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Immunology and Infection

CRISPR/Cas9 및 대식세포 및 T 세포주에서 세포 분류에 의한 유전자 노크인

Published: November 13, 2021 doi: 10.3791/62328
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 2, 1
1The Laboratory of Genetic Regulators in the Immune System, School of Laboratory Medicine, Xinxiang Medical University, 2Centre d’Immunologie de Marseille-Luminy, Aix Marseille Université

Summary

이 프로토콜은 형광 기자 및 세포 분류를 사용하여 대식세포 및 T 세포주에서 노크-인 실험을 단순화합니다. 2개의 플라스미드는 면역 세포에 있는 Rosa26 메뚜기에서 영구적으로 통합되는 EBFP2를 표현하는 EBFP2를 표현하는 상동성 재조합 기증자 플라스미드와 CRISPR/Cas9- 및 DsRed2 표현 플라스미드와 균등하게 재조합 기증자 플라스미드인 이러한 단순화된 노크-인 실험에 사용됩니다.

Abstract

면역 계통의 기능적인 유전체학 연구 결과는 표적 유전자의 삭제 및 관심있는 단백질에 요소의 추가를 둘 다 관련시키는 유전 조작을 요구합니다. 세포주 모형에 있는 유전자 기능의 확인은 세포 본질적인 기계장치의 유전자 발견 그리고 탐구를 위해 중요합니다. 그러나 CRISPR/Cas9 매개 노크인을 사용하여 T 세포 및 대식세포와 같은 면역 세포의 유전자 조작은 특히 정지 상태에서 이러한 세포의 낮은 경질 효율 때문에 어렵습니다. 면역 세포에서 유전자를 수정하기 위해 약물 내성 선택 및 바이러스 벡터는 전형적으로 CRIPSR/Cas9 시스템을 발현하는 세포를 보강하는 데 사용되며, 이는 필연적으로 세포의 바람직하지 않은 개입을 초래합니다. 이전 연구에서는 전기기화 후 일시적으로 표현된 CRISPR/Cas9에 결합된 이중 형광 기자를 설계했습니다. 이 기술적인 해결책은 면역 세포에 있는 급속한 유전자 삭제로 이끌어 냅니다; 그러나, 약물 내성 선택 또는 바이러스 벡터를 사용하지 않고 T 세포 및 대식세포와 같은 면역 세포에서 유전자 노크인은 더욱 도전적이다. 본 기사에서는, 당사는 세포 선별을 사용하여 기증자 플라스미드와 함께 Rosa26 궤적을 대상으로 CRISPR/Cas9 구조를 과도하게 표현하는 세포의 선택을 지원함으로써, 유전자 노크-인은 약물 저항 농축 없이 T 세포 및 대식세포 모두에서 달성될 수 있다는 것을 보여준다. 예를 들어, 우리는 인간 ACE2를 발현하는 방법을 보여줍니다, SARS-Cov-2의 수용체, 이는 현재 Covid-19 전염병에 대한 책임이, RAW264.7 대식세포에서 노크 -인 실험을 수행하여. 이러한 유전자 노크 세포는 기계학 연구에 널리 사용될 수 있다.

Introduction

면역 세포는 병원체에 대한 방어를 위해 중요합니다. 선천성 면역은 감염제의 통관 및 조직 항상성1,2의유지보수에필요합니다. 세포주 모형은 포유류 면역 계통의 분자 기초를 이해하기 위한 필수적인 공구입니다; 그(것)들은 인간 T 세포 활성화를 모델링하는 것과 같은 체외 기능적인 소사에서 이용되고, 면역 반응3,4를활성화하거나 감쇠에 있는 유전 요인의 기능을 결정하는 에서. 포유류 면역 계통은 엄청나게 이질적이며, 동등하게 중요한, 분자의 거대한 숫자는 주어진 세포유형의분화, 이동 및 기능을 제어한다는 것을 주의하는 것이 중요합니다5,6.

클러스터링 정기적으로 간격짧은 Palindromic 반복 (CRISPR)/Cas9 게놈 편집 도구는 정확한 방식으로 유전자의 기능성 기여를 용이하게 특정 세포 유형의 유전자 조작을 허용7,8. 여러 개의 출판 된 프로토콜은 HEK293 세포에서 리보뉴클레오 단백질 (RNPs)으로 알려진 Cas9 가이드 RNA 복합체의 형태로 CRISPR / Cas9의 전달을 설명했습니다, Jurkat 세포주, 1차 T 세포9,10,대식세포11,12, 13,줄기 세포14,및 기타15,16. 이들 프로토콜에서, 유전자 태깅은 일반적으로 내인성단백질(17,18)에형광 태그를 융합시킴으로써 달성된다. 그러나 특히 면역 세포에서 노크 인 실험19,20을용이하게하기 위해 단일 세포 분류와 호환되는 이중 형광 기자를 사용하는 시도는 거의 이루어지지 않았습니다.

면역 세포에 있는 새로운 유전 인자의 기능을 이해하기 위한 심층 기계분석은 일반적으로 유전자의 세포 형 특정 삭제, 유전 구조 실험 및 그것의 상호 작용자의 이상적으로 확인을 요구합니다. 면역 세포에서 유전자의 유전 삭제를 최적화하는 방법이9,15,21에발표되었음에도 불구하고 면역 반응을 이해하기 위해 다재다능한 기능을 가진 노크 인 알레를 도입하는 방법은 훨씬 적습니다. 따라서, 이 프로토콜에서 우리는 인간과 뮤린 면역 세포주 모두에서 안전한 항구 궤엽로26에서 관심있는 단백질 (POI)을 표현하는 효율적이고 매우 재현 가능한 프로토콜을 자세히 설명하는 것을 목표로합니다. CRISPR/Cas9(DsRed2)를 발현하는 플라스미드와 세포 분류에 의해 격리될 수 있는 재조합 DNA 템플릿(EBFP2)을 발한 플라스미드로 감염된 세포를 보강하기 위해 2색 리포터 시스템을 설계했습니다. 이 프로토콜에 따라, 우리는 제대로 연구된 단백질의 기능적 분석을 위해 인간 T 세포주 Jurkat 및 뮤린 대식세포 RAW264.7의 다중 노크-인 라인을 획득했습니다.

예를 들어, 우리는 인간 ACE2 (SARS-Cov-2의 수용체)22를안정적으로 표현하는 노크인 RAW264.7 대식세포를 얻는 방법을 이 프로토콜에서 보여준다. 선천성 면역 세포는 Covid-1923,24 및 인간 ACE2의 병인에 관여하기 때문에 복제 전에 세포로 바이러스 성 진입에 필요한 주요 수용체로 간주되기 때문에, 인간 ACE2의 노크와 대식세포는 대식세포 내부의 바이러스 증식 연구의 기계형 연구를위한 유용한 도구로 사용될 수 있습니다. 병행하여, 우리는 또한 친화성 트윈 스트렙 태그 (OST)와 그것의 아미노산 종결에서 융합된 RASGRP1 단백질을 표현하기 위하여 인간 ROSA26 메뚜기에서 유전자의 노크인의 예를 제시합니다. T 세포는 면역 요법에서 주요 표적 세포이며, 연구의 증가는 암에 그들의 반응성의 조작에 초점을맞추고있다 25,26. Rasgrp1은 T 세포 수용체의 주요 신호 분자 하류로 알려져 있으며 그 인터액터는 잘 해명되지 않는27,OST-RASGRP1 노크 -인 모델은 종양 및 감염에 T 세포의 반응을 조절하는 상호 작용을 식별하기위한 기초를 제공합니다. 종합하면, 이 공구는 Covid-19 연구 및 Rasgrp1와 상호 작용하는 새로운 분자의 발견에 이용될 수 있습니다.

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Protocol

1. 로사26 로커스를 대상으로 sgRNAs의 설계 및 플라스미드 건설

  1. 원하는 삽입 부위 주변의 설계 가이드 RNA
    1. 마우스 Rosa26(이하 mRosa26로 지정) 노크-인 실험에 대한 삽입 부위가 mRosa26의첫 번째 인트론에 위치하고 있는지 확인; 이 사이트는 이전 연구에서 사용 되었습니다28,29. 인간 세포에서의 노크-인 실험의 경우, 삽입 부위가 mRosa2630의인간 호모로로 확인된 인간 ROSA26 궤적(이하 hROSA26)에있는지 확인한다.
    2. 마우스 게놈 정보학(http://www.informatics.jax.org/)과 엔셈블 게놈 브라우저(http://www.ensembl.org/index.html)로부터 획득한 마우스 및 인간 종의 게놈 서열을 각각 사용한다. mRosa26 또는 hROSA26 궤적의 게놈 서열의 50개의 베이스 쌍(bp)을 복사하여 원하는 삽입 부위를 측면으로 한다.
    3. 온라인 웹 도구 CRISPOR (http://crispor.tefor.net/)31을사용하여 디자인 가이드 RNA . 입력 시퀀스의 100bp를 1.1.2에서 붙여넣습니다. 특이도 점수가 높은 두 개의 가이드 RNA, 고효율 점수 및 낮은 오프 타겟 활성을 선택합니다. 또한, 더 높은 Doench 점수RNA 가이드를 선택하고"비효율적"32로표시된 것을 피하십시오.
      참고: 대체 CRISPR 설계 도구는 벤치링 CRISPR 설계 도구(https://benchling.com/crispr)와 같은 가치 있고 공개적으로 사용할 수 있습니다. CRISPR/Cas9 매개 녹인 돌연변이 셀의 주파수를 증가시키기 위해, 가능하면 원하는 삽입 부위에 가까운 두 개의 가이드 RNA를선택한다 33.
    4. mRosa26 메뚜기의 경우 mR26-sg1(5'-CTCCAGTTTCTAGAAGAT -3') 및 mR26-sg2(5'-CGCCCATCTTCTAGAAAGAC-3')(그림 1A)로지정된 2개의 인접 가이드 RNA를 사용하십시오. hROSA26 메큐의 경우, hR26-sg1(5'-GGCGATGACGAGATCACGCG -3') 및 hR26-sg2(5'-AATCGAGAAGCGACTCACA-3')(그림 1B)를사용합니다.
      참고: mR26-sg1 및 mR26-sg2및 hR26-sg2의 게놈 편집 활동은 RAW264.7 세포 및 Jurkat 세포에서 각각 평가하였다(보충 파일, 도면 S1참조).
  2. Rosa26 로커스를 대상으로 sgRNA를 포함하는 CRISPR 발현 벡터의 복제
    1. 하나의 가이드 RNA에 대한 앞으로 올리고를 합성하고 역 (보충 파일참조).
      참고: U6 프로모터에 의해 구동되는 발현에 도움이 되는 가이드 서열의 시작에 'G' 뉴클레오티드를 추가하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 전술한 mR26-sg1을 복제하기 위해, 전방 올리고는 CACCGCTCCAGTCTTTCTAGAAGAT이고 역 올리고는 AAACATCTTCTAGAAGAGGGAGC이다. 전방 올리고에 추가 G와 역 올리고의 보완은 굵게 표시됩니다.
    2. 가이드 RNA에 대응하는 클론 합성 올리고스는 장연구소(https://www.addgene.org/crispr/zhang/)에 의해 개발된 gRNA 클론에 대한 일반적인 프로토콜을 사용하여 전작21(도 1C)에서생성된 올인원 CRISPR 발현 벡터 pX458-DsRed2로 변환; 그러나, 젤 정화 단계를 건너뛰고 PCR 정화 키트를 사용하여 소화된 벡터를 정화한다(재료표참조).
      참고: 이전 프로토콜에서, BbsI 소화 벡터의 겔 정화가 수행되었다; 그러나 이 단계는 시간이 많이 걸립니다. 본 프로토콜에서 소화된 제품은 PCR 정제 키트를 사용하여 정제되고 일반적으로 유사한 효율을 가진 양성 식민지를 생성하는 다운스트림 결찰 반응에 직접 사용된다.
    3. 제조 업체의 지시에 따라에체리치아 대장균 DH5α 유능한 세포의 50 μL로 결찰 생성물(step 1.2.2)의 10 μL을 변환합니다. 암피실린(100 μg/mL)이 있는 LB 한천 플레이트에서 3개의 콜로니를 무작위로 골라 내고, 하룻밤 동안 배양하기 위해 암피실린을 장착한 LB 배지 3mL로 접종한다.
    4. sanger 시퀀싱을 위해 야간 세균 배양 1mL을 사용하고 구조가 정확하다는 것이 확인될 때까지 나머지를 4°C에서 유지하십시오: pDsR-mR26-sg1 및 pDsR-mR26-sg2용 mRosa26 메뚜기 노크-인, hROSA26 궤적용 pDsR-hR26-sg1 및 pDsR-hR26-sg2.
    5. 고농도 의 플라스미드 DNA(약 2μg/μL)를 대금판으로 준비하여 질산등급 플라스미드의 정화를 위한 맥시프레플 키트(재료표참조)를 준비한다.

2. 동종 재조합 템플릿으로 타겟팅 벡터의 설계 및 구성

  1. 상동성 지향 수리 템플릿 설계
    1. CAG 하이브리드 프로모터, POI의 cDNA복제를 허용하는 AscI 제한 사이트, IRES-EBFP2 리포터, 소 성장 호르몬 폴리아데니션(bGH-polyA) 신호(그림1B)를 포함하는 이전 연구29에서최적화된 발현 카세트를 사용하여 POI를 구성적으로 표현하기 위한 표적 벡터를 설계한다.
    2. mRosa26 또는 hROSA26 궤적의 게놈 서열과 동성애를 공유하는 호모로지 암(HAs)을 설계합니다. 원하는 삽입 부위로부터 식 카세트의 왼쪽까지 상류 게놈 서열에 대응하는 5' HA의 ~1kb를 포함한다. 유사하게, 삽입 부위로부터 하류 게놈 서열에 대응하는 3' HA의 ~1kb를 발현 카세트의 오른쪽으로 포함한다.
      참고: 표현식 카세트는 CRISPR/Cas9 절단사이트(34)에가능한 한 가깝게 삽입된다. CRISPR/Cas9에 의한 표적 알레일의 재절단을 피하기 위해, 포팅벡터(34,35)에프로토스페서-인접 모티프(PAM) 서열(5'-NGG-3')에 뉴클레오티드 변화를 통합한다.
    3. 타겟팅 벡터의 선형화를 허용하려면 5' HA의 상류에 있는 고유한 EcoRI 사이트와 3HA 하류의 고유한 BamHI 사이트를 삽입합니다.
    4. 상용 벤더가 표적 벡터를 합성하고 pKR26-iBFP 및 pKhR26-iBFP로 지정하여 mRosa26 및 hROSA26 노크인을 각각 지정합니다.
  2. 타겟팅 벡터를 상동성 지향 복구 템플릿으로 구성
    1. POI를 발현하기 위해, Ensembl 게놈 브라우저로부터 cDNA 서열(coding sequence)을 얻고 가장 긴 단백질 서열을 소유한 전사체를 선택한다. 예를 들어, 인간 ACE2 유전자의 cDNA는 ACE2-202 ENST00000427411.2 및 인간 RASGRP1 유전자의 cDNA는 RASGRP1 ENSG000000172575이다.
    2. 상용 벤더의 도움으로 POI의 cDNA를 합성합니다. 또한 PCR 증폭을 통해 cDNA를 복제할 수도 있다(여기에 설명되지 않음). CDNA의 ATG 개시 코돈과 cDNA의 정지 코돈(5'-GGCGCGCC-3') 직전에 AscI 제한 사이트(기울임꼴 및 굵은) 및 코자크 컨센서스 번역 개시 사이트(밑줄)를 포함하는 서열 GGCGCGCCACC(5'-3')를 배치합니다.
    3. AscI로 합성 된 서열을 소화하고 제조 업체의 지침에 따라 제한 소화 후 DNA 조각을 정화하도록 설계된 PCR 정화 키트를 사용하여 정화하십시오 (재료 표참조).
    4. 정제된 cDNA 인서트를 제조업체의 지시에 따라 T4 DNA 리게아제를 사용하여 AscI-선형화된 백본 벡터 pKR26-iBFP 또는 pKhR26-iBFP에 리게이트한다.
    5. 최종 표적 벡터, pKR26-POI-iBFP 또는 pKhR26-POI-iBFP를 시퀀싱하여 확인합니다. maxiprep을 사용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 검증된 구문을 정화합니다.
    6. 에코리 또는 BamHI를 사용하여 타겟팅 벡터를 소화하고 제조업체의 지침에 따라 PCR 정제 키트를 사용하여 소화 제품을 정화합니다. 선형 화된 표적 벡터(~0.8 μg/μL)를 -20°C에서 전기포기까지 저장합니다.

3. 대식세포및T세포선의 전기화

  1. 전기 화에 대 한 세포 배양 준비
    1. 준비 로스웰 공원 기념 연구소 (RPMI) 1640 10% 태아 소 혈청으로 보충 (FBS) Jurkat T 세포에 대 한 완전 한 성장 매체로. RAW264.7 대식세포를 배양하기 위해 10%의 FBS로 덜벡코의 수정된 독수리 매체(DMEM)를 준비합니다. 세포 선별 전에 배양 후 배양에 사용되는 미디어를 제외하고 100 개의 U / mL 페니실린 및 100 μg / mL 연쇄 절제술 (Pen / Strep)으로 모든 완전한 성장 매체를 보완하십시오.
    2. 공급 업체의 지침에 따라 RAW264.7 및 Jurkat T 셀의 세분화를 수행 (재료의 표참조). RAW264.7 세포를 세분화할 때 트립신-EDTA 용액(0.25%)을 사용하여 세포를 분리합니다. RAW264.7 및 Jurkat 세포에 대한 냉동 보존 배지로 10 % (v / v) DMSO로 보충 된 FBS를 사용합니다.
    3. RAW264.7 대식대식대용 5분 동안 250 × g에서 세포를 수집하고 Jurkat T 세포의 경우 8분 동안 90 × g를 수집합니다. 그런 다음 1× DPBS의 5-10 mL로 세척하십시오 (Ca2 + 또는 Mg2 + 이온제외). DPBS를 제거합니다.
    4. 1× DPBS의 2mL를 사용하여 세포 펠릿을 다시 중단합니다. 세포의 10 μL을 사용하고 0.2 % 트라이팬 블루의 동일한 부피와 혼합하여 세포 수와 생존가능성을 추정합니다.
      참고: 세포 배양이 >90% 생존력을 가지고 있는지 확인하십시오.
    5. 단일 노크-인 실험을 위해 5번의 반복으로 10μL 핵형성 팁으로 전기포공을 수행합니다. 2.0 × 106 세포에 필요한 부피를 계산하고 원심 분리에 의해 세포를 펠릿. 3.1.3 단계에서 설명된 바와 같이 1× DPBS로 셀 펠릿을 다시 세척한다.
      참고: 10μL 핵형성 팁을 사용할 때는 전기기당 4.0 ×105세포가 필요합니다. 이에 따라, 1개의 노크인 실험을 위해 적어도 2.0 × 106세포를 준비한다.
    6. 펜/스트렙 없이 웰당 0.5mL의 완전한 성장 매체(3.1.1단계에서 제조)로 24웰 플레이트를 준비하고 37°C 인큐베이터에 프리웜을 준비한다.
  2. CRISPR/Cas9 성분 및 표적 벡터의 전기화
    1. 전기 기공 시스템을 켭니다. 이전 연구21에최적화된 전기포기 파라미터 사용 : RAW264.7 대식세포용 1,400 V/20 ms/2 펄스, Jurkat T 세포를 위한 1350 V/20 ms/2 펄스.
    2. 파이펫팅으로 인한 시료 손실을 고려하여, 각 CRISPR/Cas9 벡터의 2.5 μg, 선형화된 표적 벡터의 2.4 μg, 및 리서스펜션 버퍼 R의 2.5 μg를 포함하는 멸균 1.5 mL 마이크로센트심심분리기 튜브에서 55 μL 전기기화 혼합물을 준비한다.
      참고: 시간을 절약하기 위해 전기포기 혼합물은 원심 분리(3.1.5단계)에서 제조될 수 있다.
    3. 단계 3.2.2에서 55 μL 전기 기화 혼합물에서 2.0 × 106 셀 (단계 3.1.5에서 제조)을 다시 중단합니다.
    4. 파이펫을 사용하여 10 μL 핵혈제 팁을 사용하여 3.2.3 단계에서 세포/전기 포기 혼합물을 흡인한다.
      참고: 파이펫팅 하는 동안, 전기 기고 장애를 일으킬 수 있는 기포를 도입 하지 마십시오.
    5. 전자기화 키트에서 3mL의 버퍼 E로 채워진 튜브에 샘플을 추가합니다.
    6. 3.2.1 단계에서 설명된 바와 같이 두 세포 유형에 대한 전기 포파라미터를 적용한다.
    7. 3.1.6 단계에서 예온 된 배지로 24 웰 플레이트의 한 우물로 샘플을 옮기.
    8. 다른 4개의 반복에 대해 3.2.4-3.2.7단계를 반복하고 대상 벡터만 및 CRISPR 발현 벡터만 컨트롤한다.
      참고: 다른 세포 유형/플라스미드 DNA로 전환할 때 핵형성 팁과 튜브를 변경합니다.
    9. 48-72h의 전염된 세포를 배양하여 전기측정 분석 또는 형광 활성화 셀 정렬(FACS) 이전에 CRISPR/Cas9 성분의 전기기화 및 발현 후 회복을 허용한다. 24시간 후 형광후에서 적색 채널을 탑재한 형광 현미경을 사용하여 DsRed2의 발현을 검사한다.
      참고: DsRed2 형광 세포를 모니터링하는 이점은 전기기화의 효율을 추정할 수 있고 추가 세포 정렬에 대한 적합성을 예측할 수 있다는 것입니다.

4. 세포 분류는 푸티드 노크 인 세포를 분리

  1. FACS 선별하기 전에, 완전한 성장 배지로 한 번 전감염된 세포를 세척하십시오. 펠릿 세포는 3.1.3 단계에서 설명된 바와 같이 원심분리및 500 μL의 신선한 배지에서 펠릿을 재연한다.
  2. 85 μm 노즐과 낮은 유량으로 셀 선별기(생물 안전 캐비닛에 위치)를 설정합니다. 20-30셀을 96웰 마이크로플레이트의 덮개에 정렬하여 단일 셀 정렬 효율과 정밀도를 분류하고 테스트하기 위한 "단일 셀" 모드를 선택합니다. 각 우물의 중앙에 국한된 한 방울은 계측기의 적절한 설정을 나타냅니다.
  3. 세포 현탁액을 4.1 단계에서 멸균 FACS 튜브로 옮기고 SYTOX 레드 데드 셀 스테인을 최종 농도1 nM에 추가합니다.
  4. 셀 선별기의 샘플을 분석합니다. SYTOX 레드와 EBFP2는 405 nm 레이저에 의해 흥분하고 V450 / BV421 및 APC 채널에 의해 각각 감지됩니다. DsRed2는 488 nm 레이저에 의해 흥분하고 PE 채널에 의해 검출된다. 비트랜스감염 된 세포 및 EBFP2- 및 DsRed2 단일 양성 세포를 스펙트럼 보정을 위한 컨트롤로 사용하십시오.
  5. 10개의 단일 셀을 사전 따뜻하게 된 완전한 성장 배지의 웰 당 150 μL을 포함하는 96 웰 마이크로 플레이트의 각 우물에 정렬합니다. 주카트 T 세포와 같은 서스펜션 세포주 및 평평한 바닥 마이크로플레이트와 같은 서스펜션 세포주를 배양하기 위해 둥근 바닥 마이크로플레이트를 사용하여 부착된 RAW264.7 대식세포를 위해 사용하십시오.
    참고: 우물당 10개의 세포를 분류하는 것은 세포 생존을 개선하고 종자해야 하는 96웰 마이크로플레이트의 수와 유동 세포측정 및 지음에 의해 가려져야 하는 시료수를 최소화하기 위한 최적화된 전략입니다. 잘 당 하나의 셀만 정렬하는 경우, 더 많은 마이크로 플레이트의 파싱은 올바르게 편집 된 세포를 얻기의 기회를 증가해야합니다.

5. 양성 노크 인 세포의 선별 및 검증

  1. 유동 세포측정에 의한 후보 노크인 세포 에 대한 선별
    1. 10-15일 동안 4.5단계에서 세포를 배양하고 3일마다 완전한 성장 배지를 추가하여 증발을 통해 잃어버린 액체를 대체합니다. Jurkat T 세포의 경우, 둥근 바닥 96 웰 플레이트에서 성장한 세포를 평평한 바닥 플레이트로 이송하여 세포 증식을 최적화합니다.
    2. 확장된 정렬된 셀을 48웰 플레이트로 이송하여 추가 확장을 합니다.
    3. 세포가 합류에 가까우면 배양의 절반을 사용하여 유동 세포측정(그림3)에의해 EBFP2 발현을 검사한다. 일반적으로, 컨물성장 후 48웰 플레이트내의 배양의 절반은 0.5-1.0 ×105세포와 동일하며, 이는 유동 세포측정에 의한 하나의 샘플의 분석에 적합하다.
    4. 추가 증식을 위해 나머지 세포를 24웰 플레이트로 이송합니다.
    5. 추가 지평 실험을 위한 EBFP2 양성 세포의 높은 비율을 소유하는 후보 세포 인구를 유지합니다.
      참고: 10개의 세포가 96웰 마이크로플레이트의 각 우물로 분류되기 때문에, 노크인 세포가 녹인 유전자를 발현하지 않는 세포로 성장할 수 있다. 따라서 EBFP2 양성 세포를 음의 세포로부터 분리하기 위해 추가 적인 세포 분류 라운드를 수행하는 것이 정상이다.
  2. PCR 및 시퀀싱에 의한 후보 노크 인 세포 에 대한 선별
    1. 2 × 105 후보 셀을 수집합니다. DNA 준비 키트를 사용하여 게놈 DNA를 추출하십시오(재료 표참조).
    2. 정확한 상동성 지향 수리(HDR)가 mRosa26 메큐에서 발생했는지 확인하기 위해, 후보 노크인 세포의 게놈내의 임의 부위가 아닌 M Rosa26 메큐에서 발생했으며, HA의 각 측면에 걸친 프라이머로 PCR을 수행한다(도4). 표적 벡터(외부 올리고) 외부게놈 영역에 위치한 프라이머 1개 및 표적 벡터(내부 올리고) 내부에 있는 다른 프라이머를 선택한다.
      참고: hROSA26 궤적에서 HDR을 확인하는 데 유사한 디자인이 사용됩니다. PCR 프라이머는 POI 서열의 삽입을 검출하기 위해 쉽게 설계할 수 있습니다. 또한, 야생형 및 노크인 유전자형은 3프라이머 PCR을 사용하여 동시에 검출될 수 있다(보충 파일, 도S2참조).
    3. 빠른 복제 키트를 사용하여 양수 PCR 제품을 복제합니다(재료 표참조). 반응 혼합물을 DH5α 유능한 세포로 변환합니다.
    4. 무작위로 변환 당 8-10 개별 세균 성 식민지를 선택하고 Sanger 시퀀싱에 의해 단계 5.2.3에서 PCR 제품을 시퀀스.
  3. 면역블롯 분석 및 선호도 정제에 의한 양성 노크 세포의 검증
    참고: 후보 세포는 단백질-단백질 상호 작용연구를 위한 POI 의 삽입 또는 친화성 정제(AP)의 유효성검사를 위한 면역블롯 분석을 실시한다.
    1. 항체 제조업체의 지침에 따라 면역블롯 분석을 수행합니다. 1 차적인 항체 및 이차 항체의 사용에 관하여 정보에 대한 재료의 표를 참조하십시오.
    2. 제조업체의 지침에 따라 스트렙-택틴 세파로즈 구슬을 사용하여 OST 태그POI를 AP에 표현하는 노크 인 세포의 용액을 피사체(재료 표참조).
    3. 이미저를 사용하여 화학 발광을 감지합니다.

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Representative Results

murine RAW264.7 대식세포를 사용하여 mRosa26 궤적에서 노크-인 실험을 수행하기 위해 전술한 프로토콜에 따라, SARS-Cov-2바이러스(도 2A)의수용체인 인간 ACE2를 발현하기 위한 표적 벡터를 설계하였다. 유사한 설계를 사용하여, 우리는 OST 태그 RASGRP1 융합 단백질(도 2C)의노크인인간 Jurkat T 세포를 생성했다. 3개의 플라스미드의 전환 후, 그 중 2개는 CRISPR/Cas9(DsRed2; pDsR-mR26-sg1 및 pDsR-mR26-sg2용 mRosa26-sg2)의 발현에 사용되었다. hROSA26 노크인을 위한 pDsR-hR26-sg1 및 pDsR-hR26-sg2및 상동성 재조합(EBFP2)을 위한 DNA 템플릿으로 사용되는 또 다른 원소, 두 개의 형광 기자를 발현하는 이중 양성 세포가 96웰 플레이트로 분류되었다. 단일 셀 정렬 모드를 사용하여 정렬된 RAW264.7 셀 중 0.91%는 DsRed2+ EBFP2+ 개였지만,10개의 세포가 각각의 우물(도2B)으로수집되었다. Jurkat T 세포는 더 높은 경질 효율을 가졌고, 이중 양성 세포의 비율은 이 대표적인 실험에서 7.91%였으며, OST-RASGRP1 융합단백질(그림 2D)의성공적인 노크인을 입증하였다.

다음 단계에서, 유동 세포측정은 EBFP2 양성 세포를 가진 후보 우물을 위해 스크리칭하기 위하여 이용되었다. 대표적인 히스토그램은 명백한 EBFP2 양성 집단이 있었다는 것을 보여주었습니다(그림 3). 유출 세포측정이 세포 분류 후 2주 후에 수행되었을 때 노크인 세포가 DsRed2를 발현하지 않았다는 점은 주목할 만하다.

정확한 노크인 및 무작위 삽입의 차별을 위해 EBFP2 양성 세포로부터의 게놈 DNA는 발현 카세트 내부의 HA 및 특정 부위의 하스 외부게놈 서열을 인식하는 프라이머를 사용하여 PCR을 수행함으로써 더욱 테스트되었다(도4A 및 4B). 이러한 PCR 제품의 서열 분석은 mRosa26 대상부위(도 4C)에서HDR의 발생을 확인하였다. 동일한 지노피전략은 Jurkat T 세포의hROSA26 궤적에서 발현 카세트의 정확한 삽입을 검증하기 위해 적용될 수 있다.

hACE2-발현 RAW264.7 세포의 순수한 인구를 얻기 위해, 우리는 세포를 더 분류하고 대조군으로 야생 형 세포를 사용하여 확장 다음 형광 기자의 존재를 검증(도 5A). 확장된 세포는 EBFP2 양성체였으며, hACE2 단백질은 뮤린 RAW264.7 대식세포(도5B 및 5C)에서쉽게 검출할 수 있었다. 유사하게, 우리는 형광 기자및 OST-RASGRP1 단백질의 발현을 인간 주카트 T 세포에서 선별 및 제2차 세포선별(도 6A 및 6B)을검증하였다. 또한, OST-RASGRP1 단백질의 선호도 정화는 상업적으로 이용 가능한 구슬을 사용하여 수행되었다. 우리는 야생 형 세포의 그보다는 노크에 Jurkat 세포의 총 세포 용액에서 RASGRP1 단백질의 더 높은 양을 발견; RASGRP1 녹아웃 저카트 세포는대조군(도 6C)으로사용되었다. OST 태그를 사용하여 정화한 후, 노크인 샘플만 검출 가능한 RASGRP1(도6D)을가졌다.

Figure 1
그림 1. mRosa26/hROSA26노크세포주를 발생시키는 유전자 표적화 전략은 관심 있는 단백질을 과발현한다. (A) mRosa26-특이가이드RNA 표적화 서열 및 원단스페이서 인접 모티브(PAM)는 각각 파란색과 빨간색 글자로 표시된다. Cas9는 일반적으로 녹색 화살표로 표시되는 PAM 시퀀스의 3-4 bp 상류를 갈라놓습니다. 표적 벡터는 마우스 또는 인간 게놈에서 발현 카세트의 정확한 삽입으로 이어지는 상모학 지향 수리(HDR)를 위한 템플릿으로 사용된다. 원하는 대상 사이트의 상류 및 하류의 각각 1kb 시퀀스는 대상 벡터에서 5' 및 3'homology arms(HA)로 사용됩니다. 하스는 CAG 프로모터로 구성된 발현 카세트, 관심 있는 단백질(POI)의 cDNA 서열, IRES-EBFP2 리포터, bGH-폴리아 신호(pA)로 구분된다. 제한 사이트 AscI는 POI의 복제에 사용되며 EcoRI 및 BamHI는 타겟팅 벡터의 선형화에 사용됩니다. hROSA26 메뚜기에서 CRISPR/Cas9 중재 노크인에 대한 전략은 유사합니다. (B) 인간 ROSA26 궤적의 다이어그램. hR26-sg1 및 hR26-sg2 표적 시퀀스는 파란색 문자 및 해당 PAM 서열로 빨간색으로 표시됩니다. (C) 인간 U6 구동 sgRNA 발현 카세트및 Cas9-T2A-DsRed2 형광 리포터 카세트를 포함하는 올인원 CRISPR 발현 벡터 pX458-DsRed2에 대한 회로도. 2개의 BbsI 제한 사이트는 가이드 RNA의 복제를 허용합니다. U6, 인간 U6 RNA 폴리머라제 III 프로모터; sgRNA, 키메라 단일 가이드 RNA; CBh, 치킨 β 액틴 하이브리드 프로모터; NLS, 핵 국소화 신호; T2A, 그아 아시나 바이러스 2A 자가 접합 펩티드; bGH-pA, 소 성장 호르몬 polyadenylation 신호. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2. CRISPR/Cas9 벡터로 분류된 RAW264.7 및 Jurkat 세포의 단일 셀 정렬 및 상동성 재조합을 위한 표적 벡터. RAW264.7 (A) 및 Jurkat (C) 세포에서 안정적인 유전자 발현에 사용되는 표적 벡터. DsRed2 리포터및 EBFP2 리포터를 발현하는 표적 벡터를 발현하는 CRISPR/Cas9 벡터로 감염된 마우스 RAW264.7 대식세포(B) 및 인간 주카트 T 세포의 대표적인 흐름 세포 측정 플롯. DsRed2 및 EBFP2를 공동 발현하는 세포는 세포 분류를 실시하고 확장을 위해 배양되었다; 설명된 영역에 인접한 숫자는 각 게이트의 세포 비율을 나타내고, 비감염된 세포는 음의 대조군으로 사용되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3. EBFP2 발현의 검출에 의한 노크 인 세포의 선별. EBFP2+ 및 DsRed2+ RAW264.7 대식세포 (A) 및 Jurkat T 세포 (B)의 유량 세포 측정 분석은 전기 기화 후 14 일. 히스토그램에서 EBFP2+ 또는 DsRed2+ 세포의 형광 강도(FI)가 X축에 표시되고 각 형광 채널의 이벤트 수가 Y축에 표시됩니다. (A) EBFP2 및 hACE2의 발현은 RAW264.7 뮤린 대식세포에서 Rosa26 궤적에서 동일한 프로모터에 의해 구동되었다. (B) Jurkat 세포에서, OST-RASGRP1 발현은 인간 ROSA26 궤적에서 EBFP2 발현에 연결된다. 14 일 에서 전기 화 후, 흐름 세포 측정 분석은 정렬 된 세포 중 거의 제로 DsRed2+ 세포를 밝혔다. 야생형(WT) 세포는 음의 대조군으로 사용되었고, KI는 낙마세포를 의미한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
그림 4. PCR 및 시퀀싱에 의한 후보 노크 인 셀에 대한 검사. (A) hACE2 노크 인 셀을 생성하기위한 전략. 정확한 HDR과 무작위 삽입을 구별하는 데 사용되는 PCR 프라이머의 위치는 녹색 화살표로 표시됩니다. (B) 5개의 후보 세포의 PCR 유전자 형 (#4, #15, #22, #25 및 #43) 도 3에서예시로 EBFP2 발현에 대한 유동 세포 측정 검사에 의해 확인된, 5' 접합 (1472 bp) 및 3' 접합 (1472 bp) 모두 홈로지 암에 걸쳐 올바른 것으로 나타났다. M, DNA 사다리; WT, 야생형 RAW264.7 제어; H2O, 음의 제어. (C) B로부터 PCR 제품의 Sanger 시퀀싱은 hACE2 발현 카세트를 돌연변이 없이 mRosa26 메큐로 성공적으로 녹여낸 것으로 나타났다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 5
그림 5. raw264.7 대식세포에서 mRosa26 궤적으로 hACE2 발현 카세트의 성공적인 노크인검증. (A) WT RAW264.7 대식세포는 유동 세포 측정 분석을 위한 음의 대조군으로 사용되었다. (B) EBFP2 양성 세포를 음세포로부터 분리하기 위해, hACE2 KI 세포로 지정된 거의 100% EBFP2+ 노크인 세포로 구성된 집단을 얻기 위해 추가적인 세포 선별라운드가 수행되었다. DsRed2 발현은 또한 CRISPR/Cas9 플라스미드가 RAW264.7 대식세포의 게놈에 통합되지 않았는지 확인하기 위해 검사되었다. 히스토그램에서 EBFP2+ 또는 DsRed2+ 세포의 형광 강도(FI)가 X축에 표시되고 각 형광 채널의 이벤트 수가 Y축에 표시됩니다. (C) 토끼 항인간 ACE2 단클론 항체를 이용한 면역블롯 분석에 의한 hACE2 발현검출. hACE2의 발현은 여러 우물에서 세포에서 관찰되었다 (#4, #15, #22, #25, #43). WT RAW264.7 대식세포는 음의 제어로 사용되었고 GAPDH는 로딩 컨트롤로 사용되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 6
그림 6. JUrkat T 세포에서 hROSA26 궤적으로 OST-RASGRP1 발현 카세트의 성공적인 노크인의 검증. (A) WT Jurkat T 세포는 유동 세포 분석을 위한 부정적인 제어로 사용되었다. (B) JURKat 세포의 EBPF2+ 하위 집단은 세포 분류 및 확장의 추가 라운드에 의해 농축되었다; 이들 세포는 OST-RASGRP1 KI 세포로 지정되었다. 노크인 세포는 혈류 세포측정에 의해 분석되었고 DsRed2 발현 벡터를 유지하지 않았다. 히스토그램에서 EBFP2+ 또는 DsRed2+ 세포의 형광 강도(FI)가 X축에 표시되고 각 형광 채널의 이벤트 수가 Y축에 표시됩니다. (C) 항 RASGRP1 항체를 이용한 면역블롯 분석에 의한 2개의 독립적인 노크인 세포(#1 및 #2)에서 OST-RASGRP1 발현의 검출. WT 저카트와 RASGRP1 녹아웃 저카트 세포는 컨트롤로 사용되었고 β 액틴은 로딩 컨트롤로 사용되었다. (D) OST 매개 친화성 정제는 RASGRP1 녹아웃 세포를 음성 대조군으로 사용하여 OST-RASGRP1의 발현을 검증하는 데 사용되었다. 스트렙-택틴 세파로즈 비드(선호도 정화)에 대한 선호도 정화를 받거나 직접 분석(총 용액)에 대한 선호도 정화를 실시하거나 RASGRP1 또는 GAPDH(로딩 제어) 항체로 조사된 세포 용액으로부터의 동일한 양의 단백질을 면역블롯 분석하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

우리의 실험에서, 우리는 예를 예로 인간 Jurkat T 세포 및 murine RAW264.7 대식세포를 사용하여 노크세포 검열 및 검증에 구조 설계에서 면역 세포에서 노크에 편집을 수행하는 방법을 보여주었습니다. T 세포및 대식세포주 모두 형질36,37에내성이 있다; 그러나 CRISPR/Cas9 전달의 저효율 문제는 세포 분류와 결합된 형광 기자의 도움으로 극복할 수 있다. 이 프로토콜은 유전자 구조 실험 및 단백질 단백질 상호 작용 실험에 적합하지만, Rosa26 궤적의 노크 인 변형을 위해 프로토콜이 개발되었기 때문에 전사 인자의 결합 부위와 같은 규제 DNA 서열연구에는 적용할 수 없다.

이중 형광 기자는 CRISPR / Cas9 노크 인 편집을 도왔습니다.
면역 세포에서 CRISPR/Cas9 벡터의 독립적인 세트를 일시적으로 발현하기 위해 이중 형광 리포터 시스템을 성공적으로 적용하여 이전연구(21)에서DNA의 큰 단편을 삭제하였다. 우리는 DsRed2 형광 단백질을 사용하여 CRISPR/Cas9 타겟팅 도구를 리포터로, 노크 인 수정을 위한 DNA 템플릿의 전달을 추적하기 위해 추가적으로 뚜렷한 형광 단백질을 설계했습니다. 노크인 골짜기 수정을 가능하게 하기 위해, 우리는 RFP(DsRed2)와 스펙트럼 유출이 없는 EBFP2 형광 단백질 리포터를 사용하여 동종 재조합 중에 템플릿으로 사용되는 기증자 DNA의 트랜스페팅을 모니터링했습니다. POI 및 형광 기자를 발현하는 카세트를 최적화하기 위해 독립적인 단백질을 얻기 위해 IRES 서열이 도입되었습니다. 우리의 이전 연구에서, 우리는 P2A 또는 T2A 링커에서 잔류 아미노산 세포 표면에 단백질 국소화에 영향을 준 후 전사 후 분열 후 남아 주목. IRES 서열은 그러한 잔류 아미노산을 남기지 않습니다. 이전 연구에서 설명한 바와 같이, IRES는 CAG프로모터(38)에의해 구동되는 Cas9 단백질의 발현에 따라 형광 기자의 상부를 초래했다.

올인원 CRISPR/Cas9 플라스미드
CRISPR/Cas9 시스템의 다양한 포맷 및 조합은 화학적으로 합성된 sgRNAs39와함께 mRNA 또는 단백질로 Cas9 트랜스페션과 같은 이전 연구에서 설명되었다. CRISPR/Cas9 RNP 복합체는 또한 포유류 세포로 전달되었습니다; 이 전략은 뉴클레아제 활동의 초기 개시및 짧은 반감기의 이점을 제공합니다; 그러나 RNP 라벨링은 올인원 플라스미드를 구성하는 것에 비해 비용 효율이 낮습니다. 우리의 이전 연구에서, 우리는 CRISPR/Cas9를 표현하는 그 희소한 세포를 격리하기 위하여 단 하나 세포 분류를 사용하여 (DsRed2 양성) 및 노크인 단백질 (EBFP2 양성)는 RNP 납품을 사용하는 것보다 훨씬 덜 복잡하고, 플라스미드를 준비하는 것이 쉽다는 것을 것을을 발견했습니다. 이 프로토콜은 단일 셀 정렬에 의존하는 것이 사실입니다. 그러나 우리의 프로토콜은 수행하기 쉽고 높은 재현성으로 성공적인 노크 - 인 수정을 산출합니다.

Rosa26 궤적에서 POI의 표현
CRISPR/Cas9 편집40,41,42를사용하여 형광 기자와 내인성 단백질을 태깅하는 방법을 설명하는 문헌에는 여러 보고서가 있습니다. 내인성 태깅의 장점은 세포 외 국소화를 결정하고 내인성 단백질의 생체 추적을 수행하는 것이 가능하다는 것입니다. 그러나, 내인성 궤적에서 적절한 CRIPSR 가이드 RNA를 설계할 수 없다면 문제가 발생할 수 있다. 여기서 우리는 POI-IRES-EBFP2를 게놈 안전 항구 궤엽로로26에통합하여 내인성 태그를 포지셔닝하기 위한 적절한 가이드를 찾는 한계를 극복함으로써 대체 노크인 방법을 개발했습니다.

기술 재현성을 보장하기 위해 실험 중에 고려해야 할 몇 가지 핵심 사항을 요약합니다. 첫째, 세포 선별기는 EBFP2의 여기를 위한 405 nm 바이올렛 레이저와 488 nm 블루 레이저 또는 DsRed2의 여기를 위한 561 nm 노란색 레이저를 가질 필요가 있다. 이러한 구성을 통해 EBFP2 및 DsRed2는 스펙트럼 유출 없이 감지할 수 있으며 이는 거짓 긍정 결과로 이어질 수 있습니다. 우리의 실험에서, DsRed2+ EBFP2+ 이중 양성 세포의 비율은 0.9 %로 낮았다; 따라서, 적절한 인구의 게이팅은 실험의 성공을 위해 필수적이었다. 두 번째 정렬은 EBFP2+ 양수 셀게이트에 수행되었고 PCR 유효성 검사가 뒤따랐습니다. 또한, 노크인 단백질 검출을 위해, OST 또는 다른 유형의 태그와 같은 단백질 태그를 도입하는 것이 바람직하다. Rosa26 메뚜기 노크-인 실험 전에 유전자의 녹아웃은 항체가 바람직한 특이성을 가지고 있는지 여부를 평가하는 좋은 기회를 제공한다. 항체 특이성이 충분하지 않은 경우, 단백질 태그를 통해 풀다운 후 녹인 단백질의 검출을 수행해야 한다. 마지막으로, 노크인 알레를 표현하는 세포의 FACS 스크리닝 중에 EBFP2의 강도는 노크인 골의 2개 또는 사본 1개가 존재하는지 여부를 평가하는 데 사용될 수 있다.

응용 프로그램
이 프로토콜에서 우리는 RasGRP1의 노크 -인 변형을 설명, T 세포 활성화에 관련된 핵심 분자(27). 기능 상실 연구에 사용할 수 있는 RASGRP1 녹아웃 Jurkat 세포를 먼저 획득했으며, hROSA26 메큐에서 OST-RASGRP1을 발현하는 추가 저카트 세포를 생성했습니다. Jurkat 세포는 T 세포 생물학을 공부하기 위한 가장 많이 사용되는 인간 세포주(43)이다. 암 환자에서 T 세포 고갈을 방지에 면역 요법의 성공 때문에, 면역 학자와 암 생물학자후보 분자의 기능적 연구를 위한 Jurkat 세포를 수정에 큰 관심을 가지고 있습니다. Jurkat T 세포주가 신호 경로의 해부에 일반적으로 사용되는 것도 주목할 만하지만, Jurkat 세포는 자극 시 IFN-γ 가난한 생산자이기 때문에 이 세포주를 사용하는 데 한계가있습니다(44). 이전 연구는 hROSA26 메뚜기46에서 내인성 궤적 수정45 및 유전 공학을 모두 사용하여 인간 Jurkat 세포에서 노크 인 실험을 수행했습니다. 두 전략 모두 고유한 장점이 있습니다. 내인성 궤적을 수정함으로써 단백질은 아마도 "생리적"수준에서 표현된다. hROSA26 메뚜기에서 의한 녹인 변형은 mRNA의 대체 접합을 피하고, 수정된 단백질의 풍부도 쉽게 검출할 수 있기 때문에 예측 가능한 결과를 생성합니다. 아데노 관련 바이러스 사이트1(AAVS1)및 체모키네(CC 모티프) 수용체5(CCR5)47, 48 등 다른 유전체 안전 항만은 더 많은 탐사를 받을 자격이 있다.

본 이전 연구에서 Vav1-OST가 RAW264.7 세포에서 마우스 Rosa26 메큐에서 더 높은 수준으로 발현되었을 때, 우리는 미끼 단백질의 높은 수준과 OST 선호도정제13의높은 효율 때문에 낮은 발현 Vav3 분자와의 상호 작용을 검출할 수 있었다. 또한 풍부한 발현이 보장되는 SARS-CoV-2용 수용체인 hACE2를 안정적으로 발현하는 대식세포주 를 확립하기 위한 노크-인 실험을 설명했습니다. 단세포 RNA 염기서열분석 데이터베이스에서, 뮤린 아체2는 폐 대식세포로 발현되고, 우리가 개발한 hACE2를 발현하는 유전 세포 모델은 SARS-CoV-2 감염 시 대식세포의 연구에 유용할 수 있었다.

기타 고려 사항
이 프로토콜은 EBFP2 기자의 경우 형광 기자의 유동 세포 측정 분석을 통해 POI를 표현하는 노크 인 세포를 식별하도록 설계되었습니다. 그러나, FACS에 의해 검출가능한 표면 라벨링 항체가 표면단백질(49)에사용할 수 있을 때, 리포터시스템(50)을사용할 필요가 없다. T 세포 및 대식세포세포주뿐만 아니라 인터인터로메 연구에 사용되는 OST 태그 단백질의 예는 주로 시그널링 연구에 사용되며, 이러한 신호 분자의 대부분은 세포의 사이토솔 또는 핵에 국한된다. 따라서, 바람직한 녹인 세포의 식별을 위해 형광 기자가 필요할 수 있다.

이 프로토콜은 세포주를 위해 개발되었다는 것을 지적하는 것이 중요합니다, T 세포와 같은 1 차적인 면역 세포에 응용프로그램은, 단핵구/대식세포는 검증되지 않았습니다. 증식하는 세포의 제한된 용량 때문에, 우리는 1 차적인 면역 세포와 함께 사용하기 위해이 프로토콜을 권장하지 않습니다. 형광 기자 EBFP2는 IRES 요소를 사용하여 노크인 유전자 또는 POI와 동일한 프로모터로 발현되었기 때문에, 우리는 녹인 유전자의 부재시 형광 기자를 발현한 세포를 관찰하지 않았다. 우리는 형광 단백질 표현 세포의 회복이 동종 재조합의 성공에 크게 의존한다는 것을 의심합니다. 이전 연구에서 보고된 바와 같이, 노크 효율이 매우낮을때 단일 셀 정렬에 의한 올바른 노크 세포를 정렬, 확장 및 식별하는 것은 지루하며, 성공률을 향상시키기 위해 세포를 대량으로 정렬해야 하는 이유를 설명합니다.

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Disclosures

저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgments

신샹의과대학의 유동 세포측정 핵심 시설에 감사드립니다. 이러한 기술의 개발은 NSFC가 LZ, 81471595 및 YL에 32070898 81601360 보조금에 의해 지원되었습니다. 이 작품은 허난교육위원회 제21IRTSTHN030재단의 지원도 받고 있다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amersham Imager 600 Ge Healthcare imaging of chemiluminescence
Ampicillin, sodium salt MP Biomedicals 194526
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling Technology 7074 at 1/5000 dilution
Anti-RasGRP1 antibody, clone 10.1 Merck MABS146 1.0 μg/mL of working concentration
AscI New England BioLabs R0558S
β-Actin (D6A8) Rabbit mAb Cell Signaling Technology 8457 at 1/1000 dilution
BamHI-HF New England BioLabs R3136S
BbsI-HF New England BioLabs R3539S
Cellometer Mini Automated Cell Counter Nexcelom Bioscience
E.coli DH5α Competent Cells Takara 9057
DMSO (Dimethyl Sulfoxide) MP Biomedicals 196055
DNeasy Blood & Tissue Kits Qiagen 69506 cell culture reagent
DPBS (10X), no calcium, no magnesium ThermoFisher Scientific 14200075
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with high glucose HyClone SH30022.01
EcoRI-HF New England BioLabs R3101S
FACSAria™ Fusion BD Biosciences equipped with biosafety cabinet
FACS Canto flow cytometer BD Biosciences
Falcon 5 ml polystyrene round bottom test tube BD Biosciences 352003
Fetal bovine serum (FBS) ThermoFisher Scientific 10099141
FlowJo version 10.7 BD Biosciences
GAPDH (D16H11) XP Rabbit mAb Cell Signaling Technology 5174 at 1/1000 dilution
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP ThermoFisher Scientific 31430 at 1/5000 dilution
Immobilon ECL Ultra Western HRP Substrate Millipore WBKLS0500
Immobilon-PSQ PVDF Membrane Millipore ISEQ00010
Jurkat ATCC TIB-152 https://www.atcc.org/
Kanamycin sulfate MP Biomedicals 194531
LB agar powder ThermoFisher Scientific 22700041
Multi-channel Pipette (30-300 μL) Eppendorf, or similar
Neon Transfection System ThermoFisher Scientific MPK5000
Neon Transfection System, 10 μL kit ThermoFisher Scientific MPK1096
Nunc 15 mL Conical Sterile Centrifuge Tubes ThermoFisher Scientific 339651
OneTaq® Hot Start Quick-Load® 2X Master Mix New England BioLabs (M0489) for high GC% template
PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa ThermoFisher Scientific 26616
Pipette tip 0.1-20µl Eppendorf, or similar 0030 075.005
Pipette tip 2-200µl Eppendorf, or similar 0030 075.021
Pipette tip 50-1000µl Eppendorf, or similar 0030 075.064
Plasmid Maxi Kit Qiagen 12163
pX458-DsRed2 Addgene 112219
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28104 purify plasmid from restriction digestion
Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix New England BioLabs M0494S
RAW264.7 ATCC TIB-71 https://www.atcc.org/
Recombinant Anti-ACE2 antibody [EPR4435(2)] Abcam ab108252 at 1/1000 dilution
RPMI 1640 Medium HyClone SH30027.01
Strep-Tactin Sepharose beads IBA Lifesciences 2-1201-010
Penicillin-Streptomycin ThermoFisher Scientific 15140122
SYTOX™ Red Dead Cell Stain, for 633 or 635 nm excitation ThermoFisher Scientific S34859
T4 DNA ligase New England BioLabs M0202S
T4 Polynucleotide Kinase New England BioLabs M0201S
Trypan Blue Solution, 0.4% ThermoFisher Scientific 15250061
Trypsin-EDTA solution (0.25%), with phenol red ThermoFisher Scientific 25200056
ZOE Fluorescent Cell Imager Bio-Rad
1.5 mL microtubes, PCR-clean Eppendorf, or similar 0030 125.215
24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates Corning 3524
96-well Clear Flat Bottom Polystyrene TC-treated Microplates Corning 3599
96-well Clear Round Bottom TC-treated Microplate Corning 3799

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면역학 및 감염 문제 177 노크 인 CRISPR / Cas9 Rosa26,대식세포 T 세포 hACE2
CRISPR/Cas9 및 대식세포 및 T 세포주에서 세포 분류에 의한 유전자 노크인
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Zhang, L., Huang, R., Lu, L., Fu,… More

Zhang, L., Huang, R., Lu, L., Fu, R., Guo, G., Gu, Y., Liu, Z., He, L., Malissen, M., Liang, Y. Gene Knock-in by CRISPR/Cas9 and Cell Sorting in Macrophage and T Cell Lines. J. Vis. Exp. (177), e62328, doi:10.3791/62328 (2021).

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