Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

חיסון תוך-כלי ואוסף חלב במחקרים על חיסון אימהי בארנבים הלבנים של ניו זילנד (Oryctolagus cuniculus)

Published: July 31, 2021 doi: 10.3791/62317
Automatic Translation
1,2, 1, 2, 2,3,4
1Division of Laboratory Animal Resources, Duke University Medical Center, 2Department of Pathology, Duke University Medical Center, 3Department of Immunology, Duke University Medical Center, 4Duke Human Vaccine Institute, Duke University Medical Center

Summary

מאמר זה מתאר ומדגים את ניהול החיסונים התוך-אנלתיים ואת איסוף החלב מארנבים מניקים (Oryctolagus cuniculus) כאמצעי להערכת חסינות הרירית במודל מתאים מבחינה תרגומית של חיסון אימהי.

Abstract

בשל קווי דמיון בין שליה והעברת נוגדנים עם בני אדם, ארנבות הן מודל מצוין של חיסון אימהי. יתרונות נוספים של מודל מחקר זה הם קלות הרבייה ואיסוף המדגמים, תקופת הריון קצרה יחסית וגדלי פסולת גדולים. נתיבי חיסון שהוערכו בדרך כלל כוללים תת עורית, תוך שרירית, תוך-עורית ותוך עורית. איסוף מדגם לא בסיסי לגילוי כרונולוגי של התגובות האימונולוגיות לחיסונים אלה כולל איסוף דם, הן מסכרים והן מערכות, וחלב מההנקה כן. במאמר זה, נדגים טכניקות המעבדה שלנו השתמשה במחקרים של חיסון אימהי בארנבים לבנים ניו זילנד (Oryctolagus cuniculus), כולל חיסון תוך-כלי ואוסף חלב.

Introduction

מחקרים על חיסון אימהי והעברת נוגדנים הם לא יסולא בפז מסיבות רבות, שכן זהו המסלול הראשוני של העברת חסינות והגנה עוקבת מפני פתוגנים ומחלות אצל תינוקות ותינוקות. חיסון אימהי יש פוטנציאל להשפיע באופן חיובי הן על בריאות האם והן על בריאות התינוק / ילד ברמה הגלובלית על ידי הפחתת תחלואה ותמותה הקשורים פתוגנים מסוימים בתקופה פגיעה זו1. המטרה העיקרית של אסטרטגיה זו היא להגדיל את רמות הנוגדנים האימהיים הספציפיים במהלך ההריון. נוגדנים אלה יכולים להיות מועברים לאחר מכן לתינוק ולתינוק ברמות מספיקות כדי להגן מפניזיהומיםעד שמערכת החיסון שלהם בוגרת מספיק כדי להגיב כראוי לאתגרים 1,2,3. עבודה קודמת הוכיחה כי טיטרים נוגדנים גבוהים יותר בלידה קשורים להגנה מלאה או להתפרצות מאוחרת ולחומרה מופחתת של מחלות זיהומיות רבות ושונות בתינוק, כולל טטנוס, שעלת, וירוס סינסיטיאלי נשימתי (RSV), שפעת וזיהומים סטרפטוקוקליים קבוצתיים1,2,3.

אצל בני אדם, נוגדנים אימהיים מועברים באופן פסיבי על פני השליה ומועברים גם דרך חלב אם באמצעות הנקה. עבודה קודמת הוכיחה כי רמות IgA ספציפיות ל- HIV בחלב אם אנושי מאמהות נגועות בנגיף היו קשורות להעברה מופחתת לאחר הלידה של הנגיף, מה שמרמז על תפקיד מגן לחלב אם נגד HIV IgA4. מחקרים אצל פרימטים לא אנושיים הראו כי חיסון נגד HIV יכול לגרום לתגובה נוגדנית משמעותית בחלב אם, ולמרות שתגובות IgG בסרום דומה נגרמו בעקבות חיסון מערכתי לעומת ריר, חיסון הרירית גרם לתגובת IgA גבוהה משמעותית בחלב5,6.

זיהוי מודל בעלי חיים מתאים מבחינה תרגומית למחקרים אלה צריך לקחת בחשבון את סוג השליה ואת המנגנונים של העברת נוגדנים פסיביים, כמו גם את העברת נוגדנים באמצעות חלב אם. ישנם שלושה סוגים עיקריים של שליה ביונקים המבוססים על סוגי הרקמות והשכבות בממשק המאטרנו-עוברי, כולל המוכוריאל (פרימטים, מכרסמים וארנבות), אנדותליוצ'וריאלי (טורפים) ואפיתליוצ'וריאלי (סוסים, חזירים ומהרהרים). השליה המוכוריאלית היא הסוג הפולשני ביותר, המאפשר תקשורת ישירה בין אספקת הדם האימהית לבין המקהלה, או קרום העובר החיצוני ביותר. בהתבסס על מספר שכבות trophoblast, ישנן מספר וריאציות של שליה המוכוריאלית, כולל השליה המומונוצ'וריאלית שנמצאה בפרימטים, השליה המודיקוריאלית בארנבים, והשליה המוטריכוריאלית שנצפתה בחולדות ועכברים7. מגע ישיר זה בין אספקת הדם האימהי לבין chorion מאפשר העברה פסיבית של נוגדנים על פני השליה במהלך ההריון. IgG הוא סוג הנוגדנים היחיד שחוצה באופן משמעותי את השליה האנושית8, ואילו IgA הוא המעמד השולט של איג שנמצא בחלב אם אנושי9. מבין המודלים הרלוונטיים מדעית, רק פרימטים (כולל בני אדם), ארנבות ושפני ניסיונות מעבירים את IgG ברחם ו- IgA בחלב10,11. לכן, מודל הארנב משלב גורמים דומים לאלה בבני אדם השולטים העברה transplacental של IgG והעברה הנקה של IgA.

בנוסף לשמש מודל יוצא דופן עבור חסינות אימהית ופיתוח חיסון, קווי דמיון בין הארנב חללי האף האנושי להפוך אותם מודל מתאים לחיסון תוך-אנלתי. נפח חלל האף הארנב דומה יותר לבני אדם מאשר מודלים מכרסמים המבוססים על מסת גוף יחסית12. בנוסף, Casteleyn et al. 12 הוכיח כי רקמת הלימפה הקשורים לאף (NALT) הוא נפחי יותר בארנב לעומת מכרסמים. ה- NALT ממוקם בעיקר בהיבט הגחוני והגחוני של בשר האף הגחוני ובהיבט לרוחב ודורסולטרלי של בשר האף-אופרינגאלי בארנבים, ואילו במכרסמים, רקמת הלימפה נוכחת רק לאורך ההיבט הגחוני של בשר האףהאף 12. בארנבים, המבנה והמיקום של לימפוציטים תוך-אפיתאליים ולאמינה פרופריה, כמו גם זקיקי הלימפה המבודדים, דומים לבני אדם12.

יתרונות נוספים של שימוש בארנב כמודל לחסינות אימהית ורירית כוללים את פוריותם הגבוהה ותקופת ההיריון הקצרה יחסית. כלי דם אורקולריים גדולים מאפשרים גישה קלה יחסית לכמויות גדולות של דם לאוספים סדרתיים. ניתן לאסוף מגוון דגימות ריר לתגובת נוגדנים ספציפית לאנטיגן, כולל חלב אם13 (בעת הנקה), הפרשות ריר או שטיפות (למשל, אוראלי14,15,16, שטיפת ברונכולבולר13,17,18,19,נרתיק 20,21,22), וצואה20,23,24,25. דגימות חלב ניתן לאסוף בקלות במהלך ההנקה כדי להעריך את נוכחותם של תגובות נוגדנים ספציפיות לאנטיגן. אמנם לא בשפע כמו עבור בני אדם ועכברים, מגוון רחב של ריאגנטים ניסיוניים זמינים עבור מחקרים ספציפיים ארנב מבחנים. במאמר זה נתאר ונדגים חיסון תוך-אפי ואוסף חלב בארנבים לבנים בניו זילנד(Oryctolagus cuniculus).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל ההליכים אושרו ובוצעו בהתאם למדיניות IACUC של אוניברסיטת דיוק.

הערה: החומרים הדרושים מסופקים בטבלת החומרים.

1. הרדמה והרדמת ארנבות

  1. להרדם את הארנב הנשי (בוגר מינית; כ 5-30 חודשים) על ידי מתן acepromazine תוך שרירית (IM) במינון של 1 מ"ג / קילוגרם. בהתאם לגודל של החיה, להשתמש במזרק 1 או 3 מ"ל עם מחט 25 G. השרירים Epaxial הם האתר המועדף של הזרקה תוך שרירית.
    הערה: Acepromazine יכול להינתן גם תת עורית, אבל IM הוא המועדף על ידי המעבדה, כפי שהוא פועל מהר יותר ומפחית את השכיחות של נגעים בעור.
  2. המתן 10-15 דקות כדי לאפשר לאצפרומזין להיכנס לתוקף.
  3. הנח את הארנב עם isoflurane על ידי הנחת חרוט האף מחובר על אפו של החיה. כוונן את מאדה עד 4% isoflurane בשילוב עם עד 4 ליטר / דקה חמצן. ארנבים יש סלידה גבוהה isoflurane, כך איפוק נאותה יש צורך בעת מיסוך החיה.
  4. לאחר הרדמה מלאה, כפי שהוערך על ידי פינה, דוושה, ו / או רפלקס palpebral, להחיל חומר סיכה עיניים על כל עין כדי למנוע ייבוש של העיניים כיב הקרנית הבאים.
  5. לפקח ללא הרף רפלקסים ונשימה במהלך הרדמה, ולהפחית את שיעור isoflurane ל 1-2% לאחר מישור נאותה של הרדמה כבר הגיע.

2. חיסון תוך-אפי

  1. הכינו פתרון חיסון לפני הטיפול בבעלי חיים.
  2. היכך את הארנב כמתואר לעיל.
  3. ברגע שחבר המעבדה מוכן לנהל את החיסון והארנב נמצא במישור הרדמה הולם, כבה את האירופלורן והחמצן והסר את חרוט האף.
  4. מניחים את הארנב בנסיכות הגב, ומפעילים את הצוואר והראש בזווית משוערת של 45 מעלות המאפשרת גישה קלה והדמיה של שני הנארס על ידי חבר המעבדה המנהל את החיסון.
  5. לטעון את פיפטה עם לא יותר מ 100 μL של פתרון החיסון, במהירות לנהל את הפתרון בכל נחיריים. פיפטה צריך להיות מוחזק בזווית משוערת 45 °, זווית לכיוון ההיבט המדיאלי של מעבר האף.
    הערה: מטרת החיסון היא לפתרון ליצור קשר עם קרום הרירית של nares, ולכן הטיפ לא צריך להיות ממוקם בתוך nares, כמו זה עלול לגרום שחיקה או גירוי של רקמות הרירית ועלול להשפיע על האימונוגניות של החיסון מנוהל באף. החיסון צריך להינתן במהירות ונעשה באותו אופן ב nare האחר.
  6. לאחר הממשל בשני מעברי האף, לשמור על הארנב ב recumbency הגב במשך 30 שניות כדי למזער את הדליפה של פתרון החיסון.
    הערה: המעבדה בדרך כלל לנהל לא יותר מ 100 μL לכל נחיריים בכל פעם. אם יש לתת נפח גדול יותר, עם סך מרבי של 500 μL, החיסון יכול להינתן ב 100 μL aliquots עם תקופת מנוחה של 30 שניות בין חיסונים, וממשלים נוספים של חיסון חוזרים, עם 30 שניות של מנוחה בין כל ממשל, עד נפח החיסון הכולל מועבר.
  7. לאחר החיסון, מניחים את הארנב על האוורור להחלמה ומנטרים מקרוב את החיה עד שהיא יכולה לשמור על שכיבה קשה.

3. אוסף חלב

  1. הנקה את הארנב המניק כמתואר לעיל.
  2. נקה את העור מעל וריד האוזן השולי עם ספוגית אלכוהול / לנגב.
  3. באמצעות מזרק 1 מ"ל ומחט 25 גרם, לנהל כ 1-2 IU של אוקסיטוצין דרך הווריד דרך וריד האוזן השולי כדי לגרום לחלב אכזבה.
    הערה: בשל הרפיה בשרירים חלקה, זה נפוץ עבור הארנב להשתין או לעשות את צרכיו לאחר הממשל של אוקסיטוצין.
  4. לאחר ניהול אוקסיטוצין, להפעיל לחץ על אתר ההזרקה עם חתיכת גזה.
  5. תוך שמירה על מסכת ההרדמה מעל אפו של הארנב, הנח את הארנב על אחוריו.
    הערה: אוסף חלב יכול להתבצע גם עם החיה ב recumbency לרוחב, אבל המעבדה מוצאת כי האוסף קל יותר כאשר הארנב הוא נשען על העכוז שלה עם עוזר מחזיק את הארנב זקוף עם מסכת הרדמה.
  6. פתח את הצינור הסטרילי כדי להתכונן לאיסוף חלב ולאתר את רקמת החלב ואת הפטמות הקשורות. הפטמות מוקפות בדרך כלל בפרווה רטובה מההנקה האחרונה, ורקמת החלב מוחשית בקלות כאשר היא מלאה בחלב.
  7. לתפוס את רקמת החלב הקשורים פטמה בין האגודל והאצבע ולהחיל עדין, עיסוי לחץ על רקמת הבלוטות לכיוון הפטמה. מניחים את צינור האיסוף מעל הפטמה כדי לאסוף את החלב המובע.
    הערה: זה יכול לפעמים לקחת כמה דקות עבור אוקסיטוצין להיות יעיל, ייצור החלב נראה להשתנות בין בלוטות החלב. אם ביטוי החלב אינו מוצלח, המתן מספר דקות או הסתובב לבלוטות החלב הנוספות. חלב מכל הפטמות ניתן לאסוף באותו בקבוקון. בדרך כלל, כמה מיליליטר של חלב ניתן לאסוף בקלות מן פלוני מניקה.
  8. לאחר איסוף החלב, לכבות את isoflurane וחמצן, ולאפשר את הארנב להתאושש תוך פיקוח הדוק עד החיה היא מסוגלת לשמור על שכיבה עצם החזה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

באיור 1מתוארת סקירה כללית של עיצוב טיפוסי של מחקר חיסון תוך-אפי אימהי , המשלב את החיסונים, הרבייה, ההצתה, ההנקה והעברת הנוגדנים. למרות שלא הודגם, יש לאסוף דם לפני החיסון הראשוני למדידות בסיסיות ולאורך שאר המחקר במרווחי זמן קבועים. דם מתקבל בקלות דרך עורק האוזן המרכזית עם סם מתון וסוכן משכך כאבים מקומי (למשל, לידוקאין 2.5% ופרילוקאין 2.5% קרם). נוכחות של רמות IgG ספציפיות לאנטיגן ניתן למדוד בדגימות אלה. ארנבות מחוסנות דרך המסלול התוך-אנליאתי, כפי שמתואר בפרוטוקול ומודגם בסרטון. בהתאם למחקר, החיסון עשוי לדרוש דחיפה או ייתכן שיהיה צורך לתת דרך מסלול נוסף (למשל, תוך שרירי או תת עורי). לאחר התחלת המחקר, ארנבים הם bred; אנו מעדיפים לרכוש מגדלים מוכחים מספקים לשימוש כדי להבטיח שיעור הריון גבוה יותר עבור מחקרים אלה. בהתאם לציר הזמן של החיסון, ארנבים עשויים לקבל חיסונים נוספים במהלך ההריון. IgG ספציפי אנטיגן מועבר transplacentally לערכות, ובערך 30-32 ימים לאחר הרבייה, בהריון עושה להצית. אנו ממליצים להגביל את הטיפול בערכות בימים הראשונים כדי למזער את הדחייה מהערכות. ניתן לאסוף דגימות דם מהערכות כדי להעריך את רמות ה-IgG הספציפיות לאנטיגן שהועברו באופן רוחבי (איור 3). בנוסף למגוון רחב של חומרים מזינים, ערכות מקבלות IgA מן האילה מניקה בזמן הנקה. ערכות נפגמים בדרך כלל ב 4-8 שבועות, אבל לפני היתוך, חלב ניתן לאסוף בקלות מן הנקה עושה, כפי שהוכח בסרטון. לאחר מכן ניתן לעבד את דגימות החלב שנאספו לגילוי רמות IgA כוללות וספציפיות לאנטיגן (איור 4). בהתאם למחקר, חיסונים (+/- מגביר) יכול להינתן ערכות, ודגימות דם סדרתי ניתן לאסוף מן הערכות בגיל צעיר מאוד באמצעות הווריד saphenous לרוחב.

עבור מחקרים אימהיים, קביעת הריון מוקדם ככל האפשר מועילה לעיצוב המחקר ולהבטחת האיילים לא צריך להיות rebred. מדידות פרוגסטרון יכול לשמש כאמצעי לגילוי הריון. כפי שמוצג באיור 2, ניתן לזהות רמות גבוהות של פרוגסטרון בארנבים בהריון בהשוואה לארנבים שאינם בהריון גם לאחר שהזדווגו בדולר אושרו לכולם. ישנן שיטות נוספות לגילוי הריון, כולל מישוש ידני, אולטרסאונד, רדיוגרפים; עם זאת, אלה דורשים ציוד אישי ונכון מאומן היטב.

אנטיגן ספציפי IgG שהועבר transplacentally בעוד ברחם ניתן למדוד בסרום של ערכות. ניתן לאסוף דם ממספר קטן של ערכות בזמן הלידה או בסמוך לו כדי להעריך את רמות הנוגדנים הספציפיות לאנטיגן מוקדם, אך איסוף דם סדרתי הוא טכנית הרבה יותר קל ככל שהערכות מזדקנות ומגדילות את הגודל. כפי שמתואר באיור 3, רמות הסרום של IgG ספציפי לאנטיגן בערכות ניתנות למדוד על ידי ELISA ובהשוואה לרמות האימהיות. רמות IgG המועברות באופן אימהי נוטות להיות גבוהות יותר בלידה ולצמצם עם הזמן.

כסוג של דגימת ריר, ניתן לאסוף ולעבד חלב כדי למדוד את רמות הנוגדנים הכוללות או הספציפיות לאנטיגן. כפי שמוצג באיור 4, IgA מהווה חלק משמעותי מסך רמות הנוגדנים בחלב אם המועבר לערכות באמצעות הנקה. התוצאות שלנו מראות כי חלב אם IgA מייצר אות ELISA מעט גבוה יותר (יחידות אור יחסית, RLU) בהשוואה ל- IgG, וגם IgA ו- IgG מייצרים אות גבוה בהרבה מהאות עבור IgM. תוצאות אלו הן בהסכמה עם תוצאות מאחרים המציעים כי חלב ארנב מכיל סביב 4.5 מ"ג / מ"ל IgA, 2.4 מ"ג / מ"ל IgG, ו 0.1 מ"ג / מ"ל IgM26,27.

Figure 1
איור 1. ציר זמן לדוגמה עבור עיצוב מחקר חיסון תוך-אפי אימהי במודל ארנב (Oryctolagus cuniculus). ארנבות מחוסנות דרך המסלול התוך-אנליאתי, כפי שמתואר בפרוטוקול ומודגם בסרטון. בהתאם למחקר, החיסון עשוי לדרוש דחיפה או ייתכן שיהיה צורך לתת דרך מסלול נוסף (למשל תוך שרירית או תת עורית). ארנבים הם גידלו אז. IgG ספציפי אנטיגן מועבר transplacentally לערכות, ובערך 30-32 ימים לאחר הרבייה, בהריון עושה להצית. IgA מועבר ערכות מן האילמה מניקה בזמן הנקה. לפני היתוך, חלב יכול בקלות להיאסף מן ההנקה עושה כדי להעריך את רמות IgA הכוללת ואנטיגן ספציפי. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2. רמות פרוגסטרון ארנבות בהריון ולא בהריון ב 3 שבועות לאחר הרבייה. דם נאסף מארנבים בגיל 3 שבועות לאחר הרבייה. ארנבות אושרו או בהריון או לא בהריון מבוסס על היכולת להצית המלטה ב 30-32 ימים לאחר הרבייה. רמות פרוגסטרון בסרום נמדדו באמצעות המעבדה לאבחון וטרינרי של אוניברסיטת מישיגן באמצעות אימונואסיה צ'מילומינסנטית (CLIA) עם מערכת אימונואסית (למשל, סימנס Healthineers IMMULITE 2000). קווי שגיאה מייצגים שגיאת תקן של הממוצע, וגודל המדגם כלל 4-6 ארנבים לכל קבוצה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3. רמות IgG ספציפיות לאנטיגן בערכות (יחסית לרמות אימהיות) בלידה ובגיל 3 שבועות בעקבות סדרה של חיסונים אימהיים. דם נאסף מן עושה וערכות זמן קצר לאחר הצתה ובגיל 3 שבועות. רמות IgG ספציפיות לאנטיגן בתוך הסרום זוהו באמצעות ELISA פלואורסצנטי כפי שתואר קודם לכן28. IgG ספציפי אנטיגן הוא התווה כיחס של רמות זוהה בסרום ערכת וסרום אימהי. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4. השוואה בין רמות IgA, IgM ו- IgG בחלב ארנבים. חלב ארנב נאסף כמתואר והודגם בסרטון. חלב עובד על ידי צנטריפוגה ארוכה (13,000 x גרם במשך 4.5 שעות ב 4 מעלות צלזיוס), ואת השכבה האמצעית ברורה היה מבודד לאחר עיבוד. סה"כ רמות IgA, IgG ו- IgM נמדדו בשכבה ברורה זו על ידי ELISA פלואורסצנטי כפי שתואר קודם לכן28, למעט כי הצלחות היו מצופים אנטי IgA פוליקלונלי, אנטי IgG, או אנטי IgM כדי לזהות סך הארנב IgA, IgG, או IgM, בהתאמה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

למרות שלא תואר בפרוטוקול לעיל, רבייה מוצלחת של הארנבים נחוצה למודל אימהי זה ולאפשר איסוף חלב. ארנבים גדלים בקלות על ידי כיסוי חי במסגרת מחקר. מומלץ כי אכן יועבר לכלוב של הדולר לרבייה, כמו גם יכול להיות טריטוריאלי ואגרסיבי אם נשמר בכלוב שלהם עם הכסף. אם הנקבות אינן פתוחות לאחר 15 דקות (כפי שצוין על ידי ריצה משם נושך, או קול), האילה צריכה להיות ממוקמת בחזרה לתוך הכלוב שלה. ישנם מספר קטעי וידאו אינפורמטיביים הדרכות על הרבייה ארנב שניתן לראות באינטרנט29, אבל לאחר הרבייה, הזכר בדרך כלל ליפול על ועשוי להשמיע. ברגע שזה נצפה, האימונית יכולה לחזור לכלוב שלה. דולר עשוי להתרבות 2-3 פעמים ביום ללא ירידה בספירת הזרע30. בפרוטוקול שלנו שאושר על ידי IACUC, דולרים מוגבלים לרבייה 10-12 עושה בשבוע ניתנים לפחות שני ימי מנוחה בשבוע, כמו מקורות המדינה כי דולר אחד הוא בדרך כלל מספיק כדי לשרת 10-15 עושה31. הקבוצה שלנו מציעה לרכוש מגדלים מוכחים מהספק כדי לשפר את שיעור ההצלחה הרבייה. כמו ארנבים הם ביוצים המושרה הביוץ מתרחשת בדרך כלל 10-13 שעות לאחר הזדווגות31, חווינו שיעור גבוה יותר של הריון עושה כי הם bred בבוקר ולאחר מכן שוב אחר הצהריים, או פעמיים בתוך חלון זה 10-13 שעות (נצפתה עלייה מ 75% ל 95% שיעור ההצלחה, לא פורסם). על פי הספרות, שיעורי הצלחת הרבייה הטיפוסיים נעים בין 57-100%32,33,34,35,36,37,38,39,40, וגודל המלטה הממוצע כ 7-9ערכות 31.

קביעת הריון מוקדם ככל האפשר מועיל במחקרים אימהיים כדי לאשר כי האיילים לא צריך להיות rebred או להסיר מהמחקר. אפשרויות לגילוי הריון כוללות מישוש (כבר 14 ימים)31, אולטרסאונד (כבר 5-9 ימים)40, radiographs (כבר ביום 11)31, עלייה במשקל, וטכניקות מולקולריות, כגון מדידות של גורמיגדילה אינסולין 41 (IGF) ופרוגסטרון34,37,38,42,43. עבודה קודמת הצביעה על גבהים משמעותיים של רמות IGF-II בארנבים בהריון בהשוואה לרמות בארנבים שאינם בהריון41. עם זאת, בידיים שלנו, לא הצלחנו לזהות הבדל ברמות IGF-II בין ארנבות בהריון ולא בהריון (לא פורסם). כמו רמות פרוגסטרון נאותה נחוצים לשמירה על ההריון ארנבות37,44, מספר מחקרים העריכו את רמות פרוגסטרון ארנבות בהריון והפגינו רמות גבוהות יחסית ארנבים שאינם בהריון, במיוחד במהלך organogenesis סביב אמצע ההריון34,43,44. הקבוצה שלנו לא הצליחה לזהות הבדלים ברמות הפרוגסטרון באמצעות ELISA בין ארנבות בהריון ולא בהריון, אך תוצאות ראשוניות באמצעות בדיקה כימית אוטומטית במעבדת האבחון הווטרינרי של אוניברסיטת מישיגן מצביעות על רמות גבוהות של פרוגסטרון בארנבים בהריון בהשוואה לארנבים שאינם בהריון גם לאחר שהזדווגות על ידי דולר אושרה לכולם(איור 2).

הנקה יכולה לייצר כ 250 מ"ל, או 60 מ"ל / קילוגרם, של חלב מדי יום45,46, המאפשר כמויות גדולות עבור מבחנים ניסיוניים להעריך תגובות נוגדנים / ריכוזים ספציפיים לאנטיגן. חלב ארנב מכיל רמות גבוהות של שומן וחלבון, המכיל 2 ו 3 פעמים רמות מרוכזות יותר של שומן וחלבון, לעומת פרה וחלב חזיר, בהתאמה45,47. בשל תכולת השומן הגבוהה בחלב, הדגימות דורשות עיבוד משמעותי, בהתאם לתסעפויות שיש לבצע. לאחר צנטריפוגה של דגימת החלב, שלוש שכבות נפרדות מופרדות החוצה, כולל התאים בתוך השכבה התחתונה, שכבת ביניים ברורה המכילה את האימונוגלובולינים, ושומן בתוך השכבה העליונה48. אימונוגלובולין, בתוך שכבת הביניים הברורה, נמצאים בריכוזים גבוהים בתוך הקולוסטרום והחלב ומומצאים בעיקר מ- IgA, IgG ו- IgM (איור 4). למרות דגימות חלב נאספים בקלות ביד, וזו הטכניקה המועדפת עלינו בתוך המעבדה, מערכות ואקום דווחו גם בספרות13,46,48. Yoshiyama et al.48 אסף דגימות חלב בלחץ שלילי ותיאר צנטריפוגה ארוכה (15,000 x g במשך 4 שעות) להפרדת שכבות החלב לפני העברת שכבת ביניים ברורה דרך עמוד Sepharose 4B להסרת אימונוגלובולין. בשיטה זו, המחברים הצליחו לזהות נוגדנים ספציפיים לרעלן כולרה בתוך חלב הארנב של ארנבים מחוסנים דרך הפה ברמות מספיקות להגנה מפני הפרשת Vibrio כולרההנגרמת במעי48. Peri et al.13 דגימות חלב מעובד שנאספו על ידי שאיפה עם מערכת ואקום מים על ידי צנטריפוגה ב 4 מעלות צלזיוס במשך 2 שעות ב 24,000 x גרם. במחקר זה, המחברים הצליחו לזהות IgA אנטי RSV בקולוסטרום, חלב, הפרשות הסימפונות והמעיים בעקבות חיסון רירית (אוראלי או תוך ורידי), אבל לא חיסון תוך ורידי, ואילו אנטי RSV IgG זוהה קולוסטרום, חלב וסרום ללא קשר למסלולחיסון 13.

יש להקפיד במהלך הליך החיסון התוך-אפי כדי לאשר שהארנב נמצא במישור הרדמה הולם ולהימנע מניהול כמויות גדולות של חיסון בבת אחת. עבודה קודמת מהקבוצה שלנו הראתה כי היעילות של החיסון התוך-אפי הושפעה משימוש בהרדמה49. באופן ספציפי, הרדמה עמוקה הנגרמת על ידי שילוב של קטמין ו xylazine בקורלציה עם אימונוגניות מוגברת של החיסון מנוהל באף ושמירה משופרת באף של הפתרון. רמות אלה היו גבוהות באופן משמעותי מאשר שימור ואימונוגניות ארנבים מחוסנים תוך-אופן בעקבות הרדמה עם acepromazine ו butorphanol49. ממצאים דומים הוכחו גם בעקבות חיסון תוך-אפי בעכברים50,51. בנוסף, עבודתנו הוכיחה אימונוגניות מוגברת בעקבות חיסון תוך-עורי תחת ההרדמה העמוקה על בעלי חיים שהיו ערים לחלוטין ועל בעלי חיים שעברו הרדמה קצרת יותר עם שילוב של אצפרומזין ו איזופלורן. הבדל זה באימונוגניות IgG בין הרדמה עמוקה לעומת הרדמה משך קצר יותר היה משמעותי בנקודת הזמן של 42 יום, אך לא בנקודת הזמן של 56 יום. למרות אימונוגניות מוגברת ושמירה עשוי לנבוע הרדמה עמוקה יותר, ארנבים נדרשו לפחות 30 דקות כדי להתאושש; ואילו, ארנבים היו זקוף ונייד בתוך 5 דקות מקבלת החיסון לאף בעקבות משך זמן קצר יותר isoflurane-induced הרדמה. למרות הרדמה לא יכול להיות אידיאלי עבור חיקוי ההגדרה הקלינית עבור חיסון תוך-אפי בבני אדם, הרדמה משך קצר יותר (למשל, איזופלורן) עשוי להיות מועדף להרדמה ארוכה ועמוקה עם סוכנים להזרקה (למשל, קטמין + xylazine). השימוש במודל של בעלי חיים, כפי שהוכח ב- Gwinn et al.49, ידרוש לעתים קרובות שימוש בהרדמה או בהרדמה כדי לאפשר טיפול בטוח בבעלי חיים ואספקת חיסון יעילה ועקבית. מגבלה אפשרית לשימוש בהרדמה עם מתן חיסון במודלים של בעלי חיים היא השפעתה על יכולתו של בעל החיים לגרום לתגובה חיסונית מתאימה לחיסון. מעניין, דיווחים בספרות מראים כי isoflurane יכול להשמיץ תגובות דלקתיות מערכתיות, מתן הגנה מפני אתגרים52 והפחתת מתח חמצוני ודלקת53.

לגבי צמצום אובדן החיסון ואספקה תוך-חיסונית נאותה, הקבוצה שלנו ממליצה על תקופת מנוחה של 30 שניות לאחר מתן כל aliquot של החיסון תוך-ורידי כדי לאפשר שמירה על הפתרון בתוך חלל האף ולמנוע את הפתרון מחלחל מן הנחיריים אם הארנב ממוקם מיד בנסיגה קשה וחזר לכלוב. בנוסף, חשוב להגביל את נפח aliquot מנוהל כדי להבטיח חיסון תוך-אפי, כמו ספיגת הרירית מוגבלת על ידי שטח הפנים של מעבר האף. אם נפח גדול מנוהל, הפתרון עשוי לעקוף את רירית האף ולהוביל לחיסון בשאיפה או בקיבה. הקבוצה שלנו ממליצה aliquots של 100 μL לכל נחיריים עם נפח תוך-אנלתי מקסימלי של 500 μL.

מאמר זה מתמקד באספקת חיסונים ריר, במיוחד דרך המסלול התוך-אפי, אך ישנן שיטות חיסון מרובות, הן ריר והן parenteral שהודגמו בארנבים. שיטות נוספות אלה כוללות, אך אינן מוגבלות, אוראלי, תת עורי, תוך שרירי, תוך עורי, תוך עורי, תוך עורי. לפיכך, דגימות שיש לאסוף ולהעריך משתנות בהתאם למטרות הניסוי ולמסלול החיסון.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

המחברים מבקשים להכיר באגף משאבי בעלי חיים במעבדה באוניברסיטת דיוק ובצוות הבעלות שלהם על עזרתם וטיפול רב בבעלי החיים. בנוסף, המחברים רוצים להכיר את צוות PhotoPath בתוך המחלקה לפתולוגיה על עזרתם בחלקי השמע והווידאו של כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי קרנות מחקר לפי שיקול דעת ממעבדת Staats.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Intranasal Immunization
Anesthesia Machine/Vaporizer Vet Equip 901807
Hypodermic Needle (25 g) Terumo 07-806-7584
Isoflurane (250 mL Bottle) Patterson Veterinary 07-893-1389 2-4%
Luer Lock Syringe (1 mL) Air-Tite 07-892-7410
Mucosal Vaccine N/A N/A Experimental Vaccine
Nose Cone McCulloch Medical 07891-1097
Pipette Tips VWR 53503-290
Pipettor VWR 89079-962
PromAce (Acepromazine maleate) Boehringer Ingelheim 07-893-5734 1mg/kg IM
Puralube Sterile Ophthalmic Ointment Dechra 07-888-2572
Milk Collection
Alcohol Prep 2-ply Covidien 07-839-8871
Anesthesia Machine/Vaporizer Vet Equip 901807
Hypodermic Needles (25 g) Terumo 07-806-7584
Isoflurane (250 mL Bottle) Patterson Veterinary 07-893-1389 2-4%
Luer Lock Syringe (1 mL) Air-Tite 07-892-7410
Non-Woven Sponge (4x4) Covidien 07-891-5815
Nose Cone McCulloch Medical 07891-1097
PromAce (Acepromazine Maleate) Boehringer Ingelheim 07-893-5734 1mg/kg IM
Puralube Sterile Ophthalmic Ointment Dechra 07-888-2572
Sterile Conical Vial (15 mL) Falcon 14-959-49B

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Munoz, F. M. Current Challenges and Achievements in Maternal Immunization Research. Frontiers in Immunology. 9, 436 (2018).
  2. Kachikis, A., Englund, J. A. Maternal immunization: Optimizing protection for the mother and infant. The Journal of Infection. 72, Suppl 83-90 (2016).
  3. Omer, S. B. Maternal Immunization. The New England Journal of Medicine. 376 (13), 1256-1267 (2017).
  4. Pollara, J., et al. Association of HIV-1 Envelope-Specific Breast Milk IgA Responses with Reduced Risk of Postnatal Mother-to-Child Transmission of HIV-1. Journal of Virology. , 01560 (2015).
  5. Fouda, G. G. A., et al. Mucosal Immunization of Lactating Female Rhesus Monkeys with a Transmitted/Founder HIV-1 Envelope Induces Strong Env-Specific IgA Antibody Responses in Breast Milk. Journal of Virology. 87 (12), 6986-6999 (2013).
  6. Nelson, C. S., et al. Combined HIV-1 Envelope Systemic and Mucosal Immunization of Lactating Rhesus Monkeys Induces Robust IgA-Isotype B Cell Response in Breast Milk. Journal of Virology. 90 (10), 4951-4965 (2016).
  7. Furukawa, S., Kuroda, Y., Sugiyama, A. A comparison of the histological structure of the placenta in experimental animals. Journal of Toxicologic Pathology. 27 (1), 11-18 (2014).
  8. Palmeira, P., Quinello, C., Silveira-Lessa, A. L., Zago, C. A., Carneiro-Sampaio, M. IgG placental transfer in healthy and pathological pregnancies. Clinical & Developmental Immunology. 2012, 985646 (2012).
  9. Macchiaverni, P., et al. Mother to child transfer of IgG and IgA antibodies against Dermatophagoides pteronyssinus. Scandinavian Journal of Immunology. 74 (6), 619-627 (2011).
  10. Pentsuk, N., vander Laan, J. W. An interspecies comparison of placental antibody transfer: new insights into developmental toxicity testing of monoclonal antibodies. Birth Defects Research Part B Developmental and Reproductive Toxicology. 86 (4), 328-344 (2009).
  11. Butler, J. E., Rainard, P., Lippolis, J., Salmon, H., Kacskovics, I., et al. Mucosal Immunology. Mestecky, J., et al. , Academic Press. Ch. 116 2269-2306 (2015).
  12. Casteleyn, C., Broos, A. M., Simoens, P., Vanden Broeck, W. NALT (nasal cavity-associated lymphoid tissue) in the rabbit. Veterinary Immunology Immunopathology. 133 (2-4), 212-218 (2010).
  13. Peri, B. A., et al. Antibody content of rabbit milk and serum following inhalation or ingestion of respiratory syncytial virus and bovine serum albumin. Clinical and Experimental Immunology. 48 (1), 91-101 (1982).
  14. Fukuizumi, T., Inoue, H., Tsujisawa, T., Uchiyama, C. Tonsillar application of killed Streptococcus mutans induces specific antibodies in rabbit saliva and blood plasma without inducing a cross-reacting antibody to human cardiac muscle. Infection and Immunity. 65 (11), 4558-4563 (1997).
  15. Saeed, M. I., Omar, A. R., Hussein, M. Z., Elkhidir, I. M., Sekawi, Z. Development of enhanced antibody response toward dual delivery of nano-adjuvant adsorbed human Enterovirus-71 vaccine encapsulated carrier. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 11 (10), 2414-2424 (2015).
  16. Ma, Y., et al. Vaccine delivery to the oral cavity using coated microneedles induces systemic and mucosal immunity. Pharmaceutical Research. 31 (9), 2393-2403 (2014).
  17. Jarvinen, L. Z., Hogenesch, H., Suckow, M. A., Bowersock, T. L. Induction of protective immunity in rabbits by coadministration of inactivated Pasteurella multocida toxin and potassium thiocyanate extract. Infection and Immunity. 66 (8), 3788-3795 (1998).
  18. Suckow, M. A., Bowersock, T. L., Nielsen, K., Grigdesby, C. F. Enhancement of respiratory immunity to Pasteurella multocida by cholera toxin in rabbits. Laboratory Animals. 30 (2), 120-126 (1996).
  19. Jarvinen, L. Z., HogenEsch, H., Suckow, M. A., Bowersock, T. L. Intranasal vaccination of New Zealand white rabbits against pasteurellosis, using alginate-encapsulated Pasteurella multocida toxin and potassium thiocyanate extract. Comparative Medicine. 50 (3), 263-269 (2000).
  20. Winchell, J. M., Routray, S., Betts, P. W., Van Kruiningen, H. J., Silbart, L. K. Mucosal and systemic antibody responses to a C4/V3 construct following DNA vaccination of rabbits via the Peyer's patch. The Journal of Infectious Diseases. 178 (3), 850-853 (1998).
  21. Wegmann, F., et al. A novel strategy for inducing enhanced mucosal HIV-1 antibody responses in an anti-inflammatory environment. PLoS One. 6 (1), 15861 (2011).
  22. Winchell, J. M., Van Kruiningen, H. J., Silbart, L. K. Mucosal immune response to an HIV C4/V3 peptide following nasal or intestinal immunization of rabbits. AIDS Research and Human Retroviruses. 13 (10), 881-889 (1997).
  23. Knudsen, C., et al. Quantitative feed restriction rather than caloric restriction modulates the immune response of growing rabbits. The Journal of Nutrition. 145 (3), 483-489 (2015).
  24. Ciarlet, M., et al. Subunit rotavirus vaccine administered parenterally to rabbits induces active protective immunity. Journal of Virology. 72 (11), 9233-9246 (1998).
  25. Denchev, V., Mitov, I., Marinova, S., Linde, K. Local and systemic immune response in rabbits after intraintestinal immunization with a double-marker attenuated strain of Salmonella typhimurium. Journal of Hygiene, Epidemiology, Microbiology, and Immunology. 32 (4), 457-465 (1988).
  26. Watson, D. L. Immunological functions of the mammary gland and its secretion--comparative review. Australian Journal of Biological Sciences. 33 (4), 403-422 (1980).
  27. Lascelles, A. K., McDowell, G. H. Localized humoral immunity with particular reference to ruminants. Transplantation Reviews. 19, 170-208 (1974).
  28. Jones, D. I., et al. Optimized Mucosal Modified Vaccinia Virus Ankara Prime/Soluble gp120 Boost HIV Vaccination Regimen Induces Antibody Responses Similar to Those of an Intramuscular Regimen. Journal of Virology. 93 (14), (2019).
  29. Rabbit Tracks: Breeding Techniques and Management. Michigan State University. , Available from: https://www.canr.msu.edu/resources/rabit tracks breeding techniques and management (2020).
  30. Patton, N. M. The Biology of the Laboratory Rabbit. Manning, P. J., Ringler, D. H., Newcomer, C. E. , Academic Press. Ch. 2 27-45 (1994).
  31. Nowland, M. H., Brammer, D. W., Garcia, A., Rush, H. G. Laboratory Animal Medicine. Fox, J. G., et al. , Academic Press. Ch. 10 411-461 (2015).
  32. Attia, Y. A., Al-Hanoun, A., El-Din, A. E., Bovera, F., Shewika, Y. E. Effect of bee pollen levels on productive, reproductive and blood traits of NZW rabbits. Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition. 95 (3), 294-303 (2011).
  33. Feussner, E. L., Lightkep, G. E., Hennesy, R. A., Hoberman, A. M., Christian, M. S. A decade of rabbit fertility data: study of historical control animals. Teratology. 46 (4), 349-365 (1992).
  34. Manal, A. F., Tony, M. A., Ezzo, O. H. Feed restriction of pregnant nulliparous rabbit does: consequences on reproductive performance and maternal behaviour. Animal Reproduction Science. 120 (1-4), 179-186 (2010).
  35. Marai, I. F., Ayyat, M. S., Abd el-Monem, U. M. Growth performance and reproductive traits at first parity of New Zealand white female rabbits as affected by heat stress and its alleviation under Egyptian conditions. Tropical Animal Health and Production. 33 (6), 451-462 (2001).
  36. Rodríguez, M., et al. A diet supplemented with n-3 polyunsaturated fatty acids influences the metabomscic and endocrine response of rabbit does and their offspring. Journal of Animal Science. 95 (6), 2690-2700 (2017).
  37. Salem, A. A., El-Shahawy, N. A., Shabaan, H. M., Kobeisy, M. Effect of punicalagin and human chorionic gonadotropin on body weight and reproductive traits in maiden rabbit does. Veterinary and Animal Science. 10, 100140 (2020).
  38. Sirotkin, A. V., Parkanyi, V., Pivko, J. High temperature impairs rabbit viability, feed consumption, growth and fecundity: examination of endocrine mechanisms. Domestic Animal Endocrinology. 74, 106478 (2020).
  39. Sun, L., et al. Effect of light intensity on ovarian gene expression, reproductive performance and body weight of rabbit does. Animal Reproduction Science. 183, 118-125 (2017).
  40. El-Gayar, M., et al. Pregnancy detectuib ub rabbits by ultrasonography as compared to manual palpation. Egyptian Journal of Animal Production. 51 (3), 196-199 (2014).
  41. Nason, K. S., Binder, N. D., Labarta, J. I., Rosenfeld, R. G., Gargosky, S. E. IGF-II and IGF-binding proteins increase dramatically during rabbit pregnancy. The Journal of Endocrinology. 148 (1), 121-130 (1996).
  42. Haneda, R., et al. Changes in blood parameters in pregnant Japanese White rabbits. The Journal Toxicological Sciences. 35 (5), 773-778 (2010).
  43. Mizoguchi, Y., et al. Changes in blood parameters in New Zealand White rabbits during pregnancy. Laboratory Animals. 44 (1), 33-39 (2010).
  44. Salem, A. A., Gomaa, Y. A. Effect of combination vitamin E and single long-acting progesterone dose on enhancing pregnancy outcomes in the first two parities of young rabbit does. Animal Reproduction Science. 150 (1-2), 35-43 (2014).
  45. Maertens, L., Lebas, F., Szendro, Z. Rabbit milk: A review of quantity, quality and non-dietary affecting factors. World Rabbit Science. 14 (4), 205-230 (2006).
  46. Pekow, C. A. The Laboratory Rabbit, Guinea Pig, Hamster, and Other Rodents. Suckow, M. A., Stevens, K. A., Wilson, R. P. , Academic Press. 243-258 (2012).
  47. Jenness, R. Lactational Performance of Various Mammalian-Species. Journal of Dairy Science. 69 (3), 869-885 (1986).
  48. Yoshiyama, Y., Brown, W. R. Specific antibodies to cholera toxin in rabbit milk are protective against Vibrio cholerae-induced intestinal secretion. Immunology. 61 (4), 543-547 (1987).
  49. Gwinn, W. M., et al. Effective induction of protective systemic immunity with nasally administered vaccines adjuvanted with IL-1. Vaccine. 28 (42), 6901-6914 (2010).
  50. Sloat, B. R., Cui, Z. Evaluation of the immune response induced by a nasal anthrax vaccine based on the protective antigen protein in anaesthetized and non-anaesthetized mice. Journal of Pharmcy and Pharmacology. 58 (4), 439-447 (2006).
  51. Janakova, L., et al. Influence of intravenous anesthesia on mucosal and systemic antibody responses to nasal vaccines. Infection and Immunity. 70 (10), 5479-5484 (2002).
  52. Fuentes, J. M., et al. General anesthesia delays the inflammatory response and increases survival for mice with endotoxic shock. Clinical and Vaccine Immunology. 13 (2), 281-288 (2006).
  53. Lee, Y. -M., Song, B. C., Yeum, K. -J. Impact of Volatile Anesthetics on Oxidative Stress and Inflammation. BioMed Research International. 2015, 242709 (2015).

Tags

אימונולוגיה וזיהום גיליון 173 חיסון אימהי חיסון תוך-כלי חיסון הרירית אוסף חלב חלב ארנבים אוריגטולגוס cuniculus.
חיסון תוך-כלי ואוסף חלב במחקרים על חיסון אימהי בארנבים הלבנים של ניו זילנד (<em>Oryctolagus cuniculus</em>)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Landon, C. D., Dancourt, G., Shing,… More

Landon, C. D., Dancourt, G., Shing, V., Staats, H. F. Intranasal Immunization and Milk Collection in Studies of Maternal Immunization in New Zealand White Rabbits (Oryctolagus cuniculus). J. Vis. Exp. (173), e62317, doi:10.3791/62317 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter