Summary
Dieses Protokoll beschreibt das Verfahren zur Entfernung des Bauchlappens der Leber bei erwachsenen Zebrafischen, um die Untersuchung der Leberregeneration zu ermöglichen.
Abstract
Leberversagen ist eine der weltweit führenden Todesursachen, und die Sterblichkeit durch chronische Lebererkrankungen steigt in den Vereinigten Staaten stark an. Gesunde Lebern sind in der Lage, sich von toxischen Schäden zu regenerieren, aber bei fortgeschrittenen Lebererkrankungen ist die natürliche Regenerationsfähigkeit der Leber beeinträchtigt. Zebrafische haben sich als leistungsfähiges experimentelles System zur Untersuchung der Regeneration herausgestellt. Sie sind ein ideales Modell für die Untersuchung der Leberregeneration aus der partiellen Hepatektomie, einem Verfahren mit direkter klinischer Relevanz, bei dem ein Teil der Leber operativ entfernt wird, wobei der Rest intakt bleibt. Es gibt kein Standardprotokoll für die partielle Hepatektomie; Frühere Studien, die dieses Modell verwendeten, verwendeten leicht unterschiedliche Protokolle und berichteten über unterschiedliche Ergebnisse. Hier wird ein effizientes, reproduzierbares Protokoll zur Durchführung einer partiellen Hepatektomie bei erwachsenen Zebrafischen beschrieben. Mit dieser Technik zeigen wir, dass Zebrafische in der Lage sind, den resezierten Lappen epimorph zu regenerieren. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um die Mechanismen, die für die Leberregeneration bei Zebrafischen erforderlich sind, weiter zu untersuchen.
Introduction
Unter den festen Organen beim Menschen ist die Leber das einzige Regenerationsorgan1. Dies ist von entscheidender Bedeutung, da die Leber ein essentielles Organ ist, das für wichtige Stoffwechselfunktionen, Energiespeicherung, Blutentgiftung, Sekretion von Plasmaproteinen und Gallenproduktion verantwortlich ist2. Hepatozyten, die durch toxische oder entzündliche Schäden verloren gehen, werden in erster Linie durch Teilung der verbleibenden Hepatozyten ersetzt1. Ein klassisches experimentelles Modell zur Untersuchung der Leberregeneration ist die partielle Hepatektomie, bei der einzelne Leberlappen entfernt werden, wobei die verbleibenden Lappen intaktbleiben 3. Dieses Verfahren wurde ursprünglich bei Ratten entwickelt, bei denen etwa zwei Drittel der Lebermasse entfernt werden. Nach partieller Hepatektomie bei Säugetieren erfolgt eine kompensatorische Regeneration in den verbleibenden Lappen, bis die Leber ihre Ursprüngliche Masse wiedererlangt hat. Bemerkenswerterweise ersetzt die Säugetierleber nicht die fehlenden Lappen.
Zebrafische (Danio rerio) stellen ein handhabbares Modell zur Untersuchung der Erwachsenenorganregenerationdar 4. Die Zebrafischleber unterscheidet sich zwar strukturell von der Säugetierleber, besteht jedoch aus den gleichen Zelltypen und erfüllt die gleiche Funktion wie bei Säugetieren2. Es besteht aus drei Lappen mit zwei Rückenlappen und einem einzigen Bauchlappen, die entlang des Darms abgeflacht sind. Eine partielle Häpatektomie wurde zuvor bei Zebrafischen durchgeführt, mit widersprüchlichen Berichten über die genaue Art der Regeneration. Typischerweise wird eine ein Drittel partielle Häpatektomie durch Entfernung des gesamten Ventrallappens durchgeführt. Erste Berichte deuteten darauf hin, dass der Ventrallappen nach Entfernung innerhalb einer Woche vollständig regeneriert wurde5,6,7, was darauf hindeutet, dass die Zebrafischleber im Gegensatz zur Säugetierleber zu einer epimorphen Regeneration fähig ist. Nachfolgende Studien zeigten, dass die Entfernung des Bauchlappens zu einer kompensatorischen Regeneration in den Rückenlappen führte, anstatt zur Regeneration des fehlenden Bauchlappens und schließlich zur Wiederherstellung der Lebermasse innerhalb einer Woche8,9. Die transkriptomische Profilierung der Rückenlappen nach der Resektion des Bauchlappens ergab signifikante Veränderungen im Zusammenhang mit der kompensatorischen Regeneration10. Angesichts der Tatsache, dass die Art der Leberregeneration mit dem Ausmaß der Verletzung variieren kann8, spekulierten wir, dass die Diskrepanzen in den Ergebnissen auf technische Unterschiede im partiellen Hepatektomie-Protokoll zwischen forschungsgruppen zurückzuführen sein könnten.
Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Durchführung einer partiellen Hepatektomie bei erwachsenen Zebrafischen durch Entfernen des Bauchlappens. Diese Technik wird für die Beurteilung der Mechanismen der Leberregeneration wertvoll sein.
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Protocol
Zebrafische wurden nach Standardverfahren gezüchtet und gezüchtet. Die Experimente wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee des Brigham and Women's Hospital genehmigt (2016N000405). Erwachsene Zebrafische wurden vor Beginn des Protokolls 24 Stunden lang gefastet. Systemwasser bezieht sich auf das Wasser in Zebrafisch-Haltungsbecken in der Wasseranlage.
1. Vorbereitung und Betäubung
- Bereiten Sie 0,016% ige Tricainlösung in Systemwasser vor.
VORSICHT: Tricain ist ein Reizstoff, wenn es mit den Augen, der Haut oder den Atemwegen in Kontakt kommt. - Bereiten Sie einen Schwamm vor, um betäubte Zebrafische während des Sezierprotokolls zu halten. Einen vollen Schwamm in Viertel schneiden. Entfernen Sie mit einer Rasierklinge einen dünnen Schwammkeil, der parallel zur langen Achse des Schwammviertels verläuft.
- Der Schlitz sollte lang genug sein, um einen erwachsenen Fisch aufzunehmen (dies variiert zwischen verschiedenen Fischgrößen). Zum Beispiel sollte für einen erwachsenen Fisch mit einer Länge von 35 mm die Länge des Schlitzes 20 mm beträgen. Kopf und Körper werden eng im Schwamm gehalten, der Schwanz verläuft jedoch am Rand des Schwammes vorbei (Abbildung 1B).
- Den Schwamm in 0,016% igen Tricainlösung einweichen.
- Erwachsene Zebrafische (entweder männlich oder weiblich) in 625 ml 0,016% Tricainlösung geben.
- Inkubieren Sie für 6 Minuten oder bis der Fisch nicht mehr ansprechbar ist.
- Entfernen Sie den Fisch vorsichtig mit einer Zette aus dem Tricainbecken und legen Sie die Ventralseite des Fisches nach oben in die Rille des Schwamms (Abbildung 1A - B).
- Legen Sie den Schwamm unter ein Seziermikroskop mit Top-Down-Beleuchtung.
2. Chirurgie
- Mit einer feinen Zette die Haut einklemmen und medial skalieren, nur hinter dem Herzen (Abbildung 1B).
- Machen Sie mit einer federbelasteten Schere einen Schnitt unter der Zette, um ein Loch in der Körperhöhle zu erzeugen (Abbildung 1C - D). Achten Sie darauf, das Herz oder ein großes Blutgefäß nicht zu verletzen, da dies zu einer erhöhten Mortalität führt.
- Machen Sie mit einer federbelasteten Schere einen 3-4 mm-Schnitt entlang des Bauches, der nachträglich bearbeitet wird, bis der Schnitt an den Beckenflossen ankommt (Abbildung 1D - E). Zu diesem Zeitpunkt kann der Bauchlappen der Leber durch den Schnitt sichtbar sein.
- Drücken Sie die Seiten des Schwammes mit einer Hand zusammen, um die viszeralen Organe aus der Körperhöhle zu drücken. Der Bauchlappen der Leber ist oben im Darm sichtbar (Abbildungen 1F, 2A-B). Die Leber erscheint als rosa oder orange Struktur, die über den goldbraunen Darm verteilt ist. Tiere, die als Scheinkontrollen bezeichnet werden, werden an dieser Stelle geborgen.
- Drücken Sie die feine Zette so zusammen, dass sich die beiden Zinken berühren. Während Sie den Druck auf den Schwamm halten, schieben Sie die Zinken der feinen Zette zwischen Leber und Darm (Abbildung 1G). Achten Sie darauf, den Darm nicht zu punktieren, da dies zu einer erhöhten Mortalität führt.
- Den Druck auf die Zette langsam lockern, so dass sich die Zinken voneinander entfernen (Abbildung 1H). Diese Gleitwirkung durchtrennt die zahlreichen Pfortaderbefestigungen zwischen Bauchlappen und Darm (Abbildung 2B) und ist notwendig, um den Ventrallappen sauber zu entfernen. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis alle Portalverbindungen zwischen Leber und Darm getrennt wurden.
- Schälen Sie den Bauchlappen mit einer feinen Zette aus dem Darm zurück und schneiden Sie den Bauchlappen frei vom Rest der Leber (Abbildung 1I).
- Dieses Verfahren führt zu einer drittelpartiellen Hepatektomie (Abbildung 1J).
3. Wiederherstellung
- Entfernen Sie den Fisch vorsichtig aus dem Schwamm und legen Sie ihn in einen Tank mit Systemwasser.
- Pipetten Sie das Wasser für einige Minuten über die Kiemen, bis der Fisch von selbst schwimmt (Abbildung 1K).
- Überwachen Sie Fische für 2-4 Stunden, bevor Sie sie wieder auf das System legen. Füttern Sie den Fisch nicht für volle 24 Stunden nach der Operation.
- Überwachen Sie Fische täglich für die Dauer des Experiments.
- Mit der Zeit heilt der Schnitt in der Körperwand auf natürliche Weise, ohne dass Nähte erforderlich sind (Abbildung 1L, 2C).
4. Analyse der Bauchlappenlänge im Darm
- Euthanasieren Sie alle Tiere, die für die Analyse bestimmt sind, für 10 Minuten in Eiswasser, bis alle operkulären Bewegungen aufhören.
- Entfernen Sie den Fisch aus dem Eiswasser und legen Sie ihn mit der ventralen Seite nach oben in die Rille eines Schwammes.
- Machen Sie mit einer federbelasteten Schere einen Schnitt in die ventrale Körperwand an der vorderen-hinteren Position des Herzens. Machen Sie dann zwei weitere Schnitte, die entlang der vorderen hinteren Achse vom ersten Schnitt bis zu den Beckenflossen verlaufen. (Abbildung 2A).
- Schälen Sie die Haut und den Muskel zurück, um die viszeralen Organe freizulegen (Abbildung 2A).
- Erfassen Sie Hellfeld- und Fluoreszenzbilder der viszeralen Organe mit einem Epifluoreszenzmikroskop. Dieses Sichtfeld umfasst den Bereich, in dem der Bauchlappen reseziert wurde. Da Tiere vor der Analyse eingeschläfert werden, schließt diese Art der Analyse eine langfristige Bildgebung desselben Fisches aus.
5. Analyse des Leber-Körpergewichts-Verhältnisses
- Euthanasieren Sie alle Tiere, die für die Analyse bestimmt sind, für 10 Minuten in Eiswasser, bis alle operkulären Bewegungen aufhören.
- Fisch in ein 50 ml konisches Rohr geben.
- 25 ml 4% Paraformaldehyd in 1x PBS und 0,3% Tween in das Röhrchen geben.
ACHTUNG: Formaldehyd ist giftig, und formaldehydhaltige Lösungen sollten immer in einer chemischen Haube verarbeitet werden. - 48 h bei 4 °C nutatetieren.
- Führen Sie vier 10-minütige Wäschen in 1x PBS und 0,3% Tween durch.
- Holen Sie Fische mit einer Zette und trocknen Sie sie auf einem Papiertuch ab.
- Notieren Sie das Gewicht des gesamten Fisches.
- Machen Sie mit einer federbelasteten Schere einen Schnitt in die ventrale Körperwand an der vorderen-hinteren Position des Herzens. Machen Sie dann zwei weitere Schnitte, die entlang der vorderen hinteren Achse vom ersten Schnitt bis zu den Beckenflossen verlaufen. (Abbildung 2A).
- Schälen Sie die Haut und den Muskel zurück, um die viszeralen Organe freizulegen (Abbildung 2A).
- Erfassen Sie Hellfeldbilder der Leber mit einem Epifluoreszenzmikroskop.
- Sezieren Sie die Leber und legen Sie die Leberstücke auf ein Wiegeboot.
- Notieren Sie das Gewicht der Leber.
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Representative Results
Um das regenerative Potenzial der erwachsenen Zebrafischleber zu untersuchen, haben wir eine partielle Hepatektomie (PHX) bei erwachsenen Zebrafischen durchgeführt. Im Allgemeinen wurden große Erwachsene (30-40 mm Länge) ausgewählt, die zwischen 1,5 und 2,5 Jahre alt waren. In einzelnen Experimenten wurden Tiere aus demselben Tank ausgewählt und auf Alter und Größe abgestimmt. Als angemessene Kontrolle verwendeten wir Scheinoperationen, bei denen das Tier sowohl betäubt wurde als auch einen großen Schnitt in der ventralen Körperwand erhielt, aber ohne Gewebe entfernt wurde. Die Überlebensraten für Scheinkontrollen lagen zwischen 90% und 100% für männliche und weibliche Zebrafische. Die Überlebensraten für PHX-Tiere lagen zwischen 60% und 75% für männliche Zebrafische und 60% -90% für weibliche Zebrafische, wobei alle Todesfälle in den ersten 24 Stunden nach der Operation auftraten.
Der Goldstandard für die Quantifizierung der Erholung der Leber nach PHX ist das Verhältnis von Leber zu Körpergewicht oder LBR. Dieser Assay wurde sowohl für die Messung der Lebermassenrückgewinnung in Säugetier-11- als auch in Zebrafischmodellen8verwendet. Um das Gewicht der Leber zuverlässig zu quantifizieren, haben wir Gewichtsmessungen an festen Tieren durchgeführt, wie zuvor beschrieben8. Wir führten LBR-Messungen an wildtypischen, unverletzten Zebrafischen durch und stellten fest, dass, wie bereits berichtet8,weibliche Zebrafische im Vergleich zu männlichen Zebrafischen fast doppelt so viel LBR aufwiesen (3,3% für weibliche Zebrafische und 1,8% für männliche Zebrafische)(Abbildung 3A). Wir führten sowohl Sham- als auch PHX an erwachsenen Zebrafischen beiderlei Geschlechts durch und analysierten die LBR 0 und 7 Tage nach der Verletzung (dpi) (Abbildung 3B). Bei 0 dpi hatten Scheintiere einen deutlich sichtbaren Bauchlappen, während bei PHX-Tieren der Ventrallappen vollständig fehlte (Abbildung 3C). Dies führte insbesondere zu einer signifikanten Verringerung der LBR (30% Reduktion bei männlichen Fischen, 20% Reduktion bei weiblichen Fischen) (Abbildung 3D). In der Kohorte von Fischen, die mit 7 dpi analysiert wurden, fanden wir heraus, dass sich der Ventrallappen nicht regeneriert hatte (Abbildung 3E), und dennoch waren die LBR von PHX- und Scheinkontrollen vergleichbar (Abbildung 3F). Diese Messungen deuten darauf hin, dass die Leber um 7 dpi im Vergleich zu Scheinkontrollen an Masse zurückgewonnen ist, vermutlich durch kompensatorische Regeneration in den Rückenlappen, in Übereinstimmung mit früheren Berichten8,9.
Wir beschlossen zu untersuchen, ob der Bauchlappen der Leber bei ausreichender Zeit regenerationsfähig war. Erwachsene Tg(fabp10a:CFP-NTR) Fische wurden für Experimente ausgewählt, da diese Fische CFP in Hepatozyten exprimieren, was die Visualisierung der Leber mittels Fluoreszenzmikroskopie ermöglicht. Eine Kohorte von Tieren wurde dem vollständigen Drittel der partiellen Hepatektomie unterzogen. Die Tiere wurden mit 1 oder 36 dpi analysiert (Abbildung 4A). Für jedes Tier wurde das Verhältnis der Ventrallappenlänge zum Darm gemessen (Abbildung 4B).
Tiere, die Scheinoperationen unterzogen wurden, hatten einen prominenten Bauchlappen, der 50% -100% der Darmlänge einnutzte, während Tiere, die einer partiellen Hepatektomie unterzogen wurden, einen stark reduzierten Ventrallappen aufwiesen. Auffallend ist, dass viele partielle Hepatektomietiere bei 36 dpi ein erhöhtes Ventrallappen-Darm-Verhältnis im Vergleich zu partiellen Hepatektomietieren bei 1 dpi aufwies (Abbildung 4C). Es gab keine Zunahme der Größe des Ventrallappens bei Scheinkontrollen; nach Erholung von partieller Hepatektomie wurde jedoch eine statistisch signifikante Zunahme der Größe des Ventrallappens beobachtet (Abbildung 4D). Wir stellten fest, dass es eine große Variation in der Reaktion auf die Operation gab, wobei einige Tiere keine Regeneration zeigten und andere eindeutig einen gut definierten Ventrallappen regenerierten (Abbildung 4E). Diese Ergebnisse zeigen, dass der Bauchlappen in der Lage ist, sich aus der chirurgischen Leberresektion bei erwachsenen Zebrafischen zu regenerieren. Zusammengenommen zeigt unsere Arbeit, dass die Zebrafischleber sowohl epimorphe als auch kompensatorische Regeneration kann.
Abbildung 1: Das partielle Hepatektomie-Protokoll. (A) Diagramm eines erwachsenen Zebrafisches, wobei die vordere-posteriore und die dorsal-ventrale Achse notiert sind. (B) Nach der Betäubung wird ein Tier in einen Schwamm (blau dargestellt) eingebettet, so dass es ventral mit der Seite nach oben ist. Feine Zinnen werden verwendet, um die Haut nur nach dem Herzen zu kneifen. Der Schwamm wird in den nachfolgenden Panels aus Gründen der Übersichtlichkeit nicht gezeigt. (C) Scheren werden verwendet, um die Haut nur hinter dem Herzen zu brechen. (D-E) Die Schere wird an der nun offenen Wunde verwendet, um einen 3-4 mm Schnitt von vorne nach hinter zu machen, der kurz vor den Beckenflossen endet. (F) Das Zusammendrücken der Seiten des Schwamms bewirkt, dass die viszeralen Organe aus der größeren Wunde herausspringen. (G) Feine Zinnen mit beiden Zinken berühren werden zwischen dem Bauchlappen der Leber und dem Darm geschoben. (H) Die Zinnen sind entspannt, wodurch sie die Pfortaderbefestigungen zwischen Leber und Darm brechen. Dieser Vorgang wiederholt sich entlang der Länge des Bauchlappens. (I-J) Der Bauchlappen wird von seinem hinteren Ende nach oben gezogen, während die Schere verwendet wird, um den Bauchlappen vom Rest der Leber zu trennen. (K) Das Tier wird in eine Aufwachkammer mit Systemwasser gebracht, wo es das Bewusstsein und die Rechte wiedererlangt. (L) Mit der Zeit werden die Eingeweide wieder in die Körperhöhle gezogen und die Wunde heilt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Anatomie des Zebrafisches und Erholung von der partiellen Hepatektomie. (A) Zur Analyse der viszeralen Organe werden die Tiere eingeschläfert und mit der ventralen Seite nach oben auf einen Schwamm gelegt. Zunächst wird ein Schnitt an der vorderen-hinteren Position des Herzens (rote Linie) durchgeführt. Dann werden zwei Schnitte erzeugt, die entlang der vorderen hinteren Achse zu den Beckenflossen verlaufen (blaue Linie). Dann werden die Haut und die Muskeln zurückgeschält und die viszeralen Organe frei. Markiert sind der Darm, der Bauchlappen der Leber und die zentrale Vene in diesem Lappen. (B) Live-Bild einer ventralen Ansicht eines Zebrafisches, der für die Analyse der viszeralen Organe vorbereitet wurde. Der Bauchlappen der Leber ist mit einer gepunkteten weißen Linie umrandet. Das gelbe Feld im 2x-Bild zeigt den Speicherort des 8x-Bildes an. Weiße Pfeilspitzen weisen auf Pfortaderverbindungen zwischen Darm und Leber hin. (C) Ventrale Ansicht der durch die partielle Hepatektomie erzeugten Wunde zu den angegebenen Zeitpunkten. Mit der Zeit heilt der Schnitt vollständig. Skalenstäbe, 500 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Kompensatorische Regeneration nach partieller Hepatektomie. (A) Leber-Körpergewicht (LBR) Verhältnisse wurden für wildartige, unverletzte Zebrafische gemessen. Weibliche Zebrafische haben fast doppelt so viel LBR wie männliche Zebrafische. Weibliche Tiere wurden mit männlichen Tieren mit einem Wilcoxon-Rangsummentest verglichen, ****p < 0,0001. (B) Schematische Darstellung, aus der hervorgeht, dass für dieses Experiment Wildtyp-Zebrafische verwendet wurden. Die Tiere wurden einer Schein- oder partiellen Hepatektomie (PHX) unterzogen und dann entweder 0 oder 7 Tage nach der Verletzung (dpi) fixiert. Fixierte Tiere wurden abgebildet und LBR-Messungen unterzogen. (C,E) Gezeigt werden repräsentative Bilder von Tieren, die Schein- oder PHX bei 0 dpi (C) und 7 dpi (E) ausgesetzt sind. Beachten Sie das vollständige Fehlen der Ventrallappen bei PHX-Tieren. Für alle Bilder ist eine ventrale Ansicht der viszeralen Organe zu sehen. Bilder sind Hellfeldbilder. Der Bauchlappen der Leber ist weiß umrandet. Skalenstäbe, 500 μm. (D,F) Balkendiagramme des Leber-Körpergewichts-Verhältnisses für männliche und weibliche Zebrafische nach Schein- und PHX-Operationen bei 0 dpi (D) und 7 dpi (F). Die Höhe des Balkens ist der Mittelwert, und die Fehlerbalken stellen SEM dar. Während es nach partieller Hepatektomie bei 0 dpi eine Verringerung der LBR gibt, gibt es keinen signifikanten Unterschied zwischen PHX- und Scheintieren bei 7 dpi, was auf eine Wiederherstellung von LBR hinweist. Partielle Hepatektomieproben wurden mit Scheinkontrollen unter Verwendung eines Wilcoxon-Rangsummentests verglichen, ns = nicht signifikant, *p < 0,05, **p < 0,01. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Zebrafische können ihre Ventrallappen nach partieller Hepatektomie regenerieren. (A) Schematische Darstellung, die zeigt, dass Tg(fabp10a:CFP-NTR) für dieses Experiment verwendet wurden. Operation und Analyse durch Bildgebung wurden zu den angegebenen Zeitpunkten durchgeführt. (B) Ein Beispielbild, um zu zeigen, wie Tiere analysiert wurden. Die Tiere wurden quantifiziert, indem die Länge des Bauchlappens (in rot), die Länge des Darms (in gelb) und der Prozentsatz des Darms, den der Ventrallappen einnimmt (in weiß), gemessen wurden. (C) Gezeigt ist ein repräsentatives Bild von Tieren, die 1 und 36 Tage nach der Verletzung (dpi) einer Schein- oder teilhepatektomie (PHX) unterzogen wurden. (D) Violinplots des Verhältnisses von Ventrallappenlänge zu Darmlänge für Tiere, die einer Schein- oder Teilhepatektomie bei 1 und 36 dpi unterzogen wurden. Jeder Punkt stellt den Wert eines einzelnen Fisches dar. Werte für männliche Fische sind in blau, weibliche Fische in rot. Partielle Hepatektomieproben wurden mit Scheinkontrollen mit einem Wilcoxon-Rangsummentest verglichen, ns = nicht signifikant, *p < 0,05. (E) Gezeigt sind zwei Beispiele für partielle Hepatektomietiere mit 36 dpi, die sich nicht regenerierten, und zwei Beispiele, die sich regenerierten. Für alle Bilder ist eine ventrale Ansicht der viszeralen Organe zu sehen. Bilder sind eine Verschmelzung eines CFP-Fluoreszenzbildes und eines Hellfeldbildes. CFP-Fluoreszenz ist nur in der Leber vorhanden. Der Bauchlappen der Leber ist rot umrandet. Der Prozentsatz des Darms, den der Bauchlappen einnimmt, ist weiß. Skalenstäbe, 500 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Die anatomischen Unterschiede zwischen Zebrafisch- und Säugetiermodellen für die Leberregeneration stellen einzigartige Herausforderungen für die Leberresektion dar. Die Leber beim Zebrafisch befindet sich in unmittelbarer Nähe zum Herzen und zum Darm; Die versehentliche Schädigung beider Organe führt zu einer erhöhten Mortalität. Die Zebrafischleber ist nicht eingekapselt, was es schwieriger macht, sich vom Darm zu trennen. Die Leber erhält nährstoffreiches Blut aus dem Darm durch Pfortadern. Bei Säugetieren konvergieren Venen, die den Darm verlassen, auf einer primären Pfortader, die sich dann spaltet, wenn sie in die Leber eintritt12. Im Gegensatz dazu erhält die Zebrafischleber eine Portalzirkulation aus einer Reihe winziger Gefäße, die sich direkt vom Darm in die Leber bewegen (Abbildung 2B). So wird jeder Leberlappen, der über den Darm abgeflacht ist, durch diese Gefäße sicher mit dem Darm verbunden. Der Versuch, den Bauchlappen zu entfernen, ohne vorher die Pfortadern zu durchtrennen, kann oft zu einer unvollständigen Resektion führen (Daten nicht gezeigt). Einige der ersten Protokolle beschreiben das Herausziehen des Bauchlappens durch einen relativ kleinen Schnitt, der es nicht erlaubt, diese Portalansätze zu durchtrennen5,6.
Das hier beschriebene Protokoll wurde entwickelt, um diese Herausforderungen anzugehen, um eine konsistente Ventrallappenentfernung zu ermöglichen. Betäubte Zebrafische werden eng in die Feder des Schwamms gelegt, um ihre Kiemen nass und ihre Körper für die Dauer des Eingriffs unbeweglich zu halten. Das Einklemmen der Haut nur nach hinter dem Herzen ermöglicht es, einen Schnitt in die Haut zu legen, ohne eines der inneren Organe zu beschädigen. Das Öffnen eines großen (3-4 mm) Schnitts macht die Entfernung der Leber und die Beurteilung des Entfernungsgrades einfach (Abbildung 2C). Wichtig ist, dass sich Zebrafische von einer Wunde dieser Größe erholen und letztendlich heilen können, ohne dass ein primärer Wundverschluss vorn ist. Durch das Zusammendrücken des Schwamms und das Zusammendrücken der Körperwand werden die viszeralen Organe zugänglicher und es ist möglich, die Zinken einer Pinzette zwischen Leber und Darm zu schieben. Mit der Zwiesette können dann die Portalverbindungen zwischen Leber und Darm durchtrennt werden. Sobald dies erreicht ist, kann eine feine Zette verwendet werden, um den Bauchlappen zurückzuziehen, so dass er vom Rest der Leber getrennt werden kann.
Wir haben das Leber-Körpergewichts-Verhältnis (LBR) von Tieren gemessen, die Schein- und PHX-Operationen unterzogen wurden. Wir fanden heraus, dass der LBR von PHX-Tieren mit 7 dpi mit den Kontrollen vergleichbar war (Abbildung 3F). Da sich der Ventrallappen zu diesem Zeitpunkt noch nicht regeneriert hatte (Abbildung 3E), folgerten wir, dass die Regeneration durch Kompensation in den Rückenlappen erfolgte. Um der Frage nach nachzustellen, ob sich der Bauchlappen bei Zebrafischen letztendlich regenerieren kann, haben wir PHX durchgeführt und das Leberwachstum untersucht. Im Durchschnitt war das Verhältnis der Länge des Ventrallappens zum Darm mit 36 dpi höher als bei 1 dpi, was auf eine Regeneration des Ventrallappens hinweist (Abbildung 4C-D). Es gibt große Unterschiede in der Reaktion der Tiere auf die Verletzungen, wobei einige Tiere ein sehr geringes Wachstum und andere eine erhebliche Erholung des Ventrallappens erfahren (Abbildung 4E). Wir kommen zu dem Schluss, dass sich die Leber mit einer Mischung aus epimorpher Regeneration des Bauchlappens und kompensatorischer Regeneration in den Rückenlappen regenerieren kann, wenn auch auf unterschiedlichen Zeitskalen. Da frühere Studien partielle Hepatektomien verwendet haben, um die Rolle einzelner Gene5,7,9und der Signalwege 6 , 8,10 nach der Resektion zu bestimmen, erwarten wir, dass dieses Protokoll unser Verständnis der molekularen und zellulären Mechanismen der Leberregeneration beieinemerwachsenen Wirbeltier verbessern wird.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.
Acknowledgments
I.M.O. wird von der NIAAA (F32AA027135) unterstützt. W.G. wird von R01DK090311, R01DK105198, R24OD017870 und dem Claudia Adams Barr Program for Excellence in Cancer Research unterstützt. W.G. ist Pew Scholar in Biomedical Sciences.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% Paraformaldehyde Aqueous Solution, EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 15700 | |
| 50 mL Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile | Corning | 352098 | |
| AS 82/220.R2 PLUS Analytical Balance | Bay State Scale & Systems, INC. | WL-104-1051 | |
| Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| EMS Kuehne Coverglass/Specimen Forceps | Electron Microscopy Sciences | 72997-07 | |
| Epifluorescence microscope | Zeiss | Discovery.V8 | |
| Mastertop Cellulose Cleaning Scrub Sponge | Amazon | B07CBSM53Z | |
| PBS10X Liquid Conc 4L | EMD Millipore | 6505-4L | |
| Super Fine Micro Scissors, 3 1/4" straight | Biomedical Research Instruments | 11-1020 | |
| Tricaine methanesulfonate | Syndel | TRIC-M-GR-0010 | |
| Tween 20, Fisher BioReagents | Fischer Scientific | BP337-500 |
References
- Michalopoulos, G. K. Principles of liver regeneration and growth homeostasis. Comprehensive Physiology. 3, 485-513 (2013).
- Wang, S., Miller, S. R., Ober, E. A., Sadler, K. C. Making it new again: insight into liver development, regeneration, and disease from zebrafish research. Current Topics in Developmental Biology. 124, (2017).
- Michalopoulos, G. K., Bhushan, B. Liver regeneration: biological and pathological mechanisms and implications. Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology. , (2020).
- Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. The zebrafish as a model for complex tissue regeneration. Trends in Genetics. 29, 611-620 (2013).
- Sadler, K. C., Krahn, K. N., Gaur, N. A., Ukomadu, C. Liver growth in the embryo and during liver regeneration in zebrafish requires the cell cycle regulator uhrf1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 1570-1575 (2007).
- Goessling, W., et al. APC mutant zebrafish uncover a changing temporal requirement for wnt signaling in liver development. Developmental Biology. 320, 161-174 (2008).
- Dovey, M., et al. Topoisomerase II is required for embryonic development and liver regeneration in zebrafish. Molecular and Cellular Biology. 29, 3746-3753 (2009).
- Kan, N. G., Junghans, D., Belmonte, J. C. I. Compensatory growth mechanisms regulated by BMP and FGF signaling mediate liver regeneration in zebrafish after partial hepatectomy. The FASEB Journal. 23, 3516-3525 (2009).
- Zhu, Z., Chen, J., Xiong, J. W., Peng, J. Haploinsufficiency of Def activates p53-dependent TGFβ signalling and causes scar formation after partial hepatectomy. PLoS One. 9, (2014).
- Feng, G., Long, Y., Peng, J., Li, Q., Cui, Z. Transcriptomic characterization of the dorsal lobes after hepatectomy of the ventral lobe in zebrafish. BMC Genomics. 16, 979 (2015).
- Michalopoulos, G. K.
- Grisham, J. W.
