Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

मेम्ब्रेन बाउंड-आईएल-21-मॉडिफाइड बी सेल लाइन का उपयोग करके प्राकृतिक हत्यारा (एनके) और सीएआर-एनके सेल विस्तार विधि

Published: February 8, 2022 doi: 10.3791/62336
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1,3
1Department of Pathology, Immunology and Laboratory Medicine, Rutgers-New Jersey Medical School, 2Department of Microbiology, Biochemistry & Molecular Genetics, Public Health Research Institute Center, New Jersey Medical School, Rutgers University, 3Center for Immunity and Inflammation, New Jersey Medical School, Rutgers-The State University of New Jersey

Summary

यहां, हम परिधीय रक्त प्राकृतिक हत्यारा (पीबीएनके), यकृत ऊतकों से एनके कोशिकाओं और परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (पीबीएमसी) या कॉर्ड ब्लड (सीबी) से प्राप्त चिमेरिक एंटीजन रिसेप्टर (सीएआर)-एनके कोशिकाओं का विस्तार करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं। यह प्रोटोकॉल विस्तारित एनके कोशिकाओं की अनुकूलित शुद्धता के अलावा 221-एमआईएल -21 फीडर कोशिकाओं का उपयोग करके एनके और सीएआर-एनके कोशिकाओं के विस्तार को दर्शाता है।

Abstract

चिमेरिक एंटीजन रिसेप्टर (सीएआर) -संशोधित प्रतिरक्षा कोशिका चिकित्सा कैंसर और संक्रामक रोगों के लिए एक उभरता हुआ उपचार बन गया है। एनके-आधारित इम्यूनोथेरेपी, विशेष रूप से सीएआर-एनके सेल, गंभीर जीवन-धमकी विषाक्तता के बिना सबसे आशाजनक 'ऑफ-द-शेल्फ' विकास में से एक है। हालांकि, एक सफल सीएआर-एनके थेरेपी विकसित करने के लिए अड़चन एक तीसरे पक्ष से गैर-संपूर्ण, दीर्घकालिक, 'ऑफ-द-शेल्फ' सीएआर-एनके कोशिकाओं की पर्याप्त संख्या प्राप्त कर रही है। यहां, हमने एपस्टीन-बार वायरस- (ईबीवी) ट्रांसफॉर्म्ड बी सेल लाइन का उपयोग करके एक नई सीएआर-एनके विस्तार विधि विकसित की, जो इंटरल्यूकिन -21 (आईएल -21) के आनुवंशिक रूप से संशोधित झिल्ली रूप को व्यक्त करती है। इस प्रोटोकॉल में, कॉर्ड रक्त और परिधीय रक्त, साथ ही ठोस अंग ऊतकों से एनके और सीएआर-एनके कोशिकाओं का विस्तार करने के लिए चरण-दर-चरण प्रक्रियाएं प्रदान की जाती हैं। यह काम सीएआर-एनके इम्यूनोथेरेपी के नैदानिक विकास को काफी बढ़ाएगा।

Introduction

प्राकृतिक हत्यारा (एनके) कोशिकाएं लिम्फोसाइटों का एक महत्वपूर्ण उप-समूह हैं जो सीडी 56 को व्यक्त करती हैं और टी सेल मार्कर, सीडी 3 1,2 की अभिव्यक्ति की कमी होती है। पारंपरिक एनके कोशिकाओं को जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिकाओं के रूप में वर्गीकृत किया जाता है जो वायरल संक्रमित कोशिकाओं और कैंसर कोशिकाओं के इम्यूनोसर्विलांस के लिए जिम्मेदार होते हैं। टी कोशिकाओं के विपरीत, एनके कोशिकाएं सीडी 16 या अन्य सक्रिय रिसेप्टर्स का उपयोग करके संक्रमित या घातक कोशिकाओं को पहचानती हैं और एंटीजन पेप्टाइड्स और प्रमुख हिस्टोकम्पैटिबिलिटी कॉम्प्लेक्स (एमएचसी) वर्ग 1 अणु 3,4 के बीच एक परिसर के गठन की आवश्यकता नहीं होती है। रिलैप्स या दुर्दम्य सीडी 19 पॉजिटिव कैंसर (गैर-हॉजकिन लिंफोमा या क्रोनिक लिम्फोसाइटिक ल्यूकेमिया [सीएलएल]) के इलाज के लिए चिमेरिक एंटीजन रिसेप्टर (सीएआर)-एनके कोशिकाओं का उपयोग करके हालिया नैदानिक जांच ने सीएआर-एनके कोशिकाओं के उत्कृष्ट सुरक्षा लाभ दिखाए। उदाहरण के लिए, सीएआर-एनके सेल इन्फ्यूजन न्यूनतम या नगण्य ग्राफ्ट बनाम होस्ट रोग (जीवीएचडी), न्यूरोटॉक्सिसिटी, कार्डियोटॉक्सिसिटी और साइटोकिन रिलीज सिंड्रोम (सीआरएस) 6,7,8,9,10 से जुड़ा हुआ है। हालांकि, मानव एनके कोशिकाओं का विस्तार करने के पारंपरिक तरीकों ने मजबूत भ्रातृहत्या और टेलोमेयर की कमी के साथ संपूर्ण फेनोटाइप दिखाए, जो दत्तक इम्यूनोथेरेपी11 के लिए पर्याप्त संख्या में कार्यात्मक एनके कोशिकाओं को प्राप्त करने में एक बड़ी चुनौती प्रस्तुत करता है।

इन चुनौतियों को दूर करने के लिए, एक विकिरणित और आनुवंशिक रूप से इंजीनियर 721.221 (इसके बाद, 221) सेल लाइन, एमएचसी वर्ग1 अणुओं की कम अभिव्यक्ति के साथ एक मानव बी-लिम्फोब्लास्टोइड सेल लाइन का उपयोग करके प्राथमिक एनके कोशिकाओं को सीधे परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (पीबीएमसी) या कॉर्ड ब्लड (सीबी) से विस्तारित करने के लिए एक विधि विकसित की गई थी। पिछले अध्ययनों ने एनके सेल विस्तार में आईएल -21 के महत्व को दिखाया; इसलिए, 721.221 सेल लाइन (अब से, 221-एमआईएल -21 से शुरू) के एक संस्करण को व्यक्त करने वाला आनुवंशिक रूप से इंजीनियर झिल्ली-बाध्य आईएल -2111,12,13,14,15 विकसित किया गया था। परिणामों से पता चला है कि 221-एमआईएल -21 फीडर-सेल-विस्तारित प्राथमिक एनके कोशिकाओं को लगभग 2-3 सप्ताह तक लगातार उच्च एनके सेल शुद्धता के साथ औसतन >40,000 गुना तक विस्तारित किया गया था। इस प्रोटोकॉल के आवेदन के बारे में अतिरिक्त जानकारी यांग एट अल .16 में पाई जा सकती है।

इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य पीबीएनके, सीबीएनके, ऊतक-व्युत्पन्न एनके और सीएआर-एनके कोशिकाओं के नए विस्तार की चरण-दर-चरण प्रक्रिया को प्रदर्शित करना है।

Protocol

इस प्रोटोकॉल में मानव ऊतक और रक्त से संबंधित कार्य रटगर्स विश्वविद्यालय संस्थागत समीक्षा बोर्ड (आईआरबी) के दिशानिर्देशों का पालन करते हैं

1. यकृत ऊतकों से एनके सेल विस्तार (दिन 0), जैसा कि चित्र 1 में दिखाया गया है।

नोट: प्रारंभिक सेल संख्या और व्यवहार्यता अंग हटाने के बाद के समय और प्रारंभिक ऊतक नमूना राशि के साथ दृढ़ता से सहसंबद्ध हैं। हालांकि, यदि ऊतकों को हैंक के संतुलित नमक समाधान (एचबीएसएस) के 30 एमएल में रखा जाता है और रात भर बर्फ पर या फ्रिज में 4 डिग्री सेल्सियस पर रखा जाता है, तो एनके कोशिकाओं को अभी भी 24 घंटे बाद तक उच्च शुद्धता और व्यवहार्यता पर विस्तारित किया जा सकता है।

  1. बाँझ शल्य चिकित्सा उपकरणों का उपयोग करके ऊतकों और वर्गों से लिम्फोसाइट्स प्राप्त करने के लिए व्यवहार्य ऊतक क्षेत्रों की पहचान करें।
  2. ऊतकों को 30 एमएल एचबीएसएस (डब्ल्यू / ओ कैल्शियम या मैग्नीशियम) में रखें और अलगाव के लिए तैयार होने तक बर्फ पर रखें।
  3. एक जैव सुरक्षा कैबिनेट के अंदर बाँझ रेजर ब्लेड या कैंची और फोर्सप्स का उपयोग करके ऊतक को <0.5 सेमी क्यूब्स में कीमा करें।
  4. एचबीएसएस में 10x स्टॉक को पतला करके 1x कोलेजनेज IV समाधान (1 mg/mL) तैयार करें (10x कोलेजनेज IV: 10 mg/mL या ~ 200 U/mL)।
  5. ऊतक विघटनकारी ट्यूबों में कीमा ऊतक के टुकड़े रखें। ट्यूबों को 4 ग्राम से अधिक ऊतक के साथ भरें और ऊतक के टुकड़ों को ~ 10 एमएल 1x कोलेजनेज IV में डुबोएं।
    नोट: DNase I का उपयोग करने की सिफारिश नहीं की जाती है क्योंकि यह एनके व्यवहार्यता और उपज को थोड़ा कम कर सकता है। कृपया उपयोग किए गए विशिष्ट ऊतक पृथक्करणक ट्यूबों के लिए सामग्री की तालिका देखें।
  6. ऊतक विघटनकारी ट्यूबों को एक ऊतक पृथक्करणक में रखें और ऊतक को अच्छी तरह से कीमा करने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर मिश्रण करें।
    नोट: यकृत ऊतक के लिए, इसमें 30 मिनट से अधिक समय लग सकता है। अधिक भुरभुरा ऊतक के लिए, लगभग 15 मिनट पर्याप्त हो सकता है। कृपया विशिष्ट ऊतक विघटनक ट्यूबों और उपयोग किए गए ऊतक पृथक्करणक के लिए सामग्री की तालिका देखें।
  7. ऊतक विघटनकारी ट्यूबों को हटा दें और 5 एमएल सिरिंज के बैकएंड का उपयोग करके 40 μm नायलॉन सेल छन्नी के माध्यम से ट्राइट्यूरेट करें। एलुएंट को इकट्ठा करें और बड़े अनपचे हुए टुकड़ों को छोड़ दें।
  8. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 400 x g पर एलुएंट को घुमाएं। सतह पर तैरने वाले को उत्तेजित करें।
  9. वसा कोशिकाओं को हटाने के लिए 30% पॉलीविनाइलपाइरोलिडोन (पीवीपी) -लेपित सिलिका में सेल छर्रों को पुन: निलंबित करें जो अन्यथा अंतिम लिम्फोसाइट अंश को दूषित कर देंगे।
    1. 1x PVP-लेपित सिलिका तैयार करने के लिए, 10x PBS में PVP-लेपित सिलिका के 9: 1 कमजोर पड़ने का उपयोग करें।
      नोट: उपयोग किए गए विशिष्ट पीवीपी-लेपित सिलिका के लिए सामग्री की तालिका देखें।
    2. 30% पीवीपी-लेपित सिलिका तैयार करने के लिए, पीबीएस / एचबीएसएस के साथ 1 एक्स पीवीपी-लेपित सिलिका को पतला करें।
  10. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 400 x g पर सेल पेलेट को घुमाएं। सतह पर तैरने वाले को उत्तेजित करें।
  11. सेल पेलेट को 9 एमएल आर -10 मीडिया में पुन: निलंबित करें।
    नोट: आर -10 मीडिया की संरचना के लिए सामग्री की तालिका देखें
  12. लाल रक्त कोशिकाओं और पॉलीमोर्फोन्यूक्लियर कोशिकाओं से लिम्फोसाइटों को अलग करने के लिए 4 एमएल फिकॉल या लिम्फोसाइट पृथक्करण मीडिया पर सेल निलंबन को सावधानीपूर्वक परत करें।
  13. त्वरण और ब्रेक के साथ कमरे के तापमान पर 23 मिनट के लिए 400 x g पर सेंट्रीफ्यूजिंग करके परतों को अलग करें। ऊपरी-मध्यम परत को सावधानीपूर्वक काट लें और ऊतक-घुसपैठ लिम्फोसाइटों वाले इंटरफेज़ की कटाई करें।
  14. कोशिकाओं को 10 एमएल मीडिया के साथ कुल्ला करें और सेल गिनती, फ्लो साइटोमेट्री, कोशिकाओं के एलिकोटिंग और फ्रीजिंग, या प्राथमिक एनके विस्तार प्रोटोकॉल के लिए आगे बढ़ें।

2. पीबीएमसी (या सीबी या अंग ऊतकों) (दिन 0) से प्राथमिक एनके सेल विस्तार, जैसा कि चित्र 2 में दिखाया गया है।

  1. जमे हुए पीबीएमसी और जमे हुए, विकिरणित फीडर कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में पिघलाएं।
  2. पीबीएमसी और 100 गामा-विकिरणित (जीवाई-विकिरणित) 221-एमआईएल -21 कोशिकाओं को 400 x g पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा 5 मिनट के लिए 10 एमएल आर -10 मीडिया के साथ अलग से धोएं।
  3. प्रवाह साइटोमेट्री के लिए पीबीएमसी के 1 x 106 कोशिकाओं को सहेजें।
    नोट: एनके सेल विस्तार दर की गणना में प्रारंभिक एनके सेल शुद्धता एक महत्वपूर्ण कारक है।
  4. आर -10 मीडिया के 1 एमएल में कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें। ट्रिपैन ब्लू का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें।
  5. पीबीएमसी की5x10 6 कोशिकाओं को एक विशेष6-वेल प्लेट में 10 x 10 6 कोशिकाओं के साथ मिलाएं 100 Gy-विकिरणित 221-mIL-21 कोशिकाओं की 6 कोशिकाएं ( सामग्री की तालिका देखें)।
  6. मानव आईएल -2 (200 यू / एमएल) और मानव आईएल -15 (5 एनजी / एमएल) के साथ पूरक आर -10 मीडिया के 30 एमएल जोड़ें ( सामग्री की तालिका देखें)।
  7. 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर विशेष 6-वेल प्लेट को इनक्यूबेट करें।
  8. हर 3-4 दिनों में एनके कोशिकाओं को बनाए रखने के लिए मानव आईएल -2 (200 यू / एमएल) और मानव आईएल -15 (5 एनजी / एमएल) के साथ पूरक आर -10 मीडिया के साथ मीडिया को बदलें।
    नोट: प्रत्येक मीडिया परिवर्तन पर आगे विस्तार के लिए प्रति अच्छी तरह से 20 x 106 कोशिकाओं से कम बनाए रखें। सर्वोत्तम व्यवहार्यता के लिए, सुनिश्चित करें कि प्रत्येक कुएं में कुल सेल संख्या 100 x 106 कोशिकाओं से अधिक नहीं है।
  9. एनके सेल विस्तार दर की गणना करने के लिए हर 3-4 दिनों में कुल सेल संख्या, व्यवहार्यता और प्रवाह साइटोमेट्री करें।

3. 293 टी कोशिकाओं का अनुलग्नक (दिन 2), जैसा कि चित्र 2 में दिखाया गया है।

  1. 1.8 x 106 293 टी कोशिकाओं को 11 एमएल डी -10 मीडिया में प्रति उपचारित 100 मिमी प्लेट में विभाजित करें।
    नोट: डी -10 मीडिया की संरचना के लिए सामग्री की तालिका देखें
  2. 5% CO 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 293T कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।

4. रेट्रोवायरस अभिकर्मक (दिन 3)

  1. 1.7 एमएल ट्यूब में, 30 μL अभिकर्मक के साथ कम सीरम मीडिया के 470 μL मिलाएं।
    नोट: उपयोग किए गए विशिष्ट कम सीरम मीडिया और अभिकर्मक अभिकर्मक के लिए सामग्री की तालिका देखें।
  2. एक अलग 1.7 एमएल ट्यूब में, 2.5 μg pRDF प्लास्मिड, 3.75 μg Pegpam3 प्लास्मिड, और 2.5 μg CAR निर्माण SFG वेक्टर में कम सीरम मीडिया में जोड़ें ताकि अंतिम मात्रा 500 μL हो।
  3. चरण 4.1 और 4.2 ड्रॉपवाइज में समाधान ों को मिलाएं।
  4. ट्यूब को कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  5. चरण 4.4 से 293 टी सेल प्लेट तक मिश्रण का 1 एमएल पहले दिन ड्रॉपवाइज तरीके से जोड़ें।
  6. 48-72 घंटे के लिए 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेट (ओं) को इनक्यूबेट करें।

5. रेट्रोनेक्टिन प्लेट-कोटिंग (दिन 3)

  1. फॉस्फेट बफ़र्ड सेलाइन (पीबीएस) के साथ 50-100 μg / mL की अंतिम सांद्रता के लिए रेट्रोनेक्टिन प्रोटीन को पतला करें।
  2. एक अनुपचारित 24-वेल प्लेट (प्रति सीएआर निर्माण में 5 कुएं) के प्रत्येक कुएं में पतला रेट्रोनेक्टिन का 500 μL जोड़ें। पैराफिल्म का उपयोग करके प्लेट को सील करें और प्लेट को रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।

6. पारगमन (दिन 4)

  1. 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 2103 x g पर रेट्रोनेक्टिन प्लेट को सेंट्रीफ्यूज करें। सतह पर तैरने वाले को त्याग दें।
  2. 1 एमएल आर -10 माध्यम के साथ 24-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं को ब्लॉक करें।
  3. प्लेट को 1 घंटेके लिए 5 % CO2 के साथ 37 °C पर इनक्यूबेट करें।
  4. सेंट्रीफ्यूज को 32 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें, जबकि रेट्रोनेक्टिन प्लेट अवरुद्ध हो रही है।
  5. 0.45 μm फ़िल्टर का उपयोग करके संक्रमित 293T कोशिकाओं को फ़िल्टर करके रेट्रोवायरस सुपरनैटेंट एकत्र करें।
  6. प्रत्येक कुएं में फ़िल्टर किए गए रेट्रोवायरस सुपरनैटेंट के 2 एमएल का एलिकोट।
  7. 24-वेल प्लेट को 2103 x g पर 2 घंटे के लिए 32 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूज करें।
  8. प्लेट सेंट्रीफ्यूजेशन के दौरान, दिन 0 से विस्तारित पीबीएनके कोशिकाओं को इकट्ठा करें और ट्रिपैन ब्लू का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें।
    नोट: आईएल -2 (200 यू / एमएल) और आईएल -15 (5 एनजी / एमएल) के साथ पूरक आर -10 मीडिया जोड़कर पीबीएनके कोशिकाओं का विस्तार जारी रखें।
  9. आईएल -2 (200 यू / एमएल) और आईएल -15 (5 एनजी / एमएल) के साथ पूरक आर -10 मीडिया के साथ विस्तारित पीबीएनके कोशिकाओं को 2.5 x 105 x 10 5 कोशिकाओं / एमएल (0.5 x 106-1 x 106 कोशिकाओं प्रति कुएं) तक पतला करें।
    नोट: कुल सेल संख्या, व्यवहार्यता रिकॉर्ड करें, और फ्लो साइटोमेट्री के लिए 5 x 105 विस्तारित पीबीएनके कोशिकाओं को सहेजें क्योंकि ये मान एनके सेल विस्तार दर निर्धारित करने में महत्वपूर्ण हैं।
  10. सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, प्रत्येक कुएं से रेट्रोवायरस सुपरनैटेंट को आंशिक रूप से एस्पिरेटेड करें।
    नोट: पूरी तरह से एस्पिरेट न करें, यानी, रेट्रोवायरस सुपरनैटेंट के लगभग 100 μL प्रति अच्छी तरह से छोड़ दें, क्योंकि इससे पारगमन दक्षता कम हो जाएगी।
  11. चरण 6.8 से प्रत्येक कुएं तक पतला विस्तारित पीबीएनके कोशिकाओं का एलिकोट 2 एमएल।
  12. प्लेट को 600 x g पर 10 मिनट के लिए 32 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूज करें। प्लेट को 48-72 घंटे के लिए 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    नोट: प्लेट को पैराफिल्म न करें।

7. सीएआर-एनके कोशिकाओं का संग्रह (दिन 6 या 7), जैसा कि चित्र 2 में दिखाया गया है।

  1. धीरे से 24-वेल प्लेट से कोशिकाओं को इकट्ठा करें और कोशिकाओं को 50 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें
    नोट: बुलबुले उत्पन्न न करने का प्रयास करें, क्योंकि इसके परिणामस्वरूप सेल व्यवहार्यता में कमी आएगी।
  2. ट्यूब को 5 मिनट के लिए 400 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें।
  3. 1 एमएल आर -10 मीडिया के साथ गोली को फिर से निलंबित करें और ट्रिपैन ब्लू का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें।
    नोट: पारगमन दक्षता निर्धारित करने के लिए प्रवाह साइटोमेट्री के लिए 5 x 105 कोशिकाओं को सहेजें।
  4. पुन: निलंबित कोशिकाओं को एक विशेष 6-वेल प्लेट में स्थानांतरित करें जिसमें आईएल -2 (200 यू / एमएल) और आईएल -15 (5 एनजी / एमएल) के साथ पूरक 30 एमएल आर -10 मीडिया होता है।
  5. 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर विशेष 6-वेल प्लेट को इनक्यूबेट करें।
  6. हर 3 - 4 दिनों में एनके कोशिकाओं को बनाए रखने के लिए आईएल -2 (200 यू / एमएल) और आईएल -15 (5 एनजी / एमएल) के साथ पूरक आर -10 मीडिया को बदलें।
    नोट: प्रत्येक परिवर्तन पर आगे विस्तार के लिए प्रति अच्छी तरह से 20 x 106 कोशिकाओं से कम बनाए रखें। सर्वोत्तम व्यवहार्यता के लिए, सुनिश्चित करें कि प्रत्येक कुएं में कुल सेल संख्या 100 x 106 कोशिकाओं से अधिक नहीं है।
  7. एनके सेल विस्तार दर की गणना करने के लिए हर 3-4 दिनों में कुल सेल संख्या, व्यवहार्यता रिकॉर्ड करें और फ्लो साइटोमेट्री करें।
  8. उपयुक्त इन विट्रो या विवो परख के लिए कोशिकाओं का उपयोग करें।
    नोट: पूर्व विवो विस्तारित पीबीएनके, और सीएआर-एनके कोशिकाओं को लगभग 4 सप्ताह के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में संवर्धित किया जा सकता है।
  9. फ्लो साइटोमेट्री द्वारा दिन 7, दिन 11, दिन 14, दिन 18 और दिन 21 पर एनके सेल नंबर और शुद्धता की जांच करें।

Representative Results

221-एमआईएल -21 फीडर सेल पद्धति का उपयोग करके ऊतक-घुसपैठ एनके सेल अलगाव और पीबीएनके सेल विस्तार का एक योजनाबद्ध वर्कफ़्लो चित्रा 1 और चित्रा 2 में दिखाया गया है। मानव-विरोधी सीडी 56 और एंटी-ह्यूमन सीडी 3 के साथ कोशिकाओं को धुंधला करके एनके सेल शुद्धता निर्धारित करने के लिए फ्लो साइटोमेट्री के लिए हर 3 या 4 दिनों में विस्तारित पीबीएनके कोशिकाओं को एकत्र किया गया था। विस्तार प्रणाली की प्रजनन क्षमता दिखाने के लिए दो अलग-अलग दाताओं का उपयोग करके प्रयोग दोहराया गया था (चित्रा 3)। 221-एमआईएल -21 द्वारा विस्तारित पीबीएनके कोशिकाओं को लगभग 5 × 104 गुना (चित्रा 3 ए) का विस्तार करने के लिए दिखाया गया था। इसके अलावा, एनके सेल शुद्धता को अत्यधिक बनाए रखा गया था, 21-दिवसीय विस्तार (चित्रा 3 बी) के दौरान लगभग 85%। 221-एमआईएल -21 फीडर सेल विस्तार प्रणाली का उपयोग करते हुए, एनके सेल शुद्धता लगातार 85% -95% के बीच थी, जो दाताओं से स्वतंत्र थी (डेटा नहीं दिखाया गया)। 221-एमआईएल -21 विस्तार प्रणाली की मजबूती को प्रदर्शित करने के लिए, विस्तार से पहले एंटी-सीडी 56 और एंटी-सीडी 3 के लिए पीबीएमसी को दाग दिया गया था, जिसने एनके कोशिकाओं के लिए 7.09% की सेल शुद्धता और टी कोशिकाओं का उच्च प्रतिशत दिखाया (चित्रा 4 ए)। एनके कोशिकाओं का विस्तार करने के लिए पीबीएमसी को 221-एमआईएल -21 के साथ सह-संवर्धन किया गया था; दिन 4 पर सीएआर-एनके ट्रांसडक्शन से पहले एनके शुद्धता की जांच की गई थी (चित्रा 4 ए)। सीएआर-एनके कोशिकाओं को एंटी-सीडी 56, एंटी-सीडी 3, और एंटी-एचआईजीजी (एच + एल) एफ (एबी') 2 के लिए एकत्र और दाग दिया गया था, जिसने उच्च एनके सेल आबादी (दिन 7 पर 86.9%) और लगभग 70% की उच्च सीएआर पारगमन दक्षता दिखाई (चित्रा 4)। रेट्रोवायरस पैकेजिंग सिस्टम का उपयोग करके उच्च पारगमन क्षमता (95% तक) भी देखी गई। कुल मिलाकर, इन आंकड़ों से पता चलता है कि 221-एमआईएल -21 फीडर कोशिकाएं एनके कोशिकाओं का सफलतापूर्वक विस्तार कर सकती हैं और एनके सेल शुद्धता को संरक्षित कर सकती हैं।

Figure 1
चित्रा 1: ठोस मानव अंग के नमूनों से एनके सेल विस्तार का आरेख। संक्षेप में, प्राप्त मानव यकृत के नमूनों को यांत्रिक पाचन के लिए छोटे क्यूब्स में काट दिया जाता है। अलग-थलग कोशिकाओं को तब पीवीपी-लेपित सिलिका और लिम्फोसाइट पृथक्करण मीडिया का उपयोग करके अलग किया जाता है। इसके अलावा, एनके कोशिकाओं को चित्रा 2 में वर्णित विस्तार प्रोटोकॉल का उपयोग करके विस्तारित किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: पीबीएमसी से सीएआर-एनके सेल पीढ़ी का योजनाबद्ध वर्कफ़्लो। संक्षेप में, 221-एमआईएल 21 फीडर कोशिकाओं को 100 जीवाई पर विकिरणित किया गया था, इससे पहले कि पीबीएमसी के साथ सह-संवर्धन किया गया था, जिसे आईएल -2 और आईएल -15 के साथ पूरक किया गया था। समानांतर में, 293 टी कोशिकाओं को सीएआर रेट्रोवायरस का उत्पादन करने के लिए रेट्रोवायरस पैकेजिंग सिस्टम के साथ स्थानांतरित किया गया था, जिसे तब आईएल -2 और आईएल -15 की उपस्थिति में विस्तारित पीबीएनके कोशिकाओं में स्थानांतरित किया गया था। प्राथमिक सीएआर-एनके कोशिकाओं को 7 वें दिन काटा गया और 21 दिनों तक विस्तार जारी रखा गया। इस आंकड़े को यांग एट अल.16 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्र 3: PBNK कोशिकाओं का गतिशील समय-व्यपगत विस्तार। (A) 22-दिवसीय समय पाठ्यक्रम के दौरान PBNK का गुना विस्तार। प्रवाह साइटोमेट्री के लिए संकेतित दिनों में कोशिकाओं को एंटी-सीडी 56 और एंटी-सीडी 3 से दाग दिया गया था। एनके कोशिकाओं की कुल संख्या एनके सेल शुद्धता को कोशिकाओं की कुल संख्या से गुणा करके निर्धारित की गई थी। विस्तार दर निम्नानुसार उत्पन्न की गई थी: (एनके कोशिकाओं की संख्या) Tn/ (NK कोशिकाओं की संख्या) T0, जहां NK कोशिकाओं की संख्या = (NK सेल शुद्धता का प्रतिशत) × (कोशिकाओं की कुल संख्या), T0 समय दिन 0 पर NK कोशिकाओं की संख्या है, और Tn समय दिन n पर NK कोशिकाओं की संख्या है। एनके सेल विस्तार को दो अलग-अलग दाताओं के साथ दो बार दोहराया गया था। त्रुटि पट्टियाँ SEM ± प्रतिनिधित्व करती हैं. कृपया इस आरेख का बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: सीएआर-एनके कोशिकाओं का प्रतिनिधि प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण। (ए) प्रतिनिधि डॉट प्लॉट 18-दिवसीय पाठ्यक्रम के दौरान सीएआर-एनके कोशिकाओं की एनके सेल शुद्धता के गतिशील समय-चूक को दर्शाते हैं। फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण का मूल्यांकन संकेतित समय बिंदुओं पर एंटी-सीडी 56 और एंटी-सीडी 3 के साथ कोशिकाओं को धुंधला करके किया गया था। दिन 0 पीबीएनके के पूर्व-विस्तार को इंगित करता है। दिन 4 पीबीएनके के बाद के विस्तार और सीएआर-एनके कोशिकाओं के पूर्व-पारगमन को इंगित करता है। दिन 7 सीएआर-एनके कोशिकाओं के पोस्ट-ट्रांसडक्शन को इंगित करता है। (बी) रेट्रोवायरस पैकेजिंग सिस्टम का उपयोग करके सीएआर-एनके कोशिकाओं की पारगमन दक्षता को दर्शाने वाले प्रतिनिधि डॉट प्लॉट। कोशिकाओं को फ्लो साइटोमेट्री के लिए एंटी-सीडी 56, एंटी-सीडी 3, और एंटी-एचआईजीजी (एच + एल) एफ (एबी') 2 से दाग दिया गया था। (ग) 18वें दिन सीडी56+सीडी3-, सीडी56-सीडी3+, सीडी56+सीडी3+, और सीडी56-सीडी3-सहित विभिन्न उपसमुच्चयों में सीएआर अभिव्यक्ति को दर्शाने वाले प्रतिनिधि डॉट प्लॉट। कोशिकाओं को फ्लो साइटोमेट्री के लिए एंटी-सीडी 56, एंटी-सीडी 3, और एंटी-एचआईजीजी (एच + एल) एफ (एबी') 2 (सीएआर अभिव्यक्ति का संकेत) के साथ दाग दिया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

नैदानिक परीक्षणों में वर्तमान सीएआर-एनके उत्पादों में से अधिकांश एनके सेल लाइन17 का उपयोग करते हैं, जैसे एनके -92, गैर-हॉजकिन के लिम्फोमा रोगी18 से अलग एक सेल लाइन, एनके -92एमआई, आईएल -2 स्वतंत्र एनके -92 सेल लाइन 19, और एनकेएल, एक बड़े दानेदार लिम्फोसाइट रोगी20 से अलग, क्योंकि ये सेल लाइनें आसानी से 'ऑफ-द-शेल्फ' उत्पादों के लिए प्रोलिफेरेटिव हैं। हालांकि, इन सेल लाइनों, जैसे, एनके -92 कोशिकाओं में मामूली नैदानिक प्रभाव और विवो विस्तार होता है, क्योंकि उन्हें जलसेक से पहले विकिरण की आवश्यकता होती है, इस प्रकार विवो21 में उनके प्रसार और साइटोटॉक्सिसिटी को सीमित किया जाता है। इन कारणों को देखते हुए, वर्तमान में परिधीय रक्त, सीबी, अस्थि मज्जा (बीएम), मानव भ्रूण स्टेम सेल (एचएससी), प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी), और ट्यूमरऊतक21,22,23 सहित कई स्रोतों से प्राथमिक एनके कोशिकाओं का विस्तार करने के लिए विभिन्न रणनीतियों का पता लगाया जा रहा है। उदाहरण के लिए, एनके कोशिकाओं को आईएल -15, आईएल -18 और आईएल -21 सहित इंटरल्यूकिन का उपयोग करके विवो में विस्तारित किया जा सकता है। लिम्फोब्लास्टॉइड सेल लाइनें जैसे कि के 562 कोशिकाएं या एपस्टीन-बार वायरस-रूपांतरित लिम्फोब्लास्टोइड सेल लाइनें जैसे कि 721.221 कोशिकाएं, एनके सेल विस्तार16 के लिए भी उपयोग की जाती हैं। हालांकि, उपरोक्त रणनीतियां अक्सर सीएआर-एनके इम्यूनोथेरेपी22,24 के दत्तक हस्तांतरण के लिए एनके कोशिकाओं की अपर्याप्त संख्या उत्पन्न करती हैं। समस्या को हल करने में मदद करने के लिए, यहां अध्ययन आनुवंशिक रूप से संशोधित ईबीवी-रूपांतरित सेल लाइन, 221-एमआईएल -21 फीडर कोशिकाओं का उपयोग करके एक पूर्व विवो एनके सेल विस्तार के लिए एक प्रोटोकॉल दिखाता है।

इस प्रोटोकॉल में दिखाए गए 221-एमआईएल -21 फीडर कोशिकाओं का उपयोग करके विस्तार पद्धति को अन्य ल्यूकेमिया सेल लाइनों की तुलना में कम से कम 10 से 100 गुना अधिक विस्तार दर के साथ एनके कोशिकाओं का विस्तार करने के लिए अनुकूलित किया गया है, जिसमें एचएल -60 और ओसीएल-एएमएल 3 झिल्ली आईएल -21, के 562 और के 652-एमआईएल 21 को व्यक्त करते हुए ओएक्स 40 लिगैंड 22,24,25 व्यक्त करते हैं। सीएआर अभिव्यक्ति का मूल्यांकन लगभग 2 सप्ताह के लिए भी किया जाता है। इससे भी महत्वपूर्ण बात यह है कि प्रारंभिक एनके संवर्धन चरण के बिना, 221-एमआईएल -21 फीडर सेल विस्तार रणनीति को विभिन्न स्रोतों से एनके कोशिकाओं का विस्तार करने के लिए लागू किया जा सकता है, जिसमें पीबीएमसी, सीबी और यकृत जैसे ठोस अंग शामिल हैं। यद्यपि 221-एमआईएल -21 फीडर सिस्टम उपरोक्त फीडर सेल लाइनों के रूप में दाता-निर्भर नहीं है, यह दाताओं से पूरी तरह से स्वतंत्र नहीं है। औसतन, 221-एमआईएल -21 विस्तार प्रणाली उच्च एनके सेल संख्या के साथ एनके सेल शुद्धता का 90% प्राप्त कर सकती है, जिसमें विस्तार के बाद 14 वें दिन लगभग <5% टी सेल संदूषण होता है। इसलिए, टी सेल संदूषण की संभावनाओं को खत्म करने के लिए, एक्स विवो विस्तार से पहले प्राप्त नमूनों से एनके कोशिकाओं को अलग करना या एक्स विवो विस्तार के बाद टी कोशिकाओं को खत्म करने के लिए सीडी 3 + चयन प्रणाली का उपयोग करना आवश्यक है।

एनके सेल विस्तार प्रणाली का उपयोग करने में आलोचनाओं में से एक यह है कि फीडर कोशिकाओं को विस्तार के बाद या आधान से पहले पूरी तरह से समाप्त नहीं किया जा सकता है, जिसमें महत्वपूर्ण नियामक चिंताएं हो सकती हैं; इसलिए, आधान से पहले फीडर कोशिकाओं का पूर्ण उन्मूलन महत्वपूर्ण है। हालांकि, हाल ही में सीएआर-एनके नैदानिक परीक्षण जिसमें के562-एमआईएल 21-4-1 बीबीएल फीडर कोशिकाओं का उपयोग एक्स विवो सीबीएनके सेल विस्तार24,25 के लिए किया गया था, ने कोई संबंधित जटिलता नहीं दिखाई। इसके अलावा, हमारे प्रारंभिक आंकड़ों ने विस्तार की प्रगति के रूप में विकिरणित 221-एमआईएल -21 आबादी की क्रमिक कमी दिखाई (डेटा नहीं दिखाया गया)। हालांकि, नैदानिक सेटिंग में इस विस्तार पद्धति को लागू करने के लिए अधिक व्यापक अध्ययन की आवश्यकता है। सामूहिक रूप से, 221-एमआईएल -21 विस्तार प्रणाली प्राथमिक सीएआर-एनके कोशिकाओं के विस्तार की चुनौती को हल करने में मदद करती है, और इसलिए निकट भविष्य में सीएआर-एनके सेल-आधारित इम्यूनोथेरेपी के व्यापक उपयोग में महत्वपूर्ण योगदान देगी।

Disclosures

लेखक ों ने कोई प्रतिस्पर्धी हित घोषित नहीं किया है।

Acknowledgments

हम पांडुलिपियों पर उनकी टिप्पणियों के लिए लियू प्रयोगशाला के सदस्यों (डॉ सियांग-ची त्सेंग, डॉ शुएनिंग वांग और डॉ चिह-सिउंग चेन) को धन्यवाद देना चाहते हैं। हम एसएफजी वैक्टर के लिए डॉ जियानपिएट्रो डोट्टी और 721.221 कोशिकाओं के लिए डॉ एरिक लॉन्ग को धन्यवाद देना चाहते हैं। इस काम को HL125018 (D. Liu), AI124769 (D. Liu), AI129594 (D. Liu), AI130197 (D. Liu), और रटगर्स-हेल्थ एडवांस फंडिंग (NIH REACH प्रोग्राम), U01HL150852 (R. Panettieri, S. Libutti, and R. Pasqualini), S10OD025182 (D. Liu) और रटगर्स यूनिवर्सिटी-न्यू स्कूल के लिए फंडिंग से समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mm surface treated sterile tissue culture dishes VWR 10062-880 For transfection
293T cells ATCC CRL-3216 For transfection
6-well G-REX plate Wilson Wolf 80240M For NK cell expansion
AF647-conjugated AffiniPure F(ab')2 fragment goat anti-human IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 109-606-088 For flow cytometry
CAR construct in SFG vector Generated in Dr. Dongfang Liu's lab For transfection
Collagenase IV Sigma C4-22-1G For TILs isolation
Cryopreserve media
Ingredient: Fetal Bovine Serum (FBS)		 Corning 35-010-CV 90%
Cryopreserve media
Ingredient: Dimethyl sulfoxide (DMSO)		 Sigma D2050 10%
D-10 media
Ingredient: DMEM		 VWR 45000-304
D-10 media
Ingredient: Fetal Bovine Serum (FBS)		 Corning 35-010-CV 10%
D-10 media
Ingredient: Penicillin Streptomycin		 VWR 45000-652 1%
FastFlow & Low Binding Millipore Express PES Membrane Millex SLHPR33RB For transduction
Genejuice transfection reagent VWR 80611-356 For transfection
gentleMACS C-tubes Miltenyi Biotec 130-093-237 For TILs isolation
gentleMACS Octo Miltenyi Biotec Quote For TILs isolation
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS - w/o calcium or magnesium) ThermoFisher 14170120 For TILs isolation
Human IL-15 Peprotech 200-15 For NK cell expansion
Human IL-2 Peprotech 200-02 For NK cell expansion
Irradiated 221-mIL21 feeder cells Generated in Dr. Dongfang Liu's lab Frozen in cryopreserve media
Lymphocyte Separation Media Corning 25-072-CV For TILs isolation
OPTI-MEM ThermoFisher 31895 For transfection
PE anti-human CD3 clone HIT3a Biolegend 300308 For flow cytometry
PE/Cy7 anti-human CD56 (NCAM) clone 5.1H11 BioLegend 362509 For flow cytometry
Pegpam3 plasmid Generated in Dr. Dongfang Liu's lab For transfection
Percoll GE Healthcare 17089101 For TILs isolation
Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) New York Blood Center Isolated from plasma of healthy donors, frozen in cryopreserve media
Phosphate Buffer Saline (PBS) Corning 21-040-CV For transduction
pRDF plasmid Generated in Dr. Dongfang Liu's lab For transfection
R-10 media
Ingredients: RPMI 1640		 VWR 45000-404
R-10 media
Ingredient: L-glutamine		 VWR 45000-304 1%
R-10 media
Ingredient: Penicillin Streptomycin		 VWR 45000-652 1%
R-10 media
Ingredient: Fetal Bovine Serum (FBS)		 Corning 35-010-CV 10%
Retronectin Generated in Dr. Dongfang Liu's lab home-made For transduction
Trypan Blue Corning 25-900-Cl For cell counting
Untreated 24-well plate Fisher Scientific 13-690-071 For transduction

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Van Acker, H. H., et al. CD56 in the immune system: More than a marker for cytotoxicity. Frontiers in Immunology. 8, 892 (2017).
  2. Caligiuri, M. A. Human natural killer cells. Blood. 112 (3), 461-469 (2008).
  3. Shimizu, Y., et al. Transfer and expression of three cloned human non-HLA-A,B,C class I major histocompatibility complex genes in mutant lymphoblastoid cells. Proceedings of the Nationall Academy of Sciences of the United States of America. 85 (1), 227-231 (1988).
  4. Wu, J., Lanier, L. L. Natural killer cells and cancer. Advances in Cancer Research. 90, 127-156 (2003).
  5. Liu, E., et al. Use of CAR-transduced natural killer cells in CD19-positive lymphoid tumors. The New England Journal of Medicine. 382 (6), 545-553 (2020).
  6. Alonso-Camino, V., et al. Efficacy and toxicity management of CAR-T-cell immunotherapy: a matter of responsiveness control or tumour-specificity. Biochemical Society Transactions. 44 (2), 406-411 (2016).
  7. Bonifant, C. L., Jackson, H. J., Brentjens, R. J., Curran, K. J. Toxicity and management in CAR T-cell therapy. Molecular Therapy Oncolytics. 3, 16011 (2016).
  8. Kalaitsidou, M., Kueberuwa, G., Schitt, A., Gilham, D. E. CAR T-cell therapy: toxicity and the relevance of preclinical models. Immunotherapy. 7 (5), 487-497 (2015).
  9. Gust, J., et al. Endothelial activation and blood-brain barrier disruption in neurotoxicity after adoptive immunotherapy with CD19 CAR-T cells. Cancer Discovery. 7 (12), 1404-1419 (2017).
  10. Hay, K. A., et al. Kinetics and biomarkers of severe cytokine release syndrome after CD19 chimeric antigen receptor-modified T-cell therapy. Blood. 130 (21), 2295-2306 (2017).
  11. Zhang, Y., et al. In vivo kinetics of human natural killer cells: the effects of ageing and acute and chronic viral infection. Immunology. 121 (2), 258-265 (2007).
  12. Vidard, L., et al. CD137 (4-1BB) Engagement fine-tunes synergistic IL-15- and IL-21-driven nk cell proliferation. Journal of Immunology. 203 (3), Baltimore, Md. 676-685 (2019).
  13. Venkatasubramanian, S., et al. IL-21-dependent expansion of memory-like NK cells enhances protective immune responses against Mycobacterium tuberculosis. Mucosal Immunology. 10 (4), 1031-1042 (2017).
  14. Ojo, E. O., et al. Membrane bound IL-21 based NK cell feeder cells drive robust expansion and metabolic activation of NK cells. Scientific Reports. 9 (1), 14916 (2019).
  15. Denman, C. J., et al. Membrane-bound IL-21 promotes sustained ex vivo proliferation of human natural killer cells. PLoS One. 7 (1), 30264 (2012).
  16. Yang, Y., et al. Superior expansion and cytotoxicity of human primary NK and CAR-NK cells from various sources via enriched metabolic pathways. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 18, 428-445 (2020).
  17. Liu, S., et al. NK cell-based cancer immunotherapy: from basic biology to clinical development. Journal of Hematology & Oncology. 14 (1), 7 (2021).
  18. Gong, J. H., Maki, G., Klingemann, H. G. Characterization of a human cell-line (Nk-92) with phenotypical and functional-characteristics of activated natural-killer-cells. Leukemia. 8 (4), 652-658 (1994).
  19. Tam, Y. K., et al. Characterization of genetically altered, interleukin 2-independent natural killer cell lines suitable for adoptive cellular immunotherapy. Human Gene Therapy. 10 (8), 1359-1373 (1999).
  20. Robertson, M. J., et al. Characterization of a cell line, NKL, derived from an aggressive human natural killer cell leukemia. Experimental Hematology. 24 (3), 406-415 (1996).
  21. Hu, Y., Tian, Z. G., Zhang, C. Chimeric antigen receptor (CAR)-transduced natural killer cells in tumor immunotherapy. Acta Pharmacologica Sinica. 39 (2), 167-176 (2018).
  22. Tseng, H. C., et al. Efficacy of anti-CD147 chimeric antigen receptors targeting hepatocellular carcinoma. Nature Communications. 11 (1), 4810 (2020).
  23. Easom, N. J. W., et al. IL-15 overcomes hepatocellular carcinoma-induced NK cell dysfunction. Frontiers in Immunology. 9, 1009 (2018).
  24. Granzin, M., et al. Highly efficient IL-21 and feeder cell-driven ex vivo expansion of human NK cells with therapeutic activity in a xenograft mouse model of melanoma. Oncoimmunology. 5 (9), 1219007 (2016).
  25. Liu, E. L., et al. Cord blood derived natural killer cells engineered with a chimeric antigen receptor targeting CD19 and expressing IL-15 have long term persistence and exert potent anti-leukemia activity. Blood. 126 (23), (2015).

Tags

कैंसर अनुसंधान अंक 180
मेम्ब्रेन बाउंड-आईएल-21-मॉडिफाइड बी सेल लाइन का उपयोग करके प्राकृतिक हत्यारा (एनके) और सीएआर-एनके सेल विस्तार विधि
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ma, M., Badeti, S., Kim, J. K., Liu, … More

Ma, M., Badeti, S., Kim, J. K., Liu, D. Natural Killer (NK) and CAR-NK Cell Expansion Method using Membrane Bound-IL-21-Modified B Cell Line. J. Vis. Exp. (180), e62336, doi:10.3791/62336 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter