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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

基因敲击由CRISPR/Cas9和细胞排序在巨噬细胞和T细胞线

Published: November 13, 2021 doi: 10.3791/62328
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 2, 1
1The Laboratory of Genetic Regulators in the Immune System, School of Laboratory Medicine, Xinxiang Medical University, 2Centre d’Immunologie de Marseille-Luminy, Aix Marseille Université

Summary

该协议使用荧光记者和细胞分拣来简化巨噬细胞和T细胞系的敲击实验。两个质粒用于这些简化的敲击实验，即CRISPR/Cas9-和DsRed2表达质粒和同源重组供体质粒表达EBFP2，这是永久整合在 Rosa26 点在免疫细胞。

Abstract

免疫系统的功能基因组学研究需要基因操作，包括删除目标基因和在感兴趣的蛋白质中添加元素。细胞系模型中基因功能的识别对于基因的发现和细胞内在机制的探索具有重要意义。然而，使用CRISPR/Cas9介质敲击的免疫细胞（如T细胞和巨噬细胞系）的基因操作是困难的，因为这些细胞的转染效率低，尤其是在静止状态下。为了改变免疫细胞中的基因，耐药性选择和病毒载体通常用于丰富表达CRIPSR/Cas9系统的细胞，这不可避免地导致细胞的不良干预。在之前的研究中，我们设计了双荧光记者耦合到CRISPR/Cas9，在电透后短暂表达。这种技术解决方案可导致免疫细胞中快速基因缺失：然而，基因敲击免疫细胞，如T细胞和巨噬细胞，而不使用耐药性选择或病毒载体是更具挑战性的。在本文中，我们表明，通过使用细胞分拣来帮助选择暂时表达CRISPR/Cas9结构的目标 Rosa26 细胞群结合供体质粒，基因敲击可以在T细胞和巨噬细胞中实现，而无需耐药性浓缩。例如，我们通过进行敲击实验，在RAW264.7巨噬细胞中展示如何表达人类ACE2，SARS-Cov-2的受体，它负责当前Covid-19大流行。这种基因敲击细胞可以广泛用于机械研究。

Introduction

免疫细胞对防御病原体至关重要。先天免疫和适应性免疫是需要清除感染剂和维持组织平衡1，2。细胞系模型是了解哺乳动物免疫系统分子基本原理的重要工具：它们用于体外功能测定，如模拟人体T细胞活化，以及确定遗传因素在激活或抑制免疫反应中的功能3，4。需要注意的是，哺乳动物的免疫系统是极其异质的，同样重要的是，大量的分子控制着特定细胞类型5、6的分化、迁移和功能。

聚类定期间歇性短白细胞重复（CRISPR）/Cas9基因组编辑工具允许特定细胞类型的基因操作，从而促进基因的功能注释以精确的方式7，8。一些已发表的协议描述了CRISPR/Cas9的交付形式Cas9导引RNA复合物称为核糖核蛋白（RNP）在HIK293细胞，Jurkat细胞系，原发T细胞9，10，巨噬细胞11，12，13，干细胞14，和其他15，16。在这些协议中，基因标记通常是通过将荧光标签与内源性蛋白质17、18融合来实现的。然而，很少尝试使用双荧光记者，这是兼容的单细胞排序，以促进敲击实验19，20，特别是在免疫细胞。

旨在理解免疫细胞中新基因因子功能的深入机械分析通常需要细胞类型特定地删除基因、基因拯救实验以及理想地识别其相互作用物。尽管在免疫细胞中优化基因缺失的方法已经公布9，15，21，但关于引入具有多功能的敲击等位基因来理解免疫反应的方法却少得多。因此，在这个协议中，我们旨在详细描述一个高效和高度可重复的协议，以表达一个蛋白质的兴趣在安全港点Rosa26在人类和穆林免疫细胞线。我们设计了一个双色报告系统，用于丰富用质粒表示CRISPR/Cas9（DsRed2）和重组DNA模板（EBFP2）的细胞，这些模板可以通过细胞分拣进行分离。根据这个协议，我们获得了人类T细胞系Jurkat和穆林巨噬细胞RAW264.7的多个敲击线，用于对研究不善的蛋白质进行功能分析。

例如，我们在此协议中展示如何获得可敲击 RAW264.7 巨噬细胞，稳定地表达人类ACE2（SARS-Cov-2的受体）22。由于先天免疫细胞参与Covid-1923、24和人类ACE2的发病机制，被认为是病毒在复制前进入细胞所需的主要受体，具有人类ACE2的微噬细胞可以作为巨噬细胞内病毒增殖的机械研究的有用工具。同时，我们还介绍了一个基因在人类ROS26位点敲击来表达RASGRP1蛋白的例子，该蛋白在其氨基终点与亲和力双链球菌标签（OST）融合在一起。T细胞是免疫疗法中的关键靶细胞，越来越多的研究集中在对癌症的反应上。由于Rasgrp1是T细胞受体下游的关键信号分子，其相互作用因素27日没有得到很好的阐明，OST-RASGRP1的敲击模型为识别调节T细胞对肿瘤和感染反应的相互作用者奠定了基础。综合起来，这些工具可用于Covid-19的研究和发现与Rasgrp1相互作用的新分子。

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Protocol

1. 以 罗莎26 蝗虫为目标的 sgRNA 的设计和普拉斯米德构造

  1. 围绕所需插入站点的设计指南 RNA
    1. 确保鼠标Rosa26（以下简称mRosa26）的插入点位于mRosa26的第一个内电路：这个网站已经用于以前的研究28，29。对于人体细胞的敲击实验，确保插入位点位于人类ROSA26位点（以下简称hROSA26），该位点已被确定为mRosa2630的人类同源。
    2. 分别使用从小鼠基因组信息学（http://www.informatics.jax.org/）和Ensembl基因组浏览器（http://www.ensembl.org/index.html）获得的老鼠和人类物种的基因组序列。复制mRosa26 或 hROSA26点两侧所需的插入位点两侧的基因组序列的 50 个碱基对 （bp）。
    3. 设计指南RNA使用在线网络工具CRISPR（http://crispor.tefor.net/）31。将输入序列的 100 bp 从 1.1.2 中粘贴。选择两个具有高特异性分数、高效率分数和低目标活动的引导性 RNA。此外，选择具有较高 Doench 分数的 RNA 指南，避免那些标有"低效"32的指南。
      注：替代CRISPR设计工具也是有价值的和公开的，例如长凳CRISPR设计工具（https://benchling.com/crispr）。要增加CRISPR/Cas9介导的内嵌变异细胞的频率，请尽可能选择两个靠近所需插入位点的引导RNA。
    4. 对于mRosa26蝗虫，请使用两个相邻的指南 RNA，指定为 mR26-sg1 （5'- CTCCATCTCTAGAGAGAAT -3'） 和 mR26-sg2 （5'- CGCCTCTCTAGAAC -3'） （图 1A）。对于hROSA26蝗虫，请使用两个相邻的指南 RNA，即 hR26-sg1 （5'- GGCGAGACACCG -3'） 和 hR26-sg2 （5'- AATGAGAAGACACCA-3'） （图 1B）。
      注：分别在RAW264.7细胞和Jurkat细胞中评估了mR26-sg1和mR26-sg2的基因组编辑活动（见补充文件，图S1）。
  2. 以 罗莎26 蝗虫为目标的含有 sgRNA 的 CRISPR 表达载体克隆
    1. 合成一个指南RNA的向前和向后寡头（见 补充文件）。
      注：最好在指南序列的开头添加"G"核苷酸，这有助于由 U6 发起人驱动的表达方式。例如，要克隆上述 mR26-sg1，前方寡头是 CACCGCTCCATCTCTAGAGAGAAT，反向寡头是 AACATTCTAGAAGGGC。前寡头中的附加 G 及其在反向寡头中的补充以粗体表示。
    2. 克隆合成寡头对应指南RNA到一体式CRISPR表达载体pX458-DsRed2生成在我们以前的工作21（图1C）使用一般协议的gRNA克隆由张的实验室（https://www.addgene.org/crispr/zhang/）：但是，跳过凝胶纯化步骤，使用 PCR 净化套件净化消化的载体（参见材料表）。
      注：在以前的协议中，对BbsI消化的载体进行了凝胶净化：但是，此步骤非常耗时。在本协议中，消化的产品使用 PCR 纯化套件进行净化，并直接用于下游结结反应，通常产生具有类似效率的正菌落。
    3. 根据制造商的说明，将 10 μL 的粘合产品（步骤 1.2.2）转换为 50 μL的 Escherichia 大肠杆菌 DH5® 合格电池。随机从带安培素（100 μg/mL）的LB琼脂板中挑选三个菌落，并将每个菌落接种到3 mL的LB介质中，用安培素在一夜之间培养。
    4. 使用 1 mL 的隔夜细菌培养物进行桑格测序，并将其余的保持在 4 °C，直到结构被确认为正确：pDsR-mR26-sg1 和 pDsR-mR26-sg2 用于 mRosa26 蝗虫敲击， 和 pdsr - hr26 - sg1 和 pdsr - hr - sg2 用于 hrosa26 点。
    5. 准备高浓度的质粒 DNA （约 2 微克 / μL），配上套件，用于净化转染级质粒（见 材料表）。

2. 设计和建造目标矢量作为同源重组模板

  1. 设计同源定向修复模板
    1. 设计一个目标载体，构成表达POI使用从以前的研究29优化的表达盒，其中包括一个CAG混合促进器，一个AscI限制站点允许克隆的POI的cDNA，IRES-EBFP2记者，和牛生长激素聚腺基化（bGH-polyA）信号（图1B 和 补充文件）。
    2. 设计与 mRosa26 或 hROSA26 位的基因组序列共享同源的同源臂 （HAs）。包括 +1 kb 的 5' HA 对应上游基因组序列从所需的插入站点到表达盒的左侧。同样，包括从插入位到表达盒右侧的下游基因组序列对应的 3' HA 的 +1 kb。
      注：表情盒插入尽可能接近 CRISPR / Cas9 网站34 。为了避免CRISPR/Cas9重新切割目标等位基因，将核苷酸变化纳入目标向量34、35的原空间相邻主题（PAM）序列（5'-NGG-3'）中。
    3. 要允许目标载体的线性化，请在 5' HA 上游插入一个独特的 EcoRI 站点，在 3' HA 的下游插入一个独特的 BamHI 站点。
    4. 让商业供应商合成目标矢量，并指定它们分别为 mRosa26 和 hROSA26 敲击的 pKR26-iBFP 和 pKhR26-iBFP。
  2. 构建目标矢量作为同源定向修复模板
    1. 要表达 POI，请从 Ensembl 基因组浏览器获取 cDNA 序列（编码序列），并选择具有最长蛋白质序列的脚本。例如，人类 ACE2 基因的cDNA是ACE2-202 ENST00000427411.2，人类 RASGRP1 基因的cDNA是RASGRP1 ENSG00000172575。
    2. 在商业供应商的帮助下合成 POI 的 cDNA。也可以通过 PCR 放大（此处未描述）克隆 cDNA。将序列GGCGCGCCACC （5' - 3'） 放在 cDNA 停止后立即放置序列 GGCG CGCCACC （5' - 3'），其中包括 AscI 限制站点（意体和粗体）和 Kozak 共识翻译启动站点（下划线），紧接着是 CDNA 的 ATG 启动 codon 和另一个 AscI 限制站点 （5'- GGCGCC-3'）。
    3. 根据制造商的说明（参见 材料表），使用 PCR 净化套件消化 AscI 的合成序列，并使用 PCR 净化套件进行净化，用于在限制消化后净化 DNA 片段。
    4. 根据制造商的说明，使用 T4 DNA 韧带将纯化 cDNA 插入 AscI 线性骨干载体 pKR26-iBFP 或 pKhR26-iBFP 中。
    5. 通过测序验证最终目标向量 pKR26-POI-iBFP 或 pKhR26-POI-iBFP。使用 maxiprep 根据制造商的协议对经过验证的构造进行净化。
    6. 使用 EcoRI 或 BamHI 消化目标载体，并根据制造商的说明使用 PCR 净化套件净化消化产品。将线性定位矢量（+0.8 μg/μL）存储在 -20 °C 下，直到电化。

3. 巨噬细胞和 T 细胞线的电电

  1. 为电位准备细胞培养物
    1. 准备罗斯韦尔公园纪念研究所 （RPMI） 1640 补充 10% 胎儿牛血清 （FBS） 作为完整的生长介质为 Jurkat T 细胞。准备杜尔贝科的改良鹰介质 （DMEM） 与 10% FBS 培养 RAW264.7 巨噬细胞。补充所有完整的生长介质与100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素（Pen/Strep），除了用于细胞分拣前感染后孵化的介质。
    2. 根据供应商的说明（参见 材料表），对 RAW264.7 和 Jurkat T 细胞进行亚培养。在亚培养 RAW264.7 细胞时，使用 trypsin-EDTA 溶液（0.25%）分离细胞。使用 FBS 补充 10% （v/v） DMSO 作为 RAW264.7 和 Jurkat 细胞的冷冻保存介质。
    3. 以 250 × g 收集细胞，5 分钟用于 RAW264.7 巨噬细胞，90 × g 收集 8 分钟用于 Jurkat T 细胞。然后用 5-10 mL 的 1× DPBS 清洗（没有 Ca2+ 或 Mg2+ 离子）。删除 DPBS。
    4. 使用 2 mL 的 1× DPBS 重新使用细胞颗粒。使用 10 μL 的细胞，并与等量的 0.2% 试穿蓝色混合，以估计细胞计数和生存能力。
      注意：确保细胞培养在转染当天具有>90%的生存能力。
    5. 对于单个敲击实验，使用 10 μL 核感染提示进行电击，并重复 5 次。计算2.0×106 个细胞所需的体积，并通过离心颗粒细胞。再次用第 3.1.3 步中描述的 1× DPBS 清洗细胞颗粒。
      注：使用 10 微升核素尖时，每次电击需要 4.0 ×10 5 个细胞。因此，准备至少2.0×106 个细胞进行一次敲击实验。
    6. 准备一个24井板与0.5mL的完全生长介质（准备在步骤3.1.1）每井没有笔/链球和预热在37°C孵化器。
  2. CRISPR/Cas9 组件的电化和目标矢量
    1. 打开电镀系统。使用先前研究中优化的电聚参数21： 1，400 V/20 ms/2 脉冲，用于 RAW264.7 巨噬细胞和 1350 V/20 ms/2 脉冲，用于 Jurkat T 细胞。
    2. 考虑管道造成的样品损失，在无菌的 1.5 mL 微中心管中准备 55 微电位混合物，其中每个 CRISPR/Cas9 载体 2.5 μg，线性瞄准矢量 2.4 μg，以及悬浮缓冲器 R。
      注：为了节省时间，在离心过程中可以准备电化混合物（第3.1.5步）。
    3. 从第 3.2.2 步开始，在 55 微升电聚混合物中重复 2.0 × 106 个电池（在步骤 3.1.5 中准备）。
    4. 使用带移液器的 10 μL 核素尖端从第 3.2.3 步吸气细胞/电聚混合物。
      注意：在管道输送过程中，避免引入可能导致电击故障的气泡。
    5. 将样品添加到从电镀套件中装满 3 mL 缓冲器 E 的管子中。
    6. 应用第 3.2.1 步中描述的两种细胞类型的电电电位参数。
    7. 将样品从第 3.1.6 步转移到 24 井板的一口井中，并预制介质。
    8. 重复步骤 3.2.4-3.2.7 用于其他四个重复以及仅针对目标矢量和 CRISPR 表达向量仅控制。
      注意：切换到不同的细胞类型/质粒DNA时，更改核感染尖端和管。
    9. 将转染细胞培养为 48-72 小时，以便在流细胞学分析或荧光激活细胞分拣 （FACS） 之前，在 CRISPR/Cas9 组件的电电和表达后进行恢复。使用荧光显微镜检查 DsRed2 的表达，该显微镜在感染后 24 小时配备红色通道。
      注：监测DsRed2荧光细胞的一个好处是，可以估计电电效率，并预测进一步细胞分拣的适宜性。

4. 细胞分类以隔离假定敲入细胞

  1. 在 FACS 排序之前，用完整的生长介质清洗一次受感染的细胞。通过离心离心的颗粒细胞，如第 3.1.3 步所述，并将颗粒重新悬回 500 μL 的新鲜介质中。
  2. 设置具有 85 μm 喷嘴和低流量的细胞分拣器（位于生物安全柜中）。选择"单细胞"模式进行排序，通过将 20-30 个细胞排序到 96 井微板的盖上来分类并测试单个单元格分拣效率和精度。每个井中央的一滴定位指示仪器的正确设置。
  3. 将细胞悬浮从第 4.1 步转移到无菌 FACS 管中，并将 SYTOX 红死细胞污渍添加到 1 nM 的最终浓度。
  4. 分析细胞分拣器上的样品。SYTOX Red 和 EBFP2 分别被 405 nm 激光激发，并被 V450/BV421 和 APC 通道检测到。DsRed2 被 488 nm 激光激发，并被 PE 通道检测到。使用未转染的细胞和EBFP2-和DsRed2单个阳性细胞作为光谱补偿的对照组。
  5. 将10个单细胞排序到每口96井微板的井中，每口预热完全生长介质含有150微升。使用圆形底部微板培养悬架细胞线，如 Jurkat T 细胞和平底微板，用于粘附 RAW264.7 巨噬细胞。
    注：每口井对10个细胞进行排序是提高细胞存活率和尽量减少需要播种的96井微板数量以及需要通过流细胞学和基因型筛选的样本数量的优化策略：如果每口井只排序一个细胞，则需要播种更多的微板，以增加获得正确编辑的细胞的机会。

5. 积极敲击细胞的筛选和验证

  1. 通过流细胞学筛选候选敲击细胞
    1. 将细胞从第4.5步孵育10-15天，每3天添加一次完整的生长介质，以取代蒸发后失去的液体。对于 Jurkat T 细胞，将生长在圆底 96 井板中的细胞转移到平底板，以优化细胞增殖。
    2. 将扩展的分拣单元转移到 48 井板以进行进一步扩展。
    3. 当细胞接近汇合时，使用一半的培养基通过流细胞测量屏蔽EBFP2表达（图3）。通常，汇合生长后48井板中一半的培养物等同于0.5-1.0×105 个细胞，这足以通过流细胞学分析一个样本。
    4. 将剩余的细胞转移到24井板，以进一步增殖。
    5. 保持候选细胞群拥有高比例的EBFP2阳性细胞，以进行进一步的基因分型实验。
      注：由于10个细胞被分类到96井微板的每一口井中，因此敲击细胞有可能与不表达敲击基因的细胞一起生长。因此，进行另一轮细胞分拣，将EBFP2阳性细胞与负细胞分离是正常的。
  2. 通过 PCR 和测序筛选候选敲击单元
    1. 收集 2 × 105 个候选单元格。使用DNA准备包提取基因组DNA（见 材料表）。
    2. 为了验证精确的同源定向修复 （HDR） 发生在 mRosa26 位点，而不是在候选敲击细胞基因组中的随机位点，执行 PCR 与底漆跨越 HA 的每一侧（图 4）。选择位于目标向量（外部寡头）外的基因组区域的一个底漆和位于目标向量（内部寡头）内的另一个底漆。
      注：类似的设计用于验证HROSA26点的 HDR。PCR 引物也可轻松设计用于检测 POI 序列的插入。此外，野生类型和敲击等位基因型可以同时检测使用三引线PCR（见补充文件，图S2）。
    3. 使用快速克隆套件克隆正 PCR 产品（参见 材料表）。将反应混合物转换为 DH5+ 称职细胞。
    4. 随机选择8-10个单独的细菌菌落每个转换和序列PCR产品从步骤5.2.3桑格测序。
  3. 通过免疫膨胀分析和亲和力纯化验证正敲击细胞
    注：候选细胞接受免疫膨胀分析，以验证POI的插入，或亲和纯化（AP）用于蛋白质-蛋白质相互作用的研究。
    1. 根据抗体制造商的说明执行免疫膨胀分析。有关使用原发性抗体和二级抗体的信息，请参阅 材料表 。
    2. 根据制造商的说明（参见 材料表），使用链球菌-泰斯汀·塞法罗斯珠将表达 OST 标记 POI 的敲击细胞的解质置于 AP 中。
    3. 使用成像仪检测化疗。

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Representative Results

按照上述协议，使用木乃伊RAW264.7巨噬细胞在 mRosa26 靶点进行敲击实验，我们设计了一个靶向载体来表达人类ACE2，SARS-Cov-2病毒的受体（图2A）。使用类似的设计，我们生成了人类Jurkat T细胞与OST标记RASGRP1融合蛋白（图2C）的敲击。在转染三个质粒后，其中两个用于表示 CRISPR/Cas9 （DsRed2; pdsR-mR26-sg1 和 pDsR-mR-sg2 用于 mRosa26 敲击; pdsR-hR26-sg1 和 pDsR-hR26-sg2 用于 hROSA26 敲击），另一个用作同源重组 （EBFP2） 的 DNA 模板，表示两个荧光记者的双阳性细胞被分类到 96 井板中。在使用单细胞分拣模式排序的RAW264.7细胞中，0.91%为DsRed2+ EBFP2+，但每口井中收集了10个细胞（图2B）。Jurkat T细胞的转化效率较高，在这个具有代表性的实验中，双阳性细胞的比例为7.91%，表明OST-RASGRP1融合蛋白（图2D）的敲击成功。

在下一步中，流细胞学用于筛选具有EBFP2阳性细胞的候选油井。代表直方图显示，有明显的EBFP2阳性人群（图3）。值得注意的是，当细胞分拣两周后进行流细胞测序时，敲击细胞没有表达DsRed2。

为了区分精确的敲击和随机插入，通过执行PCR进一步测试了EBFP2阳性细胞的基因组DNA，底漆识别目标载体的哈斯和表达盒内特定区域（图4A 和 4B）之外的基因组序列。这些 PCR 产品的序列分析证实了 在 mRosa26 目标站点 （图 4C）发生 HDR 的情况。同样的基因型策略可以用来验证在Jurkat T细胞的hrUSA26 细胞的表达盒的精确插入。

为了获得纯种群的hACE2表达RAW264.7细胞，我们进一步对细胞进行了分类，并验证了在扩张后使用野生型细胞作为对照组（图5A）的荧光记者的存在。膨胀的细胞是EBFP2阳性，hACE2蛋白在穆林RAW264.7巨噬细胞（图5B和5C）中很容易检测到。同样，经过筛选和第二轮细胞分拣（图6A和6B），我们验证了荧光记者和OST-RASGRP1蛋白在人类Jurkat T细胞中的表达。此外，使用商业上可用的珠子对 OST-RASGRP1 蛋白进行亲和纯化。我们发现，在敲击的朱卡特细胞的总细胞解解剂中，RASGRP1蛋白的含量高于野生型细胞的RASGRP1蛋白含量：RASGRP1淘汰尤尔卡特细胞用作对照组（图6C）。使用 OST 标签进行净化后，只有敲击样品具有可检测的 RASGRP1（图 6D）。

Figure 1
图1。生成mRosa26/hROSA26 敲击细胞系的基因定位策略过度表达感兴趣的蛋白质。 （A） mRosa26特定的引导RNA定位序列和所需插入位点中的原始空间相邻主题 （PAM） 分别以蓝色和红色字母表示。Cas9 通常在 PAM 序列上游切开 3-4 个基点，由绿色箭头表示。靶向载体用作同源定向修复 （HDR） 的模板，从而在小鼠或人类基因组中精确插入表达盒。在目标矢量中，所需目标站点上游和下游的 1 kb 序列中的每一个都用作 5' 和 3' 同源臂 （HAs）。HAs 由由 CAG 促进器、带有 OST 标签的感兴趣的蛋白质 （POI） 的 cDNA 序列、IRES-EBFP2 报告器和 bGH-polyA 信号 （pA） 组成的表达盒分离。限制站点AscI用于POI的克隆，EcoRI和BamHI用于目标载体的线性化。CRISPR/Cas9 在hROSA26点进行中介敲击的策略类似。（B）人类ROSA26位图。hR26-sg1 和 hR26-sg2 目标序列以蓝色字母表示，相应的 PAM 序列以红色表示。（C）示意图为一体的CRISPR表达载体pX458-DsRed2，其中包含一个人类U6驱动的sgRNA表达盒和Cas9-T2A-DsRed2荧光记者盒。两个 Bbsi 限制站点允许克隆导 RNA。U6、人类U6RNA聚合酶III促进器：sgRNA，一种幻想单导RNA;CBh，鸡β-行动素混合促进器;核不扩散、核定位信号：T2A，该病毒2A自拼肽：bGH-pA，牛生长激素聚腺化信号。请单击此处查看此图的较大版本。

Figure 2
图2。RAW264.7 和 Jurkat 细胞的单细胞分类通过 CRISPR/Cas9 向量进行感染，并瞄准向量进行同源重组。瞄准RAW264.7（A）和朱卡特（C）细胞中用于稳定基因表达的载体。 小鼠RAW264.7巨噬细胞（B）和人类Jurkat T细胞（D）的代表流细胞图通过CRISPR/Cas9载体转染，表示DSRed2记者和目标载体表示EBFP2记者。共同表达DsRed2和EBFP2的细胞受到细胞分类和培养以进行扩展：与概述区域相邻的数字表示每个门中的细胞百分比，未转染的细胞用作负控制。请单击此处查看此图的较大版本。

Figure 3
图3。通过检测EBFP2表达物来筛选敲击细胞。 电镀后 14 天对 EBFP2+ 和 DsRed2+ RAW264.7 巨噬细胞 （A） 和 Jurkat T 细胞 （B） 进行流细胞分析。在直方图中，EBFP2+ 或 DsRed2+ 细胞的荧光强度 （FI） 显示在 X 轴上，每个荧光通道中的事件计数显示在 Y 轴上。 （A） EBFP2 和 hACE2 的表达是由 RAW264.7 木质巨噬细胞的 Rosa26 点的同一发起人推动的。 （B） 在 Jurkat 细胞中，OST-RASGRP1 表达与人类 ROSA26 位点的 EBFP2 表达相关联。在电化后的14天里，流动细胞分析显示，在分拣的细胞中，DsRed2细胞 几乎为零。野生类型 （WT） 细胞用作负控制，KI 代表敲击细胞。 请单击此处查看此图的较大版本。

Figure 4
图4。通过 PCR 和测序筛选候选敲击单元。（A） 生成hACE2敲击细胞的策略。用于区分精确 HDR 和随机插入的 PCR 引物的位置由绿色箭头指示。 （B） 通过EBFP2表达的流细胞学筛查，通过EBFP2表达的流动细胞学筛选确定的5个候选细胞（#4、#15、#22、#25和#43）的PCR基因型图（ 图3）表明，跨越同源臂的5'结（1472 bp）和3'结（1472个基点）都是正确的。M，DNA梯子;WT，野生型RAW264.7控制：H2O，负控制。 （C） 桑格对 来自 B 的 PCR 产品的测序显示，hACE2 表达式盒式磁带在没有突变的情况下成功敲入 mRosa26 位点。 请单击此处查看此图的较大版本。

Figure 5
图5。验证HACE2表达盒成功敲入RAW264.7巨噬细胞中的mRosa26位点。（A） WT RAW264.7巨噬细胞被用作流体细胞分析的负控制。（B）为了将EBFP2阳性细胞与负细胞分离，进行了另一轮细胞分类，以获得由近100%EBFP2+敲击细胞组成的群体，这些细胞被指定为hACE2 KI细胞。还检查了DsRed2表达，以确保CRISPR/Cas9质粒不被整合到RAW264.7巨噬细胞的基因组中。在直方图中，EBFP2+或 DsRed2+细胞的荧光强度 （FI） 显示在 X 轴上，每个荧光通道中的事件数显示在 Y 轴上。（C）使用兔子抗人类ACE2单克隆抗体通过免疫膨胀分析检测hACE2表达。在多个井（#4、#15、#22、#25和#43）的细胞中观察到hACE2的表达。WT RAW264.7 巨噬细胞用作负控制，GAPDH 用作负控制。请单击此处查看此图的较大版本。

Figure 6
图6。验证将 OST-RASGRP1 表达盒成功敲入Jurkat T 细胞中的 hROSA26位位。 （A） WT Jurkat T 细胞被用作流细胞分析的负控制。（B） EBPF2–通过额外的细胞分拣和扩展，Jurkat细胞的亚群丰富;这些细胞被指定为 OST-RASGRP1 KI 细胞。敲击细胞通过流细胞学分析，没有保留 DsRed2 表达载体。在直方图中，EBFP2+或 DsRed2+细胞的荧光强度 （FI） 显示在 X 轴上，每个荧光通道中的事件计数显示在 Y 轴上。（C）使用抗RASGRP1抗体进行免疫膨胀分析，在两个独立的敲击细胞（#1和#2）中检测 OST-RASGRP1 表达。WT Jurkat 和 RASGRP1 敲击 Jurkat 细胞用作对照组，β作用素用作加载控制。（D）使用 ASGRP1 敲除单元作为负控制来验证 OST-RASGRP1 的表达。免疫膨胀分析来自细胞裂解物的等量蛋白质，这些蛋白质要么在链球菌-泰克汀·塞法罗斯珠（亲和纯化）上受到亲和纯化，要么直接分析（总裂解质），并使用RASGRP1或GAPDH（加载控制）抗体进行探测。请单击此处查看此图的较大版本。

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Discussion

在我们的实验中，我们演示了如何使用人类 Jurkat T 细胞和 Murine RAW264.7 巨噬细胞进行免疫细胞的敲击编辑，从结构设计到敲击细胞筛选和验证。T细胞和巨噬细胞系都耐转染36，37：然而，CRISPR/Cas9交付效率低下的问题可以通过荧光记者的辅助和细胞分拣来克服。本协议适用于基因抢救实验和蛋白质-蛋白质相互作用实验，但不能应用于调控DNA序列的研究，如转录因子的结合位点，因为该协议是为Rosos26位点的敲击修饰而开发的。

双荧光记者协助CRISPR/Cas9敲击编辑
我们成功地应用了双荧光报告器系统，在免疫细胞中短暂地表达独立的CRISPR/Cas9载体集，从而在先前的研究中删除了DNA的大片段。我们设计了一个CRISPR/Cas9定位工具，使用DsRed2荧光蛋白作为记者和额外的光谱独特的荧光蛋白，以跟踪DNA模板的交付进行敲击修改。为了使敲击等位基因的修改可行，我们使用EBFP2荧光蛋白报告器，它与RFP（DsRed2在我们的情况下）没有光谱溢出，监测供体DNA的转染，作为同源重组过程中的模板。为了优化表达POI和荧光记者的盒式磁带，引入了IRES序列来获取独立的蛋白质。在我们之前的研究中，我们注意到 P2A 或 T2A 连接器的残余氨基酸在转录后后会影响细胞表面的蛋白质定位。IRES 序列不会留下此类残留氨基酸。如前一项研究所述，IRES在CAG促进剂38驱动的Cas9蛋白表达后，荧光报告器的含量更高。

一体式 CRISPR/Cas9 质粒
CRISPR/Cas9系统的各种格式和组合在以前的研究中已经描述，如Cas9转染为mRNA或蛋白质，以及化学合成的sgRNA39。CRISPR/Cas9 RNP复合物也已输送到哺乳动物细胞中;该策略提供了核酸酶活动早期开始和较短的半衰期的优势：但是，与构建一体式质粒相比，标记 RNP 的成本效益较低。在我们之前的研究中，我们发现使用单细胞分拣来分离那些表达CRISPR/Cas9（DsRed2阳性）和敲击蛋白（EBFP2阳性）的稀有细胞，远没有使用RNP输送那么复杂，而且很容易准备质粒。诚然，此协议依赖于单个单元格排序。但是，我们的协议易于执行，并产生成功的敲击修改与高可重复性。

来自 Rosa26点的 POI 表达
文献中有多个报告描述了使用CRISPR/Cas9编辑40，41，42的荧光记者标记内源蛋白的方法。内源性标记的优点是确定亚细胞定位并执行内源蛋白的体内跟踪是可行的。但是，如果无法在内源性位点设计适当的 CRIPSR 指南 RNA，则可能会遇到问题。在这里，我们开发了一种替代的敲击方法，将POI-IRES-EBFP2纳入基因组安全港地Rosa26，克服了为定位内源性标签寻找适当指南的局限性。

我们总结了实验中需要考虑的一些要点，以确保技术可重复性。首先，细胞分拣机需要有一个405纳米紫罗兰激光来激发EBFP2和488纳米蓝色激光器，或者一个561纳米的黄色激光来激发DsRed2。有了这样的配置，EBFP2 和 DsRed2 可以在没有光谱溢出的情况下检测到，这可能导致误报结果。在我们的实验中，DsRed2= EBFP2= 双阳性细胞的比例低至 0.9%;因此，适当人群的出生对实验的成功至关重要。进行了第二轮排序，以门 EBFP2+ 正细胞，然后是 PCR 验证。此外，对于敲击蛋白检测，最好引入蛋白质标签，如 OST 或其他类型的标签。 在Roa26 位点敲击实验之前，该基因的敲除为评估抗体是否具有理想的特异性提供了一个很好的机会。当抗体特异性不足时，应通过蛋白质标签在拉下后检测敲击蛋白。最后，在 FACS 筛选表达敲击等位基因的细胞时，EBFP2 的强度可用于评估是否存在两个副本或一个仿制等位基因的副本。

应用
在这个协议中，我们描述了RASGRP1的敲击修改，这是T细胞激活27中的关键分子。我们首先获得了可用于功能丧失研究的RASGRP1敲击朱卡特细胞，并在hROSA26点生成了表达OST-RASGRP1的更多Jurkat细胞。朱卡特细胞是研究T细胞生物学最常用的人类细胞系。由于免疫疗法在预防癌症患者T细胞衰竭方面取得了成功，免疫学家和癌症生物学家对修改Jurkat细胞以进行候选分子的功能研究有着浓厚的兴趣。值得注意的是，Jurkat T细胞系通常用于解剖信号通路，但使用这种细胞线是有局限性的，因为 Jurkat 细胞在刺激44时是 IFN-γ 的不良生产者。先前的研究使用内源性细胞位点修饰45和hrUSA26位点46的基因工程在人类Jurkat细胞中进行敲击实验。这两种策略都有其自身的优势：通过修改内源位点，蛋白质大概在"生理"水平上表达。hROSA26点的敲击修饰可产生可预测的结果，因为避免了 mRNA 的替代拼接，而且修改后的蛋白质的丰度也很容易检测到。其他基因组安全港，如腺相关病毒站点1（AAVS1）和化学（CC图案）受体5（CCR5）47，48值得更多的探索。

在我们之前的研究中，当Vav1-OST在RAW264.7细胞中小鼠 Rosa26 细胞的较高水平上表达时，由于诱饵蛋白水平高，OST亲和纯度13效率高，我们能够检测到它与低表达的Vav3分子的相互作用。我们还描述了建立一个巨噬细胞系稳定表达hACE2的敲击实验，hACE2是SARS-CoV-2的受体，在这种受体中保证丰富的表达。在单细胞RNA测序数据库中，用肺巨噬细胞表达，我们开发的表达hACE2的遗传细胞模型可用于SARS-CoV-2感染期间巨噬细胞的研究。

其他考虑
此协议旨在通过荧光记者的流细胞分析来识别表达 POI 的敲击细胞，我们的例子是 EBFP2 记者。但是，当 FACS 检测到的表面标记抗体可用于表面蛋白49时，则无需使用报告系统50。T细胞和巨噬细胞系，以及用于相互作用研究的OST标记蛋白质的例子，主要用于信号研究，这些信号分子大多在细胞醇或细胞核中定位。因此，可能需要一个荧光记者来识别理想的敲击细胞。

必须指出，此协议是为细胞系开发的，并且未验证对 T 细胞、单细胞/巨噬细胞等主要免疫细胞的应用。由于细胞增殖能力有限，我们不建议此协议用于原发性免疫细胞。由于荧光记者EBFP2是在同一促进下表达的敲击基因或POI使用IRES元素，我们没有观察到在没有敲击基因的情况下表达荧光记者的细胞。我们怀疑荧光蛋白表达细胞的恢复在很大程度上取决于同源重组的成功。正如先前的研究所报告的那样，当敲击效率非常低时，通过单个细胞排序来排序、扩展和识别正确的敲入细胞是乏味的，这也解释了为什么我们需要批量对细胞进行排序以提高成功率。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

我们感谢新乡医科大学的流细胞学核心设施。国家自然科学基金向LZ、81471595和32070898提供81601360支持了这种技术的发展。这项工作也得到了河南省教委第21号IRTSTHN030基金会的支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amersham Imager 600 Ge Healthcare imaging of chemiluminescence
Ampicillin, sodium salt MP Biomedicals 194526
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling Technology 7074 at 1/5000 dilution
Anti-RasGRP1 antibody, clone 10.1 Merck MABS146 1.0 μg/mL of working concentration
AscI New England BioLabs R0558S
β-Actin (D6A8) Rabbit mAb Cell Signaling Technology 8457 at 1/1000 dilution
BamHI-HF New England BioLabs R3136S
BbsI-HF New England BioLabs R3539S
Cellometer Mini Automated Cell Counter Nexcelom Bioscience
E.coli DH5α Competent Cells Takara 9057
DMSO (Dimethyl Sulfoxide) MP Biomedicals 196055
DNeasy Blood & Tissue Kits Qiagen 69506 cell culture reagent
DPBS (10X), no calcium, no magnesium ThermoFisher Scientific 14200075
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with high glucose HyClone SH30022.01
EcoRI-HF New England BioLabs R3101S
FACSAria™ Fusion BD Biosciences equipped with biosafety cabinet
FACS Canto flow cytometer BD Biosciences
Falcon 5 ml polystyrene round bottom test tube BD Biosciences 352003
Fetal bovine serum (FBS) ThermoFisher Scientific 10099141
FlowJo version 10.7 BD Biosciences
GAPDH (D16H11) XP Rabbit mAb Cell Signaling Technology 5174 at 1/1000 dilution
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP ThermoFisher Scientific 31430 at 1/5000 dilution
Immobilon ECL Ultra Western HRP Substrate Millipore WBKLS0500
Immobilon-PSQ PVDF Membrane Millipore ISEQ00010
Jurkat ATCC TIB-152 https://www.atcc.org/
Kanamycin sulfate MP Biomedicals 194531
LB agar powder ThermoFisher Scientific 22700041
Multi-channel Pipette (30-300 μL) Eppendorf, or similar
Neon Transfection System ThermoFisher Scientific MPK5000
Neon Transfection System, 10 μL kit ThermoFisher Scientific MPK1096
Nunc 15 mL Conical Sterile Centrifuge Tubes ThermoFisher Scientific 339651
OneTaq® Hot Start Quick-Load® 2X Master Mix New England BioLabs (M0489) for high GC% template
PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa ThermoFisher Scientific 26616
Pipette tip 0.1-20µl Eppendorf, or similar 0030 075.005
Pipette tip 2-200µl Eppendorf, or similar 0030 075.021
Pipette tip 50-1000µl Eppendorf, or similar 0030 075.064
Plasmid Maxi Kit Qiagen 12163
pX458-DsRed2 Addgene 112219
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28104 purify plasmid from restriction digestion
Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix New England BioLabs M0494S
RAW264.7 ATCC TIB-71 https://www.atcc.org/
Recombinant Anti-ACE2 antibody [EPR4435(2)] Abcam ab108252 at 1/1000 dilution
RPMI 1640 Medium HyClone SH30027.01
Strep-Tactin Sepharose beads IBA Lifesciences 2-1201-010
Penicillin-Streptomycin ThermoFisher Scientific 15140122
SYTOX™ Red Dead Cell Stain, for 633 or 635 nm excitation ThermoFisher Scientific S34859
T4 DNA ligase New England BioLabs M0202S
T4 Polynucleotide Kinase New England BioLabs M0201S
Trypan Blue Solution, 0.4% ThermoFisher Scientific 15250061
Trypsin-EDTA solution (0.25%), with phenol red ThermoFisher Scientific 25200056
ZOE Fluorescent Cell Imager Bio-Rad
1.5 mL microtubes, PCR-clean Eppendorf, or similar 0030 125.215
24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates Corning 3524
96-well Clear Flat Bottom Polystyrene TC-treated Microplates Corning 3599
96-well Clear Round Bottom TC-treated Microplate Corning 3799

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免疫学和感染， 第 177 期， 敲门， CRISPR/Cas9， 罗莎26， 巨噬细胞， T 细胞， hACE2
基因敲击由CRISPR/Cas9和细胞排序在巨噬细胞和T细胞线
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Zhang, L., Huang, R., Lu, L., Fu, R., Guo, G., Gu, Y., Liu, Z., He, L., Malissen, M., Liang, Y. Gene Knock-in by CRISPR/Cas9 and Cell Sorting in Macrophage and T Cell Lines. J. Vis. Exp. (177), e62328, doi:10.3791/62328 (2021).

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