Summary
Las células madre del glioma (GSC) son una pequeña fracción de las células cancerosas que desempeñan un papel esencial en la iniciación del tumor, la angiogénesis y la resistencia a los medicamentos en el glioblastoma (GBM), el tumor cerebral primario más prevalente y devastador. La presencia de GSC hace que el GBM sea muy refractario a la mayoría de los agentes dirigidos individuales, por lo que se requieren métodos de detección de alto rendimiento para identificar posibles terapias combinadas efectivas. El protocolo describe un flujo de trabajo simple para permitir la detección rápida de posibles terapias combinadas con interacción sinérgica. Los pasos generales de este flujo de trabajo consisten en establecer GSC marcadas con luciferasa, preparar placas recubiertas de matrigel, detección de medicamentos combinados, analizar y validar los resultados.
Abstract
Las células madre del glioma (GSC) son una pequeña fracción de las células cancerosas que desempeñan un papel esencial en la iniciación del tumor, la angiogénesis y la resistencia a los medicamentos en el glioblastoma (GBM), el tumor cerebral primario más prevalente y devastador. La presencia de GSC hace que el GBM sea muy refractario a la mayoría de los agentes dirigidos individuales, por lo que se requieren métodos de detección de alto rendimiento para identificar posibles terapias combinadas efectivas. El protocolo describe un flujo de trabajo simple para permitir la detección rápida de posibles terapias combinadas con interacción sinérgica. Los pasos generales de este flujo de trabajo consisten en establecer GSC marcadas con luciferasa, preparar placas recubiertas de matrigel, detección de medicamentos combinados, analizar y validar los resultados.
Introduction
El glioblastoma (GBM) es el tipo más común y agresivo de tumor cerebral primario. Actualmente, la supervivencia general de los pacientes con GBM que recibieron tratamiento máximo (una combinación de cirugía, quimioterapia y radioterapia) sigue siendo inferior a 15 meses; por lo que se necesitan urgentemente terapias novedosas y efectivas para la GBM.
La presencia de células madre de glioma (GSC) en GBM constituye un desafío considerable para el tratamiento convencional, ya que estas células madre desempeñan un papel de pivote en el mantenimiento del microambiente tumoral, la resistencia a los medicamentos y la recurrencia tumoral1. Por lo tanto, dirigirse a las GSC podría ser una estrategia prometedora para el tratamiento de GBM2. Sin embargo, un inconveniente importante para la eficacia del fármaco en GBM es su naturaleza heterogénea, que incluye, entre otros, la diferencia en mutaciones genéticas, subtipos mixtos, regulación epigenética y microambiente tumoral que los hace muy refractarios para el tratamiento. Después de muchos ensayos clínicos fallidos, los científicos e investigadores clínicos se dieron cuenta de que la terapia dirigida a un solo agente es probablemente incapaz de controlar completamente la progresión de cánceres altamente heterogéneos como el GBM. Considerando que, las combinaciones de medicamentos cuidadosamente seleccionadas han sido aprobadas por su efectividad al mejorar sinérgicamente el efecto de cada uno, proporcionando así una solución prometedora para el tratamiento de GBM.
Aunque hay muchas maneras de evaluar las interacciones fármaco-fármaco de una combinación de fármacos, como el CI (Índice de Combinación), HSA (Agente Único Más Alto) y los valores de Bliss, etc.3,4, estos métodos de cálculo generalmente se basan en combinaciones de concentración múltiple. De hecho, estos métodos pueden proporcionar una evaluación afirmativa de la interacción fármaco-fármaco, pero pueden ser muy laboriosos si se aplican en el cribado de alto rendimiento. Para simplificar el proceso, se desarrolló un flujo de trabajo de detección para identificar rápidamente las posibles combinaciones de medicamentos que inhiben el crecimiento de GSC originadas a partir de biopsias quirúrgicas de GBM del paciente. Se introdujo en este método un índice de sensibilidad (SI) que refleja la diferencia entre el efecto combinado esperado y el efecto combinado observado para cuantificar el efecto sinérgico de cada fármaco, de modo que los candidatos potenciales puedan identificarse fácilmente mediante la clasificación SI. Mientras tanto, este protocolo demuestra un ejemplo de pantalla para identificar el candidato (s) potencial (s) que puede sinergizar el efecto anti-glioma con temozolomida, la quimioterapia de primera línea para el tratamiento de GBM, entre 20 pequeños inhibidores moleculares.
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Protocol
La muestra de GBM se adquirió de un paciente durante una operación de rutina después de obtener el consentimiento plenamente informado del comité de ética de investigación humana del Primer Hospital Afiliado de la Universidad Médica de Nanjing.
1. Aislamiento y cultivo de GSC derivadas de pacientes
- Coloque el tejido fresco de glioblastoma resecodo quirúrgicamente en un tubo centrífugo de 15 ml lleno de PBS estéril y almacene el tejido en hielo hasta la operación adicional.
- Picar el tejido GBM en piezas de aproximadamente 0,5 a 1 mm de diámetro usando tijeras de disección y lavar las muestras de tejido con medio basal neuronal para eliminar los desechos celulares en un gabinete de bioseguridad.
- Digerir los fragmentos de tejido con 1 mg/ml de colagenasa A a 37 °C durante 30 min y centrifugar a 400 x g durante 5 min a 4 °C.
- Retire el sobrenadante y suspenda el gránulo con medio basal neuronal en blanco y disociar el gránulo mecánicamente mediante pipeteo repetitivo sobre hielo.
- Culta la mezcla en placas de cultivo de 6 pozos de fijación ultrabaja rellenas con medio de cultivo GSC (ver Tabla 1 para la receta) en una incubadora de células estériles con 5% de CO2 y 90% de humedad a 37 °C hasta la formación de la neuroesfera.
- En una formación suficiente de neuroesferas, recójalos usando una pipeta en un microtubo de 1,5 ml y centrífuga a 800 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente.
- Vuelva a colocar el pellet y divídalo en varios matraces llenos del medio de cultivo anterior para mantener las GSC primarias.
NOTA: Las GSC derivadas de pacientes utilizadas en el ejemplo se derivaron de biopsias quirúrgicas de un paciente masculino de 34 años con GBM recurrente de grado IV de la OMS. Los GSC fueron nombrados como XG387 para los futuros experimentos. Se realizaron pruebas de micoplasma basadas en PCR para las GSC anteriores para confirmar que no hay contaminación por micoplasma. Todos los experimentos con GSC utilizados en este protocolo se llevaron a cabo <15 pasajes.
2. Preparación de GSC marcadas con luciferasa
- Recoger las GSC del medio de cultivo y centrifugarlas a 70 x g durante 3 min a temperatura ambiente.
- Retire el sobrenadante, digiera las células con accutase durante 4 min a 37 °C. Use una punta y una pipeta de 200 μL repetidamente para disociar y resuspend la bolita celular.
- Diluya las células a 2 x 105 células por pozo en una placa de cultivo de 12 pozos y culta las células durante la noche.
- Añadir 30 μL de sobrenadante del virus luciferasa-EGFP (título >108 TU/mL) en cada pozo de la placa y luego centrifugar las células a 1.000 x g durante 2 h a 25 °C. Culta las células durante la noche.
- Refresque el medio al día siguiente y culta las células durante otras 48 h.
- Observe las células bajo un microscopio fluorescente para confirmar la aparición de las células GFP positivas.
- Utilice un clasificador de células de flujo para clasificar y seleccionar las GSC con alta fluorescencia GFP para cultivar aún más las células.
3. Medición basada en bioluminiscencia de la viabilidad celular
- Placas de recubrimiento con la mezcla de matriz extracelular (ECM) (por ejemplo, Matrigel): Agregue 40 μL de mezcla de ECM de 0.15 mg / ml a cada pozo e incube la placa durante 1 h a 37 ° C. Retire el exceso de mezcla de ECM y enjuague suavemente una vez con PBS.
- Agregue un medio de cultivo de 100 μL que contenga 15,000, 10,000, 8,000, 6,000, 4,000, 2,000, 1,000 y 500 células XG387-Luc junto con un medio en blanco de 100 μL como control en cada pozo para 6 réplicas en una placa inferior óptica de 96 pozos y culta las células durante la noche a 37 ° C.
- Retire el sobrenadante, agregue un medio de cultivo de 50 μL que contenga 150 ng/ μL de D-luciferina en cada pozo e incube las células durante 5 min a 37 °C.
- Tome imágenes de la bioluminiscencia celular en la placa utilizando el sistema de imágenes del espectro IVIS. Utilice el software incorporado para crear múltiples áreas circulares de la región de interés (ROI) y cuantificar la bioluminiscencia celular.
4. Tratamiento con temozolomida y cribado combinado
- Precoat cuatro placas de 96 pozos como se describió anteriormente, antes del tratamiento.
- Seed XG387-Luc cells a una densidad de 1.000 células en medio de cultivo de 100 μL en cada pozo de una placa inferior óptica de 96 pozos y cultiva las células durante la noche.
- Prepare temozolomida y los agentes específicos de la solución de stock con anticipación. Preparar una serie de concentraciones compuesta por 800 μM, 600 μM, 400 μM, 300 μM, 200 μM, 100 μM y 50 μM temozolomida en medio de cultivo para el tratamiento con un solo agente. Diluir la temozolomida y los agentes dirigidos en solución stock en el medio de cultivo, respectivamente, para obtener concentraciones finales de 200 μM y 2 μM para el cribado combinado de fármacos (Tabla 2).
- Retire el medio de cultivo cuando la mayoría de las GSC se adhieran a la parte inferior de las placas; agregue el medio preparado anteriormente que contiene temozolomida en cada pozo durante tres réplicas técnicas por tratamiento.
- Para tratar la temozolomida y examinar las combinaciones de fármacos, retire el medio en blanco y agregue el medio preparado anteriormente que contenga temozolomida de 200 μM o un agente dirigido a 2 μM, o una combinación de ambos en cada pozo durante tres réplicas técnicas por tratamiento.
- Incubar todas las placas a 37 °C, 5% co2 durante 3 días.
- Retire el medio que contiene el fármaco, agregue 50 μL de medio en blanco que contenga 150 ng/μL de D-luciferina en cada pozo e incube las células durante 5 min a 37 °C.
- Tome imágenes de la bioluminiscencia celular en la placa utilizando el sistema de imágenes del espectro IVIS. Utilice el software incorporado para crear múltiples ROI circulares y cuantificar la bioluminiscencia celular.
5. Tratamiento combinado de temozolomida y UMI-77 en líneas celulares XG387-Luc y XG328-Luc
- Precoat tres placas de 96 pozos como se describió anteriormente, antes del tratamiento.
- Sembrar células XG387-Luc y XG328-Luc a una densidad de 1.000 células respectivamente en 100 μL de medio de cultivo en cada pozo de una placa inferior óptica de 96 pozos y cultivar las células durante la noche.
- Preparar una serie de concentraciones compuesta por 600 μM, 400 μM, 300 μM, 200 μM, 100 μM, 50 μM y 0 μM temozolomida y una serie de concentraciones compuesta por 6 μM, 4 μM, 3 μM, 2 μM, 1 μM, 0,5 μM y 0 μM UMI-77 en el medio de cultivo para tratamientos con matriz de titulación de seis por seis dosis.
- Retire el medio en blanco cuando la mayoría de las GSC se adhieran a la parte inferior de la placa; agregue el medio preparado anteriormente en cada pozo para obtener tres réplicas técnicas por tratamiento.
- Incubar estas placas durante 3 días a 37 °C, 5% CO2.
- Retire el medio que contiene el medicamento; añadir 50 μL de medio en blanco que contenga 150 ng/μL de D-luciferina en cada pozo e incubar las células durante 5 min a 37 °C para la medición de la bioluminiscencia.
6. Análisis de datos
- Calcule la puntuación del índice de sensibilidad (SI) de la temozolomida y el agente dirigido de acuerdo con la fórmula de la Figura 2A.
NOTA: La puntuación SI es para cuantificar la influencia de la adición de otro fármaco. Varió de -1 a +1, con valores positivos que indican efectos sinérgicos de temozolomida. - Calcule los valores del índice de combinación (IC) entre temozolomida y UMI-77 utilizando el software CompuSyn para analizar sus interacciones combinadas. El valor de IC <1 indica sinergia; El valor de IC >1 indica antagonismo.
- Calcule los altos valores de agente único (HSA) entre temozolomida y UMI-77 utilizando el software Combenefit. El valor de HSA indica el efecto inhibidor combinado. El valor de HSA >0 indica sinergia y el valor de HSA <0 indica antagonismo.
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Representative Results
Las células XG387 formaron neuroesferas en el medio de cultivo descrito en la Tabla 1 en una placa de cultivo de 6 pozos de unión ultra baja o una placa no recubierta5 (Figura 1A). En primer lugar, se realizó una prueba para comprobar si la intensidad de bioluminiscencia de las células XG387-Luc era proporcional al número de células. Como se muestra en la Figura 1B,la intensidad de la bioluminiscencia aumentó proporcionalmente a la densidad celular y dio lugar a una corrección lineal entre ellas (Pearson r = 0,9872; p < 0,0001; Figura 1C). Dado que la bioluminiscencia de las células marcadas con luciferasa es fácil y rápida de medir, esto proporciona un método simple para medir la densidad de GSC viables. A continuación, se evaluó la actividad antiproliferativa de la temozolomida. Como se muestra en la Figura 1D,la temozolomida de 400 μM causó aproximadamente un 20% de inhibición de la proliferación de las células XG387-Luc, lo que sugiere que es útil, pero su efecto anti-GBM se puede mejorar aún más. Se seleccionó la concentración de 200 μM para el cribado combinado.
Para dar un ejemplo, se utilizaron 20 inhibidores selectivos de moléculas pequeñas para el cribado de la combinación de fármacos para identificar el candidato o candidatos potenciales que mejoran el efecto anti-GBM de la temozolomida. Como resultado, los valores del índice sensible (SI) de 13 agentes objetivo estaban por encima de 0, y 5 de ellos estaban por encima de 0,1(Figura 2B,C). Especialmente, el SI de los dos principales fármacos candidatos UMI-77 y A 83-01 fue superior a 0,25, lo que sugiere su potencial para sinergizar con temozolomida.
Para validar el hallazgo anterior, se aplicaron los modelos de sinergia clásicos de HSA y Bliss3,4,6 para determinar el efecto combinado de temozolomida y UMI-77 en GSCs. Además, se utilizó XG328, otro modelo GSC derivado del paciente establecido temprano, para realizar la misma evaluación. El ensayo antiproliferativo del tratamiento combinado de temozolomida y UMI-77 se realizó en una matriz de titulación de dosis de seis por seis. Los resultados se analizaron para adquirir los valores de HSA y Bliss, que son lecturas para la inhibición sinérgica y representan la diferencia entre la inhibición esperada y la inhibición observada. Como se muestra en la Figura 3B-D,los valores del índice de combinación (IC) <1 y los valores altos de agente único (HSA) >0 para la mayoría de las combinaciones de temozolomida y UMI-77 a diferentes concentraciones, sugiere una interacción sinérgica general de temozolomida y UMI-77 en las GSC XG387 y XG328.
Figura 1: GSCs XG387 derivadas de pacientes con GBM. (A) Formación de neuroesferas. (B) Generación de bioluminiscencia de GSC marcadas con luciferasa. (C) La bioluminiscencia generada por las células XG387-Luc fue proporcional a la densidad celular. (D) Tratamiento con temozolomida de XG387. Cada tratamiento se realizó por triplicado con dos experimentos independientes. Los datos se expresan como la media ± SD. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Cribado de combinación de fármacos mediante GSCs. (A) Fórmula para calcular el SI (índice de sensibilidad) de 20 agentes dirigidos con temozolomida (TMZ) en el cribado combinado. (B) La distribución de los valores del SI de 20 agentes objetivo. Puntos rojos: los cinco principales fármacos candidatos. C)Información de los cinco principales agentes candidatos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Tratamiento combinado de temozolomida (TMZ) y UMI-77 en líneas celulares XG387-Luc y XG328-Luc. (A) Titulación única y combinatoria de temozolomida y UMI-77 en un ensayo de proliferación en líneas celulares XG387-Luc y XG328-Luc. (B) Isobolograma y análisis del índice de combinación de la inhibición de la proliferación en células XG387-Luc y XG328-Luc tratadas con temozolomida y UMI-77. IC <1 indica un efecto sinérgico. (C,D) Gráficos de sinergia generados por Combenefit que muestran la interacción entre temozolomida y UMI-77. El análisis de la interacción dio como resultado valores de HSA (agente único alto) y valores de Bliss, lo que indica una eficacia sinérgica calculada a partir de lo esperado. Los valores de HSA y Bliss >0 indican efectos sinérgicos. Cada tratamiento se realizó por triplicado con dos experimentos independientes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
En el presente estudio, se describió un protocolo que se puede aplicar para identificar una posible terapia combinada para GBM utilizando GSC derivadas del paciente. A diferencia del modelo métrico estándar de sinergia / adición, como los métodos Loewe, BLISS o HSA, se utilizó un flujo de trabajo simple y rápido que no requiere que un par de medicamentos se combine a múltiples concentraciones de manera factorial completa como los métodos tradicionales. En este flujo de trabajo, se introdujo el SI (índice de sensibilidad) que se origina a partir de un estudio para evaluar el efecto sensibilizador de los siRNAs en combinación con un pequeño inhibidor molecular para cuantificar el efecto sinérgico del fármaco de dos pequeños inhibidores moleculares7. El rango de valores de SI es de -1 a 1, y el valor positivo de SI indica un efecto sensibilizante entre cada uno de los fármacos. Cuanto mayor era el valor del SI alcanzado, más fuerte era la sinergia. Aunque el valor de SI por sí solo es incapaz de proporcionar una respuesta afirmativa sobre el tipo (sinérgico, aditivo o antagónico) de interacción fármaco-fármaco, los candidatos mejor clasificados tienen una alta probabilidad de sinergizar con el fármaco de interés y, por lo tanto, son dignos de una mayor validación. En comparación, la mayoría de las metodologías actuales de detección de combinaciones de medicamentos de alto rendimiento siguen siendo laboriosas e involucran algoritmos difíciles8,9.
Para ejemplificar la viabilidad de este método, se realizó una prueba de detección a pequeña escala. Como resultado, fue posible identificar UMI-77, un inhibidor selectivo de MCL1, como el principal candidato entre 20 agentes dirigidos para sinergizar con temozolomida en la supresión del crecimiento de GSC. De hecho, en un estudio anterior, también se encontró que UMI-77 mejora sinérgicamente la actividad anti-glioma de la temozolomida en células GBM establecidas10. En el estudio actual, la interacción sinérgica entre UMI-77 y temozolomida se aprobó nuevamente en GSC utilizando el índice clásico de combinación Chou-Talalay, los métodos BLISS o HSA. Otra ventaja de este protocolo es el uso de GSC marcadas con luciferasa para medir la proporción viable de células. La actividad luciferasa de las células se puede medir fácilmente mediante la adición de la luciferina, el sustrato de la luciferasa, y capturar la luminiscencia por cualquier instrumento con la función de medición luminométrica. Debido a que la reacción luciferasa-luciferina es rápida, aquí proporciona una solución barata y rápida en comparación con los ensayos tradicionales de MTT (3-(4,5-Dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio), MTS(3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H tetrazolio), o CCK-8 (kit de conteo celular-8), todos los cuales requieren largos tiempos de incubación. En conjunto, el protocolo presenta un cribado de alto rendimiento de la posible combinación de fármacos para GBM. El protocolo también proporciona una solución rápida y simple opcional para la detección de combinación de medicamentos, además de los métodos estándar de evaluación de sinergia.
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Disclosures
Los autores declaran que no hay conflictos que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81672962), a la Fundación del Programa del Equipo de Innovación Provincial de Jiangsu y a la Fundación del Proyecto Clave Conjunto de la Universidad del Sureste y la Universidad Médica de Nanjing por su apoyo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B-27 | Gibco | 17504-044 | 50X |
| EGF | Gibco | PHG0313 | 20 ng/ml |
| FGF | Gibco | PHG0263 | 20 ng/ml |
| Gluta Max | Gibco | 35050061 | 100X |
| Neurobasal | Gibco | 21103049 | 1X |
| Penicillin-Streptomycin | HyClone | SV30010 | P: 10,000 units/ml S: 10,000 ug/ml |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 2088876 | 100 mM |
| Table 1. The formulation of GSC complete culture medium. | |||
| ABT-737 | MCE | Selective and BH3 mimetic Bcl-2, Bcl-xL and Bcl-w inhibitor | |
| Adavosertib (MK-1775) | MCE | Wee1 inhibitor | |
| Axitinib | MCE | Multi-targeted tyrosine kinase inhibitor | |
| AZD5991 | MCE | Mcl-1 inhibitor | |
| A 83-01 | MCE | Potent inhibitor of TGF-β type I receptor ALK5 kinase | |
| CGP57380 | Selleck | Potent MNK1 inhibitor | |
| Dactolisib (BEZ235) | Selleck | Dual ATP-competitive PI3K and mTOR inhibitor | |
| Dasatinib | MCE | Dual Bcr-Abl and Src family tyrosine kinase inhibitor | |
| Erlotinib | MCE | EGFR tyrosine kinase inhibitor | |
| Gefitinib | MCE | EGFR tyrosine kinase inhibitor | |
| Linifanib | MCE | Multi-target inhibitor of VEGFR and PDGFR family | |
| Masitinib | MCE | Inhibitor of c-Kit | |
| ML141 | Selleck | Non-competitive inhibitor of Cdc42 GTPase | |
| OSI-930 | MCE | Multi-target inhibitor of Kit, KDR and CSF-1R | |
| Palbociclib | MCE | Selective CDK4 and CDK6 inhibitor | |
| SB 202190 | MCE | Selective p38 MAP kinase inhibitor | |
| Sepantronium bromide (YM-155) | MCE | Survivin inhibitor | |
| TCS 359 | Selleck | Potent FLT3 inhibitor | |
| UMI-77 | MCE | Selective Mcl-1 inhibitor | |
| 4-Hydroxytamoxifen(Afimoxifene) | Selleck | Selective estrogen receptor (ER) modulator | |
| Table 2. The information of 20 targeted agents used in the test screen. All of these are target selective small molecular inhibitors. The provider, name, and targets were given in the table. |
References
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