Immunology and Infection

新西兰白兔产妇免疫研究中的内在免疫和牛奶收集

Published: July 31, 2021 doi: 10.3791/62317

Chelsea D. Landon^1,2, Gabriella Dancourt¹, Vivian Shing², Herman F. Staats^2,3,4

¹Division of Laboratory Animal Resources, Duke University Medical Center, ²Department of Pathology, Duke University Medical Center, ³Department of Immunology, Duke University Medical Center, ⁴Duke Human Vaccine Institute, Duke University Medical Center

Summary

本文描述并演示了鼻内疫苗的管理以及哺乳兔（Oryctolagus cuniculus）的牛奶收集，作为在转换适当的母体免疫模式下评估粘膜免疫力的一种手段。

Abstract

由于胎盘和抗体转移与人类相似，兔子是产妇免疫的优良模式。这种研究模式的其他优点是育种和样品收集的方便性、妊娠期相对较短和垃圾量大。通常评估的免疫途径包括皮下、肌肉内、内在和皮肤内。非中期样本收集，按时间顺序检测这些免疫反应，包括从水坝和包中采集血液，以及从哺乳期采集牛奶。在本文中，我们将展示我们的实验室在新西兰白兔（奥里托拉格斯小兔）的母体免疫研究中采用的技术，包括产内免疫和牛奶收集。

Introduction

母体免疫和抗体转移的研究是无价的，原因有很多，因为这是免疫转移的最初途径，也是随后保护新生儿和婴儿免受病原体和疾病侵害的途径。孕产妇免疫有可能通过减少在这一^{脆弱时期与}某些病原体有关的发病率和死亡率，对全球妇幼健康产生积极影响。该战略的主要目标是在整个怀孕期间提高特定产妇抗体的水平。然后，这些抗体可以转移到新生儿和婴儿的水平足以防止感染，直到他们的免疫系统足够成熟，足以充分应对挑战^1，2，3。先前的工作已经表明，高抗体滴定剂在出生时与完全保护或延迟发病有关，并降低了新生儿许多不同传染病的严重程度，包括破伤风、百日咳、呼吸道同步病毒（RSV）、流感和B组链球菌感染^1、2、3。

在人类中，母体抗体被动地通过胎盘转移，并通过哺乳通过母乳转移。先前的工作已经表明，感染该病毒的母亲在母乳中感染艾滋病毒的IgA水平与病毒产后传播减少有关，这表明母乳对抗艾滋病毒IgA⁴具有保护作用。对非人类灵长类动物的研究表明，对HIV的免疫可以诱导母乳中明显的抗体反应，虽然类似的血清IgG反应是在全身免疫和粘膜免疫后诱导的，但粘膜免疫在牛奶^5、6中诱导了显著较高的IgA反应。

为这些研究确定一个经过转化的动物模型时，应考虑到被动抗体转移的胎盘类型和机制，以及通过母乳转移抗体。哺乳动物的胎盘主要有三种类型，基于母体-胎儿界面的组织类型和层，包括血细胞（灵长类动物、啮齿动物和兔子）、内皮体（食肉动物）和表皮（马、猪和反胃动物）。血吸盘是最具有侵入性的类型，允许产妇血液供应和胆汁或最外层胎儿膜之间的直接通信。根据足部细胞层的数量，有几种异质胎盘的变化，包括灵长类动物体内的异质胎盘、兔子的异质胎盘，以及在大鼠^和小鼠中观察到的止痛胎盘。产妇血液供应和胆汁之间的这种直接接触允许在妊娠期间被动地将抗体转移至胎盘。IgG是唯一显著穿过人类胎盘⁸的抗体类，而IgA是人类母乳⁹中主要的Ig类。在科学相关的模型中，只有灵长类动物（包括人类）、兔子和豚鼠在牛奶^10、11中将IgG转移到子宫和IgA^中。因此，兔子模型包含的因素可与人类中控制IgG的异位转移和IgA的哺乳转移的因素相媲美。

除了作为母体免疫和疫苗开发的杰出模式外，兔子和人类鼻腔之间的相似性使其成为适当的产内免疫模式。兔子鼻腔的体积比基于相对体积¹²的啮齿动物模型更类似于人类。此外，卡斯特琳等人 ¹² 日证明，与啮齿动物相比，与啮齿动物相比，与鼻部相关的淋巴组织（NALT）在兔子中更为庞大。NALT主要位于腹腔鼻肉的腹腔和腹腔方面，位于兔子鼻咽肉的横向和侧向方面，而在啮齿动物中，淋巴组织只存在于鼻咽肉^窦12的腹腔方面。在兔子中，皮内和拉米纳丙淋巴细胞的结构和位置，以及孤立的淋巴状卵泡，^{与人类相似}。

以兔子为母体和粘体免疫模型的其他优点包括它们的肥大度高和妊娠期相对较短。大型血管允许相对容易地获得大量血液进行连续采集。可以收集各种粘膜样本，用于抗原特异性抗体反应检测，包括母乳^13（哺乳时）、粘膜分泌物或洗涤液（如口服^{14、15、16、}支气管13、17、18、19、阴道^{20、21、22）}和粪便20、23、24、25。牛奶样本在哺乳期间可以很容易地收集，以评估抗原特异性抗体反应的存在。虽然没有人类和老鼠那么丰富，但各种实验试剂可用于兔子特有的研究和检测。在这篇文章中，我们将描述和演示新西兰白兔（奥里托拉格斯小兔）的产内免疫和牛奶收集。

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Protocol

所有程序均按照杜克大学 IACUC 政策获得批准和执行。

注：所需材料在 材料表中提供。

1. 兔子安定和麻醉

通过以1毫克/公斤的剂量在肌肉内施用丙丙氨酸（IM），使雌性兔子（性成熟;大约5-30个月大）。根据动物的大小，使用1或3 mL注射器与25 G针。埃帕西拉肌肉是肌肉内注射的首选部位。
注意：丙丙氨酸也可以在皮下施用，但 IM 是实验室首选的，因为它的作用更快，降低了皮肤病变的发生率。
等待 10-15 分钟，让丙氨酸生效。
将相连的鼻锥放在动物鼻子上，用异氟烷对兔子进行麻醉。将蒸发器调整至高达 4% 异氟素，并结合高达 4 升/分钟氧气。兔子对异丙酮有很高的厌恶感，所以在遮蔽动物时需要足够的克制。
一旦完全麻醉，经pinna、踏板和/或心绞痛反射评估，将眼润滑剂涂在每个眼睛上，以防止眼睛干燥和随后的角膜溃疡。
持续监测麻醉期间的反应和呼吸，一旦达到足够的麻醉平面，将异氟兰率降低到1-2%。

2. 鼻内免疫

在动物处理之前准备免疫解决方案。
如上所述，让兔子吃了。
一旦实验室成员准备好接种疫苗，兔子处于麻醉的足够平面，关闭异氟素和氧气，并取出鼻锥。
将兔子放在背上重新任职，并以大约 45° 的角度支撑颈部和头部，以便于管理疫苗的实验室成员访问和可视化两个鼻孔。
将移液器装载不超过 100μL 的疫苗溶液，并快速管理每个鼻孔中的溶液。移液器应以大约 45° 的角度保持，向鼻通道的中间侧倾斜。
注意：免疫的目的是解决接触鼻腔粘膜的问题，因此不应将尖端放在鼻腔内，因为这可能会导致粘膜组织的磨擦或刺激，并可能影响鼻腔管理疫苗的免疫原性。疫苗应快速施用，并以同样的方式在另一个纳雷进行。
在两个鼻腔进行管理后，将兔子在后部重新任职30秒，以尽量减少疫苗溶液的泄漏。
注：实验室通常一次管理不超过100μL的鼻孔。如果要管理更大的量，最多500μL，疫苗可以在100μL的报价中给予，免疫接种和重复的疫苗额外给药之间有30秒的休息时间，每次接种之间休息30秒，直到疫苗总量交付。
免疫后，将兔子放在腹腔进行恢复，并密切监测动物，直到它能够维持粪骨再生。

3. 牛奶收集

如上所述，让哺乳的兔子受宠为一体。
用酒精拭子/擦拭清洁边缘耳静脉的皮肤。
使用1mL注射器和25克针头，通过边缘耳静脉静脉注射约1-2IU催产素，诱导牛奶放气。
注意：由于肌肉的平稳放松，兔子在施用催产素后经常小便或排便。
催产素施用后，用纱布对注射部位施加压力。
在将麻醉面罩保持在兔子鼻子上的同时，将兔子支撑在兔子的后部。
注意：牛奶收集也可以与动物在横向重新任职，但实验室发现，收集更容易，当兔子支撑在其臀部与助手举行兔子直立与麻醉面膜。
打开无菌管准备收集牛奶，并定位乳腺组织和相关奶嘴。奶嘴通常被最近护理的湿毛包围着，当充满牛奶时，乳腺组织很容易被察觉。
抓住与拇指和食指之间的奶嘴相关的乳腺组织，在奶嘴方向上对腺组织施加温和的按摩压力。将收集管放在奶嘴上收集表达的牛奶。
注意：催产素有时可能需要几分钟才能有效，乳腺的产奶量似乎各不相同。如果牛奶表达不成功，请等待几分钟或旋转到额外的乳腺。所有奶嘴的牛奶都可以在同一小瓶中收集。通常，几毫升牛奶可以很容易地从哺乳的多伊收集。
在收集牛奶后，关闭异氟烃和氧气，并允许兔子在密切监测的同时恢复，直到动物能够维持颅骨再生。

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Representative Results

图1概述了典型的产妇内免疫研究设计，包括免疫接种、育种、育苗、哺乳和抗体转移。虽然没有说明，血液应在初步免疫前收集，以便进行基线测量，并定期在整个研究的剩余部分收集。血液很容易通过中耳动脉获得温和镇定和局部镇痛剂（如利多卡因2.5%和普洛卡因2.5%霜）。这些样本中可以测量抗原特异性IgG水平的存在。雌性兔子通过鼻内路线接种疫苗，如协议所述，并在视频中演示。根据研究，疫苗可能需要增强，或者可能需要通过额外的途径（如肌肉内或皮下）给予。研究开始后，兔子被繁殖：我们更喜欢从供应商那里购买经过验证的育种者，以确保这些研究的怀孕率更高。根据免疫时间表，兔子可能会在整个怀孕期间接受额外的免疫接种。抗原特异性IgG被异位转移到试剂盒中，在繁殖后大约30-32天，怀孕确实会点燃。我们建议在头几天限制工具包的处理，以尽量减少对套件的拒绝。血液样本可以从试剂盒中采集，以评估异地转移的抗原特异性IgG水平（图3）。除了各种各样的营养物质外，试剂盒在哺乳期间还从哺乳剂中接收IgA。套件通常在 4-8 周断奶，但在断奶之前，牛奶可以很容易地从哺乳期收集，如视频中所示。然后，可以处理采集的牛奶样本，以检测总和抗原特异性IgA水平（图4）。根据研究，疫苗（+/-增强剂）可以施用到试剂盒中，并且可以使用横向树脂在很小的时候从试剂盒中采集序列血样。

对于产妇研究，尽早确定怀孕有助于研究设计，并确保杜伊不需要再繁殖。孕酮测量可用于检测怀孕。如图2所示，与非怀孕的兔子相比，怀孕的兔子可以检测到孕酮水平升高，即使交配一降压被证实。有其他方法可以检测怀孕，包括手动心绞痛、超声波和放射图：然而，这些需要训练有素的个人和适当的设备。

在子宫内异位转移的抗原特异性IgG可在试剂盒的血清中测量。血液可以在出生时或出生时接近时从少量试剂盒中采集，以评估早期抗原特异性抗体水平，但从技术上讲，随着试剂盒年龄的增长和增加的大小，连续采血要容易得多。如图3所述，试剂盒中抗原特异性IgG的血清水平可以通过ELISA测量，并与母体水平进行比较。孕产妇转移的IgG水平往往在出生时较高，并随着时间的推移而减少。

作为一种粘膜样品，牛奶可以收集和加工，以测量总或抗原特异性抗体水平。如图4所示，IgA在母乳中通过哺乳转移到试剂盒的总抗体水平中占很大一部分。我们的结果表明，母乳IgA与IgG相比产生略高的ELISA信号（相对光单位，RLU），而IgA和IgG产生的信号都远远高于IgM的信号。这些结果与其他结果表明，兔奶含有约4.5毫克/mLIgA，2.4毫克/mLIgG，和0.1毫克/mLIgM^26，27。

图1。在兔子（奥里托拉格斯小肠）模型中母体内免疫研究设计的样本时间表。雌性兔子通过鼻内路线接种疫苗，如协议所述，并在视频中演示。根据研究，疫苗可能需要增强，或者可能需要通过额外的途径（如肌肉内或皮下）给予。兔子然后繁殖。抗原特异性IgG被异位转移到试剂盒中，在繁殖后大约30-32天，怀孕确实会点燃。IgA 在护理时从哺乳剂中传递给包。断奶前，牛奶可以很容易地从哺乳期收集，以评估总和抗原特异性IgA水平。请单击此处查看此图的较大版本。

图2。孕后3周孕和非怀孕兔子的孕酮水平。繁殖后3周从兔子那里采集血液。兔子被证实怀孕或未怀孕的基础上，在繁殖后30-32天点燃垃圾的能力。血清前列腺激素水平通过密歇根州立大学兽医诊断实验室使用带有免疫测定系统的化疗免疫接种（CLIA）进行测量（例如，西门子健康者IMMULITE 2000）。错误条表示平均值的标准误差，样本大小包括每组 4-6 只兔子。请单击此处查看此图的较大版本。

图3。在一系列孕产妇免疫接种后，在出生时和3周大时，试剂盒中的抗原特异性IgG水平（相对于母体水平）。血液是在点燃后不久，并在3周的年龄从做和包收集。血清中的抗原特异性IgG水平是使用荧光ELISA检测到的，如先前描述的^28。抗原特异性IgG被绘制为在试剂盒血清和母体血清中检测到的水平比率。请单击此处查看此图的较大版本。

图4。兔子奶中IgA、IgM和IgG水平的比较。兔子奶收集如描述和演示的视频。牛奶通过长离心处理（13，000 x g，在4°C下4.5小时），经过处理后分离出透明中间层。IgA、IgG 和 IgM 总水平由荧光 ELISA 按先前描述的²⁸分在这个清晰层中测量，但板材分别涂有多克隆抗 IgA、抗 IgG 或抗 IgM 以检测总兔子 IgA、IgG 或 IgM。请单击此处查看此图的较大版本。

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Discussion

虽然上述协议没有说明，但这种母性模式和牛奶收集是必要的。在研究环境中，兔子很容易通过活盖繁殖。建议确实转移到降压笼繁殖，如果把钱关在自己的笼子里，也可以是领土和侵略性的。如果女性在15分钟后不接受（如逃跑咬人或发声所示），雌性应该被放回自己的笼子里。有几个关于兔子繁殖的信息视频和教程，可以在网上观察^到29，但繁殖后，雄性通常会跌倒，并可能发声。观察到这一点后，可以将鸽子送回她的笼子。一降压可能每天繁殖2-3次，精子数量不会减少³⁰次。在我们的IACUC批准的协议中，雄鹿仅限于每周繁殖10-12个，每周至少提供两个休息日，因为消息来源说，一个降压通常足以服务10-15做^31。我们小组建议从供应商处购买久经考验的育种者，以提高育种成功率。由于兔子是诱导排卵器，排卵通常发生在31日手术后^10-13小时，我们在早上繁殖，下午再繁殖，或在10-13小时内两次怀孕率较高（观察到成功率从75%增加到95%，未公布）。根据文献资料，典型的繁殖成功率从57-100%32，33，34，35，36，37，38，39，40，和垃圾大小平均约7-9包^31。

尽早确定怀孕对产妇研究有帮助，以确认不需要重新繁殖或从研究中取出。妊娠检测选项包括心绞痛（最早14天^）31、超声波（早至5-9天^）40、放射图（最早第11天^）31、体重增加和分子技术，如胰岛素生长因子41（IGF）和孕酮^{34、37、38、42、43}的测量。先前的工作表明，与非怀孕兔子⁴¹的水平相比，怀孕兔子的IGF-II水平显著升高。然而，在我们手中，我们无法检测到怀孕和未怀孕的兔子（未公布）之间的IGF-II水平差异。由于维持^37、44岁兔子怀孕所需的孕酮水平足够，多项研究评估了怀孕兔子的孕酮水平，并证明与非怀孕兔子相比，甲基苯丙酮水平较高，特别是在妊娠中期^、43^岁^、44岁左右的器官形成期间。我们的小组无法使用怀孕兔子和非怀孕兔子之间的ELISA检测孕激素水平的差异，但密歇根州立大学兽医诊断实验室使用自动化疗的初步结果表明，怀孕兔子的孕酮水平与非怀孕兔子相比，即使交配一分钱后，所有评估的母体激素水平都有所提高（图2）。

乳化确实可以产生大约250mL，或60mL/kg，牛奶每天^45，46，允许大量的实验检测，以评估总和抗原特异性抗体反应/浓度。兔奶含有高浓度的脂肪和蛋白质，与牛奶和母猪奶相比，含有的脂肪和蛋白质浓度分别是牛奶和母猪奶的²倍和^3倍。由于牛奶中的脂肪含量很高，样品需要大量加工，具体取决于要进行的检测。牛奶样品离心后，分离出三个不同的层，包括底层内的细胞、含有免疫球蛋白的透明中间层和顶部^层48内的脂肪。免疫球蛋白，在明确的中间层内，存在于同位素和牛奶的高浓度，主要由IgA，IgG和IgM（图4）组成。虽然牛奶样品很容易手工采集，这是我们在实验室内的首选技术，真空系统也报告在文献13，46，48。Yoshiyama等人用负压采集了⁴⁸个牛奶样品，并描述了在通过Sepharose 4B柱去除免疫球蛋白之前，为分离牛奶层进行长时间的离心（15，000 x g，持续4小时）。利用这种方法，作者能够检测出口服免疫的兔子奶中霍乱毒素特异性抗体，足以防止肠道中霍乱弧菌引起的分^泌物。Peri 等人用水真空系统在 4 °C 下离心收集¹³个加工牛奶样品，在 24，000 x g 下 2 小时。在这项研究中，作者能够检测到在粘膜免疫（口腔或体外）之后的同位素、牛奶、支气管和肠道分泌物中的抗RSV IgA，但未进行静脉注射免疫，而抗RSV IgG在同位素、牛奶和血清中检测到，而不管免疫途径¹³如何。

在进行内科免疫过程中应小心，以确认兔子处于足够的麻醉平面，并避免同时接种大量疫苗。我们小组先前的工作显示，内科免疫的功效受麻醉⁴⁹的影响。具体来说，氯胺酮和西拉津的结合引起的深度麻醉与鼻腔管理疫苗的免疫原性增加和溶液的鼻腔保留性改善有关。这些水平明显高于在用丙丙氨酸和丁醇⁴⁹镇丁镇圣后进行鼻内免疫的兔子的保留和免疫原性。在^50、51号小鼠进行产内免疫接种后^，也证明了类似的发现。此外，我们的工作表明，在深度麻醉下，对完全清醒的动物进行麻醉后，免疫原性增加，对持续时间较短的动物进行麻醉，并结合丙丙氨酸和异丙酮。深度麻醉与短持续时间麻醉之间的IgG免疫原性差异在42天时间点显著，但在56天时间点没有显著。虽然增加免疫原力和保留可能由于更深的麻醉，兔子需要至少30分钟才能恢复：然而，兔子在接受鼻腔疫苗后5分钟内直立和移动，持续时间较短，是由血红素引起的麻醉。虽然麻醉可能不适合模仿人体内麻醉的临床设置，但较短的持续时间麻醉（例如异氟素）可能优于使用注射剂（如氯胺酮+Xylazine）进行较长的深度麻醉。Gwinn等人⁴⁹所证明的动物模型的使用，往往需要使用安定或麻醉，以便安全处理动物和有效和一致的疫苗输送。在动物模型中，麻醉与疫苗管理的潜在限制是它对动物对疫苗诱导适当免疫反应的能力的影响。有趣的是，文献中的报告表明，异氟素可以减弱全身炎症反应，提供预防挑战^的保护52和减少氧化应激和炎症^53。

关于尽量减少疫苗损失和充足的产内注射，我们小组建议在接种每种鼻腔内疫苗后休息30秒，以便在鼻腔内保留溶液，并防止如果兔子立即被置于鼻骨重新任职并返回笼子里，溶液会从鼻孔渗出。此外，重要的是要限制所管理的阿利库特的体积，以确保鼻内免疫，因为粘液吸收受鼻腔表面面积的限制。如果施用大量药物，溶液可能绕过鼻粘膜，导致吸入或胃免疫。我们的小组建议每鼻孔100μL的音量最大，内在体积为500μL。

本文侧重于粘膜疫苗的传递，特别是通过鼻内途径，但有多种免疫方法，包括粘膜和母体，已经证明在兔子。这些额外的方法包括，但不限于口服，皮下，肌肉内和皮肤内。因此，要收集和评估的样本因实验目标和免疫途径而异。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

作者要感谢杜克大学实验室动物资源司及其饲养团队对动物的帮助和极大的照顾。此外，作者还希望确认病理学系内的 PhotoPath 团队，感谢他们在手稿的音频和视频部分提供的帮助。这项工作得到了Staats实验室的可自由支配的研究资金的支持。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Intranasal Immunization
Anesthesia Machine/Vaporizer	Vet Equip	901807
Hypodermic Needle (25 g)	Terumo	07-806-7584
Isoflurane (250 mL Bottle)	Patterson Veterinary	07-893-1389	2-4%
Luer Lock Syringe (1 mL)	Air-Tite	07-892-7410
Mucosal Vaccine	N/A	N/A	Experimental Vaccine
Nose Cone	McCulloch Medical	07891-1097
Pipette Tips	VWR	53503-290
Pipettor	VWR	89079-962
PromAce (Acepromazine maleate)	Boehringer Ingelheim	07-893-5734	1mg/kg IM
Puralube Sterile Ophthalmic Ointment	Dechra	07-888-2572
Milk Collection
Alcohol Prep 2-ply	Covidien	07-839-8871
Anesthesia Machine/Vaporizer	Vet Equip	901807
Hypodermic Needles (25 g)	Terumo	07-806-7584
Isoflurane (250 mL Bottle)	Patterson Veterinary	07-893-1389	2-4%
Luer Lock Syringe (1 mL)	Air-Tite	07-892-7410
Non-Woven Sponge (4x4)	Covidien	07-891-5815
Nose Cone	McCulloch Medical	07891-1097
PromAce (Acepromazine Maleate)	Boehringer Ingelheim	07-893-5734	1mg/kg IM
Puralube Sterile Ophthalmic Ointment	Dechra	07-888-2572
Sterile Conical Vial (15 mL)	Falcon	14-959-49B