Un flux de travail de dépistage rapide pour identifier la thérapie combinée potentielle pour le GBM à l’aide de cellules souches de gliome dérivées du patient

Summary

Les cellules souches du gliome (CSC) sont une petite fraction des cellules cancéreuses qui jouent un rôle essentiel dans l’initiation tumorale, l’angiogenèse et la résistance aux médicaments dans le glioblastome (GBM), la tumeur cérébrale primaire la plus répandue et la plus dévastatrice. La présence de CSG rend le GBM très réfractaire à la plupart des agents ciblés individuels, de sorte que des méthodes de dépistage à haut débit sont nécessaires pour identifier des combinaisons thérapeutiques efficaces potentielles. Le protocole décrit un flux de travail simple pour permettre un dépistage rapide de la thérapie combinée potentielle avec interaction synergique. Les étapes générales de ce flux de travail consistent à établir des CSG marqués à la luciférase, à préparer des plaques revêtues de matrigel, à dépister les médicaments combinés, à analyser et à valider les résultats.

Abstract

Les cellules souches du gliome (CSC) sont une petite fraction des cellules cancéreuses qui jouent un rôle essentiel dans l’initiation tumorale, l’angiogenèse et la résistance aux médicaments dans le glioblastome (GBM), la tumeur cérébrale primaire la plus répandue et la plus dévastatrice. La présence de CSG rend le GBM très réfractaire à la plupart des agents ciblés individuels, de sorte que des méthodes de dépistage à haut débit sont nécessaires pour identifier des combinaisons thérapeutiques efficaces potentielles. Le protocole décrit un flux de travail simple pour permettre un dépistage rapide de la thérapie combinée potentielle avec interaction synergique. Les étapes générales de ce flux de travail consistent à établir des CSG marqués à la luciférase, à préparer des plaques revêtues de matrigel, à dépister les médicaments combinés, à analyser et à valider les résultats.

Introduction

Le glioblastome (GBM) est le type de tumeur cérébrale primaire le plus courant et le plus agressif. Actuellement, la survie globale des patients atteints de GBM qui ont reçu un traitement maximal (une combinaison de chirurgie, de chimiothérapie et de radiothérapie) est encore inférieure à 15 mois; il est donc urgent de prévoir des thérapies nouvelles et efficaces pour le GBM.

La présence de cellules souches de gliome (CSG) dans le GBM constitue un défi considérable pour le traitement conventionnel car ces cellules souches jouent un rôle pivot dans le maintien du microenvironnement tumoral, la résistance aux médicaments et la récidive tumorale¹. Par conséquent, le ciblage des CSC pourrait être une stratégie prometteuse pour le traitement gbm². Néanmoins, un inconvénient majeur pour l’efficacité du médicament dans le GBM est sa nature hétérogénétique, y compris, mais sans s’y limiter, la différence de mutations génétiques, de sous-types mixtes, de régulation épigénétique et de microenvironnement tumoral, ce qui les rend très réfractaires au traitement. Après de nombreux essais cliniques ratés, les scientifiques et les chercheurs cliniques ont réalisé que le traitement ciblé à agent unique est probablement incapable de contrôler pleinement la progression de cancers très hétérogènes tels que le GBM. Alors que des combinaisons de médicaments soigneusement sélectionnées ont été approuvées pour leur efficacité en renforçant de manière synergique l’effet les unes des autres, fournissant ainsi une solution prometteuse pour le traitement du GBM.

Bien qu’il existe de nombreuses façons d’évaluer les interactions médicamenteuses d’une combinaison de médicaments, telles que les valeurs CI (Indice de combinaison), HSA (agent unique le plus élevé) et Bliss, etc.^3,4, ces méthodes de calcul sont généralement basées sur des combinaisons de concentrations multiples. En effet, ces méthodes peuvent fournir une évaluation positive de l’interaction médicament-médicament, mais peuvent être très laborieuses si elles sont appliquées dans le criblage à haut débit. Pour simplifier le processus, un flux de travail de dépistage permettant d’identifier rapidement les combinaisons de médicaments potentielles qui inhibent la croissance des CSC provenant de biopsies chirurgicales de patients GBM a été développé. Un indice de sensibilité (SI) qui reflète la différence entre l’effet combiné attendu et l’effet combiné observé a été introduit dans cette méthode pour quantifier l’effet synergique de chaque médicament, de sorte que les candidats potentiels peuvent être facilement identifiés par le classement SI. Pendant ce temps, ce protocole démontre un exemple de dépistage pour identifier le ou les candidats potentiels qui peuvent mettre en synergie l’effet anti-gliome avec le témozolomide, la chimiothérapie de première intention pour le traitement GBM, parmi 20 petits inhibiteurs moléculaires.

Protocol

L’échantillon de GBM a été acquis d’un patient lors d’une opération de routine après avoir obtenu le consentement pleinement éclairé du comité d’éthique de la recherche humaine du premier hôpital affilié de l’Université médicale de Nanjing.

1. Isolement et culture des CSC dérivés du patient

1. Placer le tissu de glioblastome frais réséqué chirurgicalement dans un tube de centrifugeuse de 15 mL rempli de PBS stérile et stocker le tissu sur de la glace jusqu’à une opération ultérieure.
2. Hacher le tissu GBM en morceaux d’environ 0,5 à 1 mm de diamètre à l’aide de ciseaux à dissection et laver les échantillons de tissu avec un milieu basal neuronal pour éliminer les débris cellulaires dans une armoire de biosécurité.
3. Digérer les fragments de tissu avec 1 mg/mL de collagénase A à 37 °C pendant 30 min et centrifuger à 400 x g pendant 5 min à 4 °C.
4. Retirez le surnageant et suspendez la pastille avec un milieu basal neuronal vierge et dissociez mécaniquement la pastille par pipetage répétitif sur de la glace.
5. Culture du mélange dans des plaques de culture à 6 puits à très faible fixation remplies de milieu de culture GSC (voir tableau 1 pour la recette) dans un incubateur cellulaire stérile avec 5% de CO₂ et 90% d’humidité à 37 °C jusqu’à la formation de la neurosphère.
6. En formation suffisante de neurosphère, collectez-les à l’aide d’une pipette dans un microtube de 1,5 mL et centrifugez à 800 x g pendant 5 min à température ambiante.
7. Remettre en service le granulé et le diviser en plusieurs flacons remplis du milieu de culture ci-dessus pour maintenir les CSC primaires.
   REMARQUE: Les CSC dérivés du patient utilisés dans l’exemple ont été dérivés de biopsies chirurgicales d’un patient de sexe masculin de 34 ans atteint de GBM récidivant de grade IV de l’OMS. Les GSC ont été nommés XG387 pour les expériences futures. Des tests de mycoplasmes basés sur la PCR ont été effectués pour les CSGC ci-dessus afin de confirmer qu’aucune contamination par les mycoplasmes n’est présente. Toutes les expériences impliquant des CGV utilisées dans ce protocole ont été réalisées <15 passages.

2. Préparation des GSC marqués par la luciférase

1. Recueillir les CSC du milieu de culture et les centrifuger à 70 x g pendant 3 min à température ambiante.
2. Retirer le surnageant, digérer les cellules avec de l’accutase pendant 4 min à 37 °C. Utilisez une pointe et une pipette de 200 μL à plusieurs reprises pour dissocier et ressuspend la pastille de la cellule.
3. Diluer les cellules à 2 x 10⁵ cellules par puits dans une plaque de culture de 12 puits et faire la culture des cellules pendant la nuit.
4. Ajouter 30 μL de surnageant du virus luciférase-EGFP (titre >10⁸ TU/mL) dans chaque puits de la plaque, puis centrifuger les cellules à 1 000 x g pendant 2 h à 25 °C. Culturez les cellules pendant la nuit.
5. Rafraîchissez le milieu le lendemain et culturez les cellules pendant encore 48 heures.
6. Observez les cellules sous un microscope fluorescent pour confirmer l’apparition des cellules GFP positives.
7. Utilisez un trieur de cellules à flux pour trier et sélectionner les CGV à fluorescence GFP élevée afin de poursuivre la culture des cellules.

3. Mesure de la viabilité cellulaire basée sur la bioluminescence

1. Plaques de revêtement avec le mélange de matrice extracellulaire (ECM) (par exemple, Matrigel): Ajouter 40 μL de mélange ECM de 0,15 mg / mL à chaque puits et incuber la plaque pendant 1 h à 37 ° C. Retirez l’excès de mélange ECM et rincez doucement une fois avec du PBS.
2. Ajouter un milieu de culture de 100 μL contenant 15 000, 10 000, 8 000, 6 000, 4 000, 2 000, 1 000 et 500 cellules XG387-Luc avec un milieu vierge de 100 μL comme témoin dans chaque puits pour 6 répliques dans une plaque inférieure optique de 96 puits et faire la culture des cellules pendant la nuit à 37 °C.
3. Retirer le surnageant, ajouter 50 μL de milieu de culture contenant 150 ng/μL de D-luciférine dans chaque puits et incuber les cellules pendant 5 min à 37 °C.
4. Prenez des images de la bio-luminescence cellulaire dans la plaque à l’aide du système d’imagerie à spectre IVIS. Utilisez le logiciel intégré pour créer plusieurs zones circulaires de la région d’intérêt (ROI) et quantifier la bio-luminescence cellulaire.

4. Traitement au témozolomide et dépistage combiné

1. Prélaquez quatre plaques de 96 puits comme décrit ci-dessus, avant le traitement.
2. Ensemencez des cellules XG387-Luc à une densité de 1 000 cellules dans un milieu de culture de 100 μL dans chaque puits d’une plaque inférieure optique de 96 puits et culturez les cellules pendant la nuit.
3. Préparez à l’avance le témozolomide et les agents ciblés à partir de la solution mère. Préparer une série de concentrations composée de 800 μM, 600 μM, 400 μM, 300 μM, 200 μM, 100 μM et 50 μM de témozolomide en milieu de culture pour le traitement à agent unique. Diluer le témozolomide et les agents ciblés en solution mère dans le milieu de culture, respectivement, pour obtenir des concentrations finales de 200 μM et 2 μM pour le dépistage des médicaments combinés (tableau 2).
4. Retirer le milieu de culture lorsque la plupart des CSCG adhèrent au fond des plaques; ajouter le milieu préparé ci-dessus contenant du témozolomide dans chaque puits pour trois répétitions techniques par traitement.
5. Pour traiter le témozolomide et dépister les combinaisons de médicaments, retirez le milieu vierge et ajoutez le milieu préparé ci-dessus contenant soit 200 μM de témozolomide, soit 2 μM d’agent ciblé, soit une combinaison des deux dans chaque puits pour trois répétitions techniques par traitement.
6. Incuber toutes les plaques à 37 °C, 5% de CO2 pendant 3 jours.
7. Retirer le milieu contenant le médicament, ajouter 50 μL de milieu vierge contenant 150 ng/μL de D-luciférine dans chaque puits et incuber les cellules pendant 5 min à 37 °C.
8. Prenez des images de la bio-luminescence cellulaire dans la plaque à l’aide du système d’imagerie à spectre IVIS. Utilisez le logiciel intégré pour créer plusieurs rois circulaires et quantifier la bio-luminescence cellulaire.

5. Traitement combiné du témozolomide et de l’UMI-77 dans les lignées cellulaires XG387-Luc et XG328-Luc

1. Prélaquage de trois plaques de 96 puits comme décrit ci-dessus, avant le traitement.
2. Ensemencez les cellules XG387-Luc et XG328-Luc à une densité de 1 000 cellules respectivement dans 100 μL de milieu de culture dans chaque puits d’une plaque inférieure optique de 96 puits et culturez les cellules pendant la nuit.
3. Préparer une série de concentrations composée de 600 μM, 400 μM, 300 μM, 200 μM, 100 μM, 50 μM et 0 μM de témozolomide et une série de concentrations composée de 6 μM, 4 μM, 3 μM, 2 μM, 1 μM, 0,5 μM et 0 μM UMI-77 dans le milieu de culture pour des traitements par matrice de titrage à six doses.
4. Retirez le milieu vierge lorsque la plupart des CGV adhèrent au fond de la plaque; ajouter le milieu préparé ci-dessus dans chaque puits pour trois répétitions techniques par traitement.
5. Incuber ces plaques pendant 3 jours à 37 °C, 5% CO_2.
6. Retirer le milieu contenant du médicament; ajouter 50 μL de milieu vierge contenant 150 ng/μL de D-luciférine dans chaque puits et incuber les cellules pendant 5 min à 37 °C pour la mesure de la bioluminescence.

6. Analyse des données

1. Calculer le score de l’indice de sensibilité (SI) du témozolomide et de l’agent ciblé selon la formule de la figure 2A.
   NOTE: Le score SI consiste à quantifier l’influence de l’ajout d’un autre médicament. Il variait de -1 à +1, avec des valeurs positives indiquant des effets synergiques du témozolomide.
2. Calculer les valeurs de l’indice de combinaison (IC) entre le témozolomide et l’UMI-77 à l’aide du logiciel CompuSyn pour analyser leurs interactions combinées. La valeur IC <1 indique une synergie; La valeur CI >1 indique un antagonisme.
3. Calculez les valeurs élevées d’agent unique (HSA) entre le témozolomide et l’UMI-77 à l’aide du logiciel Combenefit. La valeur HSA indique l’effet inhibiteur combiné. La valeur HSA >0 indique la synergie et la valeur HSA <0 indique l’antagonisme.

Representative Results

Les cellules XG387 ont formé des neurosphères dans le milieu de culture décrit dans le tableau 1 dans une plaque de culture à 6 puits à fixation ultra-faible ou une plaque⁵ non revêtue(figure 1A). Tout d’abord, un test a été effectué pour vérifier si l’intensité de bio-luminescence des cellules XG387-Luc était proportionnelle au nombre de cellules. Comme le montre la figure 1B, l’intensité de la bioluminscence a augmenté proportionnellement à la densité cellulaire et a entraîné une correction linéaire entre elles (Pearson r = 0,9872; p < 0,0001; Figure 1C). Étant donné que la bio-luminescence des cellules marquées par la luciférase est facile et rapide à mesurer, cela fournit une méthode simple pour mesurer la densité des CSC viables. Ensuite, l’activité anti-proliférative du témozolomide a été évaluée. Comme le montre la figure 1D,le témozolomide de 400 μM a provoqué une inhibition de la prolifération d’environ 20% des cellules XG387-Luc, ce qui suggère qu’il est utile, mais que son effet anti-GBM peut être encore amélioré. La concentration de 200 μM a été choisie pour le dépistage combiné.

Pour donner un exemple, 20 inhibiteurs de petites molécules sélectifs pour la cible ont été utilisés pour le dépistage de la combinaison de médicaments afin d’identifier le ou les candidats potentiels qui améliorent l’effet anti-GBM du témozolomide. Par conséquent, les valeurs de l’indice sensible (SI) de 13 agents ciblés étaient supérieures à 0 et 5 d’entre eux étaient supérieures à 0,1(Figure 2B,C). En particulier, le SI des deux principaux médicaments candidats UMI-77 et A 83-01 était supérieur à 0,25, ce qui suggère leur potentiel de synergie avec le témozolomide.

Pour valider la constatation ci-dessus, les modèles de synergie classiques de HSA et Bliss^3,4,6 ont été appliqués pour déterminer l’effet combiné du témozolomide et de l’UMI-77 dans les GSC. De plus, XG328 – un autre modèle de CCG dérivé du patient établi tôt – a été utilisé pour effectuer la même évaluation. Le dosage anti-prolifératif du traitement combiné du témozolomide et de l’UMI-77 a été effectué dans une matrice de titration de six doses par six. Les résultats ont été analysés pour acquérir les valeurs HSA et Bliss qui sont des lectures pour l’inhibition synergique et décrivent la différence entre l’inhibition attendue et l’inhibition observée. Comme le montre la figure 3B-D,les valeurs de l’indice de combinaison (IC) <1 et les valeurs élevées d’agent unique (HSA) >0 pour la plupart des combinaisons de témozolomide et d’UMI-77 à différentes concentrations, suggèrent une interaction synergique globale du témozolomide et de l’UMI-77 dans les CSG XG387 et XG328.

Figure 1: GBM GSC dérivé du patient XG387. (A) Formation de neurosphère. (B) La génération de bio-luminescence de GSC marqués par la luciférase. (C) La bio-luminescence générée par les cellules XG387-Luc était proportionnelle à la densité cellulaire. (D) Traitement au témozolomide de XG387. Chaque traitement a été réalisé en trois exemplaires avec deux expériences indépendantes. Les données sont exprimées comme la moyenne ± SD. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2: Dépistage des combinaisons de médicaments à l’aide de CSM. (A) Formule pour calculer le SI (indice de sensibilité) de 20 agents ciblés avec le témozolomide (TMZ) dans l’écran combiné. (B) La distribution des valeurs SI de 20 agents ciblés. Points rouges : les cinq principaux médicaments candidats. (C) Information sur les cinq principaux candidats aux agents ciblés. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3: Traitement combiné du témozolomide (TMZ) et de l’UMI-77 dans les lignées cellulaires XG387-Luc et XG328-Luc. (A) Titrage unique et combinatoire du témozolomide et de l’UMI-77 dans un essai de prolifération dans les lignées cellulaires XG387-Luc et XG328-Luc. (B) Isobologramme et analyse de l’indice d’association de l’inhibition de la prolifération dans les cellules XG387-Luc et XG328-Luc traitées avec du témozolomide et de l’UMI-77. CI <1 indique un effet synergique. (C,D) Diagrammes de synergie générés par Combenefit montrant l’interaction entre le témozolomide et l’UMI-77. L’analyse de l’interaction a abouti à des valeurs HSA (agent unique élevé) et à des valeurs de Bliss, indiquant une efficacité synergique calculée à partir de ce qui était attendu. Les valeurs HSA et Bliss >0 indiquent des effets synergiques. Chaque traitement a été réalisé en trois exemplaires avec deux expériences indépendantes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

Dans la présente étude, un protocole qui peut être appliqué pour identifier une thérapie combinée potentielle pour gbM en utilisant des CSCG dérivés du patient a été décrit. Contrairement au modèle métrique standard de synergie/additivité tel que les méthodes Loewe, BLISS ou HSA, un flux de travail simple et rapide a été utilisé qui ne nécessite pas qu’une paire de médicaments soit combinée à plusieurs concentrations de manière factoriele complète comme les méthodes traditionnelles. Dans ce flux de travail, le SI (indice de sensibilité) issu d’une étude visant à évaluer l’effet sensibilisant des siRNA en combinaison avec un petit inhibiteur moléculaire a été introduit pour quantifier l’effet synergique médicamenteux de deux petits inhibiteurs moléculaires⁷. La plage de valeurs si est comprise entre -1 et 1, et la valeur SI positive indique un effet sensibilisant entre chacun des médicaments. Plus la valeur du SI obtenue est élevée, plus la synergie est forte. Bien que la valeur SI seule soit incapable de fournir une réponse affirmative sur le type (synergique, additif ou antagoniste) d’interaction médicamenteuse, les candidats les mieux classés ont une forte probabilité de créer une synergie avec le médicament d’intérêt et méritent donc une validation supplémentaire. En comparaison, la plupart des méthodologies actuelles de dépistage des combinaisons de médicaments à haut débit sont encore laborieuses et impliquent des algorithmes difficiles^8,9.

Pour illustrer la faisabilité de cette méthode, un écran de test à petite échelle a été effectué. En conséquence, il a été possible d’identifier l’UMI-77, un inhibiteur sélectif de MCL1, comme le meilleur candidat parmi 20 agents ciblés pour créer une synergie avec le témozolomide dans la suppression de la croissance des CSG. En fait, dans une étude précédente, UMI-77 s’est également avéré améliorer de manière synergique l’activité anti-gliome du témozolomide dans les cellules GBM établies¹⁰. Dans la présente étude, l’interaction synergique entre l’UMI-77 et le témozolomide a de nouveau été approuvée dans les CSG en utilisant les méthodes classiques de l’indice de combinaison Chou-Talalay, BLISS ou HSA. Un autre avantage de ce protocole est l’utilisation de GSC marqués à la luciférase pour mesurer la proportion viable de cellules. L’activité de la luciférase des cellules peut être facilement mesurée par l’ajout de la luciférine, le substrat de la luciférase, et capturer la luminescence par n’importe quel instrument ayant la fonction de mesure luminométrique. Parce que la réaction luciférase-luciférine est rapide, elle fournit ici une solution bon marché et rapide par rapport au MTT traditionnel (bromure de MTT traditionnel (3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium), MTS(3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxyméthoxyphényl)-2-(4-sulfophényl)-2H tétrazolium) ou CCK-8 (kit de comptage cellulaire-8), qui nécessitent tous de longs temps d’incubation. Ensemble, le protocole présente un dépistage à haut débit d’une combinaison potentielle de médicaments pour le GBM. Le protocole fournit également une solution rapide et simple en option pour le dépistage des combinaisons de médicaments en plus des méthodes standard d’évaluation des synergies.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
B-27	Gibco	17504-044	50X
EGF	Gibco	PHG0313	20 ng/ml
FGF	Gibco	PHG0263	20 ng/ml
Gluta Max	Gibco	35050061	100X
Neurobasal	Gibco	21103049	1X
Penicillin-Streptomycin	HyClone	SV30010	P: 10,000 units/ml     S:  10,000 ug/ml
Sodium Pyruvate	Gibco	2088876	100 mM
Table 1. The formulation of GSC complete culture medium.
ABT-737	MCE		Selective and BH3 mimetic Bcl-2, Bcl-xL and Bcl-w inhibitor
Adavosertib (MK-1775)	MCE		Wee1 inhibitor
Axitinib	MCE		Multi-targeted tyrosine kinase inhibitor
AZD5991	MCE		Mcl-1 inhibitor
A 83-01	MCE		Potent inhibitor of TGF-β type I receptor ALK5 kinase
CGP57380	Selleck		Potent MNK1 inhibitor
Dactolisib (BEZ235)	Selleck		Dual ATP-competitive PI3K and mTOR inhibitor
Dasatinib	MCE		Dual Bcr-Abl and Src family tyrosine kinase inhibitor
Erlotinib	MCE		EGFR tyrosine kinase inhibitor
Gefitinib	MCE		EGFR tyrosine kinase inhibitor
Linifanib	MCE		Multi-target inhibitor of VEGFR and PDGFR family
Masitinib	MCE		Inhibitor of c-Kit
ML141	Selleck		Non-competitive inhibitor of Cdc42 GTPase
OSI-930	MCE		Multi-target inhibitor of Kit, KDR and CSF-1R
Palbociclib	MCE		Selective CDK4 and CDK6 inhibitor
SB 202190	MCE		Selective p38 MAP kinase inhibitor
Sepantronium bromide (YM-155)	MCE		Survivin inhibitor
TCS 359	Selleck		Potent FLT3 inhibitor
UMI-77	MCE		Selective Mcl-1 inhibitor
4-Hydroxytamoxifen(Afimoxifene)	Selleck		Selective estrogen receptor (ER) modulator
Table 2. The information of 20 targeted agents used in the test screen. All of these are target selective small molecular inhibitors. The provider, name, and targets were given in the table.