfördes <15 passager.
2. Förbereda luciferasmärkta GSCs
- Samla GSCs från medelkulturen och centrifugera dem vid 70 x g i 3 min vid rumstemperatur.
- Ta bort supernatanten, smält cellerna med accutas i 4 min vid 37 °C. Använd en 200 μL spets och pipett upprepade gånger för att dissociera och återanvända cellpelleten.
- Späd cellerna till 2 x 105 celler per brunn i en 12-brunns odlingsplatta och odla cellerna över natten.
- Tillsätt 30 μL luciferas-EGFP-virus supernatant (titer >108 TU /mL) i varje brunn i plattan och centrifugera sedan cellerna vid 1 000 x g i 2 timmar vid 25 °C. Odla cellerna över en natt.
- Uppdatera mediet nästa dag och odla cellerna i ytterligare 48 timmar.
- Observera cellerna under ett florescent mikroskop för att bekräfta utseendet på GFP-positiva celler.
- Använd en flödescellsortering för att sortera och markera GSC:erna med hög GFP-fluorescens för att odla cellerna ytterligare.
3. Bioluminscensbaserad mätning av cellens livskraft
- Beläggningsplattor med blandningen extracellulär matris (ECM) (t.ex. Matrigel): Tillsätt 40 μL 0,15 mg/ml ECM-blandning till varje brunn och inkubera plattan i 1 timme vid 37 °C. Ta bort överskottet av ECM-blandningen och skölj försiktigt en gång med PBS.
- Tillsätt 100 μL odlingsmedium som innehåller 15 000, 10 000, 8 000, 6 000, 4 000, 2 000, 1 000 och 500 XG387-Luc-celler tillsammans med 100 μL tomt medium som kontroll i varje brunn i 6 replikater i en 96-brunns optisk bottenplatta och odla cellerna över natten vid 37 °C.
- Ta bort supernatanten, tillsätt 50 μL odlingsmedium som innehåller 150 ng/μL D-luciferin i varje brunn och inkubera cellerna i 5 min vid 37 °C.
- Ta bilder av cellulär bioluminscens i plattan med hjälp av IVIS-spektrumavbildningssystemet. Använd den inbyggda programvaran för att skapa flera cirkulära områden i intresseområdet (ROI) och kvantifiera den cellulära biolumnescence.
4. Behandling av Temozolomid och kombinationsscreening
- Förrock fyra 96-brunnsplattor enligt beskrivningen ovan, före behandlingen.
- Frö XG387-Luc celler med en densitet av 1000 celler i 100 μL odlingsmedium i varje brunn av en 96-brunn optisk bottenplatta och odla cellerna över natten.
- Förbered temozolomid och de riktade agenterna från lagerlösningen i förväg. Förbered en koncentrationsserie bestående av 800 μM, 600 μM, 400 μM, 300 μM, 200 μM, 100 μM och 50 μM temozolomid i odlingsmedium för enmedelsbehandling. Späd temozolomid och de målinriktade agenserna i stamlösningen i odlingsmediet för att erhålla slutliga koncentrationer på 200 μM respektive 2 μM för screening av kombinationsläkemedel (tabell 2).
- Ta bort odlingsmediet när de flesta GSC:er fäster vid botten av plattorna; tillsätt det ovan beredda mediet som innehåller temozolomid i varje brunn för tre tekniska replikat per behandling.
- För att behandla Temozolomide och för att screena läkemedelskombinationerna avlägsna det tomma mediet och tillsätt det ovan beredda mediet som innehåller antingen 200 μM temozolomid, eller 2 μM riktat medel, eller en kombination av båda i varje brunn för tre tekniska replikat per behandling.
- Inkubera alla plattor vid 37 °C, 5 % CO2 i 3 dagar.
- Ta bort det läkemedelsinnehållande mediet, tillsätt 50 μL tomt medium som innehåller 150 ng/μL D-luciferin i varje brunn och inkubera cellerna i 5 min vid 37 °C.
- Ta bilder av cellulär bioluminscens i plattan med hjälp av IVIS-spektrumavbildningssystemet. Använd den inbyggda programvaran för att skapa flera cirkulära ROM-skivor och kvantifiera den cellulära biolumnescence.
5. Kombinationsbehandling av temozolomid och UMI-77 i XG387-Luc- och XG328-Luc-cellinjer
- Förrock tre 96-brunnsplattor enligt beskrivningen ovan, före behandlingen.
- Frö XG387-Luc- och XG328-Luc-celler med en densitet på 1 000 celler respektive i 100 μL odlingsmedium i varje brunn på en 96-brunns optisk bottenplatta och odla cellerna över natten.
- Förbered en koncentrationsserie bestående av 600 μM, 400 μM, 300 μM, 200 μM, 100 μM, 50 μM och 0 μM temozolomid och en koncentrationsserie bestående av 6 μM, 4 μM, 3 μM, 2 μM, 1 μM, 0,5 μM och 0 μM UMI-77 i odlingsmediet för sex gånger sex dosers titreringsmatrisbehandlingar.
- Ta bort det tomma mediet när de flesta GSC:er fäster vid botten av plattan. tillsätt det ovanberedda mediet i varje brunn för tre tekniska replikat per behandling.
- Inkubera dessa plattor i 3 dagar vid 37 °C, 5 % CO2.
- Ta bort det läkemedelsinnehållande mediet; tillsätt 50 μL blindt medium som innehåller 150 ng/μL D-luciferin i varje brunn och inkubera cellerna i 5 min vid 37 °C för bioluminescensmätning.
6. Dataanalys
- Beräkna känslighetsindex (SI) för temozolomid och målämne enligt formeln i figur 2A.
OBS: SI-poängen är att kvantifiera påverkan av tillsats av ett annat läkemedel. Det varierade från -1 till +1, med positiva värden som indikerar temozolomide synergistiska effekter. - Beräkna kombinationsindexvärdena (CI) mellan temozolomid och UMI-77 med CompuSyn-programvara för att analysera deras kombinerade interaktioner. CI-<1 anger synergi; CI->1 indikerar antagonism.
- Beräkna de höga värdena för en enda agent (HSA) mellan temozolomid och UMI-77 med hjälp av Combenefit-programvara. HSA-värdet indikerar den kombinerade hämmande effekten. HSA->0 anger synergi och HSA-värdet <0 indikerar antagonism.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
XG387-cellerna bildade neurosfärer i odlingsmediet som beskrivs i tabell 1 i en ultralåg fastsättningsredskap 6-brunns odlingsplatta eller en icke-belagdplatta 5 (Figur 1A). Först utfördes ett test för att kontrollera om bioluminscensintensiteten från XG387-Luc-cellerna var proportionell mot cellnumret. Som visas i figur 1Bökade bioluminensintensiteten proportionellt mot celltätheten och resulterade i en linjär korrigering mellan dem (Pearson r = 0,9872; p < 0,0001; Figur 1C). Eftersom bioluminscensen hos luciferasmärkta celler är enkel och snabb att mäta, ger detta en enkel metod för att mäta densiteten hos livskraftiga GSCs. Därefter bedömdes den antiproliferativa aktiviteten av temozolomide. Som visas i figur 1Dorsakade 400 μM temozolomid cirka 20% spridningshämning av XG387-Luc-celler, vilket tyder på att det är användbart men dess anti-GBM-effekt kan förbättras ytterligare. Koncentrationen på 200 μM valdes ut för kombinationsscreeningen.
För att ge ett exempel användes 20 målselektiva små molekylhämmare för läkemedelskombinationsscreening för att identifiera den potentiella kandidaten eller kandidaterna som förbättrar anti-GBM-effekten av temozolomid. Till följd av detta var värdena för det känsliga indexet (SI) för 13 målagenter över 0, och 5 av dem var över 0,1 (figur 2B, C). Särskilt SI av de två främsta läkemedelskandidaterna UMI-77 och A 83-01 var högre än 0,25, vilket tyder på deras potential att synergisera med temozolomid.
För att validera ovanstående konstaterande tillämpades de klassiska synergimodellerna av HSA och Bliss3,4,6 för att bestämma den kombinerade effekten av temozolomid och UMI-77 i GSCs. Dessutom användes XG328-en annan patient-härledd GSC-modell som upprättats tidigt-för att utföra samma utvärdering. Anti-proliferative analys av kombinerade behandling av temozolomide och UMI-77 utfördes i en sex-av-sex doser titrering matris. Resultaten analyserades för att förvärva HSA- och Bliss-värdena som är avläsningar för synergistisk hämning och visar skillnaden mellan den förväntade hämningen och den observerade hämningen. Som visas i figur 3B-Dtyder kombinationsindexvärdena <1 och de höga värdena för ett enda medel (HSA) >0 för de flesta kombinationer av temozolomid och UMI-77 vid olika koncentrationer på en övergripande synergistisk interaktion mellan temozolomid och UMI-77 i både XG387 och XG328 GSCs.
Figur 1:GBM patientbaserade GSCs XG387. (A)Neurosfärbildning. ( B) Generering av luciferasmärkta GSC. (C) Biolumnescence som genereras av XG387-Luc celler var proportionell mot celldensiteten. D)Behandling med Temozolomid av XG387. Varje behandling utfördes i tre exemplar med två oberoende experiment. Uppgifterna uttrycks som medelvärdet ± SD. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Screening av läkemedelskombinationer med GSC. (A) Formeln för att beräkna SI (känslighetsindex) på 20 riktade medel med temozolomid (TMZ) i kombinationsskärmen. B)Fördelningen av SI-värden för 20 riktade agenser. Röda prickar: de fem bästa kandidaterna droger. C)Information om de fem främsta kandidaternas riktade agenter. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3: Kombinationsbehandling av temozolomid (TMZ) och UMI- 77 i XG387-Luc- och XG328- Luc-cellinjer. (B) Isobologram- och kombinationsindexanalys av spridningshämningen i XG387-Luc- och XG328- Luc-celler behandlade med temozolomid och UMI- 77. CI <1 indikerar en synergistisk effekt. C,D) Synergitomter genererade av Combenefit som visar interaktionen mellan temozolomid och UMI-77. Analys av interaktion resulterade i HSA -värden (höga värden för en enda agent) och Bliss-värden, vilket indikerar synergistisk effekt beräknad från förväntat. HSA- och Bliss-värden >0 indikerar synergistiska effekter. Varje behandling utfördes i tre exemplar med två oberoende experiment. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I den aktuella studien beskrevs ett protokoll som kan tillämpas för att identifiera potentiell kombinationsbehandling för GBM med patientbaserade GSCs. Till skillnad från standardsynergi/additivitetsmåttsmodellen som Loewe-, BLISS- eller HSA-metoder användes ett enkelt och snabbt arbetsflöde som inte kräver att ett läkemedelspar kombineras vid flera koncentrationer på ett fullständigt faktoriellt sätt som de traditionella metoderna. I detta arbetsflöde introducerades SI (känslighetsindex) som härstammar från en studie för att utvärdera siRNAs sensibiliserande effekt i kombination med liten molekylär hämmare för att kvantifiera den synergistiska läkemedelseffekten hos två små molekylära hämmare7. Intervallet av SI-värden är från -1 till 1, och det positiva SI-värdet indikerar en sensibiliserande effekt mellan vart och ett av drogerna. Ju högre SI-värde som uppnåddes, desto starkare synergi var. Även om SI-värdet ensamt är oförmöget att ge ett jakande svar om typen (synergistisk, additiv eller antagonistisk) av läkemedelsinteraktion, har dessa topprankade kandidater stor sannolikhet att synergisera med det intressevägda läkemedlet och är därför värda ytterligare validering. I jämförelse är de flesta av de nuvarande höggenomströmningsmetoderna för läkemedelskombinationer fortfarande mödosamma och involverar svåraalgoritmer 8,9.
För att exemplifiera genomförbarheten av denna metod utfördes en småskalig testskärm. Som ett resultat var det möjligt att identifiera UMI-77, en selektiv MCL1-hämmare, som toppkandidat bland 20 riktade agenter för att synergisera med temozolomid i GSCs tillväxtdämpning. I en tidigare studie konstaterades UMI-77 också synergistiskt förbättra anti-gliom aktivitet av temozolomide i etablerade GBM celler10. I den aktuella studien godkändes den synergistiska interaktionen mellan UMI-77 och temozolomid igen i GSCs med hjälp av det klassiska Kombinationsindexet Chou-Talalay, BLISS eller HSA. En annan fördel med detta protokoll är användningen av luciferas-märkta GSCs för att mäta den livskraftiga andelen celler. Cellernas luciferasaktivitet kan lätt mätas genom tillsats av luciferin, luciferas substrat och fånga luminescence av alla instrument med funktionen av luminometrisk mätning. Eftersom luciferas-luciferinreaktionen är snabb, ger den häri en billig och snabb lösning i jämförelse med traditionell MTT (3-(4,5-Dimetylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid), MTS(3-(2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid), MTS(3-(3-(2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid 4,5-dimetyletyletiazol-2-yl)-5-(3-karboxymetyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H tetrazolium) eller CCK-8 (cellräkning kit-8) analyser, som alla kräver långa inkubationstider. Tillsammans presenterar protokollet en screening med hög genomströmning av potentiell läkemedelskombination för GBM. Protokollet ger också valfri snabb och enkel lösning för läkemedelskombinationsskärm utöver standardutvärderingsmetoderna för synergi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga konflikter att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar National Natural Science Foundation of China (81672962), Jiangsu Provincial Innovation Team Program Foundation och Joint Key Project Foundation of Southeast University och Nanjing Medical University för deras stöd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B-27 | Gibco | 17504-044 | 50X |
| EGF | Gibco | PHG0313 | 20 ng/ml |
| FGF | Gibco | PHG0263 | 20 ng/ml |
| Gluta Max | Gibco | 35050061 | 100X |
| Neurobasal | Gibco | 21103049 | 1X |
| Penicillin-Streptomycin | HyClone | SV30010 | P: 10,000 units/ml S: 10,000 ug/ml |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 2088876 | 100 mM |
| Table 1. The formulation of GSC complete culture medium. | |||
| ABT-737 | MCE | Selective and BH3 mimetic Bcl-2, Bcl-xL and Bcl-w inhibitor | |
| Adavosertib (MK-1775) | MCE | Wee1 inhibitor | |
| Axitinib | MCE | Multi-targeted tyrosine kinase inhibitor | |
| AZD5991 | MCE | Mcl-1 inhibitor | |
| A 83-01 | MCE | Potent inhibitor of TGF-β type I receptor ALK5 kinase | |
| CGP57380 | Selleck | Potent MNK1 inhibitor | |
| Dactolisib (BEZ235) | Selleck | Dual ATP-competitive PI3K and mTOR inhibitor | |
| Dasatinib | MCE | Dual Bcr-Abl and Src family tyrosine kinase inhibitor | |
| Erlotinib | MCE | EGFR tyrosine kinase inhibitor | |
| Gefitinib | MCE | EGFR tyrosine kinase inhibitor | |
| Linifanib | MCE | Multi-target inhibitor of VEGFR and PDGFR family | |
| Masitinib | MCE | Inhibitor of c-Kit | |
| ML141 | Selleck | Non-competitive inhibitor of Cdc42 GTPase | |
| OSI-930 | MCE | Multi-target inhibitor of Kit, KDR and CSF-1R | |
| Palbociclib | MCE | Selective CDK4 and CDK6 inhibitor | |
| SB 202190 | MCE | Selective p38 MAP kinase inhibitor | |
| Sepantronium bromide (YM-155) | MCE | Survivin inhibitor | |
| TCS 359 | Selleck | Potent FLT3 inhibitor | |
| UMI-77 | MCE | Selective Mcl-1 inhibitor | |
| 4-Hydroxytamoxifen(Afimoxifene) | Selleck | Selective estrogen receptor (ER) modulator | |
| Table 2. The information of 20 targeted agents used in the test screen. All of these are target selective small molecular inhibitors. The provider, name, and targets were given in the table. |
References
- Lathia, J. D., Mack, S. C., Mulkearns-Hubert, E. E., Valentim, C. L., Rich, J. N.
- Binello, E., Germano, I. M. Targeting glioma stem cells: a novel framework for brain tumors. Cancer Science. 102 (11), 1958-1966 (2011).
- Mathews Griner, L. A., et al. High-throughput combinatorial screening identifies drugs that cooperate with ibrutinib to kill activated B-cell-like diffuse large B-cell lymphoma cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (6), 2349-2354 (2014).
- Di Veroli, G. Y., et al. Combenefit: an interactive platform for the analysis and visualization of drug combinations. Bioinformatics. 32 (18), 2866-2868 (2016).
- Shi, Y., et al. Ibrutinib inactivates BMX-STAT3 in glioma stem cells to impair malignant growth and radioresistance. Science Translational Medicine. 10 (443), 1-13 (2018).
- Tan, X., et al. Systematic identification of synergistic drug pairs targeting HIV. Nature Biotechnology. 30 (11), 1125-1130 (2012).
- Jansen, V. M., et al. Kinome-wide RNA interference screen reveals a role for PDK1 in acquired resistance to CDK4/6 inhibition in ER-positive breast cancer. Cancer Research. 77 (9), 2488-2499 (2017).
- Malyutina, A., et al. Drug combination sensitivity scoring facilitates the discovery of synergistic and efficacious drug combinations in cancer. PLoS Computational Biology. 15 (5), 1006752 (2019).
- He, L., et al. Methods for High-throughput drug combination screening and synergy scoring. Cancer Systems Biology. 1711, 351-398 (2018).
- Chen, C., et al. Targeting the synthetic vulnerability of PTEN-deficient glioblastoma cells with MCL1 inhibitors. Molecular Cancer Therapeutics. 19 (10), 2001-2011 (2020).
