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Biology

Analisi quantitativa della dinamica dei bordi cellulari durante la diffusione cellulare

doi: 10.3791/62369 Published: May 22, 2021
* These authors contributed equally

Summary

In questo protocollo, presentiamo le procedure sperimentali di un saggio di diffusione cellulare basato sulla microscopia a cellule vive. Forniamo uno strumento computazionale open source per la segmentazione imparziale di cellule etichettate fluorescentmente e l'analisi quantitativa della dinamica lamellipodia durante la diffusione cellulare.

Abstract

La diffusione cellulare è un processo dinamico in cui una cellula sospesa nel supporto si attacca a un substrato e si appiattisce da una forma arrotondata a una sottile e distribuita. Seguendo l'attacco cellula-substrato, la cellula forma un sottile foglio di lamellipodia che emana dal corpo cellulare. Nella lamellipodia, i monomeri dell'actina globulare (G-actina) polimerizzano in una fitta rete ad actina filamentosa (F-actin) che spinge contro la membrana plasmatica, fornendo così le forze meccaniche necessarie per la diffusione della cellula. In particolare, i giocatori molecolari che controllano la polimerizzazione dell'actina nella lamellipodia sono essenziali per molti altri processi cellulari, come la migrazione cellulare e l'endocitosi.

Poiché le cellule di diffusione formano lamellipodi continue che attraversano l'intera periferia cellulare e si espandono persistentemente verso l'esterno, i test di diffusione cellulare sono diventati uno strumento efficiente per valutare la cinetica delle sporgenze lamellipodiali. Sebbene siano state sviluppate diverse implementazioni tecniche del test di diffusione delle celle, attualmente manca una descrizione dettagliata del flusso di lavoro, che includerebbe sia un protocollo passo-passo che strumenti computazionali per l'analisi dei dati. Qui descriviamo le procedure sperimentali del saggio di diffusione cellulare e presentiamo uno strumento open source per l'analisi quantitativa e imparziale della dinamica dei bordi cellulari durante la diffusione. Se combinato con manipolazioni farmacologiche e/o tecniche di silenziamento genico, questo protocollo è suscettibile a uno schermo su larga scala di lettori molecolari che regolano le sporgenze lamellipodiali.

Introduction

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Le sporgenze lamellipodiali sono strutture citoscheletriche prominenti formate nella parte anteriore di una cellula migratare. In lamellipodia, la polimerizzazione dell'actina con l'aiuto del complesso Arp2/3 e delle forme crea una rete actina ramificata in rapida crescita che spinge contro la membranaplasmatica 1,2. La forza di spinta generata dalla meshwork actin spinge fisicamente la cella inavanti 1,3,4,5. L'esaurimento del complesso Arp2/3 o l'interruzione delle vie di segnalazione essenziali per le sporgenze lamellipodiali spesso compromettono la migrazionecellulare 6, 7. Sebbene sia stata segnalata anche la migrazione di cellule carenti di lamellipodia8,9, l'importanza della lamellipodia nella migrazione cellulare è evidente in quanto l'esaurimento di questa struttura protrusiva perturba la capacità della cellula di muoversi attraverso complessi microambientatibiologici 6,10.

Uno dei principali ostacoli alla comprensione della regolazione della lamellipodia nelle cellule migratrici è la variabilità naturale nella cinetica, nelle dimensioni e nella forma della protrusione lamellipodale11,12,13,14. Inoltre, studi recenti hanno dimostrato che i lamellipodia mostrano comportamenti protrusivi complessi, tra cui sporgenze fluttuanti, periodiche e acceleranti14,15. Rispetto alla lamellipodia altamente variabile delle cellule migratrici6,16,lamellipodia formata durante la diffusione cellulare sono piùuniformi 12. Poiché l'attività protrusiva di diffusione e migrazione delle cellule è guidata da assiemi macromolecolari identici, che includono una rete actina ramificata, fasci di actomiosina contrattili e aderenze a matrice cellulare a base di integrina17,18, le cellule di diffusione sono state ampiamente utilizzate come modello per indagare la regolazione della dinamica della lamellipodia.

La diffusione cellulare è un processo meccanochimico dinamico in cui una cellula in sospensione aderisce prima a un substrato attraverso aderenze a base di integrina17,19,20 e poi si diffonde estendendo le sporgenze a base di actina21,22,23. Durante la fase di diffusione, lamellipodia che emana dal corpo cellulare sporge isotropicamente e persistentemente con poca o nessuna retrazione o stallo12. I protocolli di diffusione cellulare più comunemente utilizzati sono test di endpoint, in cui le cellule di diffusione sono fissate in vari momenti dopo laplaccatura 19,24. Questi test, sebbene rapidi e semplici, sono limitati nel loro potere diagnostico per rilevare i cambiamenti nelle caratteristiche dinamiche della lamellipodia. Per determinare i meccanismi molecolari che controllano la dinamica lamellipodia, il gruppo Sheetz ha aperto la strada all'uso dell'analisi quantitativa delle cellule di diffusione dal vivo e ha scoperto molte proprietà fondamentali delle sporgenze dei bordi cellulari11,12,22. Questi studi hanno dimostrato che il saggio di diffusione delle cellule vive è una tecnica robusta e potente nella cassetta degli attrezzi di un laboratorio di biologia cellulare. Nonostante ciò, un protocollo dettagliato e uno strumento computazionale open source per un saggio di diffusione di cellule vive non sono attualmente disponibili per la comunità della biologia cellulare. A tal fine, il nostro protocollo delinea le procedure di imaging delle cellule di diffusione dal vivo e fornisce uno strumento automatizzato di analisi delle immagini. Per convalidare questo metodo, abbiamo usato l'inibizione dell'Arp2/3 come trattamento sperimentale e abbiamo dimostrato che inibire la funzione del complesso Arp2/3 non ha arrestato la diffusione cellulare ma ha causato una significativa riduzione della velocità di protrusione cellulare, così come la stabilità delle sporgenze del bordo cellulare, dando origine a bordi cellulari frastagliati. Questi dati dimostrano che la combinazione di imaging a cellule vive e analisi automatizzata delle immagini è uno strumento utile per analizzare la dinamica dei bordi delle cellule e identificare componenti molecolari che regolano lamellipodia.

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Protocol

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1. Semina cellulare

NOTA: Il protocollo di diffusione cellulare descritto è stato eseguito utilizzando fibroblasti embrionali di topo (MEF) che esprimono PH-Akt-GFP (un marcatore fluorescente per PIP3/PI(3,4)P2). Questa linea cellulare è stata generata integrando genomicamente un costrutto di espressione per PH-Akt-GFP (Addgene #21218) mediante editing genico mediato da CRISPR. Tuttavia, altri marcatori fluorescenti che sono espressi transitoriamente o integrati nel genoma possono anche essere utilizzati in questo saggio. Per una segmentazione ottimale dell'immagine, si consiglia di utilizzare marcatori fluorescenti distribuiti uniformemente nel citoplasma, ad esempio GFP citosolico.

  1. Coltura un piatto di cellule da 10 cm al 90% di confluenza.
  2. Una volta che le cellule hanno raggiunto la corretta confluenza, posizionare una coverlip di 22 mm x 22 mm (spessore #1,5; 0,17 mm) in un piatto di coltura cellulare da 35 mm. Rivestire il copripazzo con 400 μL di fibronectina che è stato diluito in PBS ad una concentrazione finale di 2,5 μg/mL.
    NOTA: Il numero di coverlips necessari per il saggio è determinato dal numero di condizioni sperimentali e dalla replica tecnica.
  3. Posizionare il piatto da 35 mm con la coverslip rivestita con fibronectina in un incubatore di 37 °C, 5% DI CO2 per 1 ora.
  4. Rimuovere il piatto con il copripasci dall'incubatrice. Aspirare la fibronectina e lavare il copripavimenti con PBS tubazione delicatamente intorno al coperchio due o tre volte.
  5. Aspirare il supporto di coltura cellulare dal piatto di cellule di 10 cm e lavare il piatto con PBS.
  6. Aggiungere 650 μL dello 0,05% di tripsiderina-EDTA al piatto confluente al 90% delle cellule, inclinando il piatto per distribuire uniformemente l'enzima. Posizionare il piatto con la triptina nell'incubatrice per 1 minuto.
  7. Rimuovere il piatto con le cellule dall'incubatrice. Aggiungere 10 ml di mezzi di coltura cellulare in un tubo di centrifuga da 15 ml. Aggiungere rapidamente altri 10 mL di supporti nel piatto per spegnere la tripina.
  8. Pipetta 1 ml delle cellule tripsinizzate nel tubo di centrifuga da 15 ml per diluire le cellule. Pipettare il contenuto del tubo su e giù per garantire una distribuzione uniforme delle celle all'interno del supporto. Per i tipi di cellule con elevata propensione all'aggregazione, si consiglia di filtrare le cellule attraverso un filtro cellulare (dimensione della rete di 100 μm) per ridurre al minimo il verificarsi di raggruppamento cellulare.
  9. Dal tubo, pipetta 500 - 1000 μL di cellule diluite nel piatto da 35 mm contenente il coverslip.
  10. Agitare delicatamente il piatto per stendere uniformemente le cellule. Assicurarsi che il coverslip sia a una confluenza di ~10% (~50.000 celle/mL) e regolare il volume delle celle diluite in base alle esigenze.
    NOTA: Lo scopo di avere cellule a così bassa confluenza è quello di garantire che ci siano 1-2 cellule polarizzate in ogni campo visivo che verranno utilizzate per focalizzare l'obiettivo durante l'acquisizione della diffusione cellulare.
  11. Passaggio 1/5 delle cellule rimanenti nel piatto di 10 cm in un piatto di 6 cm per condizione di trattamento. Posizionare i piatti passaggi e il piatto da 35 mm con la coverlip nell'incubatrice durante la notte.
    NOTA: Queste saranno le cellule che verranno analizzate per la diffusione della dinamica.

2. Incubazione di farmaci e recupero cellulare

  1. Aggiungere 5 ml di mezzi di coltura cellulare in ciascuno dei due tubi di centrifuga da 15 ml e 20 ml di DMEM privo di fenolo rosso in ciascuno dei due tubi di centrifuga da 50 ml.
    NOTA: Il numero di coppie di tubi (15 mL + 50 mL) deve corrispondere al numero di condizioni sperimentali.
  2. Per verificare l'importanza dell'Arp2/3 per la diffusione cellulare, pipettare l'inibitore farmacologico di Arp2/3, CK-666, o il trattamento di controllo, come DMSO, in ogni coppia di tubi di centrifuga fino alla concentrazione desiderata.
  3. Rimuovere i piatti di 6 cm (vedere passaggio 1.11) dall'incubatore e aspirare il supporto. Lavare i piatti con PBS caldo.
  4. Aggiungere il contenuto dei tubi di centrifuga da 15 ml integrati con CK-666 o DMSO in ciascuno dei piatti passaggi. Etichettare ogni piatto con il corretto trattamento farmacologico e posizionare i piatti nell'incubatrice per un'ora.
  5. Rimuovere i piatti dall'incubatore e aspirare il supporto. Lavare i piatti con PBS caldo per rimuovere accuratamente tutti i restanti mezzi rosso fenolo.
  6. Aggiungere 230 μL di 0,05% di tripsiderina-EDTA a ogni piatto da 6 cm e incubare le cellule per 1 minuto.
    NOTA: Se applicabile, la tripsidena può essere sostituita da un blocco dell'adesione delle cellule non proteolitiche.
  7. Rimuovere i piatti dall'incubatrice. Per ogni trattamento, aggiungere 5 ml di DMEM privo di fenolo rosso integrato dal farmaco in un tubo di centrifuga da 15 ml designato come "Tubo B". Aggiungere altri 5 mL dello stesso supporto nel piatto pertinente per dissetare la tripina. Trasferire il contenuto del piatto in un tubo di centrifuga da 15 ml designato come "Tubo A".
  8. Trasferire 1 ml di cellule dal tubo A al tubo B. Ripetere per ogni trattamento.
  9. Posizionare i tubi A e B nell'incubatore per 45 minuti per consentire alle cellule di riprendersi dalla tripsinizzazione. Allentare leggermente il tappo dei tubi della centrifuga prima di posizionarli nell'incubatrice per consentire la penetranza di CO2.
    NOTA: la durata del tempo di recupero può variare per diversi tipi di cella. Sebbene nei nostri esperimenti il recupero di 45 minuti abbia avuto un effetto trascurabile sulla vitalità cellulare, alcuni tipi di cellule possono subire anoikis quando mantenuti in sospensione per troppo tempo. Pertanto, si consiglia di determinare empiricamente il tempo di recupero ottimale. Il tempo di ripristino ottimale consente la diffusione rapida e sincrona delle celle senza celle morte o apoptotiche nel campione.

3. Preparazione della camera magnetica

  1. Assicurarsi che tutte le parti di una camera magnetica a cella a camlide bene in grado di ospitare una coverlip quadrata di 22 mm x 22 mm siano state pulite prima dell'uso.
  2. Rimuovere il piatto da 35 mm con il copripasci (vedere passaggio 1.11) dall'incubatore. Aspirare il supporto di coltura cellulare e lavare il copripavimenti con PBS caldo.
  3. Rimuovere il copripavo dal piatto da 35 mm utilizzando un paio di forcep e posare delicatamente il coverslip sulla piastra inferiore della camera magnetica.
  4. Posizionare la guarnizione in silicone sopra la coverlip.
    NOTA: Una guarnizione in silicone posizionata in modo improprio è la causa più comune di una camera magnetica che perde. Assicurarsi che la guarnizione si riposi nel rientro della piastra inferiore e non si alzerà oltre il rientro.
  5. Attaccare il corpo principale sulla piastra inferiore.
    NOTA: Fai questa parte molto lentamente. Una buona punta è quella di tenere premuta la piastra inferiore con una mano mentre si posiziona il corpo principale in cima. Ciò garantisce che i magneti del corpo principale non sollevino la piastra inferiore verso l'alto, il che potrebbe potenzialmente spostare e rompere il copripasci.
  6. Aggiungere 1 mL di DMEM privo di fenolo rosso integrato dal farmaco alla camera magnetica. Prendi un tessuto privo di pelucchi e tampona con cura l'involucro tra il corpo principale e la piastra inferiore per verificare eventuali perdite.
    NOTA: In caso di perdite, aspirare rapidamente il supporto e procedere di nuovo dal passaggio 3.4.
  7. Abbassare il coperchio trasparente sul corpo principale per racchiudere la camera magnetica.
  8. Spruzzare prima un tessuto da laboratorio con acqua e pulire il fondo della camera magnetica (il coverslip, non la parte metallica). Successivamente, spruzzare un secondo tessuto da laboratorio con una piccola quantità di etanolo e pulire al 70%, facendo attenzione a non rompere il coverslip.

4. Acquisizione di immagini

  1. Preriscaldare l'incubatore superiore dello stadio e il riscaldatore obiettivo a 37 °C e impostare il livello di CO2 nell'incubatore superiore dello stadio al 5%.
    NOTA: Se l'incubatore superiore dello stadio non è collegato a un alimentatore di CO2, il supporto di coltura cellulare deve essere integrato con HEPES da 25 mM per mantenere un pH costante 7.4.
  2. Applicare una quantità sufficiente di olio ad immersione all'obiettivo olio prerifapidto 60X, 1.4 N.A.
    NOTA: Utilizziamo un obiettivo di immersione dell'olio 60X, 1.4 N.A. in questo protocollo a causa del suo campo visivo ragionevolmente ampio e dell'eccezionale efficienza di raccolta della luce. Se è necessario un campo visivo più ampio, è possibileutilizzare un obiettivo diingrandimento inferiore ( ad esempio , 20x) purché il rapporto segnale-rumore delle immagini sia maggiore di 2,5.
  3. Portare sia la camera magnetica completata che il tubo B (fase 2.9) al microscopio confocale. Posizionare la camera magnetica sull'incubatore superiore del palco.
    NOTA: Posizionare delicatamente la camera magnetica sul palco per evitare di creare bolle nell'olio ad immersione.
  4. Impostare lo stato attivo sulle celle fluorescenti utilizzando il canale GFP. Assicurarsi che il bordo della cella sia nitido e ben definito.
  5. Rimuovere il coperchio trasparente della camera magnetica e pipettare 500 μL dal tubo B nella camera magnetica. Riposizionare il coperchio trasparente sopra la camera magnetica.
  6. Per identificare le cellule ideali per l'analisi della diffusione cellulare, cercare "aloni" di cellule che devono ancora attaccarsi al coverslip ma non rotolano più. Anche le celle che si trovano nelle prime fasi dell'allegato coverslip sono ottimi candidati, ma l'acquisizione di immagini deve essere rapida per catturare la diffusione.
  7. Configurare l'acquisizione dell'immagine time-lapse per il canale verde in modo che includa quattro campi di visualizzazione, con immagini a intervalli di 6 secondi.
    NOTA: A causa dell'elevata variabilità della velocità di protrusione della lamellipodia tra i diversi tipi di cellule, la frequenza fotogrammi ottimale deve essere determinata empiricamente. L'intervallo di imaging di 6 secondi utilizzato nei nostri esperimenti è un buon punto di partenza per l'analisi di molte cellule mesenchimali ed epiteliali. Tuttavia, le cellule che si diffondono moltorapidamente (ad esempio,cellule immunitarie) possono richiedere una frequenza fotogrammi molto più elevata (intervallo di imaging più breve). La frequenza fotogrammi ottimale per i filmati di diffusione delle celle garantisce uno spostamento di 2-5 pixel del bordo della cella sporgente tra i fotogrammi successivi. Considerando l'accuratezza del raccordo a curva utilizzato per identificare l'altopiano della diffusione delle cellule, la frequenza ottimale del telaio dovrebbe anche garantire 50-100 misurazioni dello spostamento del bordo cellulare durante la fase di rapida espansione della diffusione cellulare. Il numero di campi di visualizzazione deve essere regolato in base al tempo di esposizione, alla distanza tra i punti di acquisizione e alla velocità di movimento dello stadio. Si consiglia agli utenti di determinare il numero massimo di campi di visualizzazione che possono essere acquisiti con la frequenza fotogrammi desiderata.
  8. Dopo aver identificato un campo visivo adatto, salvare le coordinate X e Y dello stadio del microscopio. Procedere con l'identificazione di altri tre campi di visualizzazione relativamente vicini l'uno all'altro sulla coverslip. Salvare le coordinate dello stadio del microscopio per ogni campo visivo desiderato.
    NOTA: Si consiglia vivamente di ottimizzare il percorso di movimento dello stadio tra i campi visivo al fine di ridurre al minimo qualsiasi movimento del campione non necessario. Tale ottimizzazione può essere eseguita manualmente o automaticamente. Un eccessivo movimento del campione rallenta l'acquisizione e può causare l'implementazione delle celle fuori dalla vista mentre scendono.
  9. Acquisisci immagini per 15 minuti a una frequenza fotogrammi di 6 secondi e salva i file. Se sono necessarie altre acquisizioni, ripetere a partire dal passaggio 4.6.

5. Analisi dell'area cellulare, circolarità e dinamica di protrusione durante la diffusione cellulare

  1. Preparare le immagini per l'elaborazione e l'analisi dei dati
    NOTA: il software richiede un'immagine in .tiff e una dimensione in pixel come parametri di input. Entrambi i requisiti possono essere soddisfatti utilizzando il software di acquisizione o Fiji (in questo protocollo). Se questi requisiti sono soddisfatti, procedere al passaggio 5.2.
    1. Installare l'ultima versione dell'applicazione Fiji (https://imagej.net/Fiji/Downloads).
    2. Apri un'immagine time-lapse usando Fiji.
    3. Copiare le dimensioni in pixel dell'immagine selezionando Immagine > proprietà. Copiare e incollare le dimensioni dei pixel in μm nel Blocco note/Word.
    4. Per l'analisi dell'area di diffusione delle celle e della circolarità, salvate l'immagine time-lapse come stack di immagini tiff. Il software di analisi della compilazione personalizzata non supporta formati di file proprietari. Salvare lo stack di immagini tiff delle singole celle selezionando File > Salva con nome > Tiff.
  2. Installare python IDE (Spyder) e i pacchetti necessari (PySimpleGUI e tifffile) per l'elaborazione e l'analisi dei dati.
    NOTA: L'installazione di Python e pacchetti è necessaria solo per la configurazione iniziale.
    1. I film time-lapse verranno analizzati nell'IDE Spyder utilizzando uno script Python di compilazione personalizzata. Per scaricare l'IDE Spyder, scarica il distributore Anaconda (https://www.anaconda.com/products/individual) che include Spyder IDE e la maggior parte delle librerie e dei pacchetti necessari per questa analisi.
    2. Installa Anaconda e lancia Spyder tramite Anaconda Navigator.
    3. Nella scheda della console IPython (situata nella sezione in basso a destra di Spyder), copiare e incollare il comando seguente: pip installare PySimpleGUI e premere INVIO. L'esecuzione di questo comando installerà il pacchetto necessario per avviare l'interfaccia utente grafica (GUI).
    4. Nella stessa console copiare e incollare il comando seguente: pip install tifffile e premere INVIO. L'esecuzione di questo comando installerà il pacchetto necessario per salvare le immagini come file tiff.
    5. Scarica tutti gli script Python dai file supplementari o dagli script più aggiornati da GitHub all'https://github.com/ernestiu/Cell-spreading-analysis.git
  3. Quantificare l'area cellulare e i fattori di forma cellulare durante la diffusione cellulare
    1. Aprire lo script di analisi principale "cell_spreading_GUI.py" selezionando l'opzione apri file nel pannello superiore di Spyder o utilizzando il collegamento CTRL+O.
    2. Aprire l'interfaccia utente grafica di analisi della diffusione delle celle selezionando "Esegui file" nel pannello superiore o utilizzando il collegamento F5.
    3. Fare clic sulla scheda Area di diffusione celle ( Figura3A).
    4. Selezionare l'immagine tiff da analizzare utilizzando il pulsante sfoglia.
      NOTA: il file selezionato deve essere un file tiff.
    5. Specificare la directory di destinazione in cui verranno salvati gli output dei dati (ad esempio, maschere di cella, valori).
    6. Specificare le impostazioni di output dei dati:
      1. Salva maschere: salva le maschere di cella generate durante il processo di segmentazione.
      2. Esportare dati: esportare un foglio di calcolo di Excel (.xlsx) contenente tutti i dati di analisi nella cartella di destinazione.
        L'area delle celle, la circolarità e le proporzioni di tutte le celle di diffusione verranno salvate come foglio di calcolo di Excel nella cartella di destinazione. L'area della cella viene calcolata come:
        Equation 1 
        La circolarità cellulare è una misura di quanto una cellula sia vicina a una cella perfettamente rotonda. È calcolato come:
        Equation 2 
        dove A e P sono rispettivamente l'area cellulare e il perimetro cellulare. Le proporzioni della cella rappresentano l'allungamento della cellula. Una cellula di diffusione dovrebbe avere proporzioni vicine a 1. Le proporzioni sono calcolate come:
        Equation 3 
      3. Salva contorni: salva le immagini sovrapposte al contorno del contorno della cella nella cartella di destinazione.
    7. Specificare le impostazioni di segmentazione
      1. Mostra segmentazione: mostra il risultato della segmentazione nella console Spyder durante il processo di analisi.
      2. Area cellulare più piccola (μm2): immettereil valore minimo per l'area cellulare, inclusi i valori di area delle celle nelle fasi iniziali dell'attacco. Gli oggetti con un'area inferiore a questa soglia non verranno considerati come celle di diffusione. Questo numero influenzerà il processo di segmentazione.
    8. Specificare i parametri dell'immagine.
      1. Intervallo di acquisizione: immettere la frequenza dell'acquisizione dell'immagine in secondi.
      2. Dimensione pixel (μm): immettere la dimensione dei pixel registrata durante la preparazione delle immagini per l'analisi.
      3. Profondità del bit dell'immagine: immettere la profondità di bit della fotocamera/rilevatore.
    9. Fare clic su Esegui. Se si verifica un errore, nella console di Spyder verrà visualizzato un messaggio di errore. In caso contrario, il processo di analisi delle immagini verrà visualizzato nella console.
      NOTA: la prima immagine visualizzata nella sezione console/grafici (a seconda delle impostazioni di Spyder) mostra tutte le celle identificate nel campo visivo. Le caselle verdi posizionate intorno alle celle indicano celle di diffusione adatte alla segmentazione e all'analisi. Le caselle grigie indicano celle non adatte all'analisi. Il numero totale di celle di diffusione identificate verrà visualizzato anche nella scheda Console. Il software traccia l'area cellulare (in blu) e la circolarità cellulare (in rosso) in funzione del tempo. Questi grafici consentono agli utenti di valutare l'accuratezza della segmentazione cellulare. Una segmentazione riuscita produce una curva monotonamente crescente per l'area cellulare. Per ottenere una curva rappresentativa dell'area di diffusione cellulare, la fase di ritardo deve essere rimossa manualmente dal grafico. La fase di ritardo include misurazioni dell'area cellulare prima che la cellula inizi a diffondersi. La fase di ritardo è indicata da fluttuazioni veloci, rappresentate nel grafico dell'area cellulare(figura 3C a destra).

6. Quantificare la dinamica del bordo cellulare durante la diffusione cellulare utilizzando i cimografi

  1. Prima di eseguire l'analisi, ritagliare i filmati grezzi delle cellule di diffusione per creare serie temporali di singole cellule di diffusione.
    1. Utilizzare lo strumento Rettangolo nella barra degli strumenti Fiji per selezionare manualmente un'area di interesse (ROI) che incapsula una singola cella. Per assicurarsi che il ROI incapsula completamente la cella di diffusione, utilizzare la funzione di scorrimento per ispezionare il ROI in tutti i punti di tempo.
    2. Fare clic con il pulsante destro del mouse sul ROI e scegliere Duplica.
    3. Selezionare Stack duplicato e fare clic su OK.
  2. Aprire lo script di analisi principale "cell_spreading_GUI.py" selezionando il pulsante Apri file nella barra degli strumenti di Spyder o utilizzando il collegamento CTRL+O. Se la GUI è già stata aperta, passare direttamente al passaggio 6.3.
  3. Aprire l'interfaccia utente grafica di analisi della diffusione delle celle selezionando Esegui file nel pannello superiore o utilizzando il collegamento F5 (Figura 3B).
  4. Fare clic sulla scheda Generatore e analisi Kymograph.
  5. Usa il pulsante sfoglia per selezionare l'immagine tiff per l'analisi.
    NOTA: i formati di file proprietari, ad esempio nd2, lif, zen, non sono supportati dallo script.
  6. Specificare la cartella di destinazione per salvare i dati di output (maschere e valori delle celle).
  7. Specificare le impostazioni di output.
    1. Esportare i dati: esportare un foglio di calcolo di Excel (.xlsx) nella cartella di destinazione contenente le posizioni relative del bordo delle celle e gli eventi di retrazione dei cimografi.
  8. Specificare i parametri dell'immagine:
    1. Intervallo di acquisizione: immettere la frequenza di acquisizione dell'immagine in secondi.
    2. Dimensione pixel (μm): immettere la dimensione dei pixel registrata durante la preparazione delle immagini per l'analisi nel passaggio 5.1.3.
    3. Area cellulare più piccola (μm2): immettereil valore minimo per l'area cellulare, inclusi i valori di area delle celle nelle fasi iniziali dell'attacco. Gli oggetti con un'area inferiore a questa soglia non verranno considerati come celle di diffusione. Questo numero influenzerà il processo di segmentazione.
    4. Profondità del bit dell'immagine: immettere la profondità di bit della fotocamera/rilevatore.
  9. Fare clic su Esegui. Se si verifica un errore, nella console di Spyder verrà visualizzato un messaggio di errore. In caso contrario, nella console verrà visualizzato un riepilogo delle quantificazioni delle dinamiche di protrusione. Ci saranno 4 coppie di misurazioni della frequenza di retrazione e della velocità di protrusione, che vengono estratte da 4 cimografi generati dalle parti superiore, inferiore, sinistra e destra della cella. La frequenza di retrazione è calcolata come:
    Equation 4 
    NOTA: Questo numero dimostra la frequenza con cui il lamellipodio si ritrae nel corso della diffusione. La velocità media di protrusione è misurata dalla pendenza tra l'inizio della sporgenza e il punto di plateau sul cimografo. Una figura kymografica di riepilogo verrà mostrata nella console dopo la segmentazione. Per salvare la figura di riepilogo, fare clic con il pulsante destro del mouse sulla figura e salvare l'immagine.

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Representative Results

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Il protocollo di cui sopra descrive le procedure sperimentali per l'imaging a cellule vive di cellule di diffusione e uno strumento computazionale per l'analisi quantitativa della dinamica di diffusione cellulare. Lo strumento computazionale può essere utilizzato in un formato a bassa o alta produttività per identificare i lettori molecolari che regolano i macchinari di polimerizzazione dell'actina all'avanguardia cellulare.

La rappresentazione schematica delle procedure sperimentali è illustrata nella figura 1. Il test di diffusione cellulare è stato eseguito su fibroblasti embrionale di topo immortalati che esprimono stabilmente il dominio di omologia della pleckstrin (PH) della proteina Akt chinasi taggata con eGFP25. Le cellule sono state staccate con tripside-EDTA e sono state autorizzate a riprendersi in sospensione per 45 minuti. Durante la fase di recupero, le cellule hanno rifornito i loro recettori dell'integrina sulla membrana plasmatica come indicato dall'attacco rapido e sincrono delle cellule recuperate alle coperture rivestite con fibronecina (Figura 2). Senza il periodo di recupero, le cellule di diffusione hanno mostrato un'ampia distribuzione delle dimensioni delle cellule che indica un'elevata variabilità nell'insorgenza della diffusione cellulare (figura 2A e B). Successivamente, le cellule sono state placcate su un coverslip contrassegnato in modo fiduciario e la loro dinamica di diffusione è stata visualizzata mediante microscopia confocale a disco rotante (schemi mostrati nella figura 1A - H). Durante l'acquisizione dell'immagine, abbiamo considerato campi di visualizzazione che presentavano celle con un rapporto segnale-rumore di 2,5 o superiore. Questa è stata una considerazione importante in quanto la successiva segmentazione dell'immagine è sensibile all'intensità di fluorescenza delle cellule rispetto allo sfondo. Nei nostri esperimenti, abbiamo acquisito immagini ogni 6 secondi per 15 minuti (schemi mostrati nella figura 1I-J). In accordo con i rapportiprecedenti 16, l'imaging a una frequenza di fotogrammi di 6 secondi ha garantito una risoluzione temporale sufficiente per catturare la dinamica dei singoli eventi di protrusione e retrazione, consentendoci al contempo di acquisire diversi campi visivo in parallelo. Le immagini time-lapse risultanti sono state analizzate utilizzando il software Python di compilazione personalizzata (Figura 3).

Una quantificazione imparziale della diffusione cellulare è stata eseguita utilizzando due distinte procedure analitiche: ( i )Profilazionemorfodinamica delle cellule di diffusione (Figura 3A,C e 4) e ( ii )Analisikymograph della dinamica dei bordi cellulari(figure 3B e 5). L'analisi della diffusione cellulare mediante profilazione morfodinamica comporta il rilevamento automatizzato delle cellule di diffusione e fiduciale nel campo visivo (Figura 3C a sinistra), seguita da una segmentazione dell'immagine fotogramma per fotogramma e dal rilevamento del limite della cella di diffusione. La segmentazione viene eseguita mediante la soglia di intensità globale dei singoli fotogrammi. Il valore di soglia viene calcolato come minimo locale tra la prima e la seconda modalità di intensità nell'istogrammadell'immagine 26. Le immagini con un istogramma unimodale inclinato a destra sono segmentate dall'algoritmo di soglia triangolare27. A seguito della segmentazione cellulare, sono state calcolate le caratteristiche morfodinamichedelle cellule di diffusione (ad esempio, area cellulare, proporzioni e circolarità cellulare)(Figura 3C destra).

Coerentemente con irisultati pubblicati 12,28, la diffusione cellulare è stata guidata da un'espansione isotropica della lamellipodia come indicato da una forma sigmoidale sul grafico rappresentativo dell'area cellulare(Figura 3C a destra, curva blu e S1). Il grafico di area ha mostrato che l'area cellulare è aumentata di circa 3 volte prima di raggiungere un altopiano(figure 4A e B). Durante tutto il processo di diffusione cellulare, le cellule sono rimaste circolari (circolarità = 0,70 ± 0,076) e hanno mostrato bordi cellulari sporgenti simili a veli, che sono indicativi di sporgenze lamellipodiali(Figura 4C).

Per convalidare il saggio di diffusione cellulare, abbiamo inibito Arp2/3 con 100 μM CK-666 per 1 ora e 45 minuti e valutato l'effetto di questo trattamento sulla dinamica di diffusione cellulare. D'accordo con leprecedenti relazioni 13, la soppressione dell'attività Arp2/3 non ha prodotto una significativa diminuzione della velocità di diffusione cellulare(figura 4A e B, curvarosa). Tuttavia, l'analisi della forma cellulare ha rivelato una differenza significativa nella circolarità delle cellule trattate con CK-666 (Controllo: 0 <,70 ± 0,08 vs ±. Mentre le celle di controllo rimanevano circolari fino all'altopiano, le cellule inibite da Arp2/3 acquisivano una forma poligonale che è stata mantenuta durante tutto il corso della diffusione (Figura 4A). Insieme, questi risultati sperimentali dimostrano che il saggio descritto di diffusione cellulare rivela cambiamenti moderati nella morfodinamica cellulare causati da perturbazioni dei macchinari di polimerizzazione dell'actina.

Mentre la profilazione morfodinamica è spesso sufficiente a rilevare alterazioni grossolane nella dinamica di diffusione cellulare, questa analisi ha una capacità limitata di identificare componenti citoscheletrici specifici che regolano i cicli di protrusione-retrazione del bordo cellulare, spingendoci a implementare uno strumento di analisi kymografica imparziale (Figura 5 linee a sinistra tratteggiate). L'analisi della velocità del bordo cellulare ha rivelato una diminuzione moderata ma significativa della velocità media di protrusione delle cellule inibite da Arp2/3 rispetto al controllo (Controllo: 37,1 ± 12,87 nm/s rispetto a CK-666: 28,7 ± 13,4 nm/s, p = 0, 9 x 10-3) (Figura 5C). Inoltre, la dinamica del bordo cellulare del controllo e delle cellule inibite da Arp2/3 era notevolmente diversa(figura 5A e D). Le celle di controllo sporgevano persistentemente con poca o nessuna retrazione durante la fase di rapida espansione, che durò circa 200 secondi, e mostrarono retrazioni intermittenti durante la fase di plateau(Figura 5A e D). Al contrario, l'espansione delle cellule inibite da Arp2/3 è stata intervenuta con eventi di retrazione, denotati dai punti rossi sui grafici(Figura 5B e D). La quantificazione della frequenza di retrazione ha mostrato che le cellule inibite da Arp2/3 si ritraevano il 26% più frequentemente delle cellule di controllo (Controllo: 0,18 ±0,22 s -1 contro CK-666: 0,24 ± 0,19 s-1, p = 0,03) (Figura 5D). Questi dati dimostrano l'elevata sensibilità dell'analisi del kymograph nel rilevare lievi alterazioni della dinamica lamellipodiale.

Figure 1
Figura 1: Flusso di lavoro sperimentale di un saggio di diffusione cellulare. ( A -H) Schemi del saggio di diffusione cellulare. (A) Un coverslip di 22 mm x 22 mm è rivestito con fibronectina diluita in PBS ad una concentrazione finale di 2,5 μg/mL. (B) Un piatto confluente di 10 cm di fibroblasti embrionali di topo (MEF) che esprimono PH-Akt-GFP viene lavato con PBS e trattato con 0,05% di tripside-EDTA. Le cellule trattate con tripina vengono quindi divise in un tubo di centrifuga da 15 ml e in un piatto di coltura tissutale di 6 cm, entrambi contenenti mezzi di coltura cellulare. (C) Dal tubo di centrifuga da 15 ml, 500-1000 μL vengono pipettati sul coperchio rivestito di fibronectina. (D) Il piatto da 6 cm e il piatto da 35 mm con il coverslip contenente le cellule scarsamente sementi sono collocati durante la notte in un'incubatrice a 37 °C. Una volta polarizzate, queste cellule forniranno il fotogramma di messa a fuoco per l'acquisizione della diffusione cellulare. (E) Un'ora prima dell'acquisizione dell'immagine, il supporto del piatto da 6 cm viene sostituito con DMEM privo di fenolo-rosso integrato con HEPES e il farmaco di interesse. Dopo 1 ora, le cellule vengono trattate con 0,05% di tripsiderina-EDTA e trasferite in un tubo di centrifuga da 15 ml (tubo A) contenente il DMEM privo di fenolo HEPES/antidroga. Le celle del tubo A vengono quindi ulteriormente diluite in un altro tubo di centrifuga da 15 ml (tubo B), che viene posto nell'incubatrice per 45 minuti. (F) Man mano che le celle si riprendono, la camera magnetica viene preparata dal basso verso l'alto: prima la piastra inferiore viene posizionata su una superficie piana, poi il copripasta con le celle polarizzate, la guarnizione in silicone, il corpo principale della camera e infine il coperchio trasparente viene posato sopra. (G) 1 mL di DMEM privo di fenolo rosso integrato dal farmaco viene pipettato nella camera magnetica, che viene poi portata allo stadio del microscopio. Per l'acquisizione di immagini viene selezionato un obiettivo CFI Plan Apo Lambda 60X Oil. (H) Il coperchio trasparente viene rimosso e 500 μL del contenuto del tubo B vengono pipettati nella camera magnetica. (I) Per l'acquisizione di immagini, campi di vista appropriati conterranno "aloni" verdi, che sono celle sospese che non sono ancora state attaccate al coverslip. (J) Le celle vengono immagini per 15 minuti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Effetto del tempo di recupero sulla diffusione cellulare. Le cellule mantenute in sospensione per il tempo indicato (fase di recupero cellulare nel protocollo) sono state placcate su coverlips rivestite con fibronectina per 15 minuti, fissate con paraformaldeide al 4% e immagini mediante microscopia a contrasto di fase. (A) Pannelli principali: immagini di contrasto di fase acquisite con un obiettivo 20X. Pannelli inferiori: maschere cellulari segmentate spartiacque con le aree cellulari codificate a colori. (B) Quantificazione della superficie cellulare. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Interfaccia utente grafica (GUI) e principi di lavoro del software di elaborazione e analisi delle immagini. (A) La GUI della scheda "Area di diffusione cella". Fare riferimento al passaggio 5.3 per istruzioni. (B) La GUI della scheda "Generatore e analisi kymograph". Fare riferimento al passaggio 6 per istruzioni. (C) Pipeline di elaborazione delle immagini del software. Il software identifica innanzitutto le celle di diffusione (etichettate da un riquadro di delimitazione verde) nell'intero campo visivo. Le cellule di diffusione vengono identificate in base al loro valore di intensità, circolarità e proporzioni. Le celle di diffusione identificate vengono quindi segmentate fotogramma per fotogramma utilizzando la soglia di intensità globale. Ogni maschera binaria viene elaborata mediante filtraggio mediano e riempimento binario dei fori seguita da chiusura morfologica per levigare il bordo della cella. Il contorno rosso corrisponde al limite della cella segmentata. L'area, le proporzioni e la circolarità della cella vengono estratte dalla mappa delle celle binarie. Il grafico mostra l'area e la circolarità di una cella rappresentativa nel tempo. Al momento della semina cellulare, le cellule non iniziano a diffondersi immediatamente, dando origine alla fase di ritardo vista sul grafico. Dopo la fase di ritardo, le cellule si diffondono rapidamente durante la fase di rapida espansione e alla fine raggiungono una fase di plateau. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Risultati rappresentativi dell'analisi dell'area di diffusione cellulare in caso di inibizione dell'Arp2/3. (A) Immagini rappresentative dei MEF che esprimono PH-Akt-GFP che si diffondono su una busta di cover rivestita di fibronectina nel corso di 3 minuti. La linea rossa indica il limite della cella estratto dall'algoritmo di segmentazione delle celle. Pannelli superiore: 0,1% di cellule trattate con DMSO. Pannelli inferiori: 100 μM CK-666 (inibitore Arp2/3) -cellule trattate. (B) Grafico che mostra l'area di diffusione delle celle nel tempo. L'area di diffusione delle cellule è stata quantificata come variazioni di piega rispetto all'area media di diffusione cellulare delle celle di controllo. Le linee blu e rosa rappresentano rispettivamente il controllo e le cellule inibite da Arp2/3. Le regioni ombreggiate indicano la deviazione standard superiore e inferiore dell'area di diffusione delle celle. (C) Un grafico a barre con singoli punti dati che mostra la circolarità media cellulare del controllo e delle cellule inibite di Arp2/3. Tutte le barre di errore rappresentano una deviazione standard. *, p < 0,05, **, p < 0,01, ***, p < 0,001, n.s. (non significativo, p > 0,05) rilevato dai test t parametrici degli studenti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Risultati rappresentativi dell'analisi del cimografo delle cellule di diffusione inibendo l'Arp2/3. (A - B) Immagini rappresentative e cimografie estratte da cellule trattate con DMSO (controllo) allo 0,1% e da cellule trattate con 100 μM CK-666 (inibitore Arp2/3). Pannelli a sinistra: immagini in scala di grigi invertite di un controllo e cellule inibite Arp2/3. Le linee tratteggiate corrispondono alle linee predefiniti in cui sono stati estratti i cimografi. Pannelli a destra: i cimografi vengono estratti lungo le linee tratteggiate mostrate sulle immagini in scala di grigi. I limiti del tracciato sono codificati a colori in modo che corrispondano alle linee tratteggiate nelle immagini in scala di grigi. La linea tratteggiata in ogni tracciato indica la pendenza della curva da cui è stata calcolata la velocità media di protrusione. Per individuare la fase dell'altopiano, è stata inserita una curva di crescita logistica sui punti dati e l'altopiano è stato derivato dal parametro, c (Figura complementare 1). I punti rossi indicano gli eventi di retrazione. (C) Un grafico a barre con singoli punti dati che mostra le velocità medie di protrusione del controllo e le cellule inibite di Arp2/3. Tutte le barre di errore rappresentano una deviazione standard. (D) Un grafico a barre con singoli punti dati che mostra la frequenza degli eventi di retrazione del controllo e delle cellule inibite da Arp2/3. (C - D) *, p < 0,05, **, p < 0,01, ***, p < 0,001, n.s. (non significativo, p > 0,05) rilevato da prove Mann-Whitney non parametriche. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura supplementare 1: Un kymografo rappresentativo e il risultato del raccordo a curva. Un kymografo estratto da una cellula di diffusione. La linea tratteggiata blu corrisponde alla distanza del bordo della cella rispetto al primo fotogramma. La linea solida rossa corrisponde alla curva montata. Per aumentare la sicurezza del raccordo della curva, i punti dati grezzi sono stati prima smussati da un filtro Savitzky-Golay. Dopo il raccordo a curva, il parametro c, dall'equazione logistica, è stato utilizzato per identificare il punto di plateau. Il punto dati non elaborati più vicino a c è designato come punto di plateau. Clicca qui per scaricare questo file.

File supplementari. Clicca qui per scaricare questo file.

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Discussion

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Il saggio di diffusione cellulare descritto consente il tracciamento continuodei cambiamenti morfologici (ad esempio, dimensione e forma delle cellule)e dei movimenti del bordo cellulare (cioè velocità di protrusione e frequenza di retrazione), che sono caratteristiche mancanti nella maggior parte dei protocolli di diffusione cellulare19,24. Mentre i test di diffusione delle cellule del punto finale comunemente usati consentono la determinazione della velocità di diffusione cellulare, questi test non riescono a risolvere la dinamica temporale dei movimenti del bordo cellulare. La mancanza di informazioni temporali limita la capacità di rilevare e quantificare i cambiamenti nei cicli di protrusione-retrazione lamellipodiale.

Il nostro software di elaborazione e analisi delle immagini esegue un'analisi semplificata delle cellule di diffusione, dalla segmentazione cellulare alla quantificazione dei dati. Le analisi manuali delle immagini della diffusione cellulare di solito comportano una selezione distorta di un valore soglia o l'applicazione di un algoritmo di segmentazione automatizzato, che non è adatto per esperimenti ad alta produttività in cui molte immagini devono essere analizzate. Il nostro software è, quindi, progettato per rilevare e segmentare le cellule di diffusione in modo automatizzato, oltre a quantificare dinamiche di protrusione e descrittori morfologici. Insieme, queste caratteristiche rendono il protocollo descritto suscettibile per screening a grande produttività di percorsi di segnalazione e giocatori molecolari che regolano lamellipodia.

Per garantire che l'analisi delle cellule di diffusione sia robusta e accurata, è necessario eseguire alcuni passaggi critici del protocollo con ulteriore cautela. Il primo passo del saggio di diffusione cellulare prevede la placcatura di cellule etichettate fluorescentmente a una densità molto bassa su una coverlip rivestita di fibronectina il giorno prima dell'imaging (Figura 1A-D). Queste celle polarizzate consentono una messa a fuoco precisa dei bordi sporgenti delle celle di diffusione durante l'acquisizione dell'immagine. Se la densità delle cellule polarizzate è troppo alta, le cellule di diffusione hanno un'alta probabilità di atterrare o sovrapporsi alle cellule polarizzate, il che può portare a un fallimento della segmentazione cellulare. Il periodo di ripristino dopo la tripsidenza è un altro passaggio critico di questo protocollo. Le cellule trattate con il farmaco di interesse, ad esempio DMSO o CK-666, vengono staccate dal piatto di coltura cellulare mediante tripside-EDTA (Fase 2), seguite da un periodo di recupero di 45 minuti(Figura 1E). Questo passaggio di recupero consente alle cellule di riprendersi dalla scissione proteolitica delle proteine della superficie cellulare mediante tripside19,24 e sincronizza l'inizio della diffusione cellulare ( Figura2). Se la fase di recupero viene omessa, la variabilità da cellula a cellula nell'area di diffusione cellulare aumenta, riducendo la consistenza del fenotipo biologico.

Durante l'acquisizione dell'immagine, qualsiasi deriva del campione diminuisce inevitabilmente la qualità e la precisione dell'analisi di diffusione cellulare, in particolare l'analisi del kymograph. Per ridurre al minimo la deriva del campione, è necessario adottare alcune misure. Innanzitutto, l'utente dovrebbe ottimizzare il movimento dello stadio durante l'acquisizione dell'immagine. L'ottimizzazione include la riduzione al minimo del viaggio in fase tra i campi visivo e la riduzione della velocità di movimento dello stadio. In secondo luogo, è essenziale fissare saldamente il campione sullo stadio del microscopio. Se queste misure suggerite non eliminano la deriva del campione, si dovrebbe prendere in considerazione l'elaborazione post-acquisizione. Tra molti strumenti computazionali proprietari e open source, si consiglia di utilizzare il plug-in Fiji "Registrazione basata su descrittore" per correggere i cambiamenti di immagine e allineare i filmati delle celle di diffusione (le istruzioni sono disponibili all'indirizzo: https://imagej.net/Descriptor-based_registration_(2d/3d)).

Va notato che l'analisi quantitativa delle aree cellulari e della dinamica dei bordi eseguita dal software dipende fortemente dall'accuratezza della segmentazione cellulare. Per garantire una segmentazione precisa, si consiglia di visualizzare la diffusione delle cellule utilizzando un sistema di imaging confocale, preferibilmente un microscopio confocale a disco rotante che offre alta risoluzione, bassa fotobleaching / fototossicità e alto rapporto segnale-rumore. Un microscopio confocale rimuove in modo efficiente la fluorescenza fuori fuoco emessa dalle cellule di diffusione, il che ridurrebbe altrimenti l'accuratezza della segmentazione dell'immagine e la traccia del limite cellulare. Se un microscopio widefield viene utilizzato per l'acquisizione di immagini, potrebbe essere necessaria un'ulteriore elaborazione post-acquisizione, ad esempio la deconvoluzione delle immagini, per rimuovere la fluorescenza fuori fuoco e migliorare l'accuratezza della segmentazione cellulare. Pertanto, dovrebbe essere presa in considerazione la scelta del sistema di imaging.

All'interno del software descritto, sono stati implementati e ottimizzati due algoritmi di segmentazione delle immagini per rilevare in modo affidabile le cellule etichettate con proteine fluorescenti fioche o moderatamente luminose, come le proteine fluorescenti verde citosolico e rosse (GFP e RFP)26,27. Tuttavia, questi algoritmi di segmentazione hanno una gamma dinamica limitata e non sono adatti per rilevare cellule etichettate con proteine fluorescenti o coloranti estremamente luminosi. Nelle nostre mani, questi algoritmi tendono a sottosegmentare cellule estremamente luminose a causa dell'inclinazione dell'istogramma dell'immagine verso pixel ad alta intensità. Per campioni luminosi, le intensità delle immagini possono essere controllate regolando il tempo di esposizione o la potenza di uscita del laser di eccitazione.

Tenendo presenti queste considerazioni, questo protocollo di diffusione delle cellule vive è uno strumento robusto e potente per studiare la dinamica della lamellipodia. La piattaforma automatizzata di analisi delle immagini è adatta a molte indagini biologiche, ad esempio lo screening ad alto contenuto di fattori molecolari / di segnalazione che regolano le sporgenze lamellipodiali.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato supportato dal Connaught Fund New Investigator Award a S.P., Canada Foundation for Innovation, NSERC Discovery Grant Program (sovvenzioni RGPIN-2015-05114 e RGPIN-2020-05881), University of Manchester and University of Toronto Joint Research Fund e University of Toronto XSeed Program.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05% Trypsin (0.05%), 0.53 mM EDTA Wisent Bioproducts 325-042-CL
10.0 cm Petri Dish, Polystyrene, TC Treated, Vented Starstedt 83.3902
15 mL High Clarity PP Centrifuge Tube, Conical Bottom, with Dome Seal Screw Cap, Sterile Falcon 352097
1-Well Chamlide CMS for 22 mm x 22 mm Coverslip Quorum Technologies CM-S22-1
35 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish Falcon 353001
50 mL Centrifuge Tube, Transparent, Plug Seal Nest 602002
6.0 cm Cell Culture Dishes Treated for Increased Cell Attachment, Sterile VWR 10861-658
Arp2/3 Complex Inhibitor I, CK-666 Millipore Sigma 182515
Camera, Prime 95B-25MM Photometrics
Dimethyl Sulfoxide, Sterile BioShop DMS666
DMEM, 1x, 4.5 g/L Glucose, with L-Glutamine, Sodium Pyruvate and Phenol Red Wisent Bioproducts 319-005 CL
DMEM/F-12, HEPES, No Phenol Red Gibco 11039021
D-PBS, 1X Wisent Bioproducts 311-425 CL
Fetal Bovine Serum Wisent Bioproducts 080-110
Fiji Software ImageJ
HEPES (1 M) Gibco 15630080
Human Plasma Fibronectin Purified Protein 1 mg Millipore Sigma FC010
Immersion Oil Cargille 16241
L-Glutamine Solution (200 mM) Wisent Bioproducts 609-065-EL
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) Gibco 11140050
Micro Cover Glasses, Square, No. 11/2 22 x 22 mm VWR CA48366-227-1
Microscope Body, Eclipse Ti2-E Nikon
Objective, CFI Plan Apo Lambda 60X Oil Nikon MRD01605
Penicillin-Streptomycin Sigma P4333
Spinning Disk, Crest Light V2 CrestOptics
Spyder Anaconda
Stage top incubator Tokai Hit
Statistics Software, Prism GraphPad
Tweezers, Style 2 Electron Microscopy Sciences 78326-42

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References

  1. Mullins, R. D., Heuser, J. A., Pollard, T. D. The interaction of Arp2/3 complex with actin: Nucleation, high affinity pointed end capping, and formation of branching networks of filaments. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95, (11), 6181-6186 (1998).
  2. Yang, C., Czech, L., Gerboth, S., Kojima, S., Scita, G., Svitkina, T. Novel Roles of Formin mDia2 in Lamellipodia and Filopodia Formation in Motile Cells. PLoS Biology. 5, (11), 317 (2007).
  3. Mogilner, A., Oster, G. Cell motility driven by actin polymerization. Biophysical Journal. 71, (6), 3030-3045 (1996).
  4. Mogilner, A., Oster, G. Force Generation by Actin Polymerization II: The Elastic Ratchet and Tethered Filaments. Biophysical Journal. 84, (3), 1591-1605 (2003).
  5. Pollard, T. D., Borisy, G. G. Cellular Motility Driven by Assembly and Disassembly of Actin Filaments. Cell. 112, (4), 453-465 (2003).
  6. Wu, C., et al. Arp2/3 is critical for lamellipodia and response to extracellular matrix cues but is dispensable for chemotaxis. Cell. 148, (5), 973-987 (2012).
  7. Steffen, A., et al. Rac function is crucial for cell migration but is not required for spreading and focal adhesion formation. Journal of cell science. 126, Pt 20 4572-4588 (2013).
  8. Gupton, S. L., et al. Cell migration without a lamellipodium. The Journal of Cell Biology. 168, (4), 619-631 (2005).
  9. Dimchev, V., et al. Induced Arp2/3 Complex Depletion Increases FMNL2/3 Formin Expression and Filopodia Formation. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 634708 (2021).
  10. Leithner, A., et al. Diversified actin protrusions promote environmental exploration but are dispensable for locomotion of leukocytes. Nature cell biology. 18, (11), 1253-1259 (2016).
  11. Giannone, G., Dubin-Thaler, B. J., Döbereiner, H. -G., Kieffer, N., Bresnick, A. R., Sheetz, M. P. Periodic Lamellipodial Contractions Correlate with Rearward Actin Waves. Cell. 116, (3), 431-443 (2004).
  12. Dubin-Thaler, B. J., et al. Quantification of Cell Edge Velocities and Traction Forces Reveals Distinct Motility Modules during Cell Spreading. PLoS ONE. 3, (11), 3735 (2008).
  13. Suraneni, P., Rubinstein, B., Unruh, J. R., Durnin, M., Hanein, D., Li, R. The Arp2/3 complex is required for lamellipodia extension and directional fibroblast cell migration. The Journal of cell biology. 197, (2), 239-251 (2012).
  14. Wang, C., et al. Deconvolution of subcellular protrusion heterogeneity and the underlying actin regulator dynamics from live cell imaging. Nature Communications. 9, (1), 1688 (2018).
  15. Dimchev, G., et al. Lamellipodin tunes cell migration by stabilizing protrusions and promoting adhesion formation. Journal of cell science. 133, (7), 239020 (2020).
  16. Burnette, D. T., et al. A role for actin arcs in the leading-edge advance of migrating cells. Nature cell biology. 13, (4), 371-381 (2011).
  17. Yamada, K. M., Kennedy, D. W. Dualistic nature of adhesive protein function: fibronectin and its biologically active peptide fragments can autoinhibit fibronectin function. The Journal of Cell Biology. 99, (1), 29-36 (1984).
  18. Cai, Y., et al. Nonmuscle Myosin IIA-Dependent Force Inhibits Cell Spreading and Drives F-Actin Flow. Biophysical Journal. 91, (10), 3907-3920 (2006).
  19. Humphries, M. J. Cell adhesion assays. Molecular Biotechnology. 18, (1), 57-61 (2001).
  20. Cavalcanti-Adam, E. A., Volberg, T., Micoulet, A., Kessler, H., Geiger, B., Spatz, J. P. Cell Spreading and Focal Adhesion Dynamics Are Regulated by Spacing of Integrin Ligands. Biophysical Journal. 92, (8), 2964-2974 (2007).
  21. Dubin-Thaler, B. J., Giannone, G., Döbereiner, H. -G., Sheetz, M. P. Nanometer Analysis of Cell Spreading on Matrix-Coated Surfaces Reveals Two Distinct Cell States and STEPs. Biophysical Journal. 86, (3), 1794-1806 (2004).
  22. Gauthier, N. C., Fardin, M. A., Roca-Cusachs, P., Sheetz, M. P. Temporary increase in plasma membrane tension coordinates the activation of exocytosis and contraction during cell spreading. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, (35), 14467-14472 (2011).
  23. Wolfenson, H., Iskratsch, T., Sheetz, M. P. Early Events in Cell Spreading as a Model for Quantitative Analysis of Biomechanical Events. Biophysical Journal. 107, (11), 2508-2514 (2014).
  24. Guan, J. -L., Berrier, A. L., LaFlamme, S. E. Cell Migration, Developmental Methods and Protocols. Methods in molecular biology. 294, Clifton, N.J. 55-68 (2004).
  25. Raucher, D., et al. Phosphatidylinositol 4,5-Bisphosphate Functions as a Second Messenger that Regulates Cytoskeleton-Plasma Membrane Adhesion. Cell. 100, (2), 221-228 (2000).
  26. Machacek, M., Danuser, G. Morphodynamic Profiling of Protrusion Phenotypes. Biophysical Journal. 90, (4), 1439-1452 (2006).
  27. Zack, G. W., Rogers, W. E., Latt, S. A. Automatic measurement of sister chromatid exchange frequency. The journal of histochemistry and cytochemistry official journal of the Histochemistry Society. 25, (7), 741-753 (1977).
  28. Bardsley, W. G., Aplin, J. D. Kinetic analysis of cell spreading. I. Theory and modelling of curves. Journal of cell science. 61, 365-373 (1983).
Analisi quantitativa della dinamica dei bordi cellulari durante la diffusione cellulare
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Iu, E., Bogatch, A., Plotnikov, S. V. Quantitative Analysis of Cell Edge Dynamics during Cell Spreading. J. Vis. Exp. (171), e62369, doi:10.3791/62369 (2021).More

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