Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

التحليل الكمي لديناميكيات حافة الخلية أثناء انتشار الخلايا

doi: 10.3791/62369 Published: May 22, 2021
* These authors contributed equally

Summary

في هذا البروتوكول، نقدم الإجراءات التجريبية للخلية التي تنشر المقايسة التي تقوم على المجهر الحي الخلية. نحن نقدم أداة حسابية مفتوحة المصدر للتجزئة غير المتحيزة للخلايا المسماة بالفلورسنت والتحليل الكمي لديناميكيات اللاميلبوديا أثناء انتشار الخلايا.

Abstract

انتشار الخلية هو عملية ديناميكية تعلق فيها الخلية المعلقة في الوسائط على الركيزة وتسطيح نفسها من شكل مدور إلى شكل رقيق ومنتشر. بعد مرفق ركيزة الخلية، تشكل الخلية ورقة رقيقة من اللاميليبوديا المنبثقة من جسم الخلية. في اللاميلبوديا ، يبوليمر أكتين كروي (G-actin) إلى شبكة أكتين خيوط كثيفة (F-actin) تدفع ضد غشاء البلازما ، وبالتالي توفير القوى الميكانيكية اللازمة للخلية للانتشار. وتجدر الإشارة إلى أن اللاعبين الجزيئيين الذين يتحكمون في بلمرة أكتين في اللاميلبوديا ضروريون للعديد من العمليات الخلوية الأخرى ، مثل هجرة الخلايا وداء الغدد الصماء.

منذ انتشار الخلايا تشكل lamellipodia المستمر التي تمتد على محيط الخلية بأكملها والتوسع باستمرار إلى الخارج، أصبحت المقايسات انتشار الخلايا أداة فعالة لتقييم حركية نتوءات اللاميليبوديال. وعلى الرغم من وضع عدة تطبيقات تقنية للتشتيت الذي ينشر الخلية، فإن هناك نقصا في وصف مفصل لسير العمل، الذي سيشمل بروتوكولا تدريجيا وأدوات حسابية لتحليل البيانات. هنا، نقوم بوصف الإجراءات التجريبية للخلية التي تنشر المقايسة وتقديم أداة مفتوحة المصدر للتحليل الكمي وغير المتحيز لديناميكيات حافة الخلية أثناء الانتشار. عندما يقترن التلاعب الدوائي و / أو تقنيات إسكات الجينات ، وهذا البروتوكول قابلة لشاشة واسعة النطاق من اللاعبين الجزيئية التي تنظم نتوءات lamellipodial.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

نتوءات لاميليبوديال هي هياكل هيكلية خلوية بارزة تشكلت في الجزء الأمامي من الخلية المهاجرة. في lamellipodia، البلمرة من أكتين بمساعدة مجمع Arp2/3 وفورمين يخلق شبكة أكتين المتفرعة سريعة النمو التي تدفع ضد غشاء البلازما1،2. دفع القوة التي ولدتها شبكة actin يدفع جسديا الخلية إلى الأمام1،3،4،5. استنفاد Arp2/3 معقدة أو تعطيل مسارات الإشارات الضرورية لproprorusions lamellipodial غالبا ما يضعف هجرة الخلايا6، 7. علىالرغممن أن هجرة الخلايا اللاميلبوديا ناقصة كما تم الإبلاغ عن 8,9, أهمية lamellipodia في هجرة الخلايا واضح كما استنفاد هذا الهيكل النتوءي يبخل قدرة الخلية على التحرك من خلال البيئات الدقيقة البيولوجية المعقدة6,10.

عائق رئيسي لفهم تنظيم lamellipodia في الخلايا المهاجرة هو التغير الطبيعي في الحركية نتوء lamellipodial، وحجم، وشكل11،12،13،14. وعلاوة على ذلك، أظهرت الدراسات الحديثة أن lamellipodia يحمل السلوكيات النتوءية المعقدة، بما في ذلك النتوءات المتقلبة والدورية والمتسارعة14،15. بالمقارنة مع lamellipodia متغير للغاية من الخلايا المهاجرة6،16، lamellipodia شكلت خلال انتشار الخلية هي أكثر اتساقا12. منذ النشاط النتوءي للخلايا المنتشرة والمهاجرة مدفوعة بتجميعات الجزيئات الكلية المتطابقة ، والتي تشمل شبكة أكتين متفرعة ، وحزم أكتوميوسين انقباضية ، والتصاقات مصفوفة الخلايا القائمة على integrin17،18، فقد تم استخدام خلايا الانتشار على نطاق واسع كنموذج للتحقيق في تنظيم ديناميات اللاميلبوديا.

انتشار الخلية هو عملية ميكانيكية ديناميكية حيث تلتزم الخلية المعلقة أولا بركيزة من خلال التصاقات المستندة إلى integrin17و19و20 ثم تنتشر عن طريق توسيع نتوءات المستندة إلى أكتين21،22،23. خلال مرحلة الانتشار، lamellipodia المنبثقة من جسم الخلية تبرز isotropically وبإصرار مع تراجع ضئيلة أو معدومة أو المماطلة12. بروتوكولات انتشار الخلايا الأكثر استخداما هي المقايسات نقاط النهاية ، حيث يتم إصلاح خلايا الانتشار في أوقات مختلفة بعد طلاء19،24. هذه المقايسات، على الرغم من سريعة وبسيطة، محدودة في قدرتها التشخيصية للكشف عن التغيرات في الميزات الديناميكية للlamellipodia. لتحديد الآليات الجزيئية التي تتحكم في ديناميات اللاميلبوديا ، كانت مجموعة شيتز رائدة في استخدام التحليل الكمي للخلايا الحية المنتشرة وكشفت عن العديد من الخصائص الأساسية لنتوءات حافة الخلية11و12و22. وقد أظهرت هذه الدراسات أن الخلايا الحية نشر المقايسة هو تقنية قوية وقوية في صندوق أدوات مختبر بيولوجيا الخلية. وعلى الرغم من ذلك، فإن البروتوكول التفصيلي والأداة الحسابية مفتوحة المصدر لإجراء فحص للخلايا الحية المنتشرة غير متاحة حاليا لمجتمع بيولوجيا الخلايا. وتحقيقا لهذه الغاية، يحدد بروتوكولنا إجراءات تصوير خلايا الانتشار الحي ويوفر أداة تحليل تلقائي للصور. للتحقق من صحة هذه الطريقة، استخدمنا Arp2/3 تثبيط كعلاج تجريبي وأظهرت أن تثبيط وظيفة مجمع Arp2/3 لم يوقف انتشار الخلايا ولكن تسبب في انخفاض كبير في سرعة نتوء الخلية، فضلا عن استقرار نتوءات حافة الخلية، مما أدى إلى حواف الخلية خشنة. هذه البيانات تثبت أن الجمع بين التصوير بالخلايا الحية وتحليل الصور الآلي هو أداة مفيدة لتحليل ديناميات حافة الخلية وتحديد المكونات الجزيئية التي تنظم lamellipodia.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. البذر الخلية

ملاحظة: تم تنفيذ بروتوكول نشر الخلية الموصوف باستخدام الخلايا الليفية الجنينية الماوس (MEFs) التعبير PH-Akt-GFP (علامة الفلورسنت لبرنامج تطبيق السلام3/PI(3,4)P2). تم إنشاء خط الخلية هذا عن طريق دمج بناء تعبير عن PH-Akt-GFP (أدجين #21218) من خلال تحرير الجينات بوساطة CRISPR. ومع ذلك، يمكن أيضا استخدام علامات الفلورسنت الأخرى التي يتم التعبير عنها بشكل عابر أو متكاملة في الجينوم في هذا المقايسة. للحصول على تجزئة الصورة المثلى، نوصي باستخدام علامات الفلورسنت التي يتم توزيعها بالتساوي في السيتوبلازم، على سبيل المثال، GFP السيتوسوليك.

  1. ثقافة طبق 10 سم من الخلايا إلى التقاء 90٪.
  2. بمجرد أن تصل الخلايا إلى التقاء مناسب، ضع غطاء 22 مم × 22 مم (#1.5؛ سمك 0.17 مم) في طبق ثقافة الخلية مقاس 35 ملم. معطف coverlip مع 400 ميكرولتر من فيبروكتين التي تم تخفيفها في برنامج تلفزيوني إلى تركيز النهائي من 2.5 ميكروغرام / مل.
    ملاحظة: يتم تحديد عدد الأغطية المطلوبة لإجراء الفحص بواسطة عدد الشروط التجريبية والنسخة المتماثلة التقنية.
  3. ضع طبق 35 مم مع غطاء مغطى بالفيبروكتين في حاضنة 37 درجة مئوية و5٪ CO2 لمدة ساعة واحدة.
  4. إزالة الطبق مع غطاء من الحاضنة. اسبيرات فيبروكتين وغسل coverslip مع برنامج تلفزيوني عن طريق الأنابيب بلطف حول coverslip مرتين إلى ثلاث مرات.
  5. يستنشق وسائط ثقافة الخلية من طبق 10 سم من الخلايا ويغسل الطبق مع PBS.
  6. إضافة 650 ميكرولتر من 0.05٪ تريبسين-EDTA إلى طبق التقاء 90٪ من الخلايا، وإمالة الطبق لتوزيع الإنزيم بالتساوي. ضع الطبق مع التريبسين في الحاضنة لمدة دقيقة واحدة.
  7. إزالة الطبق مع الخلايا من الحاضنة. إضافة 10 مل من وسائط ثقافة الخلية إلى أنبوب الطرد المركزي 15 مل. إضافة بسرعة آخر 10 مل من وسائل الإعلام في الطبق لإرواء تريبسين.
  8. ماصة 1 مل من الخلايا المثقبة في أنبوب الطرد المركزي 15 مل من أجل تمييع الخلايا. ماصة محتويات الأنبوب صعودا وهبوطا لضمان توزيع الخلايا حتى داخل وسائل الإعلام. بالنسبة لأنواع الخلايا ذات الميل العالي إلى التجميع، يوصى بتصفية الخلايا من خلال مصفاة الخلايا (حجم شبكة 100 ميكرومتر) لتقليل حدوث تكتل الخلايا.
  9. من الأنبوب، ماصة 500 - 1000 ميكرولتر من الخلايا المخففة في طبق 35 ملم التي تحتوي على غطاء.
  10. يهز الطبق بلطف لنشر الخلايا بالتساوي. تأكد من أن الغطاء هو في ~ 10٪ التقاء (~ 50،000 الخلايا / مل) وضبط حجم الخلايا المخففة حسب الحاجة.
    ملاحظة: الغرض من وجود خلايا في مثل هذا الالتقاء المنخفض هو التأكد من وجود خلايا مستقطبة 1-2 في كل مجال من مجالات الرؤية التي سيتم استخدامها لتركيز الهدف في جميع أنحاء الخلية انتشار اكتساب.
  11. مرور 1/5 من الخلايا المتبقية في طبق 10 سم في طبق واحد 6 سم لكل حالة علاج. ضع الأطباق المقطعة وطبق 35 مم مع غطاء في الحاضنة بين عشية وضحاها.
    ملاحظة: هذه ستكون الخلايا التي سيتم تحليلها لنشر ديناميكيات.

2. حضانة المخدرات واستعادة الخلايا

  1. إضافة 5 مل من وسائط ثقافة الخلية في كل من اثنين من أنابيب الطرد المركزي 15 مل، و 20 مل من الفينول الأحمر DMEM الحرة في كل من اثنين من أنابيب الطرد المركزي 50 مل.
    ملاحظة: يجب أن يتوافق عدد أزواج الأنبوب (15 مل + 50 مل) مع عدد الحالات التجريبية.
  2. لاختبار أهمية Arp2/3 لانتشار الخلايا، ماصة إما المثبط الدوائية من Arp2/3، CK-666، أو علاج التحكم، مثل DMSO، في كل زوج من أنابيب الطرد المركزي تصل إلى التركيز المطلوب.
  3. أزل الأطباق المقطعة التي 6 سم (انظر الخطوة 1.11) من الحاضنة وخص وسائل الإعلام. غسل الأطباق مع برنامج تلفزيوني دافئ.
  4. أضف محتويات أنابيب الطرد المركزي CK-666 أو DMSO المكملة ب 15 مل في كل طبق من الأطباق المقطعة. تسمية كل طبق مع العلاج الدوائي الصحيح ووضع الأطباق في الحاضنة لمدة ساعة واحدة.
  5. إزالة الأطباق من الحاضنة وتوبيخ وسائل الإعلام. غسل الأطباق مع برنامج تلفزيوني دافئ من أجل إزالة تماما جميع وسائل الإعلام الحمراء الفينول المتبقية.
  6. إضافة 230 ميكرولتر من 0.05٪ تريبسين-EDTA إلى كل طبق 6 سم واحتضان الخلايا لمدة دقيقة واحدة.
    ملاحظة: إذا كان ذلك ممكنا، يمكن استبدال التريبسين بحاصر الالتصاق بالخلايا غير البروتيوليكية.
  7. إزالة الأطباق من الحاضنة. لكل علاج, إضافة 5 مل من المخدرات تكملها الفينول الأحمر مجانا DMEM في أنبوب الطرد المركزي 15 مل المعينة باسم "أنبوب B". إضافة 5 مل إضافية من نفس الوسائط في الطبق ذات الصلة لإرواء التريبسين. نقل محتويات الطبق إلى أنبوب الطرد المركزي 15 مل المعينة باسم "أنبوب A".
  8. نقل 1 مل من الخلايا من الأنبوب A إلى الأنبوب B. كرر لكل علاج.
  9. ضع الأنبوبين A و B في الحاضنة لمدة 45 دقيقة للسماح للخلايا بالتعافي من التربسين. تخفيف قليلا سقف أنابيب الطرد المركزي قبل وضعها في الحاضنة للسماح ل PENETRANCE CO2.
    ملاحظة: قد تختلف مدة وقت الاسترداد لأنواع الخلايا المختلفة. على الرغم من أن التعافي لمدة 45 دقيقة في تجاربنا كان له تأثير لا يذكر على صلاحية الخلية ، إلا أن بعض أنواع الخلايا قد تخضع لأنويكي عندما يتم الاحتفاظ بها في التعليق لفترة طويلة جدا. لذلك، نوصي بتحديد وقت الاسترداد الأمثل تجريبيا. يتيح وقت الاسترداد الأمثل انتشار الخلايا السريعة والمتزامنة دون وجود خلايا ميتة أو أبوبتوتية في العينة.

3. إعداد الغرفة المغناطيسية

  1. تأكد من تنظيف جميع أجزاء غرفة مغناطيسية 1 Well Chamlide Cell التي يمكنها استيعاب غطاء مربع 22 مم × 22 مم قبل الاستخدام.
  2. أزل طبق 35 مم مع غطاء الغطاء (انظر الخطوة 1.11) من الحاضنة. يستنشق وسائل الإعلام ثقافة الخلية وغسل coverslip مع برنامج تلفزيوني دافئ.
  3. إزالة غطاء من طبق 35 ملم باستخدام زوج من ملقط ووضع بلطف coverslip على لوحة أسفل الغرفة المغناطيسية.
  4. ضع طوقا السيليكون على رأس غطاء الغطاء.
    ملاحظة: طوقا السيليكون وضعت بشكل غير صحيح هو السبب الأكثر شيوعا لغرفة المغناطيسي راشح. تأكد من أن طوقا تقع في المسافة البادئة من لوحة أسفل ولا ترتفع إلى ما بعد المسافة البادئة.
  5. إرفاق الجسم الرئيسي على لوحة أسفل.
    ملاحظة: القيام بهذا الجزء ببطء شديد. نصيحة جيدة هو الاستمرار على لوحة أسفل بيد واحدة في حين وضع الجسم الرئيسي على القمة. وهذا يضمن أن المغناطيس في الجسم الرئيسي لا ترفع لوحة أسفل لأعلى، والتي يمكن أن تحل محل ولقضاء على coverslip.
  6. إضافة 1 مل من المخدرات تكملها الفينول الأحمر DMEM الحرة إلى الغرفة المغناطيسية. خذ أنسجة خالية من الوبر وداب بعناية الضميمة بين الجسم الرئيسي ولوحة أسفل من أجل التحقق من أي تسرب.
    ملاحظة: إذا كان هناك تسرب، بسرعة يستنشق الوسائط ثم انتقل مرة أخرى من الخطوة 3.4.
  7. خفض الغطاء الشفاف على الجسم الرئيسي لإحاطة الغرفة المغناطيسية.
  8. رش الأنسجة المختبرية أولا بالماء ومسح الجزء السفلي من الغرفة المغناطيسية (غطاء، وليس الجزء المعدني). بعد ذلك، رش نسيج مختبري ثان مع كمية صغيرة من الإيثانول 70٪ ومسح، مع الحرص على عدم كسر غطاء.

4. الحصول على صورة

  1. سخني حاضنة المرحلة العليا وسخان الهدف إلى 37 درجة مئوية وحددمستوى ثاني أكسيد الكربون في حاضنة المرحلة العليا إلى 5٪.
    ملاحظة: إذا لم يتم توصيل حاضنة المرحلة العليا بإمدادات CO يجب أن تستكمل وسائط ثقافة الخلية ب 25 mM HEPES للحفاظ على رقم الحموضة الثابت 7.4.
  2. تطبيق كمية كافية من زيت الغمر إلى 60X قبل الحارة، 1.4 N.A. هدف النفط.
    ملاحظة: نستخدم هدف الغمر بالنفط 60X و 1.4 N.A. في هذا البروتوكول بسبب مجال الرؤية الكبير بشكل معقول وكفاءة جمع الضوء المتميزة. إذا كان هناك حاجة إلى مجال رؤية أكبر، يمكن استخدام هدف تكبير أقل(على سبيل المثال، 20x) طالما أن نسبة الإشارة إلى الضوضاء للصور أكبر من 2.5.
  3. جلب كل من الغرفة المغناطيسية المكتملة وB الأنبوب (الخطوة 2.9) إلى المجهر confocal. ضع الغرفة المغناطيسية على حاضنة المسرح العلوية.
    ملاحظة: ضع الغرفة المغناطيسية برفق على المسرح لتجنب خلق فقاعات في زيت الغمر.
  4. تعيين التركيز على الخلايا الفلورية باستخدام قناة GFP. تأكد من أن حافة الخلية حادة ومحددة جيدا.
  5. إزالة الغطاء الشفاف للغرفة المغناطيسية وماصة 500 ميكرولتر من الأنبوب B إلى الغرفة المغناطيسية. ضع الغطاء الشفاف مرة أخرى على أعلى الغرفة المغناطيسية.
  6. لتحديد الخلايا المثالية لتحليل انتشار الخلايا، ابحث عن "هالات" الخلايا التي لم تعلق بعد على غطاء الغطاء ولكنها لم تعد تتدحرج. الخلايا التي هي في المراحل الأولى من مرفق coverslip هي أيضا المرشحين كبيرة، ولكن يجب أن يكون اكتساب الصورة سريعة من أجل التقاط انتشار.
  7. تكوين الحصول على صورة الفاصل الزمني للقناة الخضراء لتشمل أربعة مجالات للعرض، في الصورة في فترات 6 ثانية.
    ملاحظة: نظرا للتغير العالي لسرعة نتوء لاميليبوديا بين أنواع الخلايا المختلفة، يجب تحديد معدل الإطار الأمثل تجريبيا. فترة التصوير من 6 ثوان المستخدمة في تجاربنا هو نقطة انطلاق جيدة لتحليل العديد من الخلايا الظهارية والنسنة. ومع ذلك، قد تتطلب الخلايا التي تنتشر بسرعة كبيرة(مثلالخلايا المناعية) معدل إطار أعلى بكثير (فاصل تصوير أقصر). يضمن معدل الإطار الأمثل لأفلام نشر الخلايا إزاحة 2-5 بكسل لحافة الخلية البارزة بين الإطارات اللاحقة. وبالنظر إلى دقة تركيب المنحنى المستخدم لتحديد هضبة انتشار الخلايا، ينبغي أن يضمن معدل الإطار الأمثل أيضا قياسات 50-100 لإزاحة حافة الخلية خلال مرحلة التوسع السريع لانتشار الخلايا. يجب تعديل عدد مجالات الرؤية اعتمادا على وقت التعريض الضوئي والمسافة بين نقاط الامتلاك وسرعة حركة المرحلة. ينصح المستخدمون بتحديد الحد الأقصى لعدد مجالات العرض التي يمكن الحصول عليها مع معدل الإطار المطلوب.
  8. بعد تحديد مجال رؤية مناسب، احفظ إحداثيات X و Y لمرحلة المجهر. تابع تحديد ثلاثة مجالات أخرى للعرض قريبة نسبيا من بعضها البعض على غطاء. حفظ إحداثيات مرحلة المجهر لكل مجال من مجالات الرؤية المطلوبة.
    ملاحظة: يوصى بشدة بتحسين مسار حركة المرحلة بين حقول العرض لتقليل أي حركة عينة غير ضرورية. يمكن تنفيذ هذا التحسين إما يدويا أو تلقائيا. حركة عينة الزائد يبطئ اقتناء وقد يسبب الخلايا لطرح خارج العرض كما أنها تنازلي.
  9. احصل على الصور لمدة 15 دقيقة بمعدل إطار 6 ثوان واحفظ الملفات. إذا كان هناك حاجة إلى المزيد من عمليات الاستحواذ، كرر بدءا من الخطوة 4.6.

5. تحليل منطقة الخلية، ديناميات التعميم والنتوء أثناء انتشار الخلايا

  1. إعداد الصور لمعالجة البيانات وتحليلها
    ملاحظة: يتطلب البرنامج صورة بتنسيق .tiff وحجم بكسل مثل معلمات الإدخال. ويمكن استيفاء كلا الأمرين باستخدام برنامج الاقتناء أو فيجي (في هذا البروتوكول). إذا تم استيفاء هذه المتطلبات، انتقل إلى الخطوة 5.2.
    1. تثبيت أحدث إصدار من تطبيق فيجي (https://imagej.net/Fiji/Downloads).
    2. افتح صورة الفاصل الزمني باستخدام فيجي.
    3. نسخ حجم بكسل الصورة عن طريق تحديد خصائص > الصورة. نسخ ولصق حجم البكسل في μm إلى المفكرة / Word.
    4. لتحليل منطقة انتشار الخلية والتعميم، احفظ صورة الفاصل الزمني ككومة صور tiff. لا يدعم برنامج تحليل البنية المخصصة تنسيقات الملفات الخاصة. حفظ مكدس صورة tiff الخلية الفردية عن طريق تحديد ملف > حفظ كما > Tiff.
  2. تثبيت IDE بيثون (سبايدر) والحزم اللازمة(PySimpleGUI و tifffile)لمعالجة البيانات وتحليلها.
    ملاحظة: تثبيت Python وحزم مطلوب فقط الإعداد الأولي.
    1. سيتم تحليل الأفلام الفاصل الزمني في IDE سبايدر باستخدام سيناريو بيثون مخصص البناء. لتحميل IDE سبايدر، تحميل الموزع أناكوندا (https://www.anaconda.com/products/individual) الذي يتضمن IDE سبايدر ومعظم المكتبات اللازمة وحزم لهذا التحليل.
    2. تثبيت أناكوندا وإطلاق سبايدر من خلال أناكوندا نافيجيتور.
    3. في علامة التبويب وحدة تحكم IPython (الموجود في القسم الأيمن السفلي من Spyder) ، نسخ ولصق الأمر التالي: pip install PySimpleGUI واضغط على مفتاح الإدخال. تشغيل هذا الأمر سيتم تثبيت الحزمة المطلوبة لبدء واجهة المستخدم الرسومية (GUI).
    4. في وحدة التحكم نفسها، نسخ ولصق الأمر التالي: pip تثبيت tifffile واضغط على مفتاح Enter. تشغيل هذا الأمر سيتم تثبيت الحزمة المطلوبة لحفظ الصور كملفات tiff.
    5. تحميل جميع البرامج النصية بيثون من الملفات التكميلية أو البرامج النصية الأكثر تحديثا من GitHub في: https://github.com/ernestiu/Cell-spreading-analysis.git
  3. قياس مساحة الخلية وعوامل شكل الخلية أثناء انتشار الخلية
    1. فتح السيناريو التحليل الرئيسي "cell_spreading_GUI.py" عن طريق تحديد خيار الملف المفتوح في اللوحة العليا من سبايدر أو باستخدام الاختصار Ctrl + O.
    2. فتح الخلية نشر تحليل واجهة المستخدم الرسومية عن طريق تحديد "تشغيل الملف" في اللوحة العليا أو باستخدام الاختصار F5.
    3. انقر فوق علامة التبويب منطقة انتشار الخلية ( الشكل3A).
    4. حدد صورة tiff ليتم تحليلها باستخدام زر الاستعراض.
      ملاحظة: يجب أن يكون الملف المحدد ملف tiff.
    5. حدد الدليل الوجهة حيث سيتم حفظ مخرجات البيانات (مثل أقنعة الخلية والقيم).
    6. تحديد إعدادات إخراج البيانات:
      1. حفظ أقنعة: حفظ أقنعة الخلية التي تم إنشاؤها أثناء عملية التقسيم.
      2. تصدير البيانات: تصدير جدول بيانات Excel (.xlsx) يحتوي على كافة بيانات التحليل إلى المجلد الوجهة.
        سيتم حفظ منطقة الخلية، نسبة التدوير والنسبة إلى الارتفاع لكافة الخلايا المنتشرة كجداول بيانات Excel في المجلد الوجهة. يتم حساب منطقة الخلية على النحو التالي:
        Equation 1 
        دائرية الخلية هي مقياس لمدى قرب الخلية من خلية مستديرة تماما. يتم حسابها على النحو:
        Equation 2 
        حيث A و P هي منطقة الخلية ومحيط الخلية، على التوالي. تمثل نسبة العرض إلى الارتفاع للخلية مدى استطالة الخلية. يجب أن يكون للخلية المنتشرة نسبة عرض إلى ارتفاع قريبة من 1. يتم حساب نسبة العرض إلى الارتفاع على النحو التالي:
        Equation 3 
      3. حفظ الخطوط المحيطة: حفظ صور تراكب محيط حدود الخلية في المجلد الوجهة.
    7. تحديد إعدادات التقسيم
      1. إظهار التقسيم: إظهار نتيجة التقسيم في وحدة تحكم Spyder أثناء عملية التحليل.
      2. أصغر منطقة خلايا (μm2):أدخل القيمة الدنيا لمنطقة الخلية، بما في ذلك قيم المساحة للخلايا في المراحل الأولى من المرفق. لن تعتبر الكائنات ذات المساحة الأصغر من هذه العتبة كخلايا منتشرة. سيؤثر هذا الرقم على عملية التقسيم.
    8. حدد معلمات الصورة.
      1. الفاصل الزمني للاستحواذ (s): أدخل تكرار اكتساب الصورة بالثواني.
      2. حجم البكسل (μm): أدخل حجم البكسل الذي تم تسجيله عند إعداد الصور للتحليل.
      3. عمق بت الصورة: أدخل عمق بت الكاميرا/الكاشف.
    9. انقر فوق تشغيل. في حالة ظهور خطأ، ستظهر رسالة خطأ في وحدة تحكم Spyder. وإلا، سيتم عرض عملية تحليل الصورة في وحدة التحكم.
      ملاحظة: تظهر الصورة الأولى التي تظهر في قسم وحدة التحكم/المؤامرات (اعتمادا على إعدادات Spyder) كافة الخلايا المحددة في مجال العرض. تشير المربعات الخضراء الموضوعة حول الخلايا إلى انتشار خلايا مناسبة للتجزئة والتحليل. تشير المربعات الرمادية إلى خلايا غير مناسبة للتحليل. سيظهر العدد الإجمالي للخلايا المنتشرة المحددة أيضا في علامة التبويب وحدة التحكم. يرسم البرنامج منطقة الخلية (باللون الأزرق) وتعاميم الخلية (باللون الأحمر) كدالة للوقت. تسمح هذه الرسوم البيانية للمستخدمين بتقييم دقة تجزئة الخلايا. ينتج عن التقسيم الناجح منحنى متزايد بشكل رتيب لمنطقة الخلية. للحصول على منحنى تمثيلي لمنطقة انتشار الخلية، يجب إزالة مرحلة التأخر من الرسم البياني يدويا. تتضمن مرحلة التأخر قياسات لمنطقة الخلية قبل أن تبدأ الخلية في الانتشار. يشار إلى مرحلة التأخر من خلال التقلبات السريعة، كما هو موضح في مؤامرة منطقة الخلية(الشكل 3C الحق).

6. قياس ديناميات حافة الخلية أثناء انتشار الخلية باستخدام kymographs

  1. قبل تشغيل التحليل، قم بقص الأفلام الخام لنشر الخلايا لإنشاء سلسلة زمنية من خلايا الانتشار الفردية.
    1. استخدم أداة المستطيل في شريط الأدوات فيجي لتحديد منطقة الاهتمام (ROI) التي تغلف خلية واحدةيدويا. (للتأكد من أن ROI تغليف الخلية المنتشرة بشكل كامل، استخدم دالة التمرير لفحص عائد الاستثمار في كافة النقاط الزمنية.)
    2. انقر بزر الماوس الأيمن على عائد الاستثمار وحدد مكرر.
    3. تحقق من المكدس المكرر وانقر فوق موافق.
  2. افتح برنامج التحليل الرئيسي "cell_spreading_GUI.py" عن طريق تحديد الزر فتح ملف في شريط أدوات Spyder أو باستخدام الاختصار Ctrl + O. إذا تم فتح واجهة المستخدم الرسومية بالفعل، انتقل مباشرة إلى الخطوة 6.3.
  3. فتح الخلية نشر تحليل واجهة المستخدم الرسومية عن طريق تحديد تشغيل الملف في اللوحة العليا أو باستخدام الاختصار F5 (الشكل 3B).
  4. انقر فوق علامة التبويب مولد كيموغراف والتحليل.
  5. استخدم زر الاستعراض لتحديد صورة tiff للتحليل.
    ملاحظة: تنسيقات الملفات الخاصة، مثل nd2، lif، zen، غير معتمدة من قبل البرنامج النصي.
  6. حدد المجلد الوجهة لحفظ بيانات الإخراج (أقنعة الخلية والقيم).
  7. حدد إعدادات الإخراج.
    1. تصدير البيانات: تصدير جدول بيانات excel (.xlsx) إلى المجلد الوجهة الذي يحتوي على مواضع حافة الخلية النسبية وأحداث التراجع من kymographs.
  8. حدد معلمات الصورة:
    1. الفاصل الزمني للاستحواذ (s): أدخل تكرار الحصول على الصورة بالثواني.
    2. حجم البكسل (μm): أدخل حجم البكسل الذي تم تسجيله عند إعداد الصور للتحليل في الخطوة 5.1.3.
    3. أصغر منطقة خلايا (μm2):أدخل القيمة الدنيا لمنطقة الخلية، بما في ذلك قيم المساحة للخلايا في المراحل الأولى من المرفق. لن تعتبر الكائنات ذات المساحة الأصغر من هذه العتبة كخلايا منتشرة. سيؤثر هذا الرقم على عملية التقسيم.
    4. عمق بت الصورة: أدخل عمق بت الكاميرا/الكاشف.
  9. انقر فوق تشغيل. في حالة ظهور خطأ، ستظهر رسالة خطأ في وحدة تحكم Spyder. وإلا، سيتم عرض ملخص لديناميات النتوءات في وحدة التحكم. سيكون هناك 4 أزواج من تردد التراجع وقياسات سرعة النتوء ، والتي يتم استخراجها من 4 kymographs ولدت من الأجزاء العلوية والسفلية واليسفلية والأيمنة من الخلية. يتم حساب تردد التراجع على النحو التالي:
    Equation 4 
    ملاحظة: يوضح هذا الرقم عدد مرات تراجع اللاميليبوديوم على مدار الانتشار. يقاس متوسط سرعة نتوء من قبل المنحدر بين بداية نتوء ونقطة الهضبة على kymograph. سيتم عرض رقم kymograph موجز في وحدة التحكم بعد التقسيم. لحفظ الشكل الموجز، انقر بزر الماوس الأيمن على الشكل واحفظ الصورة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

يصف البروتوكول أعلاه الإجراءات التجريبية لتصوير الخلايا الحية للخلايا المنتشرة وأداة حسابية للتحليل الكمي لديناميكيات انتشار الخلايا. يمكن استخدام الأداة الحاسوبية في شكل منخفض أو عالي الإنتاجية لتحديد اللاعبين الجزيئيين الذين ينظمون آلات البلمرة actin على الحافة الرائدة للخلية.

يصور الشكل 1التمثيل التخطيطي للإجراءات التجريبية. تم إجراء فحص انتشار الخلية على الخلايا الليفية الجنين الماوس الخالدة التعبير بشكل ثابت عن مجال التماثل البشري pleckstrin (PH) من كيناز بروتين Akt الموسومة مع eGFP25. وتم فصل الخلايا عن التريبسين-EDTA وسمح لها بالتعافي في التعليق لمدة 45 دقيقة. خلال خطوة الانتعاش، والخلايا تجديد مستقبلات integrin على غشاء البلازما كما هو مبين من قبل مرفق سريع ومتزامن من الخلايا المستردة إلى فيبروكتين المغلفة coverslips (الشكل 2). دون فترة الانتعاش، أظهرت الخلايا المنتشرة توزيعا واسعا لحجم الخلية مما يشير إلى تباين كبير في بداية انتشار الخلايا(الشكل 2A وB). بعد ذلك ، كانت الخلايا مطلية على غطاء يحمل علامة ائتمانية وتم تصور ديناميكيات الانتشار الخاصة بهم عن طريق المجهر الكونفوكوكال القرص الغزل(التخطيطات هو مبين في الشكل 1A - H). في جميع أنحاء الحصول على الصورة، نظرنا في مجالات الرؤية التي ظهرت الخلايا مع نسبة إشارة إلى الضوضاء من 2.5 أو أكثر. وكان هذا الاعتبار هاما كما تجزئة الصورة اللاحقة حساسة لكثافة الخلايا الفلورية بالنسبة للخلفية. في تجاربنا، حصلنا على الصور كل 6 ثوان لمدة 15 دقيقة(المخططات هو مبين في الشكل 1I-J). بالاتفاق مع التقارير السابقة16، والتصوير بمعدل الإطار 6 ثانية ضمان دقة زمنية كافية لالتقاط ديناميات الأحداث الفردية نتوء وتراجع ، في حين يسمح لنا للحصول على عدة مجالات الرؤية في موازاة ذلك. تم تحليل الصور الناتجة الفاصل الزمني باستخدام برنامج بيثون مخصص البناء(الشكل 3).

تم إجراء تحديد كمي غير متحيز لانتشار الخلايا باستخدام إجراءين تحليليين متميزين:(1)التنميط المورفوديناميكي للخلايا المنتشرة (الشكل 3Aو C و 4) و (2) تحليل كيموجراف لديناميكيات حافة الخلية (الشكل 3B و 5). تحليل انتشار الخلايا عن طريق التنميط المورفوديناميكي ينطوي على الكشف الآلي للخلايا المنتشرة وال fiducial في مجال الرؤية (الشكل 3C اليسار)، تليها تجزئة صورة الإطار تلو الإطار والكشف عن حدود الخلية المنتشرة. يتم تنفيذ التقسيم بواسطة كثافة عمومية عتبة الإطارات الفردية. يتم حساب قيمة العتبة على أنها الحد الأدنى المحلي بين أوضاع الكثافة الأولى والثانية على الرسم البياني للصورة26. يتم تقسيم الصور ذات الرسم البياني الأحادي الواسطة والمحرفة يمينا بواسطة خوارزمية عتبة المثلث27. بعد تجزئة الخلية، تم حساب الخصائص المورفوديناميكية للخلايا المنتشرة(أي منطقة الخلية، ونسبة العرض إلى الارتفاع، وتدوين الخلية)(الشكل 3C اليمين).

بما يتفق مع النتائج المنشورة12،28، كان الدافع وراء انتشار الخلية من قبل التوسع متساوي الخواص من lamellipodia كما هو مبين من قبل شكل sigmoidal على مؤامرة منطقة الخلية التمثيلية (الشكل 3C الحق ، منحنى أزرق و S1). وأظهرت مؤامرة المنطقة أن مساحة الخلية زادت بنحو 3 أضعاف قبل أن تصل إلى هضبة(الشكل 4A وB). طوال عملية انتشار الخلايا، ظلت الخلايا دائرية (دائرية = 0.70 ± 0.076) وعرضت حواف خلايا بارزة تشبه الحجاب، والتي تدل على نتوءات لاميليبوديال(الشكل 4C).

للتحقق من صحة فحص انتشار الخلية، منعنا Arp2/3 مع 100 ميكرومتر CK-666 لمدة ساعة و 45 دقيقة وقيمنا تأثير هذا العلاج على ديناميات انتشار الخلية. بالاتفاق مع التقارير السابقة13، قمع نشاط Arp2 / 3 لم يسفر عن انخفاض كبير في سرعة انتشار الخلية (الشكل 4A و B ، منحنى وردي). ومع ذلك، كشف تحليل شكل الخلية عن اختلاف كبير في دائرية التحكم والخلايا المعالجة CK-666 (التحكم: 0.70 ± 0.08 مقابل CK-666: 0.54 ± 0.09، ص < 0. 1 × 10-3) (الشكل 4C). بينما ظلت خلايا التحكم دائرية حتى الهضبة، اكتسبت الخلايا المثبطة Arp2/3 شكلا مضلعا تم الاحتفاظ به طوال فترة الانتشار(الشكل 4A). معا، هذه النتائج التجريبية تثبت أن الخلية الموصوفة نشر المقايسة يكشف عن تغييرات معتدلة في مورفوديناميكا الخلية الناجمة عن الاضطرابات من آلات البلمرة أكتين.

في حين أن التنميط المورفوديناميكي غالبا ما يكون كافيا للكشف عن التغيرات الإجمالية في ديناميكيات انتشار الخلايا ، فإن هذا التحليل لديه قدرة محدودة على تحديد مكونات هيكلية خلوية محددة تنظم دورات التراجع عن النتوءات في حافة الخلية ، مما يدفعنا إلى تنفيذ أداة تحليل كيموغراف غير متحيزة(الشكل 5 يسار ، خطوط متقطعة). وكشف تحليل سرعة حافة الخلية عن انخفاض معتدل ولكنه كبير في متوسط سرعة نتوء الخلايا المثبطة Arp2/3 مقارنة بالتحكم (التحكم: 37.1 ± 12.87 نانومتر /ثانية مقابل CK-666: 28.7 ± 13.4 نانومتر /ثانية، ص = 0. 9 × 10-3) (الشكل 5C). وعلاوة على ذلك، كانت ديناميات حافة الخلية من السيطرة وArp2/3-تثبيط الخلايا مختلفة بشكل ملحوظ(الشكل 5A و D). برزت خلايا التحكم باستمرار مع تراجعات قليلة أو معدومة خلال مرحلة التوسع السريع ، والتي استمرت حوالي 200 ثانية ، وأظهرت تراجعا متقطعا خلال مرحلة الهضبة(الشكل 5A و D). في المقابل، تم التدخل في توسيع الخلايا المثبطة Arp2/3 من خلال أحداث التراجع، التي تشير إليها النقاط الحمراء على الرسوم البيانية(الشكل 5B و D). أظهر القياس الكمي لتردد التراجع أن الخلايا المثبطة Arp2/3 تراجعت بنسبة 26٪ أكثر من خلايا التحكم (التحكم: 0.18 ± 0.22 ثانية-1 مقابل CK-666: 0.24 ± 0.19ثانية -1، ص = 0.03)(الشكل 5D). هذه البيانات تثبت حساسية عالية من تحليل كيموغراف في الكشف عن التعديلات الطفيفة في ديناميات lamellipodial.

Figure 1
الشكل 1: سير العمل التجريبي للخلية نشر المقايسة. ( أ -ح) مخططات الخلية نشر المقايسة. (أ)مغلفة 22 مم × 22 مم coverslip مع فيبروكتين المخفف في برنامج تلفزيوني إلى تركيز نهائي من 2.5 ميكروغرام / مل. (ب) طبق التقاء 10 سم من PH-Akt-GFP التعبير الماوس الخلايا الليفية الجنينية (MEFs) يتم غسلها مع برنامج تلفزيوني وعلاجها مع 0.05٪ تريبسين-EDTA. ثم تنقسم الخلايا المعالجة بالتريبسين إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل وطبق زراعة أنسجة طوله 6 سم، وكلاهما يحتوي على وسائط زراعة الخلايا. (ج)من أنبوب الطرد المركزي 15 مل، يتم أنابيب 500-1000 ميكرولتر على غطاء فيبروكتين المغلفة. (د) طبق 6 سم وطبق 35 مم مع غطاء يحتوي على خلايا قليلة البذر توضع في حاضنة 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. بمجرد الاستقطاب ، ستوفر هذه الخلايا إطار التركيز للخلية التي تنتشر اكتسابها. (E) قبل ساعة من الحصول على الصورة، يتم استبدال وسائل الإعلام طبق 6 سم مع فينول الأحمر خالية DMEM تكملها HEPES والمخدرات ذات الأهمية. بعد 1 ساعة، يتم التعامل مع الخلايا مع 0.05٪ تريبسين-EDTA ونقلها إلى أنبوب الطرد المركزي 15 مل (أنبوب A) التي تحتوي على HEPES / المخدرات تكملها الفينول الأحمر خالية DMEM. ثم يتم تخفيف الخلايا في الأنبوب A في أنبوب طرد مركزي آخر سعة 15 مل (الأنبوب B) ، والذي يتم وضعه في الحاضنة لمدة 45 دقيقة. (F)كما يتعافى الخلايا، يتم إعداد الغرفة المغناطيسية من أسفل إلى أعلى: أولا يتم وضع لوحة أسفل على سطح مستو، ثم coverslip مع الخلايا المستقطبة، طوقا السيليكون، والجسم الرئيسي للغرفة، وأخيرا وضعت غطاء شفاف على القمة. (G) 1 مل من المخدرات تكملها الفينول الأحمر الحرة DMEM هو pipetted في الغرفة المغناطيسية، والتي يتم إحضارها بعد ذلك إلى مرحلة المجهر. يتم اختيار هدف CFI Plan Apo Lambda 60X Oil للحصول على الصورة. (H) تتم إزالة الغطاء الشفاف ويتم توجيه 500 ميكرولتر من محتويات الأنبوب B إلى الغرفة المغناطيسية. (I) للحصول على الصورة، ومجالات مناسبة للعرض تحتوي على الأخضر "هالات"، والتي هي الخلايا المعلقة التي لم تعلق بعد على coverlip. (J) يتم تصوير الخلايا لمدة 15 دقيقة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: تأثير وقت التعافي على انتشار الخلايا. كانت الخلايا التي تم الاحتفاظ بها في التعليق للوقت المشار إليه (خطوة استعادة الخلية في البروتوكول) مطلية على أغطية مغلفة بالفيبرونيتين لمدة 15 دقيقة ، ثابتة بنسبة 4٪ paraformaldehyde وصورت بواسطة المجهر التباين المرحلي. (أ) لوحات أعلى: صور التباين المرحلة المكتسبة مع هدف 20X. اللوحات السفلية: أقنعة الخلايا المقسمة إلى مستجمعات مياه مع مناطق الخلايا المرمزة بالألوان. (ب)تحديد كمية منطقة الخلية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: واجهة المستخدم الرسومية (GUI) ومبادئ العمل لمعالجة الصور وبرامج التحليل. (أ) واجهة المستخدم الرسومية لعلامة التبويب "منطقة انتشار الخلية". راجع الخطوة 5.3 للحصول على إرشادات. (ب) واجهة المستخدم الرسومية لعلامة التبويب "مولد كيموغراف وتحليله". راجع الخطوة 6 للحصول على الإرشادات. (ج) خط أنابيب معالجة الصور من البرنامج. يحدد البرنامج أولا الخلايا المنتشرة (المسماة بمربع يحدها أخضر) في مجال الرؤية بأكمله. يتم تحديد الخلايا المنتشرة بناء على قيمة شدتها، ولتعميمها، ونسبة الارتفاع. ثم يتم تقسيم خلايا الانتشار المحددة إطارا بإطار باستخدام عتبة الكثافة العالمية. تتم معالجة كل قناع ثنائي عن طريق تصفية متوسط وملء ثقب ثنائي متبوعا إغلاق مورفولوجية لتنعيم حافة الخلية. يتوافق المخطط التفصيلي الأحمر مع حد الخلية المقسمة. يتم استخراج مساحة الخلية ونسبة العرض إلى الارتفاع والتعميم من خريطة الخلية الثنائية. يوضح الرسم البياني مساحة خلية تمثيلية وتعاميمها بمرور الوقت. عند بذر الخلايا ، لا تبدأ الخلايا في الانتشار على الفور ، مما يؤدي إلى مرحلة التأخر التي شوهدت على الرسم البياني. بعد مرحلة التأخر، تنتشر الخلايا بسرعة خلال مرحلة التوسع السريع وتصل في نهاية المطاف إلى مرحلة الهضبة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4:النتائج التمثيلية لتحليل منطقة انتشار الخلية على تثبيط Arp2/3. (A) صور تمثيلية ل PH-Akt-GFP-التعبير عن MEFs تنتشر على غطاء مغلفة فيبروكتين على مدى 3 دقائق. يشير الخط الأحمر إلى حد الخلية المستخرج بواسطة خوارزمية تجزئة الخلية. أعلى لوحات: 0.1٪ الخلايا المعالجة DMSO. الألواح السفلية: 100 ميكرومتر CK-666 (مثبط Arp2/3) - الخلايا المعالجة. (ب)رسم بياني يوضح مساحة انتشار الخلية بمرور الوقت. تم قياس منطقة انتشار الخلية كميا كتغيرات أضعاف بالنسبة لمتوسط منطقة انتشار الخلية في خلايا التحكم. تمثل الخطوط الزرقاء والوردية التحكم والخلايا المثبطة Arp2/3 على التوالي. تشير المناطق المظللة إلى الانحراف المعياري العلوي والسفلي لمنطقة انتشار الخلية. (ج) شريط رسم مع نقاط البيانات الفردية التي تبين متوسط دائرية الخلية من السيطرة و Arp2/3- الخلايا المثبطة. تمثل كافة أشرطة الخطأ الانحراف المعياري. *، ص < 0.05، **، ص < 0.01، ***، ص < 0.001، n.s. (غير مهم، ص > 0.05) كما تم اكتشافه من خلال اختبارات t للطالب البارامترية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5:النتائج التمثيلية لتحليل كيموغراف للخلايا المنتشرة عند تثبيط Arp2/3. (أ - ب) الصور التمثيلية و kymographs المستخرجة من 0.1٪ DMSO المعالجة (السيطرة) الخلايا و 100 ميكرومتر CK-666 المعالجة (Arp2/3 المانع) الخلايا. اللوحات اليسرى: صور ذات تدرج رمادي مقلوب لعنصر تحكم وخلية مثبطة Arp2/3. تتوافق الخطوط المتقطعة مع الخطوط المحددة مسبقا حيث تم استخراج الكيموغراف. اللوحات اليمنى: يتم استخراج kymographs على طول الخطوط المتقطعة المعروضة على الصور ذات التدرج الرمادي. حدود الرسم مرمزة بالألوان لمطابقة الخطوط المتقطعة على الصور ذات التدرج الرمادي. يشير الخط المتقطع في كل قطعة إلى انحدار المنحنى الذي تم حساب متوسط سرعة نتوء منه. لتحديد مرحلة الهضبة، تم تركيب منحنى النمو اللوجستي على نقاط البيانات واستمدت الهضبة من المعلمة، ج (الشكل التكميلي 1). تشير النقاط الحمراء إلى أحداث التراجع. (ج) شريط مؤامرة مع نقاط البيانات الفردية التي تبين متوسط سرعة نتوء من السيطرة و Arp2/3- الخلايا المثبطة. تمثل كافة أشرطة الخطأ الانحراف المعياري. (D) شريط مؤامرة مع نقاط البيانات الفردية التي تبين تواتر أحداث التراجع من السيطرة و Arp2/3-تثبيط الخلايا. (C - D) * ، ص < 0.05 ، **، ص < 0.01 ، ***، ص < 0.001 ، n.s. (ليست كبيرة ، ص > 0.05) كما تم الكشف عنها من قبل اختبارات مان ويتني غير البارامترية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل التكميلي 1: كيموغراف تمثيلي ونتيجة تركيب المنحنى. كيموغراف مستخرج من خلية منتشرة. يتوافق الخط الأزرق المتقطع مع مسافة حافة الخلية بالنسبة للإطار الأول. يتوافق الخط الأحمر الصلب مع المنحنى المجهز. لزيادة الثقة في تركيب المنحنى ، تم تنعيم نقاط البيانات الخام لأول مرة بواسطة فلتر Savitzky-Golay. بعد تركيب المنحنى، تم استخدام المعلمة c، من المعادلة اللوجستية، لتحديد نقطة الهضبة. يتم تعيين نقطة البيانات الخام الأقرب إلى c كنقطة هضبة. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

ملفات تكميلية. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

يسمح المقايسة المنتشرة للخلية الموصوفة بالتتبع المستمر للتغيرات المورفولوجية(على سبيل المثال ، حجم الخلية وشكلها) وحركات حافة الخلية(أي سرعة النتوء وتردد التراجع) ، وهي ميزات مفقودة في معظم بروتوكولات انتشار الخلايا19،24. في حين أن شائعة الاستخدام خلية نقطة النهاية نشر المقايسات تسمح لتحديد سرعة انتشار الخلية، تفشل هذه المقايسات لحل الديناميات الزمنية لحركات حافة الخلية. نقص المعلومات الزمنية يحد من القدرة على الكشف عن التغيرات في دورات النتوءات اللاميلبودية وقياسها كميا.

يقوم برنامج معالجة الصور وتحليلها بإجراء تحليل مبسط للخلايا المنتشرة ، من تجزئة الخلايا إلى تحديد كمية البيانات. عادة ما تتضمن تحليلات الصور اليدوية لانتشار الخلايا اختيارا متحيزا لقيمة العتبة أو تطبيق خوارزمية تجزئة تلقائية ، وهي غير مناسبة للتجارب عالية الإنتاجية حيث تحتاج العديد من الصور إلى تحليلها. لذلك ، فإن برنامجنا مصمم للكشف عن الخلايا المنتشرة وتقسيمها بطريقة آلية ، بالإضافة إلى تحديد ديناميكيات النتوء واصفات مورفولوجية. معا، هذه الميزات تجعل البروتوكول الموصوف قابلا للفحص عالي الإنتاجية لمسارات الإشارات واللاعبين الجزيئيين الذين ينظمون اللاميلبوديا.

لضمان أن تحليل الخلايا المنتشرة قوي ودقيق، يجب تنفيذ بعض الخطوات الهامة في البروتوكول بحذر إضافي. الخطوة الأولى من الخلية نشر المقايسة ينطوي على الطلاء الخلايا ذات العلامات الفلورية في كثافة منخفضة جدا على غطاء المغلفة فيبروكتين في اليوم السابق للتصوير (الشكل 1A-D). هذه الخلايا المستقطبة تمكين التركيز الدقيق لل حواف الخلايا المنتشرة جاحظ أثناء الحصول على الصورة. إذا كانت كثافة الخلايا المستقطبة عالية جدا، فإن الخلايا المنتشرة لديها فرصة كبيرة للهبوط على الخلايا المستقطبة أو تداخلها معها، مما قد يؤدي إلى فشل تجزئة الخلية. فترة الاسترداد بعد المحاولة خطوة هامة أخرى في هذا البروتوكول. الخلايا المعالجة بالمخدرات ذات الأهمية، على سبيل المثال، DMSO أو CK-666، يتم فصلها عن طبق زراعة الخلايا عن طريق تريبسين-EDTA (الخطوة 2)، تليها فترة نقاهة مدتها 45 دقيقة(الشكل 1E). هذه الخطوة الانتعاش يسمح للخلايا للتعافي من الانقسام البروتيوليك من البروتينات سطح الخلية عن طريق تريبسين19،24 ومزامنة بداية انتشار الخلية ( الشكل2). إذا تم حذف خطوة الاسترداد، فإن التباين بين الخلايا في منطقة انتشار الخلايا يزيد، مما يقلل من اتساق النمط الظاهري البيولوجي.

أثناء الحصول على الصورة ، أي انجراف عينة يقلل حتما من جودة ودقة تحليل انتشار الخلايا ، وخاصة تحليل kymograph. وللتقليل إلى أدنى حد من انحراف العينة، ينبغي اتخاذ بعض التدابير. أولا، يجب على المستخدم تحسين حركة المرحلة أثناء الحصول على الصورة. ويشمل التحسين تقليل مرحلة السفر بين مجالات الرؤية وتقليل سرعة حركة المرحلة. ثانيا، من الضروري تأمين العينة بإحكام على مرحلة المجهر. وإذا لم تقض هذه التدابير المقترحة على انحراف العينة، فينبغي النظر في تجهيز ما بعد الاقتناء. من بين العديد من الأدوات الحاسوبية الملكية والمفتوحة المصدر ، نوصي باستخدام المكون الإضافي "التسجيل القائم على الوصف" فيجي لتصحيح تحولات الصورة ومحاذاة أفلام الخلايا المنتشرة (يمكن العثور على التعليمات على: https://imagej.net/Descriptor-based_registration_(2d/3d)).

وتجدر الإشارة إلى أن التحليل الكمي لمناطق الخلية وديناميات الحافة التي يؤديها البرنامج يعتمد بشكل كبير على دقة تجزئة الخلية. لضمان التقسيم الدقيق، نوصي بتصور انتشار الخلايا باستخدام نظام تصوير كونفوج، ويفضل أن يكون مجهرا كونفوجكال قرص دوار يوفر دقة عالية، وbleaching/phototoxicity منخفضة، ونسبة عالية من الإشارة إلى الضوضاء. يزيل المجهر البؤري بكفاءة الفلورسينس الخارج عن التركيز المنبعث من الخلايا المنتشرة ، مما يقلل من دقة تقسيم الصورة وتتبع حدود الخلية. إذا تم استخدام مجهر واسع النطاق لاكتساب الصورة، فقد يلزم معالجة إضافية بعد الاستحواذ، مثل إزالة الالتهاب من الصورة، لإزالة الفلورسينس خارج التركيز وتحسين دقة تجزئة الخلايا. لذلك ، ينبغي النظر في اختيار نظام التصوير.

ضمن البرنامج الموصوف ، تم تنفيذ خوارزميتين لتقسيم الصور وتحسينها للكشف بشكل موثوق عن الخلايا المسماة ببروتينات فلورية خافتة إلى مشرقة بشكل معتدل ، مثل البروتينات الفلورية الخضراء والحمراء الخلوية (GFP و RFP)26،27. ومع ذلك ، فإن خوارزميات التقسيم هذه لها نطاق ديناميكي محدود وليست مناسبة للكشف عن الخلايا المسماة ببروتينات أو أصباغ فلورية مشرقة للغاية. في أيدينا ، تميل هذه الخوارزميات إلى نقص الفصل في الخلايا الساطعة للغاية بسبب انحراف الرسم البياني للصورة نحو بكسل عالي الكثافة. بالنسبة للعينات الساطعة ، يمكن التحكم في كثافة الصور عن طريق ضبط وقت التعرض أو قوة إخراج ليزر الإثارة.

مع أخذ هذه الاعتبارات في الاعتبار ، فإن بروتوكول نشر الخلايا الحية هذا هو أداة قوية وقوية لدراسة ديناميكيات اللاميلبوديا. منصة تحليل الصور الآلية مناسبة للعديد من التحقيقات البيولوجية ، على سبيل المثال ، فحص عالي المحتوى للعوامل الجزيئية / الإشارات التي تنظم نتوءات لاميليبوديال.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

Acknowledgments

تم دعم هذا العمل من خلال جائزة المحقق الجديد لصندوق كونوت ل S.P. ، المؤسسة الكندية للابتكار ، برنامج منح اكتشاف NSERC (المنح RGPIN-2015-05114 و RGPIN-2020-05881) ، صندوق الأبحاث المشتركة لجامعة مانشستر وجامعة تورنتو ، وبرنامج جامعة تورونتو XSeed.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05% Trypsin (0.05%), 0.53 mM EDTA Wisent Bioproducts 325-042-CL
10.0 cm Petri Dish, Polystyrene, TC Treated, Vented Starstedt 83.3902
15 mL High Clarity PP Centrifuge Tube, Conical Bottom, with Dome Seal Screw Cap, Sterile Falcon 352097
1-Well Chamlide CMS for 22 mm x 22 mm Coverslip Quorum Technologies CM-S22-1
35 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish Falcon 353001
50 mL Centrifuge Tube, Transparent, Plug Seal Nest 602002
6.0 cm Cell Culture Dishes Treated for Increased Cell Attachment, Sterile VWR 10861-658
Arp2/3 Complex Inhibitor I, CK-666 Millipore Sigma 182515
Camera, Prime 95B-25MM Photometrics
Dimethyl Sulfoxide, Sterile BioShop DMS666
DMEM, 1x, 4.5 g/L Glucose, with L-Glutamine, Sodium Pyruvate and Phenol Red Wisent Bioproducts 319-005 CL
DMEM/F-12, HEPES, No Phenol Red Gibco 11039021
D-PBS, 1X Wisent Bioproducts 311-425 CL
Fetal Bovine Serum Wisent Bioproducts 080-110
Fiji Software ImageJ
HEPES (1 M) Gibco 15630080
Human Plasma Fibronectin Purified Protein 1 mg Millipore Sigma FC010
Immersion Oil Cargille 16241
L-Glutamine Solution (200 mM) Wisent Bioproducts 609-065-EL
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) Gibco 11140050
Micro Cover Glasses, Square, No. 11/2 22 x 22 mm VWR CA48366-227-1
Microscope Body, Eclipse Ti2-E Nikon
Objective, CFI Plan Apo Lambda 60X Oil Nikon MRD01605
Penicillin-Streptomycin Sigma P4333
Spinning Disk, Crest Light V2 CrestOptics
Spyder Anaconda
Stage top incubator Tokai Hit
Statistics Software, Prism GraphPad
Tweezers, Style 2 Electron Microscopy Sciences 78326-42

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mullins, R. D., Heuser, J. A., Pollard, T. D. The interaction of Arp2/3 complex with actin: Nucleation, high affinity pointed end capping, and formation of branching networks of filaments. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95, (11), 6181-6186 (1998).
  2. Yang, C., Czech, L., Gerboth, S., Kojima, S., Scita, G., Svitkina, T. Novel Roles of Formin mDia2 in Lamellipodia and Filopodia Formation in Motile Cells. PLoS Biology. 5, (11), 317 (2007).
  3. Mogilner, A., Oster, G. Cell motility driven by actin polymerization. Biophysical Journal. 71, (6), 3030-3045 (1996).
  4. Mogilner, A., Oster, G. Force Generation by Actin Polymerization II: The Elastic Ratchet and Tethered Filaments. Biophysical Journal. 84, (3), 1591-1605 (2003).
  5. Pollard, T. D., Borisy, G. G. Cellular Motility Driven by Assembly and Disassembly of Actin Filaments. Cell. 112, (4), 453-465 (2003).
  6. Wu, C., et al. Arp2/3 is critical for lamellipodia and response to extracellular matrix cues but is dispensable for chemotaxis. Cell. 148, (5), 973-987 (2012).
  7. Steffen, A., et al. Rac function is crucial for cell migration but is not required for spreading and focal adhesion formation. Journal of cell science. 126, Pt 20 4572-4588 (2013).
  8. Gupton, S. L., et al. Cell migration without a lamellipodium. The Journal of Cell Biology. 168, (4), 619-631 (2005).
  9. Dimchev, V., et al. Induced Arp2/3 Complex Depletion Increases FMNL2/3 Formin Expression and Filopodia Formation. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 634708 (2021).
  10. Leithner, A., et al. Diversified actin protrusions promote environmental exploration but are dispensable for locomotion of leukocytes. Nature cell biology. 18, (11), 1253-1259 (2016).
  11. Giannone, G., Dubin-Thaler, B. J., Döbereiner, H. -G., Kieffer, N., Bresnick, A. R., Sheetz, M. P. Periodic Lamellipodial Contractions Correlate with Rearward Actin Waves. Cell. 116, (3), 431-443 (2004).
  12. Dubin-Thaler, B. J., et al. Quantification of Cell Edge Velocities and Traction Forces Reveals Distinct Motility Modules during Cell Spreading. PLoS ONE. 3, (11), 3735 (2008).
  13. Suraneni, P., Rubinstein, B., Unruh, J. R., Durnin, M., Hanein, D., Li, R. The Arp2/3 complex is required for lamellipodia extension and directional fibroblast cell migration. The Journal of cell biology. 197, (2), 239-251 (2012).
  14. Wang, C., et al. Deconvolution of subcellular protrusion heterogeneity and the underlying actin regulator dynamics from live cell imaging. Nature Communications. 9, (1), 1688 (2018).
  15. Dimchev, G., et al. Lamellipodin tunes cell migration by stabilizing protrusions and promoting adhesion formation. Journal of cell science. 133, (7), 239020 (2020).
  16. Burnette, D. T., et al. A role for actin arcs in the leading-edge advance of migrating cells. Nature cell biology. 13, (4), 371-381 (2011).
  17. Yamada, K. M., Kennedy, D. W. Dualistic nature of adhesive protein function: fibronectin and its biologically active peptide fragments can autoinhibit fibronectin function. The Journal of Cell Biology. 99, (1), 29-36 (1984).
  18. Cai, Y., et al. Nonmuscle Myosin IIA-Dependent Force Inhibits Cell Spreading and Drives F-Actin Flow. Biophysical Journal. 91, (10), 3907-3920 (2006).
  19. Humphries, M. J. Cell adhesion assays. Molecular Biotechnology. 18, (1), 57-61 (2001).
  20. Cavalcanti-Adam, E. A., Volberg, T., Micoulet, A., Kessler, H., Geiger, B., Spatz, J. P. Cell Spreading and Focal Adhesion Dynamics Are Regulated by Spacing of Integrin Ligands. Biophysical Journal. 92, (8), 2964-2974 (2007).
  21. Dubin-Thaler, B. J., Giannone, G., Döbereiner, H. -G., Sheetz, M. P. Nanometer Analysis of Cell Spreading on Matrix-Coated Surfaces Reveals Two Distinct Cell States and STEPs. Biophysical Journal. 86, (3), 1794-1806 (2004).
  22. Gauthier, N. C., Fardin, M. A., Roca-Cusachs, P., Sheetz, M. P. Temporary increase in plasma membrane tension coordinates the activation of exocytosis and contraction during cell spreading. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, (35), 14467-14472 (2011).
  23. Wolfenson, H., Iskratsch, T., Sheetz, M. P. Early Events in Cell Spreading as a Model for Quantitative Analysis of Biomechanical Events. Biophysical Journal. 107, (11), 2508-2514 (2014).
  24. Guan, J. -L., Berrier, A. L., LaFlamme, S. E. Cell Migration, Developmental Methods and Protocols. Methods in molecular biology. 294, Clifton, N.J. 55-68 (2004).
  25. Raucher, D., et al. Phosphatidylinositol 4,5-Bisphosphate Functions as a Second Messenger that Regulates Cytoskeleton-Plasma Membrane Adhesion. Cell. 100, (2), 221-228 (2000).
  26. Machacek, M., Danuser, G. Morphodynamic Profiling of Protrusion Phenotypes. Biophysical Journal. 90, (4), 1439-1452 (2006).
  27. Zack, G. W., Rogers, W. E., Latt, S. A. Automatic measurement of sister chromatid exchange frequency. The journal of histochemistry and cytochemistry official journal of the Histochemistry Society. 25, (7), 741-753 (1977).
  28. Bardsley, W. G., Aplin, J. D. Kinetic analysis of cell spreading. I. Theory and modelling of curves. Journal of cell science. 61, 365-373 (1983).
التحليل الكمي لديناميكيات حافة الخلية أثناء انتشار الخلايا
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Iu, E., Bogatch, A., Plotnikov, S. V. Quantitative Analysis of Cell Edge Dynamics during Cell Spreading. J. Vis. Exp. (171), e62369, doi:10.3791/62369 (2021).More

Iu, E., Bogatch, A., Plotnikov, S. V. Quantitative Analysis of Cell Edge Dynamics during Cell Spreading. J. Vis. Exp. (171), e62369, doi:10.3791/62369 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter