Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Kvantitativ analyse av cellekantdynamikk under cellespredning

Published: May 22, 2021 doi: 10.3791/62369
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Cell and Systems Biology, University of Toronto
* These authors contributed equally

Summary

I denne protokollen presenterer vi eksperimentelle prosedyrer for en cellespredningsanalyse som er basert på levende cellemikroskopi. Vi tilbyr et beregningsverktøy med åpen kildekode for objektiv segmentering av fluorescerende merkede celler og kvantitativ analyse av lamellipodiadynamikk under cellespredning.

Abstract

Celleoppslag er en dynamisk prosess der en celle som er suspendert i medier, knyttes til et underlag og flater seg ut fra en avrundet til en tynn og spredt form. Etter celle-substratet danner cellen et tynt ark med lamellipodia som kommer fra cellekroppen. I lamellipodia polymeriserer kulefikale aktin (G-aktin) monomerer til et tett filamentøst aktin (F-aktin) maskearbeid som skyver mot plasmamembranen, og gir dermed de mekaniske kreftene som kreves for at cellen skal spre seg. Spesielt er de molekylære spillerne som kontrollerer aktinpolymeriseringen i lamellipodia avgjørende for mange andre cellulære prosesser, for eksempel cellemigrasjon og endokytose.

Siden spredning av celler danner kontinuerlig lamellipodia som spenner over hele celleperiphery og vedvarende ekspanderer utover, har cellespredningsanalyser blitt et effektivt verktøy for å vurdere kinetikken til lamellipodiale fremspring. Selv om flere tekniske implementeringer av cellespredningsanalysen er utviklet, mangler det for tiden en detaljert beskrivelse av arbeidsflyten, som vil inkludere både en trinnvis protokoll og beregningsverktøy for dataanalyse. Her beskriver vi de eksperimentelle prosedyrene for cellespredningsanalysen og presenterer et åpen kildekodeverktøy for kvantitativ og objektiv analyse av cellekantdynamikk under spredning. Kombinert med farmakologiske manipulasjoner og/eller gen-silencing teknikker, er denne protokollen egnet til en storskala skjerm av molekylære spillere som regulerer lamellipodiale fremspring.

Introduction

Lamellipodiale fremspring er fremtredende cytoskeletale strukturer dannet på forsiden av en migrerende celle. I lamellipodia skaper polymerisering av aktin ved hjelp av Arp2/3-komplekset og formins et raskt voksende forgrenet aktinnettverk som skyver mot plasmamembranen1,2. Trykkkraften som genereres av aktinnettverket, driver fysisk cellen fremover1,3,4,5. Uttømming av Arp2/3-komplekset eller forstyrrelse av signalveier som er avgjørende for lamellipodiale fremspring, svekker ofte cellemigrasjon6, 7. Selv om migrasjon av lamellipodia-mangelfulle celler også har blitt rapportert8,9, er betydningen av lamellipodia i cellemigrasjon tydelig som uttømming av denne fremspringende strukturen perturberer cellens evne til å bevege seg gjennom komplekse biologiske mikromiljøet6,10.

En stor hindring for å forstå reguleringen av lamellipodia i migrerende celler er den naturlige variasjonen i lamellipodial fremspring kinetikk, størrelse og form11,12,13,14. Videre har nyere studier vist at lamellipodia viser kompleks fremspringende oppførsel, inkludert svingende, periodiske og akselererende fremspring14,15. Sammenlignet med den svært variable lamellipodia av migrerende celler6,16, er lamellipodia dannet under cellespredning mer ensartet12. Siden den fremspringende aktiviteten med å spre og migrere celler er drevet av identiske makromolekylære samlinger, som inkluderer et forgrenet aktinnettverk, sammentrekningsformede actomyosinbunter og integrinbaserte cellematriseadhesjoner17,18, har spredningsceller blitt mye brukt som modell for å undersøke reguleringen av lamellipodiadynamikk.

Cellespredning er en dynamisk mekanokjemisk prosess der en celle i suspensjon først holder seg til et substrat gjennom integrinbaserte adhesjoner17,19,20 og deretter sprer seg ved å utvide aktinbaserte fremspring21,22,23. Under spredningsfasen stikker lamellipodia ut fra cellekroppen isotropisk og vedvarende med liten eller ingen tilbaketrekning eller stalling12. De mest brukte cellespredningsprotokollene er endepunktanalyser, der spredning av celler er faste på forskjellige tidspunkter etter plating19,24. Disse analysene, selv om de er raske og enkle, er begrenset i sin diagnostiske kraft til å oppdage endringer i de dynamiske egenskapene til lamellipodia. For å bestemme de molekylære mekanismene som kontrollerer lamellipodiadynamikken, var Sheetz-gruppen en pioner innen bruk av kvantitativ analyse av levende spredningsceller og avdekket mange grunnleggende egenskaper ved cellekantprotrudering11,12,22. Disse studiene har vist at live-celle spredningsanalysen er en robust og kraftig teknikk i verktøykassen til et cellebiologisk laboratorium. Til tross for det er et detaljert protokoll- og åpen kildekode-beregningsverktøy for en live-celle spredningsanalyse for tiden utilgjengelig for cellebiologisamfunnet. For dette formål skisserer protokollen vår prosedyrene for avbildning av direkte spredningsceller og gir et automatisert bildeanalyseverktøy. For å validere denne metoden brukte vi Arp2/3-hemming som eksperimentell behandling og viste at hemming av funksjonen til Arp2/3-komplekset ikke arresterte cellespredning, men forårsaket en betydelig reduksjon i celleutstikkhastigheten, samt stabiliteten til cellekantutstikk, noe som ga opphav til hakkede cellekanter. Disse dataene viser at kombinasjonen av levende celleavbildning og automatisert bildeanalyse er et nyttig verktøy for å analysere cellekantdynamikk og identifisere molekylære komponenter som regulerer lamellipodia.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Celle såing

MERK: Den beskrevne cellespredningsprotokollen ble utført ved hjelp av musens embryonale fibroblaster (MEFer) som uttrykker PH-Akt-GFP (en fluorescerende markør for PIP3/PI(3,4)P2). Denne cellelinjen ble generert ved genomisk integrering av en uttrykkskonstruksjon for PH-Akt-GFP (Addgene #21218) ved CRISPR-mediert genredigering. Imidlertid kan andre fluorescerende markører som uttrykkes forbigående eller integrert i genomet også brukes i denne analysen. For optimal bildesegmentering anbefaler vi å bruke fluorescerende markører som er jevnt fordelt i cytoplasma, for eksempel cytoosolic GFP.

  1. Kultur en 10 cm tallerken med celler til 90% samløp.
  2. Når cellene har oppnådd riktig samløp, plasser en 22 mm x 22 mm dekslelip (#1,5; 0,17 mm tykkelse) i en 35 mm cellekulturfat. Belegge dekslene med 400 μL fibronektin som er fortynnet i PBS til en endelig konsentrasjon på 2,5 μg/ml.
    MERK: Antall deksler som kreves for analysen bestemmes av antall eksperimentelle forhold og teknisk kopi.
  3. Plasser den 35 mm parabolen med fibronectinbelagte deksler i en 37 °C, 5 % CO 2-inkubator i 1 time.
  4. Fjern parabolen med dekslene fra inkubatoren. Aspirer fibronectin og vask dekslene med PBS ved å forsiktig pipettere rundt dekslene to til tre ganger.
  5. Aspirer cellekulturmediene fra 10 cm parabolen av celler og vask parabolen med PBS.
  6. Tilsett 650 μL 0,05% trypsin-EDTA til den 90% konfluente parabolen av celler, vippe parabolen for å fordele enzymet jevnt. Plasser parabolen med trypsin i inkubatoren i 1 minutt.
  7. Fjern parabolen med cellene fra inkubatoren. Tilsett 10 ml cellekulturmedier i et 15 ml sentrifugerør. Legg raskt ytterligere 10 ml medier inn i parabolen for å slukke trypsin.
  8. Pipette 1 ml av de trypsiniserte cellene inn i 15 ml sentrifugerøret for å fortynne cellene. Pipette innholdet i røret opp og ned for å sikre en jevn fordeling av celler i mediet. For celletyper med høy aggregasjonspropensitet anbefales det å filtrere celler gjennom en cellesil (100 μm maskestørrelse) for å minimere forekomsten av cellekumping.
  9. Fra røret, pipette 500 - 1000 μL fortynnede celler inn i 35 mm parabolen som inneholder dekslene.
  10. Rist forsiktig parabolen for jevnt å spre ut cellene. Kontroller at dekslene er på ~10 % samløp (~50 000 celler/ml) og juster volumet av fortynnede celler etter behov.
    MERK: Hensikten med å ha celler med så lav samløp er å sikre at det er 1-2 polariserte celler i hvert synsfelt som vil bli brukt til å fokusere målet gjennom hele cellespredningsanskaffelsen.
  11. Passasje 1/5 av de resterende cellene i 10 cm parabolen i en 6 cm tallerken per behandlingstilstand. Plasser de passerende rettene og den 35 mm parabolen med dekslene i inkubatoren over natten.
    MERK: Dette vil være cellene som vil bli analysert for spredning av dynamikk.

2. Narkotika inkubasjon og cellegjenoppretting

  1. Tilsett 5 ml cellekulturmedier i hvert av to 15 ml sentrifugerør, og 20 ml fenolrød fri DMEM i hvert av to 50 ml sentrifugerør.
    MERK: Antall rørpar (15 ml + 50 ml) skal tilsvare antall eksperimentelle forhold.
  2. For å teste betydningen av Arp2/3 for cellespredning, pipette enten den farmakologiske hemmeren til Arp2/3, CK-666 eller kontrollbehandlingen, for eksempel DMSO, i hvert par sentrifugerør opp til ønsket konsentrasjon.
  3. Fjern de passerende 6 cm rettene (se trinn 1.11) fra inkubatoren og aspirer mediet. Vask oppvasken med varm PBS.
  4. Tilsett innholdet i CK-666- eller DMSO-supplerte 15 ml sentrifugerør i hver av de passasjede rettene. Merk hver tallerken med riktig legemiddelbehandling og legg oppvasken i inkubatoren i en time.
  5. Fjern oppvasken fra inkubatoren og aspirer media. Vask oppvasken med varm PBS for å fjerne alle gjenværende fenolrøde medier grundig.
  6. Tilsett 230 μL 0,05% trypsin-EDTA til hver 6 cm tallerken og inkuber celler i 1 minutt.
    MERK: Hvis det er aktuelt, kan trypsin erstattes av en ikke-proteolytisk celleadhesjonsblokkering.
  7. Fjern oppvasken fra inkubatoren. For hver behandling, tilsett 5 ml legemiddel-supplert fenol rødfri DMEM i en 15 ml sentrifuge rør utpekt som "Tube B". Tilsett ytterligere 5 ml av de samme mediene i den aktuelle parabolen for å slukke trypsin. Overfør innholdet i parabolen til et 15 ml sentrifugerør merket som "Rør A".
  8. Overfør 1 ml celler fra rør A til rør B. Gjenta for hver behandling.
  9. Plasser rør A og B i inkubatoren i 45 minutter for å la cellene komme seg etter trypsinisering. Løsne lokket på sentrifugerørene litt før du plasserer dem i inkubatoren for å tillate CO 2-penetrans.
    MERK: Varigheten av gjenopprettingstiden kan variere for forskjellige celletyper. Selv om 45-minutters gjenoppretting i våre eksperimenter hadde en ubetydelig effekt på celle levedyktigheten, kan noen celletyper gjennomgå anoikis når de opprettholdes i suspensjon for lenge. Derfor anbefaler vi å bestemme den optimale gjenopprettingstiden empirisk. Den optimale gjenopprettingstiden muliggjør rask og synkron cellespredning uten døde eller apoptotiske celler i prøven.

3. Magnetisk kammerforberedelse

  1. Påse at alle deler av et 1 Brønn chamlidecellemagnetisk kammer som har plass til en firkantdeksle på 22 mm x 22 mm, er rengjort før bruk.
  2. Fjern den 35 mm fatet med dekslene (se trinn 1.11) fra inkubatoren. Aspirer cellekulturmediene og vask dekslene med varm PBS.
  3. Fjern dekslene fra 35 mm parabolen med et par tang og legg forsiktig dekslene på bunnplaten på det magnetiske kammeret.
  4. Plasser silikonpakningen på toppen av dekslene.
    MERK: En feilplassert silikonpakning er den vanligste årsaken til et lekket magnetisk kammer. Pass på at pakningen hviler i innrykket på bunnplaten og ikke stiger utover innrykket.
  5. Fest hoveddelen på bunnplaten.
    MERK: Gjør denne delen veldig sakte. Et godt tips er å holde bunnplaten nede med en hånd mens du plasserer hoveddelen på toppen. Dette sikrer at hoveddelens magneter ikke løfter bunnplaten opp, noe som potensielt kan fortrenge og knekke dekslene.
  6. Tilsett 1 ml legemiddelsupplert fenolrød fri DMEM til magnetkammeret. Ta et lofritt vev og forsiktig dab kabinettet mellom hoveddelen og bunnplaten for å se etter lekkasjer.
    MERK: Hvis det er lekkasje, aspirerer du raskt mediet og fortsetter igjen fra trinn 3.4.
  7. Senk det gjennomsiktige dekselet på hoveddelen for å omslutte det magnetiske kammeret.
  8. Spray et laboratorievev først med vann og tørk bunnen av det magnetiske kammeret (dekslene, ikke metalldelen). Spray deretter et annet laboratorievev med en liten mengde 70% etanol og tørk, vær forsiktig så du ikke knekker dekslene.

4. Bildeoppkjøp

  1. Forvarm scenen topp inkubator og objektiv varmeapparatet til 37 °C og sett CO2-nivået i trinntoppen inkubator til 5%.
    MERK: Hvis scenens toppinkubator ikke er koblet til en CO2-forsyning, bør cellekulturmediet suppleres med 25 mM HEPES for å opprettholde konstant pH 7.4.
  2. Påfør tilstrekkelig mengde nedsenkningsolje på det forvarmede oljemålet 60X, 1,4 N.A.
    MERK: Vi bruker et 60X, 1.4 N.A. olje nedsenking mål i denne protokollen på grunn av sin rimelig store synsfelt og fremragende lys samling effektivitet. Hvis et større synsfelt kreves, kan et lavere forstørrelsesmål (for eksempel20x) brukes så lenge signal-til-støy-forholdet mellom bildene er større enn 2,5.
  3. Ta både det ferdige magnetiske kammeret og rør B (trinn 2.9) til det konfiske mikroskopet. Plasser det magnetiske kammeret på scenen øverst inkubator.
    MERK: Plasser magnetkammeret forsiktig på scenen for å unngå å lage bobler i nedsenkningsoljen.
  4. Sett fokus på fluorescerende celler ved hjelp av GFP-kanalen. Kontroller at cellekanten er skarp og veldefinert.
  5. Fjern det gjennomsiktige dekselet til det magnetiske kammeret og pipetten 500 μL fra rør B inn i magnetkammeret. Plasser det gjennomsiktige dekselet tilbake på toppen av det magnetiske kammeret.
  6. For å identifisere celler som er ideelle for cellespredningsanalyse, søk etter "glorier" av celler som ennå ikke er festet til dekslene, men som ikke lenger ruller rundt. Celler som er i de tidligste stadiene av coverlip vedlegg er også gode kandidater, men bildeoppkjøp må være rask for å fange spredning.
  7. Konfigurer bildeanskaffelsen for den grønne kanalen til å inkludere fire synsfelt, avbildet med 6 sekunders intervaller.
    MERK: På grunn av den høye variasjonen av lamellipodia fremspringhastighet blant forskjellige celletyper, bør den optimale bildefrekvensen bestemmes empirisk. Bildeintervallet på 6 sekunder som brukes i våre eksperimenter er et godt utgangspunkt for analyse av mange mesenchymale og epitelceller. Celler som sprer seg veldig raskt(f.eks.immunceller), kan imidlertid kreve en mye høyere bildefrekvens (kortere bildeintervall). Den optimale bildefrekvensen for cellespredning av filmer sikrer en forskyvning på 2-5 piksler for den fremspringende cellekanten mellom etterfølgende delbilder. Tatt i betraktning nøyaktigheten av kurvetilpasning som brukes til å identifisere platået for cellespredning, bør den optimale bildefrekvensen også sikre 50-100 målinger av cellekantforskyvning under den raske ekspansjonsfasen av cellespredning. Antall synsfelt bør justeres avhengig av eksponeringstid, avstanden mellom anskaffelsespunkter og trinnbevegelseshastigheten. Brukere anbefales å bestemme maksimalt antall synsfelt som kan anskaffes med ønsket bildefrekvens.
  8. Når du har identifisert et passende synsfelt, lagrer du X- og Y-koordinatene til mikroskopstadiet. Fortsett med å identifisere tre andre synsfelt som er relativt nær hverandre på forsiden. Lagre koordinatene til mikroskopstadiet for hvert ønskede synsfelt.
    MERK: Det anbefales på det sterkeste å optimalisere scenebevegelsesbanen mellom synsfelt for å minimere unødvendig prøvebevegelse. Slik optimalisering kan utføres enten manuelt eller automatisk. Overdreven prøvebevegelse reduserer anskaffelsen og kan føre til at celler rulles ut av syne etter hvert som de synker.
  9. Skaff bilder i 15 minutter med en bildefrekvens på 6 sekunder og lagre filene. Hvis det kreves flere anskaffelser, gjentar du fra og med trinn 4.6.

5. Analyse av celleområde, sirkularitet og fremspringsdynamikk under cellespredning

  1. Klargjøre bilder for databehandling og analyse
    MERK: Programvaren krever et bilde i .tiff format og en pikselstørrelse som inndataparametere. Begge kravene kan oppfylles ved hjelp av anskaffelsesprogramvaren eller Fiji (i denne protokollen). Hvis disse kravene er oppfylt, går du videre til trinn 5.2.
    1. Installer den nyeste versjonen av Fiji-programmet (https://imagej.net/Fiji/Downloads).
    2. Åpne et tidsforløpbilde ved hjelp av Fiji.
    3. Kopier pikselstørrelsen på bildet ved å velge Egenskaper for bilde >. Kopier og lim inn pikselstørrelsen i μm til Notisblokk/Word.
    4. Hvis du vil analysere celleoppslagsområdet og sirkulariteten, lagrer du bildet for tidsforløp som en tiff-bildestakk. Programvaren for tilpasset analyse støtter ikke proprietære filformater. Lagre den individuelle tiff-cellebildestakken ved å velge Fil > Lagre som > Tiff.
  2. Installer Python IDE (Spyder) og de nødvendige pakkene (PySimpleGUI og tifffile) for databehandling og analyse.
    MERK: Installasjonen av Python og pakker er bare nødvendig for det første oppsettet.
    1. Tidsforløpfilmene vil bli analysert i Spyder IDE ved hjelp av et spesialbygget Python-skript. For å laste ned Spyder IDE, last ned Anaconda-distributøren (https://www.anaconda.com/products/individual) som inkluderer Spyder IDE og de fleste nødvendige biblioteker og pakker for denne analysen.
    2. Installer Anaconda og start Spyder gjennom Anaconda Navigator.
    3. I IPython-konsollfanen (nederst til høyre i Spyder) kopierer og limer du inn følgende kommando: pip installer PySimpleGUI og trykk enter-tasten. Hvis du kjører denne kommandoen, installeres pakken som kreves for å starte det grafiske brukergrensesnittet.
    4. I samme konsoll kopierer og limer du inn følgende kommando: pip install tifffile og trykker enter-tasten. Hvis du kjører denne kommandoen, installeres pakken som trengs for å lagre bilder som TIFF-filer.
    5. Last ned alle Python-skriptene fra tilleggsfilene eller de mest oppdaterte skriptene fra GitHub på: https://github.com/ernestiu/Cell-spreading-analysis.git
  3. Kvantifisere celleområde- og celleformfaktorer under cellespredning
    1. Åpne hovedanalyseskriptet "cell_spreading_GUI.py" ved å velge alternativet for åpen fil i topppanelet på Spyder eller ved hjelp av snarveien Ctrl + O.
    2. Åpne brukergrensesnittet for cellespredningsanalyse ved å velge Kjør fil i det øverste panelet eller ved hjelp av snarveien F5.
    3. Velg kategorien Celleoppslagsområde (Figur 3A).
    4. Velg tiff-bildet som skal analyseres ved hjelp av blaknappen.
      MERK: Den valgte filen må være en TIFF-fil.
    5. Angi målmappen der datautganger (f.eks. cellemasker, verdier) skal lagres.
    6. Angi innstillinger for datautdata:
      1. Lagre masker: Lagre cellemasker som genereres under segmenteringsprosessen.
      2. Eksportere data: Eksporter et Excel-regneark (.xlsx) som inneholder alle analysedataene, til målmappen.
        Celleområde, sirkularitet og størrelsesforhold for alle spredende celler lagres som et Excel-regneark i målmappen. Celleområdet beregnes som:
        Equation 1 
        Cellesirkulariteten er et mål på hvor nær en celle er en perfekt rund celle. Den beregnes som:
        Equation 2 
        der A og P er henholdsvis celleområdet og celleperimeteren. Størrelsesforholdet i cellen representerer hvor langstrakt cellen er. En spredningscelle bør ha et størrelsesforhold nær 1. Størrelsesforholdet beregnes som:
        Equation 3 
      3. Lagre konturer: Lagre bildene av cellegrensekonturen i målmappen.
    7. Angi segmenteringsinnstillingene
      1. Vis segmentering: Vis segmenteringsresultatet i Spyder-konsollen under analyseprosessen.
      2. Minste celleområde (μm2): Skriv inn minimumsverdien for celleområdet, inkludert områdeverdier for celler i begynnelsen av vedlegget. Objekter med et område som er mindre enn denne terskelen, regnes ikke som spredningsceller. Dette nummeret vil påvirke segmenteringsprosessen.
    8. Angi bildeparameterne.
      1. Anskaffelsesintervall(er): Angi hyppigheten av bildeanskaffelsen i sekunder.
      2. Pikselstørrelse (μm): Angi pikselstørrelsen som ble registrert under klargjøring av bilder for analyse.
      3. Bildebitdybde: Angi bitdybden til kameraet/detektoren.
    9. Klikk Kjør. Hvis det oppstår en feil, vises en feilmelding i Spyders konsoll. Ellers vises bildeanalyseprosessen i konsollen.
      MERK: Det første bildet som vises i konsoll/plott-delen (avhengig av Spyder-innstillingene) viser alle cellene som er identifisert i synsfeltet. Grønne bokser plassert rundt cellene indikerer spredningsceller som passer for segmentering og analyse. Grå bokser angir celler som ikke er egnet for analyse. Totalt antall identifiserte spredningsceller vises også i kategorien Konsoll . Programvaren plotter celleområdet (i blått) og celle sirkularitet (i rødt) som en funksjon av tid. Disse grafene lar brukerne evaluere nøyaktigheten av cellesegmentering. En vellykket segmentering gir en monotont økende kurve for celleområdet. For å oppnå en representativ kurve av cellespredningsområdet, bør oppholdsfasen fjernes manuelt fra grafen. Oppholdsfasen inneholder målinger av celleområdet før cellen begynner å spre seg. Oppholdsfasen indikeres av raske svingninger, som representert i celleområdeplottet (Figur 3C høyre).

6. Kvantifisere cellekantdynamikk under cellespredning ved hjelp av kymografer

  1. Før du kjører analysen, må du beskjære råfilmene med å spre celler for å lage tidsserier med individuelle spredningsceller.
    1. Bruk rektangelverktøyet på fiji-verktøylinjen til manuelt å velge et område av interesse (ROI) som innkapsler en enkelt celle. (For å sikre at avkastningen innkapsler spredningscellen fullstendig, bruker du rullefunksjonen til å inspisere avkastningen til enhver tid.)
    2. Høyreklikk avkastningen, og velg Dupliser.
    3. Merk av for Duplikatstakk , og klikk OK.
  2. Åpne hovedanalyseskriptet "cell_spreading_GUI.py" ved å velge Åpne fil -knappen i Spyders verktøylinje eller ved hjelp av snarveien Ctrl + O. Hvis GUI allerede er åpnet, går du direkte til trinn 6.3.
  3. Åpne brukergrensesnittet for cellespredningsanalyse ved å velge Kjør fil i det øverste panelet eller ved hjelp av snarveien F5 (Figur 3B).
  4. Klikk kategorien Kymografigenerator og analyse .
  5. Bruk Bla gjennom-knappen til å velge tiff-bildet for analysen.
    MERK: Proprietære filformater, for eksempel nd2, lif, zen, støttes ikke av skriptet.
  6. Angi målmappen for lagring av utdatadata (cellemasker og verdier).
  7. Angi utdatainnstillingene.
    1. Eksportere data: Eksporter et Excel-regneark (.xlsx) til målmappen som inneholder relative cellekantposisjoner og tilbaketrekkingshendelser for kymografiene.
  8. Angi bildeparameterne:
    1. Anskaffelsesintervall(er): Angi bildeanskaffelsesfrekvensen i sekunder.
    2. Pikselstørrelse (μm): Angi pikselstørrelsen som ble registrert da du forberedte bilder for analysen i trinn 5.1.3.
    3. Minste celleområde (μm2): Skriv inn minimumsverdien for celleområdet, inkludert områdeverdier for celler i begynnelsen av vedlegget. Objekter med et område som er mindre enn denne terskelen, regnes ikke som spredningsceller. Dette nummeret vil påvirke segmenteringsprosessen.
    4. Bildebitdybde: Angi bitdybden til kameraet/detektoren.
  9. Klikk Kjør. Hvis det oppstår en feil, vises en feilmelding i Spyders konsoll. Ellers vises et sammendrag av utstikksdynamikken i konsollen. Det vil være 4 par tilbaketrekkingsfrekvens og fremspringhastighetsmålinger, som er hentet fra 4 kymografier generert fra øvre, nedre, venstre og høyre del av cellen. Tilbaketrekkingsfrekvensen beregnes som:
    Equation 4 
    MERK: Dette tallet viser hvor ofte lamellipodiumet trekker seg tilbake i løpet av spredningen. Den gjennomsnittlige fremspringhastigheten måles ved skråningen mellom begynnelsen av fremspringet og platåpunktet på kymografen. En oppsummering av kymografifiguren vises i konsollen etter segmenteringen. For å lagre sammendragsfiguren, høyreklikk på figuren og lagre bildet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Protokollen ovenfor beskriver de eksperimentelle prosedyrene for live-celleavbildning av spredningsceller og et beregningsverktøy for kvantitativ analyse av cellespredningsdynamikk. Beregningsverktøyet kan brukes i et lav- eller høygjennomstrømningsformat for å identifisere molekylære aktører som regulerer aktinpolymeriseringsmaskineriet i celleforkanten.

Den skjematiske representasjonen av de eksperimentelle prosedyrene er avbildet i figur 1. Cellespredningsanalysen ble utført på udødelige museembryofibroblaster som stabilt uttrykte pleckstrin homology (PH) domenet til Akt protein kinase merket med eGFP25. Cellene ble løsnet med trypsin-EDTA og fikk lov til å gjenopprette i suspensjon i 45 minutter. Under gjenopprettingstrinnet etterfylt cellene sine integrinske reseptorer på plasmamembranen som indikert av den raske og synkrone vedlegget av de gjenvunne cellene til fibronectinbelagte deksler (Figur 2). Uten gjenopprettingsperioden viste spredning av celler en bred fordeling av cellestørrelse som indikerer høy variasjon i utbruddet av cellespredning (figur 2A og B). Deretter ble celler belagt på en fiducially-merket coverlip og deres spredningsdynamikk ble visualisert ved å spinne disk konfokal mikroskopi (skjemaer vist i figur 1A - H). Gjennom bildeanskaffelsen vurderte vi synsfelt som inneholdt celler med et signal-til-støy-forhold på 2,5 eller høyere. Dette var en viktig vurdering da den påfølgende bildesegmenteringen er følsom for cellenes fluorescensintensitet i forhold til bakgrunnen. I våre eksperimenter kjøpte vi bilder hvert6.  I samsvar med tidligere rapporter16, imaging med en 6 sekunders bildefrekvens sikret tilstrekkelig tidsoppløsning for å fange dynamikken i individuelle fremspring og tilbaketrekningshendelser, samtidig som vi kunne skaffe oss flere synsfelt parallelt. De resulterende tidsforløpbildene ble analysert ved hjelp av den spesialbygde Python -programvaren (Figur 3).

En objektiv kvantifisering av cellespredning ble utført ved hjelp av to distinkte analytiske prosedyrer: (i) Morfodynamisk profilering av spredningsceller (Figur 3A, C og 4) og (ii) Kymografanalyse av cellekantdynamikk (Figur 3B og 5). Analysen av cellespredning ved morfodynamisk profilering innebærer automatisert deteksjon av sprednings- og fiduciale celler innen synsfeltet (figur 3C venstre), etterfulgt av en bildesegmentering fra ramme for ramme og deteksjon av spredningscellegrensen. Segmenteringen utføres av global intensitet som terskelverdier for de enkelte delbildene. Terskelverdien beregnes som det lokale minimumet mellom første og andre intensitetsmodus på bildets histogram26. Bilder med et uimodalt, høyrevridd histogram segmenteres av trekantterskelalgoritmen27. Etter cellesegmentering ble de morfodynamiske egenskapene til spredningscellene (dvs. celleområde, størrelsesforhold og cellesirkularitet) beregnet (Figur 3C høyre).

I samsvar med publiserte resultater12,28, ble cellespredning drevet av en isotropisk utvidelse av lamellipodia som angitt av en sigmoidal form på det representative celleområdeplottet ( Figur3C høyre, blå kurve og S1). Arealtomten viste at celleområdet økte med ca. 3 ganger før det nådde et platå (Figur 4A og B). Gjennom hele prosessen med cellespredning forble cellene sirkulære (sirkularitet = 0,70 ± 0,076) og viste slørlignende fremspringende cellekanter, som indikerer lamellipodiale fremspring (figur 4C).

For å validere cellespredningsanalysen hemmet vi Arp2/3 med 100 μM CK-666 i 1 time og 45 minutter og vurderte effekten av denne behandlingen på cellespredningsdynamikken. I samsvar med tidligere rapporter13førte ikke undertrykkelsen av Arp2/3-aktiviteten til en betydelig reduksjon i cellespredningshastigheten (Figur 4A og B, rosa kurve). Celleformanalysen viste imidlertid en signifikant forskjell i kontrollens sirkularitet og CK-666-behandlede celler (Kontroll: 0,70 ± 0,08 vs. CK-666: 0,54 ± 0,09, p < 0, 1 x 10-3) (Figur 4C). Mens kontrollcellene forble sirkulære til platået, fikk Arp2/3-hemmet celler en polygonal form som ble beholdt gjennom hele spredningsforløpet (figur 4A). Sammen viser disse eksperimentelle resultatene at den beskrevne cellespredningsanalysen avslører moderate endringer i cellemorfodynamikk forårsaket av perturbasjoner av aktinpolymeriseringsmaskineriet.

Mens morfodynamisk profilering ofte er tilstrekkelig til å oppdage grove endringer i cellespredningsdynamikken, har denne analysen begrenset evne til å identifisere spesifikke cytoskeletale komponenter som regulerer fremspring-tilbaketrekningssyklusene til cellekanten, og ber oss om å implementere et objektivt Kymograph Analysis-verktøy (Figur 5 venstre, stiplede linjer). Analysen av cellekanthastigheten viste en moderat, men signifikant reduksjon i gjennomsnittlig fremspringhastighet for Arp2/3-hemmede celler sammenlignet med kontroll (Kontroll: 37,1 ± 12,87 nm/s vs. CK-666: 28,7 ± 13,4 nm/s, p = 0,9 x10 -3) (Figur 5C). Videre var dynamikken i cellekanten av kontrollen og Arp2/3-hemmet celler bemerkelsesverdig forskjellige (Figur 5A og D). Kontrollcellene stakk ut vedvarende med lite eller ingen tilbaketrekninger i den raske ekspansjonsfasen, som varte i omtrent 200 sekunder, og viste periodiske tilbaketrekninger under platåfasen (Figur 5A og D). Utvidelsen av Arp2/3-hemmet celle ble derimot grepet inn av tilbaketrekningshendelser, betegnet med de røde prikkene på grafene (Figur 5B og D). Kvantifisering av tilbaketrekkingsfrekvens viste at Arp2/3-hemmede celler trakk seg tilbake 26 % oftere enn kontrollceller (Kontroll: 0,18 ± 0,22 s-1 vs. CK-666: 0,24 ± 0,19 s-1, p = 0,03) ( Figur5D). Disse dataene viser den høye følsomheten til kymografanalysen ved å oppdage milde endringer i lamellipodial dynamikk.

Figure 1
Figur 1: Den eksperimentelle arbeidsflyten foren cellespredningsanalyse. (A - H) Skjema for cellespredningsanalysen. (A) En 22 mm x 22 mm dekslelip er belagt med fibronektin fortynnet i PBS til en endelig konsentrasjon på 2,5 μg/ml. (B) En sammenhengende 10 cm tallerken med PH-Akt-GFP-uttrykkende mus embryonale fibroblaster (MEF-er) vaskes med PBS og behandles med 0,05% trypsin-EDTA. De trypsinbehandlede cellene deles deretter inn i et 15 ml sentrifugerør og en 6 cm vevskulturrett, som begge inneholder cellekulturmedier. (C) Fra det 15 ml sentrifugerøret pipetteres 500-1000 μL på den fibronektinbelagte dekslen. (D) Retten på 6 cm og den 35 mm tallerkenen med dekslene som inneholder de tynt frøede cellene, plasseres i en inkubator på 37 °C over natten. Når de er polarisert, vil disse cellene gi fokusrammen for cellespredningsanskaffelsen. (E) En time før bildeoppkjøp erstattes 6 cm parabolens medier med fenolrødt DMEM supplert med HEPES og stoffet av interesse. Etter 1 time behandles cellene med 0,05% trypsin-EDTA og overføres til et 15 ml sentrifugerør (rør A) som inneholder HEPES / legemiddeltilskuddt fenol rødfri DMEM. Cellene i rør A fortynnes deretter ytterligere i et annet 15 ml sentrifugerør (rør B), som er plassert i inkubatoren i 45 minutter. (F) Etter hvert som cellene gjenopprettes, fremstilles det magnetiske kammeret fra bunn til topp: først plasseres bunnplaten på en flat overflate, deretter dekslene med de polariserte cellene, silikonpakningen, hoveddelen av kammeret, og til slutt legges det gjennomsiktige dekselet på toppen. (G) 1 ml legemiddelsupplert fenolrød fri DMEM pipetteres inn i magnetkammeret, som deretter bringes til mikroskopstadiet. Et CFI-plan Apo Lambda 60X Oil-mål er valgt for bildeanskaffelse. (H) Det gjennomsiktige dekselet fjernes og 500 μL av rør Bs innhold pipetters inn i magnetkammeret. (I) For bildeanskaffelse vil passende synsfelt inneholde grønne "glorier", som er suspenderte celler som ennå ikke er festet til omslagsslipet. (J) Cellene er avbildet i 15 minutter. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Effekten av restitusjonstid på cellespredning. Celler opprettholdt i suspensjon for den angitte tiden (cellegjenopprettingstrinn i protokollen) ble belagt på fibronectinbelagte deksler i 15 minutter, festet med 4% paraformaldehyd og avbildet ved fasekontrastmikroskopi. (A) Topppaneler: fasekontrastbilder som er anskaffet med en 20X-målsetting. Bunnpaneler: vannskillesegmenterte cellemasker med celleområdene fargekodet. (B) Kvantifisering av celleområde. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Grafisk brukergrensesnitt (GUI) og arbeidsprinsippene for bildebehandlings- og analyseprogramvare. (A) GUI i kategorien "Cellespredningsområde". Se trinn 5.3 hvis du vil ha instruksjoner. (B) GUI i kategorien "Kymograph generator &analyse". Se trinn 6 hvis du vil ha instruksjoner. (C) Bildebehandlingssamlebåndet til programvaren. Programvaren identifiserer først spredningsceller (merket med en grønn markeringsramme) i hele synsfeltet. Spredningscellene identifiseres basert på intensitetsverdien, sirkulariteten og størrelsesforholdet. De identifiserte spredningscellene segmenteres deretter ramme for ramme ved hjelp av global intensitetsterskelverdi. Hver binærmaske behandles ved hjelp av median filtrering og binær hullfylling etterfulgt av morfologisk lukking for å jevne ut cellekanten. Den røde omrisset tilsvarer den segmenterte cellegrensen. Cellens område, størrelsesforhold og sirkularitet trekkes ut fra det binære cellekartet. Grafen viser området og sirkulariteten til en representativ celle over tid. Ved cellesåing begynner ikke celler å spre seg umiddelbart, noe som gir opphav til lagfasen sett på grafen. Etter forsinkelsesfasen spredte cellene seg raskt i den raske ekspansjonsfasen og til slutt nådde en platåfase. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Representative resultater av cellespredningsområdeanalyse ved Arp2/3-hemming. (A) Representative bilder av PH-Akt-GFP-uttrykkende MEFer som sprer seg på en fibronectin-belagt coverlip i løpet av 3 minutter. Den røde linjen angir cellegrensen som er trukket ut av cellesegmenteringsalgoritmen. Topppaneler: 0,1 % DMSO-behandlede celler. Bunnpaneler: 100 μM CK-666 (Arp2/3-hemmer)-behandlede celler. (B) Et diagram som viser celleoppslagsområdet over tid. Celleoppslagsområdet ble kvantifisert etter hvert som bretten endres i forhold til det gjennomsnittlige celleoppslagsområdet for kontrollceller. Blå og rosa linjer representerer henholdsvis kontroll- og Arp2/3-hemmet celler. De skyggelagte områdene angir det øvre og nedre standardavviket for celleoppslagsområdet. (C) En stolpetegning med individuelle datapunkt som viser gjennomsnittlig cellesirkularitet for kontroll og Arp2/3-hemmet celler. Alle feilfelt representerer standardavvik. *, p < 0,05, **, p < 0,01, ***, p < 0,001, n.s. (ikke signifikant, p > 0,05) som oppdaget av parametriske student t-tester. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Representative resultater av kymografanalyse av spredning av celler ved Arp2/3-hemming. (A - B) Representative bilder og kymografier hentet ut fra 0,1 % DMSO-behandlede (kontroll)celler og 100 μM CK-666-behandlede (Arp2/3-hemmer) celler. Venstre paneler: inverterte gråtonebilder av en kontroll og Arp2/3-hemmet celle. De stiplede linjene tilsvarer de forhåndsdefinerte linjene der kymografier ble trukket ut. Høyre paneler: kymografier trekkes ut langs de stiplede linjene som vises på gråtonebildene. Tegnegrensene er fargekodet slik at de samsvarer med de stiplede linjene i gråtonebildene. Den stiplede linjen i hvert plott angir hellingen til kurven som den gjennomsnittlige fremspringhastigheten ble beregnet fra. For å finne platåfasen ble det montert en logistisk vekstkurve på datapunktene, og platået ble avledet fra parameteren c (Tilleggsfigur 1). De røde prikkene angir tilbaketrekningshendelsene. (C) En stolpetegning med individuelle datapunkt som viser gjennomsnittlige fremspringhastigheter for kontrollen og Arp2/3-hemmet celler. Alle feilfelt representerer standardavvik. (D) En stolpetegning med individuelle datapunkt som viser hyppigheten av tilbaketrekkingshendelser for kontrollen og Arp2/3-hemmede celler. (C - D) *, p < 0,05, **, p < 0,01, ***, p < 0,001, n.s. (ikke signifikant, p > 0,05) som oppdaget av ikke-parametriske Mann-Whitney-tester. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Supplerende figur 1: En representativ kymograf og kurvetilpasningsresultatet. En kymografi hentet fra en spredningscelle. Den blå stiplede linjen tilsvarer avstanden til cellekanten i forhold til den første rammen. Den røde heltrukket linjen tilsvarer den monterte kurven. For å øke tilliten til kurvetilpasningen ble rådatapunktene først utjevnet av et Savitzky-Golay-filter. Etter kurvetilpasningen ble parameteren c, fra den logistiske ligningen, brukt til å identifisere platåpunktet. Rådatapunktet nærmest c er angitt som platåpunkt. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfiler. Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den beskrevne cellespredningsanalysen muliggjør kontinuerlig sporing av morfologiske endringer(f.eks. cellestørrelse og -form) og cellekantbevegelser (dvs. fremspringshastighet og tilbaketrekkingsfrekvens), som mangler i de fleste cellespredningsprotokoller19,24. Mens ofte brukte sluttpunktcellespredningsanalyser tillater bestemmelse av cellespredningshastighet, klarer ikke disse analysene å løse den tidsmessige dynamikken i cellekantbevegelser. Mangelen på tidsinformasjon begrenser evnen til å oppdage og kvantifisere endringer i lamellipodiale fremspring-tilbaketrekningssykluser.

Vår bildebehandlings- og analyseprogramvare utfører en strømlinjeformet analyse av spredningscellene, fra cellesegmentering til data kvantifisering. Manuelle bildeanalyser av cellespredning innebærer vanligvis et partisk utvalg av en terskelverdi eller bruk av en automatisert segmenteringsalgoritme, som ikke er egnet for eksperimenter med høy gjennomstrømning der mange bilder må analyseres. Vår programvare er derfor designet for å oppdage og segmentere spredning av celler på en automatisert måte, i tillegg til å kvantifisere fremspringdynamikk og morfologiske beskrivelser. Sammen gjør disse funksjonene den beskrevne protokollen egnet for screening av stor gjennomstrømning av signalveier og molekylære spillere som regulerer lamellipodia.

For å sikre at analysen av spredningsceller er robust og nøyaktig, må noen få kritiske trinn i protokollen utføres med ekstra forsiktighet. Det første trinnet i cellespredningsanalysen innebærer å plating fluorescerende merkede celler med svært lav tetthet på en fibronectin-belagt dekslelip dagen før avbildning (Figur 1A-D). Disse polariserte cellene muliggjør presis fokusering av spredningscellenes fremspringende kanter under bildeanskaffelsen. Hvis tettheten til polariserte celler er for høy, har spredning av celler stor sjanse for å lande på eller overlappe med de polariserte cellene, noe som kan føre til en cellesegmenteringsfeil. Gjenopprettingsperioden etter forsøk er et annet kritisk trinn i denne protokollen. Celler som behandles med stoffet av interesse, for eksempel DMSO eller CK-666, løsnes fra cellekulturretten av trypsin-EDTA (trinn 2), etterfulgt av en gjenopprettingsperiode på 45 minutter (figur 1E). Dette gjenopprettingstrinnet gjør det mulig for celler å gjenopprette fra den proteolytiske spaltingen av celleoverflateproteiner ved å prøve19,24 og synkroniserer utbruddet av cellespredning ( figur2). Hvis gjenopprettingstrinnet utelates, øker celle-til-celle-variasjonen i cellespredningsområdet, noe som reduserer konsistensen av den biologiske fenotypen.

Under bildeanskaffelsen reduserer enhver prøvedrift uunngåelig kvaliteten og presisjonen til cellespredningsanalysen, spesielt kymografanalysen. For å minimere prøvedriften, bør det treffes noen få tiltak. Først bør brukeren optimalisere scenebevegelsen under bildeanskaffelsen. Optimaliseringen inkluderer å minimere scenereise mellom synsfelt og redusere hastigheten på scenebevegelsen. For det andre er det viktig å tette prøven på mikroskopstadiet. Hvis disse foreslåtte tiltakene ikke eliminerer prøvedrift, bør etteranskaffelsesbehandling vurderes. Blant mange proprietære og åpen kildekode beregningsverktøy, anbefaler vi å bruke "Descriptor-basert registrering" Fiji plugin for å korrigere bildeskift og justere filmene i spredningsceller (instruksjoner finner du på: https://imagej.net/Descriptor-based_registration_(2d/3d)).

Det skal bemerkes at den kvantitative analysen av celleområder og kantdynamikk utført av programvaren avhenger sterkt av nøyaktigheten av cellesegmentering. For å sikre presis segmentering anbefaler vi å visualisere cellespredning ved hjelp av et konfokalt bildebehandlingssystem, helst et roterende diskkonfokalt mikroskop som tilbyr høy oppløsning, lav fotobleaching / fototoksisitet og høyt signal-til-støy-forhold. Et konfokalt mikroskop fjerner effektivt fluorescens utenfor fokus som avgis av spredningscellene, noe som ellers ville redusere bildesegmenteringsnøyaktigheten og cellegrensesporingen. Hvis et widefield-mikroskop brukes til bildeanskaffelse, kan ytterligere etteranskaffelsesbehandling, for eksempel bildedekonvolusjon, være nødvendig for å fjerne fluorescens utenfor fokus og forbedre nøyaktigheten av cellesegmentering. Derfor bør valget av bildesystemet vurderes.

Innenfor den beskrevne programvaren ble to bildesegmenteringsalgoritmer implementert og optimalisert for pålitelig å oppdage celler merket med dim til moderat lyse fluorescerende proteiner, for eksempel cytosoliske grønne og røde fluorescerende proteiner (GFP og RFP)26,27. Imidlertid har disse segmenteringsalgoritmene et begrenset dynamisk område og er ikke egnet for å oppdage celler merket med ekstremt lyse fluorescerende proteiner eller fargestoffer. I våre hender har disse algoritmene en tendens til å undersegmentere ekstremt lyse celler på grunn av skjevheten i bildets histogram mot høyintensitetspiksler. For lyse prøver kan bildenes intensiteter styres ved å justere eksponeringstiden eller utgangseffekten til eksitasjonslaseren.

Med disse hensynene i tankene er denne live-celle spredningsprotokollen et robust og kraftig verktøy for å studere dynamikken i lamellipodia. Den automatiserte bildeanalyseplattformen er egnet for mange biologiske undersøkelser, for eksempel høyinnholdsscreening av molekylære / signalfaktorer som regulerer lamellipodiale fremspring.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av Connaught Fund New Investigator Award til S.P., Canada Foundation for Innovation, NSERC Discovery Grant Program (tilskudd RGPIN-2015-05114 og RGPIN-2020-05881), University of Manchester og University of Toronto Joint Research Fund, og University of Toronto XSeed Program.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05% Trypsin (0.05%), 0.53 mM EDTA Wisent Bioproducts 325-042-CL
10.0 cm Petri Dish, Polystyrene, TC Treated, Vented Starstedt 83.3902
15 mL High Clarity PP Centrifuge Tube, Conical Bottom, with Dome Seal Screw Cap, Sterile Falcon 352097
1-Well Chamlide CMS for 22 mm x 22 mm Coverslip Quorum Technologies CM-S22-1
35 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish Falcon 353001
50 mL Centrifuge Tube, Transparent, Plug Seal Nest 602002
6.0 cm Cell Culture Dishes Treated for Increased Cell Attachment, Sterile VWR 10861-658
Arp2/3 Complex Inhibitor I, CK-666 Millipore Sigma 182515
Camera, Prime 95B-25MM Photometrics
Dimethyl Sulfoxide, Sterile BioShop DMS666
DMEM, 1x, 4.5 g/L Glucose, with L-Glutamine, Sodium Pyruvate and Phenol Red Wisent Bioproducts 319-005 CL
DMEM/F-12, HEPES, No Phenol Red Gibco 11039021
D-PBS, 1X Wisent Bioproducts 311-425 CL
Fetal Bovine Serum Wisent Bioproducts 080-110
Fiji Software ImageJ
HEPES (1 M) Gibco 15630080
Human Plasma Fibronectin Purified Protein 1 mg Millipore Sigma FC010
Immersion Oil Cargille 16241
L-Glutamine Solution (200 mM) Wisent Bioproducts 609-065-EL
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) Gibco 11140050
Micro Cover Glasses, Square, No. 11/2 22 x 22 mm VWR CA48366-227-1
Microscope Body, Eclipse Ti2-E Nikon
Objective, CFI Plan Apo Lambda 60X Oil Nikon MRD01605
Penicillin-Streptomycin Sigma P4333
Spinning Disk, Crest Light V2 CrestOptics
Spyder Anaconda
Stage top incubator Tokai Hit
Statistics Software, Prism GraphPad
Tweezers, Style 2 Electron Microscopy Sciences 78326-42

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mullins, R. D., Heuser, J. A., Pollard, T. D. The interaction of Arp2/3 complex with actin: Nucleation, high affinity pointed end capping, and formation of branching networks of filaments. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (11), 6181-6186 (1998).
  2. Yang, C., Czech, L., Gerboth, S., Kojima, S., Scita, G., Svitkina, T. Novel Roles of Formin mDia2 in Lamellipodia and Filopodia Formation in Motile Cells. PLoS Biology. 5 (11), 317 (2007).
  3. Mogilner, A., Oster, G. Cell motility driven by actin polymerization. Biophysical Journal. 71 (6), 3030-3045 (1996).
  4. Mogilner, A., Oster, G. Force Generation by Actin Polymerization II: The Elastic Ratchet and Tethered Filaments. Biophysical Journal. 84 (3), 1591-1605 (2003).
  5. Pollard, T. D., Borisy, G. G. Cellular Motility Driven by Assembly and Disassembly of Actin Filaments. Cell. 112 (4), 453-465 (2003).
  6. Wu, C., et al. Arp2/3 is critical for lamellipodia and response to extracellular matrix cues but is dispensable for chemotaxis. Cell. 148 (5), 973-987 (2012).
  7. Steffen, A., et al. Rac function is crucial for cell migration but is not required for spreading and focal adhesion formation. Journal of cell science. 126, Pt 20 4572-4588 (2013).
  8. Gupton, S. L., et al. Cell migration without a lamellipodium. The Journal of Cell Biology. 168 (4), 619-631 (2005).
  9. Dimchev, V., et al. Induced Arp2/3 Complex Depletion Increases FMNL2/3 Formin Expression and Filopodia Formation. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 634708 (2021).
  10. Leithner, A., et al. Diversified actin protrusions promote environmental exploration but are dispensable for locomotion of leukocytes. Nature cell biology. 18 (11), 1253-1259 (2016).
  11. Giannone, G., Dubin-Thaler, B. J., Döbereiner, H. -G., Kieffer, N., Bresnick, A. R., Sheetz, M. P. Periodic Lamellipodial Contractions Correlate with Rearward Actin Waves. Cell. 116 (3), 431-443 (2004).
  12. Dubin-Thaler, B. J., et al. Quantification of Cell Edge Velocities and Traction Forces Reveals Distinct Motility Modules during Cell Spreading. PLoS ONE. 3 (11), 3735 (2008).
  13. Suraneni, P., Rubinstein, B., Unruh, J. R., Durnin, M., Hanein, D., Li, R. The Arp2/3 complex is required for lamellipodia extension and directional fibroblast cell migration. The Journal of cell biology. 197 (2), 239-251 (2012).
  14. Wang, C., et al. Deconvolution of subcellular protrusion heterogeneity and the underlying actin regulator dynamics from live cell imaging. Nature Communications. 9 (1), 1688 (2018).
  15. Dimchev, G., et al. Lamellipodin tunes cell migration by stabilizing protrusions and promoting adhesion formation. Journal of cell science. 133 (7), 239020 (2020).
  16. Burnette, D. T., et al. A role for actin arcs in the leading-edge advance of migrating cells. Nature cell biology. 13 (4), 371-381 (2011).
  17. Yamada, K. M., Kennedy, D. W. Dualistic nature of adhesive protein function: fibronectin and its biologically active peptide fragments can autoinhibit fibronectin function. The Journal of Cell Biology. 99 (1), 29-36 (1984).
  18. Cai, Y., et al. Nonmuscle Myosin IIA-Dependent Force Inhibits Cell Spreading and Drives F-Actin Flow. Biophysical Journal. 91 (10), 3907-3920 (2006).
  19. Humphries, M. J. Cell adhesion assays. Molecular Biotechnology. 18 (1), 57-61 (2001).
  20. Cavalcanti-Adam, E. A., Volberg, T., Micoulet, A., Kessler, H., Geiger, B., Spatz, J. P. Cell Spreading and Focal Adhesion Dynamics Are Regulated by Spacing of Integrin Ligands. Biophysical Journal. 92 (8), 2964-2974 (2007).
  21. Dubin-Thaler, B. J., Giannone, G., Döbereiner, H. -G., Sheetz, M. P. Nanometer Analysis of Cell Spreading on Matrix-Coated Surfaces Reveals Two Distinct Cell States and STEPs. Biophysical Journal. 86 (3), 1794-1806 (2004).
  22. Gauthier, N. C., Fardin, M. A., Roca-Cusachs, P., Sheetz, M. P. Temporary increase in plasma membrane tension coordinates the activation of exocytosis and contraction during cell spreading. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (35), 14467-14472 (2011).
  23. Wolfenson, H., Iskratsch, T., Sheetz, M. P. Early Events in Cell Spreading as a Model for Quantitative Analysis of Biomechanical Events. Biophysical Journal. 107 (11), 2508-2514 (2014).
  24. Guan, J. -L., Berrier, A. L., LaFlamme, S. E. Cell Migration, Developmental Methods and Protocols. Methods in molecular biology. 294, Clifton, N.J. 55-68 (2004).
  25. Raucher, D., et al. Phosphatidylinositol 4,5-Bisphosphate Functions as a Second Messenger that Regulates Cytoskeleton-Plasma Membrane Adhesion. Cell. 100 (2), 221-228 (2000).
  26. Machacek, M., Danuser, G. Morphodynamic Profiling of Protrusion Phenotypes. Biophysical Journal. 90 (4), 1439-1452 (2006).
  27. Zack, G. W., Rogers, W. E., Latt, S. A. Automatic measurement of sister chromatid exchange frequency. The journal of histochemistry and cytochemistry official journal of the Histochemistry Society. 25 (7), 741-753 (1977).
  28. Bardsley, W. G., Aplin, J. D. Kinetic analysis of cell spreading. I. Theory and modelling of curves. Journal of cell science. 61, 365-373 (1983).

Tags

Biologi utgave 171
Kvantitativ analyse av cellekantdynamikk under cellespredning
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Iu, E., Bogatch, A., Plotnikov, S.… More

Iu, E., Bogatch, A., Plotnikov, S. V. Quantitative Analysis of Cell Edge Dynamics during Cell Spreading. J. Vis. Exp. (171), e62369, doi:10.3791/62369 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter