Summary
Her leverer vi en trinvis protokol med tip til at generere xenografts og retningslinjer for tumoradfærdsanalyse, fuldmonterings immunofluorescens og konfokal billeddannelseskvantificering.
Abstract
Zebrafisk larve xenografts bliver udbredt til kræftforskning til at udføre in vivo og real-time undersøgelser af kræft hos mennesker. Muligheden for hurtigt at visualisere reaktionen på kræftbehandlinger (kemo, strålebehandling og biologiske), angiogenese og metastaser med enkeltcelleopløsning placerer zebrafisk xenograft-modellen som et øverste valg til at udvikle prækliniske undersøgelser.
Zebrafisk larve xenograft assay præsenterer flere eksperimentelle fordele i forhold til andre modeller, men sandsynligvis den mest slående er reduktionen af størrelsesskalaen og dermed tid. Denne reduktion af skalaen tillader enkeltcellebilleddannelse, brug af et relativt lavt antal menneskelige celler (kompatibel med biopsier), medium-høj-gennemløb lægemiddelscreeninger, men vigtigst af alt muliggør en betydelig reduktion af tidspunktet for analysen. Alle disse fordele gør zebrafisk xenograft assay yderst attraktivt for fremtidige personlige medicin applikationer.
Mange zebrafisk xenograft protokoller er blevet udviklet med en bred mangfoldighed af menneskelige tumorer; Der mangler dog stadig en generel og standardiseret protokol til effektiv generering af zebrafisk larve xenografts. Her giver vi en trin-for-trin protokol, med tips til at generere xenografts og retningslinjer for tumor adfærd analyse, hele mount immunofluorescens, og konfokale billeddannelse kvantificering.
Introduction
Zebrafisk (Danio rerio) er på vej som en kraftig hvirveldyr model organisme til at studere udvikling og sygdom. Zebrafisk deler stærkt bevarede genetiske (~70% genetisk homologi og ~84% sygdomsrelaterede gener) og grundlæggende organmorfologiske træk hos mennesker1,2. Denne bevarelse tillader brug af zebrafisk til at modellere flere menneskelige sygdomme, herunder kræft3,4.
Håndtering og vedligeholdelse af zebrafisk er meget lettere og mere omkostningseffektiv end mus på grund af deres lille størrelse, høj fecundity hele året rundt og ekstern befrugtning3,5. Zebrafisk embryoner kræver ikke levende fodring i løbet af deres første 5-7 dage af livet og er blevet brugt som en effektiv model for udvikling, infektion og kræft1,4,6,7. Zebrafisk embryoner klækkes på 48 timer efter befrugtning (hpf) og er fritsvømte dyr med alle dannede organer, et bankende hjerte og funktionelt kredsløbssystem, lever, hjerne, nyremarv osv.1,3. Også på dette udviklingsstadium kun medfødte immunitet er på spil, adaptiv immunitet er stadig under udvikling, så en generel effektiv engraftment af menneskelige celler uden behov for brug af immunkompromitterede mutanter7,8. Ikke desto mindre er det vigtigt at bemærke, at ikke alle menneskelige celler engraft lige9, og at det for f.eks. leukæmiceller blev påvist, at fagocytter (neutrofiler og makrofager) skal nedbrydes for at sikre effektiv engraftment10.
Zebrafiskens genetiske tarmkanal og den optiske gennemsigtighed i dens tidlige embryonale stadier giver mulighed for intravital billeddannelse i en enkelt celle i høj opløsning og dermed for etablering af avancerede billeddannelsesteknikker inden for forskellige biologiområder. Desuden, i forbindelse med kræft, disse funktioner er nyttige for real-time undersøgelser af de tidligste stadier af vært-tumor interaktioner, som at studere angiogene og metastatiske potentiale, samt interaktioner med det medfødte immunsystem8,9,11,12,13.
Selv i den korte xenograft assay er der ikke tid til metastatisk "evolution" - det er muligt at analysere tumorcellernes metastatiske kapacitet (dvs. deres effektivitet til at gå gennem metastatiske trin som invasion, intravasation, overlevelse i omløb, ekstravasation og kolonisering og derfor studere disse processer in vivo og i realtid8,11,13,14).
Kendetegnene ved dens livscyklus placerer zebrafisken som en unik model for personlig medicin i kræft. Assays kan udføres på kortere tid og resultater opnået i et par uger7,8,9,11,12,15,16. Celerity og gennemførligheden af disse assays giver læger og forskere mulighed for at opnå translationelle resultater, der kan være nyttige for kræftpatienter, for hvem tid er et væsentligt behov.
På trods af de stigende forsøg på at generere vellykkede zebrafiskembryo xenografter er der stadig behov for standardisering af injektionsproceduren samt evaluering af cellelevedygtighed og tumoradfærd efter injektion.
I denne protokol giver vi forskere en klar og detaljeret trin-for-trin guide til injektion af humane kræftcellelinjer i zebrafiskembryoner og efterfølgende fiksering, immunostaining, billeddannelse og kvantificering af tumorcelleadfærd.
Protocol
Zebrafiskmodellen(Danio rerio)blev håndteret og vedligeholdt i overensstemmelse med standardprotokollerne i den europæiske dyrevelfærdslovgivning, direktiv 2010/63/EU (Europa-Kommissionen, 2016) og Champalimaud Fish Platform. Alle protokoller blev godkendt af Champalimaud Animal Ethical Committee og portugisiske institutionelle organisationer-ORBEA (Órgão de Bem-Estar e Ética Animal/Animal Welfare and Ethics Body) og DGAV (Direção Geral de Alimentação e Veterinária/Generaldirektoratet for Fødevarer og Veterinær).
BEMÆRK: Før du starter de vigtigste eksperiment, praksis med den menneskelige kolorektal cancer (CRC) celle linje HCT116. Denne celle linje er let at forberede (meget proliferative), let at injicere og engrafts meget effektivt (omkring 95-100%). Start med celler i overskud (~ 12x106 celler, T-75 kolbe) og overskydende fisk (400 fisk), indtil de bliver dygtige i teknikken, da mange celler og fisk vil gå tabt under træningen. Eksperimenter er klar, når engraftment på ~ 95% er opnået i HCT116 xenografts. Se figur 1 for at få et skema over hele protokollen.
1. Opsætning til injektion
- To uger før injektionen udvides cellerne i kulturen (se tabel 1 for en detaljeret vejledning i det optimale in vitro-sammenløb ved injektion af flere cellelinjer).
- Tre dage før injektionen krydser zebrafisken i den ønskede baggrund.
2. 24 timer før injektion
- Rengør zebrafiskembryoner (kassér alle døde og ikke-udviklede embryoner) og opdater E3-mediet.
- I cellekulturrummet skal cellekulturmediet kasseres fra de kolber, der er planlagt til injektion, vaskes én gang med 1x fosfatbufferet saltvand (PBS) for at fjerne de døde celler og tilsættes frisk medium.
- Forbered værktøjerne til injektionsproceduren, såsom: mikroinjection nåle, agaroseplader og hårnåle for at justere embryoner til injektion(Figur 2A-D, beskrevet nedenfor).
- Mikroinjektionsnåle (figur 2A)
- Brug borosilikatglaskapillærer (4 tommer, OD 1,0 mm, ingen glødetråd i en mikropipettetrækker (varme: ≈500; fil: 10; vel: 50; dec: 60; træk: 100).
- Tilberedning af plader(figur 2B)
- Forbered 2% agarose i H2O, varm det op og hæld et lag opløst agarose i låget af en ren petriskål. Lad det polymerisere og ved hjælp af en lineal, lav tre til fire lige agaroselinjer til tilpasning af embryonerne.
- Hårnålesamling (Figur 2C-D)
- Placer 1 hår inde i et glas kapillær rør forlader ca 1 centimeter hår uden for røret.
- Krølle den udvendige spids af håret ved hjælp af pincet i glasset kapillær rør danner en løkke på ~ 0,5 mm længde.
- Forsegl kanten af kapillærrøret med en dråbe neglelak. Dette vil også hjælpe med at løse løkken på plads. Lad det tørre. Gentag proceduren på den anden kant af røret.
- Skær et stykke elektrisk tape (mere modstandsdygtigt, uigennemtrængeligt og stift end almindeligt klæbebånd).
- Forsegl båndet omkring kapillæren for at beskytte det mod at gå i stykker.
- Mikroinjektionsnåle (figur 2A)
3. Injektionsdag
- Adskil de udklækkede embryoner fra unhatched æg. Tilføjelse af 1x pronase (0,6 mg/mL, tabel 3) til fostermediet på dette stadium kan øge udklækningen. Embryonerne anbringes i inkubatoren (ved 28 °C) indtil injektionen.
BEMÆRK: Lad ikke embryonerne stå i pronaseopløsningen i mere end 1 time, da enzymet vil virke på de udklækkede embryoner, hvilket øger deres risiko for dødelighed. Sørg for, at embryonernes udviklingsstadium er det, der svarer til 48 hkf (figur 3A, A') for at undgå risikoen for ødem og dødelighed. - Forbered 1x Tricaine (fra en 25x lager).
BEMÆRK: En detaljeret opskrift findes i tabel 3 og på Zebrafish Information Network - ZFIN webside17.
4. Cellemærkning til injektion
BEMÆRK: Mærkning af celler kan udføres enten direkte i en kolbe eller i et 1,5 mL mikrocentrifugerør efter enzymatisk løsrivelse. Yderligere oplysninger finder du i Discussion.
- Fjern cellekulturmediet og vask kolben to gange (2x) med 1X PBS.
- Cellerne mærkes med et fedtstof efter eget valg enten direkte i kolben (2 ml opløsning/T75-kolbe) eller i et 1,5 ml mikrocentrifugerør efter enzymatisk løsrivelse. Undgå at blive udsat for lys og inkubere celler ved 37 °C (se tabel 1 og tabel 2 for tilstande/opløsninger).
- Hvis mærkning i kolben
- Fjern farvestoffet, vask med 1x PBS og løsrive cellerne med EDTA og en celle skraber.
- Celler overføres til 1,5 mL mikrocentrifugerør. Centrifuge i 5 minutter ved 300 x g derefter gå til trin 4,5.
- Hvis mærkningen i mikrocentrifugerøret på 1,5 mL:
- Centrifuge 5 minutter ved 300 x g for at fjerne farvestoffet og kassere supernatanten. Resuspend i 1x PBS til vask.
- Centrifuge 5 minutter ved 300 x g og derefter gå til trin 4.5.
- Supernatanten kasseres, og pelletpen med cellekulturmedium (for en 50 μL pellet tilsættes ~ 150-200 μL medium).
- Kvantificer celle levedygtighed ved hjælp af en Neubauer kammer med Trypan blå udelukkelse eller anden metode valg.
- Centrifuge i 4 minutter ved 300 x g og kassér supernatanten. Genbrug cellerne i injektionsmediet.
BEMÆRK: Den anbefalede cellekoncentration (generelt fra 0,25-0,5x106 celler/μL) og medium findes i tabel 1. - Fra dette tidspunkt og fremefter, holde cellerne på is.
5. Injektionsprocedure
- Bedøve embryoner i 1x Tricaine i 5 minutter.
- Med en plastik Pasteur pipette, overføre en lille mængde (~ 50) af bedøvede embryoner til agarose plade og omhyggeligt tilpasse dem ved hjælp af en hårnål loop. Sørg for at holde afstand mellem embryonerne, især mellem æggeblommen på den ene og hovedet på den næste(Figur 4A).
BEMÆRK: Antallet af embryoner, der skal justeres, vil variere afhængigt af ekspertiseniveauet hos den forsker, der udfører injektionerne. Start med et par (~10-20). For en skematisk over den korrekte placering af embryonerne i agar/agarosepladen se figur 4A. - Sørg for, at de justerede embryoner ikke tørrer ud i agarosepladen for at forhindre dødelighed ved forsigtigt at tilføje 1-3 dråber 1x Tricaine-opløsning til pladen.
- Tryk let på mikrocentrifugerøret for at genbruge cellerne. Indsprøjtningsnålen med celleaffjedringen tilbage ved hjælp af en mikrolæsserspids, der undgår luftbobler, da de kan kompromittere embryonernes integritet.
- Åbn lufttryksventilen (40 psi), opsæt mikroinjektoren, og placer forsigtigt mikroinjection nålen i holderen.
BEMÆRK: Brug følgende anbefalede mikroinjektorindstillinger: Hold trykket - udluftning (3 psi); Skub trykket ud - udluftning; Rækkevidde - 100 ms. - Skær mikroinjection nålen tæt på spidsen med Dumont pincet #5 eller lignende under stereomikroskopet.
BEMÆRK: Spidsen skal være stump og tynd nok til, at cellerne kan passere uden tilstopning, samt for at undgå at beskadige embryonerne og miste celler. En tyk mikroinjection nål spids vil skade embryoet og fremme dannelsen af ødem eller zebrafisk død. Graticule bruges ikke til nålekalibrering. Se Diskussion for at få en detaljeret forklaring. - Før embryonerne injiceres, testes mikroinjektortrykket, der starter med det laveste udslyngningstryk, indtil der i ~1-3 pulser opnås et volumen svarende til størrelsen af zebrafiskembryoets øje.
BEMÆRK: Det anbefales at anvende et fluorescensstermikroskop, når det er muligt i begyndelsen af træningen. Dette vil gøre det lettere at identificere fluorescerende mærkede celler. - Gennembor forsigtigt i midten af embryoets æggeblomme, sænk nålens vinkel og skub forsigtigt, indtil nålespidsen når perivitellinerummet (PVS) (Figur 4B-D).
- Tryk på mikroinjektorpedalen, og indsprøjt cellerne i PVS. Brug embryoets øje som vejledning. Prøv at injicere et volumen af celler svarende til størrelsen af embryoets øje og så vidt muligt fra hjertet for at forhindre hjerteødem.
- Fjern forsigtigt nålen og gå videre til det næste foster.
- Juster mikroinjektortrykket, hvis det er nødvendigt.
BEMÆRK: Celler har en tendens til at starte tilstopning, så trykket kan øges. Hvis det er nødvendigt, er det muligt at skære kapillæren (for at øge diameteren) og samtidig reducere trykket. - De injicerede embryoner overføres til en ren petriskål (tabel 4) med 1x Tricaine-opløsning, og de hviles i 5-10 minutter. Dette vil give tid til såret til at lukke.
BEMÆRK: For at overføre embryonerne fra agarpladen til petriskålen tilsættes et par dråber 1x Tricaine-opløsning oven på embryonerne og omhyggeligt samle dem med en plast pasteurpipette. Drop de indsamlede embryoner i en ny petriskål med 1x Tricaine opløsning. - Fjern 1x Tricaine opløsning og tilsæt frisk E3 medium.
- Xenografterne inkuberes ved 34 °C (en kompromitteret temperatur mellem menneskelige cellelinjers overlevelse og udvikling af zebrafisk8).
6. Metastatisk analyse
- Ved ca. 1 times postinjektion (hpi) screenes de injicerede embryoner på et fluorescerende stereomikroskop, og xenografterne sorteres i 2 grupper i henhold til fraværet (figur 5A) eller tilstedeværelsen (figur 5B) af celler i omløb.
BEMÆRK: Selv om der kun påvises én kræftcelle i hjertet eller cirkulationen, skal disse xenografter medtages i gruppen af xenografter med celler i omløb. Alternativt kan celler injiceres direkte i omløb for at øge antallet af xenografts i denne gruppe.
7. 1 dag efter injektion
- På et fluorescerende stereomikroskop analyseres hvert foster omhyggeligt, og der vælges dem med korrekt injicerede tumorer (Figur 6).
BEMÆRK: Hvis det er nødvendigt, bedøve de injicerede embryoner med Tricaine 1X opløsning før screening. - Udsmid følgende embryoner/xenografter (figur 6A-A''):
• uden tumor/unormal morfologi/død
• med hjerte- og/eller æggeblommeødem
• kun med tumorceller i æggeblommen
• med meget få kræftceller. - Sorter udvalgte xenografts efter deres tumor størrelse. Brug øjets størrelse til sammenligning(Figur 6B-B'', 6C).
• Tumorer mindre end størrelsen af øjet (+),
• Tumorer af samme størrelse som øjet (++)
• Tumorer større end størrelsen af øjet (+++). - Fordel xenografts i henhold til den ønskede eksperimentelle layout og starte narkotika assay (kontrol vs stof, osv.). Udskift stofferne og E3-mediet dagligt(tabel 4).
- Xenografterne inkuberes og holder temperaturen på 34°C indtil afslutningen af analysen.
8. 4 dage efter injektion
- På den sidste dag i analysen bedøves xenografterne med 1x Tricaine-opløsning og justerer dem omhyggeligt på agarpladen.
BEMÆRK: Kassér eventuelle døde eller hævede xenografts. Drug behandlinger og nogle tumorceller kan fremkalde toksicitet og i sidste ende forårsage xenograft dødelighed. Disse xenografts tages ikke i betragtning ved engraftment kvantificering. - At bestemme procentdelen af engraftment: på et fluorescerende stereomikroskop analysere hver levende xenograft og vurdere fraværet (Figur 6D) / tilstedeværelse (Figur 6E) af tumorer i PVS.
- At bestemme procentdelen af metastaser: På et fluorescerende stereomikroskop analyseres hver xenograft, og tilstedeværelsen/fraværet af mikrometastase i det kaudale hæmatopoietiske væv (CHT) i de 2 tidligere definerede grupper (CIRC og NO CIRC, figur 6F)
- Ifølge forsøgsopsætningen skal du vælge xenografts af interesse og aflive dem med 25x Tricaine (Tabel 3).
- De fastgøres i 4 % formaldehyd (FA) i mindst 4 timer ved stuetemperatur (RT) eller natten over ved 4 °C.
BEMÆRK: Brug methanolfri formaldehyd (16% FA) fortyndet ved 4% i PBS/0,1% Triton. Fyld rørene til toppen med fiksativ. Placer rørene vandret for at sikre en homogen fiksering af alle xenografter, hvilket øger permeabiliteten og forhindrer zebrafisken i at aggregere i bunden. - De kan også fastgøres med rør (pr. 1 mL: 100 μL 1 M PIPES natriumsalt (4 °C), 1 μL på 1 M MgSO4 (RT); 4 μL af 0,5 M EGTA (RT); 93,7 μL 16% FA (RT); 801,3 μL ddH2O).
BEMÆRK: PIPES bevarer fluorescensen af RFP og mCherry transgene linjer bedre end 4% FA. - Hvis immunostaining vil blive udført på en anden dag, erstatte FA med 100% methanol (MetOH). Xenografts, der er fastgjort i 100% methanol, kan opbevares ved -20 °C på ubestemt tid.
BEMÆRK: MetOH kan forringe effektiviteten af visse farvninger (dvs. falloidin) og slukke nogle fluorescerende mærkning. Bekræft effektiviteten af antistofferne i MetOH faste prøver på forhånd.
9. Hele mount immunostaining til confocal billeddannelse
BEMÆRK: Hele mount immunofluorescens teknik tager 3 dage fordelt som følger: Den første dag er for gennemtrængning af xenografts og primære antistof inkubation. Den anden dag til vask og sekundær antistofinkubation og den tredje dag til vask, fiksering af xenografter og opbevaring i monteringsmediet.
- Dag 1
- Hvis xenografterne blev opbevaret i 100% MetOH, rehydreres de med en række faldende MetOH-koncentrationer (75%, 50%, 25% MetOH fortyndet i PBS/0,1% Triton). Hvis det er fastsat i FA, erstatte det med PBS/0,1% Triton.
- Vask 4x i 5 minutter i PBS/0,1% Triton.
- Vask 1x i 5 minutter i H2O.
BEMÆRK: Rørene skal placeres vandret altid i fikserings-, gennemtrængnings- og vasketrin, medmindre andet er angivet. - H2O udskiftes for iskold acetone og inkuberes ved -20 °C i 7 minutter.
BEMÆRK: Placer et 50 ml rør med acetone ved -20 °C, så det er klar til brug. Mikrocentrifugerør skal placeres lodret på et stativ, så acetonen ikke siver ud. - Vask 2x i 10 minutter i PBS/0,1%Triton.
- Inkuberes med PBDX_GS blokeringsopløsning i 1 time ved RT (PBDX_GS blokeringsbuffer: 50 ml 1x PBS; 0,5 g kvægserumalbumin - BSA; 0,5 ml DMSO; 250 μL på 10% Triton; 750 μL gedeserum - GS (15 μL/1 ml)).
- Fjern PBDX_GS og tilsæt ~40 μL primær antistoffortynding (generelt 1:100).
BEMÆRK: Mængden af det primære antistoffortynding varierer afhængigt af antallet af xenografter i mikrocentrifugerøret. Sørg for, at alle xenografts er nedsænket. - Inkuber i 1 time ved RT og derefter ved 4 °C natten over. Placer rørene lodret.
- Dag 2
- Fjern primært antistof og vask 2x i 10 minutter i PBS/0,1% Triton.
- Vask 4x i 30 min i PBS/0,05% Tween.
BEMÆRK: Følgende trin skal udføres i mørke (brug aluminiumsfolie for at beskytte rør mod lys). - Fjern PBS/0,05% Tween og tilsæt ~50-100 μL sekundær antistoffortynding (generelt 1:200 - 1:400) + DAPI (50 μg/mL) fortyndet i PBDX_GS.
- Inkuber i 1 time ved RT og derefter ved 4 °C natten over. Placer rør lodret og beskyt mod lys.
- Dag 3 (brug aluminiumsfolie til at beskytte rør mod lys)
- Fjern sekundær antistoffortynding og vask 4x i 15 minutter i PBS/0,05% Tween.
- Fix ved stuetemperatur i 20 minutter i 4% FA.
- Vask 1x i 5 minutter i PBS/0,05% Tween.
- Fjern PBS/0,05% Tween og tilsæt 1 dråbe vandigt monteringsmedium til hvert mikrocentrifugerør. Placer rørene lodret.
- Monter eller opbevar ved 4 °C beskyttet mod lys, indtil den monteres. Placer rørene lodret.
10. Montering af xenografts
BEMÆRK: Beskyt mikrocentrifugerør mod lyset under hele processen. Zebrafisk xenografts er monteret mellem 2 coverslips (24 x 60 mm # 1,5). Dette gør det muligt at vende de monterede xenografts under konfokal billeddannelse, så begge sider af tumoren (top og bund) er tilgængelige. Brug ikke plastpipetter med monteringsmedium - xenografterne kan blive fanget i pipetten. Se figur 7 for at få en skematisk repræsentation af følgende trin.
- Mærk coverslip Y og forsegle kanterne af coverslip X med vaseline eller silikone fedt for at undgå lækage af monteringsmediet.
- Overfør xenografterne med en glas Pasteur pipette til coverslip X.
- Juster dem forsigtigt med en hårnål og fjern det overskydende vandige monteringsmedie.
- Tilføj vandigt monteringsmedie til coverlip Y.
- Placer forsigtigt coverlip Y oven på coverslip X. Tryk ikke på coverlips, da dette potentielt kan forstyrre xenografterne.
- Placer de samlede coverlips oven på et mikroskop dias og fastgør dem med gennemsigtigt tape. Dette gør det lettere at manipulere med konfokal billedbehandling og lagring.
11. Konfokal billeddannelse
BEMÆRK: En apokomatisk 25x nedsænkning objektiv linse med vand korrektion er optimal til billeddannelse PVS tumorer med enkelt celle opløsning (se figur 8C-C" og Figur 9A for eksempler).
- Anskaffe prøver ved hjælp af z-stack-funktionen med et interval på 5μm mellem hver skive. For billeder, der er rettet mod 3D-rekonstruktion, især i fartøjer, skal der anvendes et interval på 1-3μm mellem skiver (Figur 8A).
12. Analyse og kvantificering
- Brug FIJI/ImageJ-software eller lignende til konfokal billedbehandling og -analyse.
- Åbn de rå data (.czi, .lsm osv.) i FIJI-software.
- Hvis du vil markere hele eller kun en enkelt kanal i sammensat tilstand, skal du klikke på: Billede > farver > kanaler .
- Hvis du vil justere lysstyrke og kontrastniveauer, skal du klikke på: Billede > Juster > Farvebalance.
- At kvantificere tumor størrelse
- Vælg tre repræsentative skiver af tumoren, fra toppen, midten og bunden, pr. z-stak pr. xenograft (Figur 8 A).
BEMÆRK: Confocal opløsning opnår ~ 60-70 μm tumor dybde. Hvis tumoren er stor, kan det ikke være muligt at billedet sin samlede volumen. - Åbn et regneark for at anmærke dataene.
- Tæl alle DAPI-kerner, der svarer til tumorcellerne i de 3 udvalgte skiver (Figur 8 A, B). Det gør du ved at gøre følgende:
- Åbn celletæller-plug-in'en fra FIJI/ImageJ ved at klikke på Plugins > Analyser > Celletæller.
- Klik på Initialiseri celletællerværktøjet, vælg en tællertype, og klik på billedet for at starte optællingstilstanden manuelt. For hvert klik tilføjer tælleren, hvor mange celler der tælles (antal klik).
- Når du har talt et helt udsnit, skal du gemme cellenummeret i det tilsvarende Excel-dokument.
- Tilbage til Fiji skal du klikke på Nulstil fra vinduet Celletæller for at slette oplysningerne, hvis den samme tæller skal bruges. Ellers kan oplysningerne opbevares, og andre tællere kan bruges sammen med andre udsnit (eller celler).
- Flyt til det andet repræsentative udsnit, og gentag de forrige trin. Indsaml alle data.
BEMÆRK: DAPI-modståning bruges ofte til at tælle cellenumre på grund af den klare definition af individuelle celler, men der kan bruges anden cellespecifik farvning.
- For at opnå det samlede antal celler i tumoren skal du bruge følgende formel:
BEMÆRK: Korrektionstallet på 1,5 blev estimeret for celler med en gennemsnitlig kernediameter på ~10-12 μm. Denne korrektion skal muligvis justeres, hvis cellerne er større/mindre. Se Dicussion for flere detaljer om denne metode.
- Vælg tre repræsentative skiver af tumoren, fra toppen, midten og bunden, pr. z-stak pr. xenograft (Figur 8 A).
- At kvantificere andre markører (immunceller, mitotiske tal, PPH3, aktiveret Caspase3, Ki67, osv.), kvantificere alle skiver ved hjælp af samme plugin (se figur 8C-C'' for mitotiske tal visualisering). Divider det samlede antal optalte celler med den tilsvarende tumorstørrelse og gang med 100 for at få procentdelen.
BEMÆRK: Pas på, at nogle celler vil være placeret mellem to skiver, gå frem og tilbage i z-stakken for at sikre, at en celle ikke tælles to gange.
Representative Results
Zebrafisk xenograft som et redskab til at studere anti-cancer behandlinger.
HCT116 kolorektal cancer celle linje blev mærket med CM-DiI og injiceres i PVS af 2 dage efter befrugtning (dpf) embryoner. Efter injektion blev xenografts inkuberet ved 34 °C, en temperatur, der tillader vækst af tumorceller uden at gå på kompromis med zebrafiskudviklingen. Den næste dag blev xenografts screenet i henhold til tilstedeværelsen eller fraværet af en tumormasse i PVS (ikke korrekt injiceret zebrafisk blev kasseret og aflivet) (Figur 6A-A''). Xenografts blev grupperet efter deres tumorstørrelse (Figur 6B-B'') og tilfældigt fordelt (i en 6-brønds plade: ~ 12 xenografts pr. brønd) i ikke-behandlede kontroller og FOLFIRI kemoterapi (0,18 mM Folinsyre, 0,08 mM Inoterican og 4,2 mM Fluorouracil (5-FU)).
Kontrol E3 og narkotika blev erstattet dagligt, og døde zebrafisk kasseres. 4 dpi, og tre dage efter behandlingen (dpt), blev engraftment kvantificeret som i trin 8.2 i protokollen. Engraftment betragtes som hyppigheden af xenografts, der præsenterer en tumormasse i PVS ved 4 dpi. For eksempel, hvis der i slutningen af eksperimentet er 40 levende larver og 35 ud af de 40 udgør en tumor i PVS, er engraftmenthastigheden 87,5%. Xenografts blev aflivet og fast til at evaluere tumor størrelse og apoptose ved immunofluorescens og konfokal mikroskopi.
Immunfluorescens blev udført for at detektere apptotiske celler ved hjælp af antikløvet Caspase 3 antistof (Asp175) (kanin, 1:100, #CST 9661) og DAPI (50 μg/mL) til kerner. Billedstakdatasæt (hver 5um) blev erhvervet i et LSM710 konfokalt mikroskop og dataanalyse udført med FIJI / ImageJ-software som forklaret i trin 12. Kvantificering af mitotisk indeks, apoptose (% af aktiveret Caspase3) og tumorstørrelse, afslørede, at FOLFIRI fremkalder et betydeligt fald i mitose (Mann Whitney Test, P<0.0001) og en betydelig induktion af apoptose (Mann Whitney test, P<0.0001), ledsaget af en 54% reduktion af tumor størrelse (P<0.001) (Figur 8C-E, Figur 9A-E).
Disse funktioner er nyttige i høj gennemløb fænotypiske stof skærme samt at teste cellen iboende og fysiologiske virkninger af flere kræftbehandlinger i en kort tidsramme.
Karakterisering af menneske-zebrafisk xenografter med menneskespecifikke antistoffer
Som i alle xenograft modeller, er der risiko for fejlidentificere cellerne. For eksempel kan makrofager phagocytose menneskelige kræftceller, bliver mærket med lipofil farvestof, og derefter rejse langs zebrafisk vært og dermed disse celler kan forveksles med tumor mikrometastase. Derfor er mærkning af xenografter med specifikke menneskelige antistoffer som human HLA, ki-67 eller human mitokondrier (hMITO) afgørende for indledende karakterisering og også at stifte bekendtskab med tumorcellernes morfologi (Figur 9F-I).
Zebrafisk xenograft at studere celle-celle interaktioner.
En anden stor fordel ved zebrafisk xenograft model er, at det er muligt at studere samspillet mellem forskellige tumorceller og analysere, hvordan hver type celle kan påvirke den andens adfærd. Forskellige menneskelige kræftceller (forskellige kloner fra samme tumor eller fra forskellige tumorer) kan medin injiceres. I dette eksempel blev to CRC-cellelinjer fra samme patient mærket med forskellige lipofile farvestoffer og blandet i et forhold på 1:1 for injektion (Figur 9J-K').
Når du blander menneskelige cellelinjer (for at generere polyklonale tumorer) på samme graft, undgå at bruge DiO farvestof, da dette resulterer i ikke-specifikke dobbelt farvning (Tabel 2). Brug i stedet f.eks. CM-DiI (cellelinje#1) med grøn CMFDA (cellelinje#2) eller CM-DiI (cellelinje#1) med dyb rød (cellelinje#2) (Tabel 2, Figur 9J-K') for at få en let forskelsbehandling af populationerne i slutningen af eksperimentet. For at kvantificere hyppigheden af hver klon i tumoren skal du bruge 2 forskellige tællertyper i FIJI til at identificere hver klon og derefter dividere med det samlede cellenummer (summen af alle kloner) for at få den relative brøkdel af hver enkelt (%).
Figur 1. Flow diagram resumé af zebrafisk xenograft protokol Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Materialer til injektion af zebrafiskembryoner: A. Borosilicate nål B. 2% Agarose plade. C Hårnåle loop D. Trin til at lave en hårnålesløjfe: 1. Placer 1 hår inde i et glaskapillærrør, der efterlader ca. 1 centimeter hår uden for røret. 2-3. Krølle den udvendige spids af håret ved hjælp af pincet ind i glasset kapillær rør danner en løkke på ~ 0,5 mm længde. 4. Forsegl kanten af kapillærrøret med en dråbe neglelak. 5-6. Luk et stykke elektrisk tape omkring kapillæren for at beskytte det mod at bryde. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Repræsentative stereomikroskopbilleder af zebrafiskembryoner efter 48 timer efter befrugtningen (48 hkf): A-A'. Normal morfologi af et zebrafiskembryo ved 48 hkf udvikling, klar til mikroinjektion B-B'. Morfologi af en zebrafisk embryo, der ikke har opnået tilstrækkelig udviklingsstadium for mikroinjections på 48 hkf og præsenterer allerede en vis grad af hjerteødem (sort pilespids) og udspilet æggeblomme. A' og B' er forstørrelser af henholdsvis A og B. Skalalinjer repræsenterer 500 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Skematisk repræsentation af zebrafisk mikroinjection plade oprettet: A. Tilpasning af bedøvede embryoner i 3% Agar/2% Agarose plade. B. Grafisk repræsentation af et 2 dages zebrafiskembryo efter befrugtning med en sort pil, der angiver perivitellinerummet (PVS). C og D. Kræftceller kan injiceres med forskellige vinkler i PVS injiceres i perivitelline rummet (PVS) af en 48 timer efter befrugtning embryo. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Metastatisk analyse. 1 time efter injektion (1hpi) injiceres embryoner sorteres i henhold til fravær (NO_circ) eller tilstedeværelse (CIRC) af tumorceller i omløb. Ved 4 dage efter injektionen kvantificeres antallet af xenografter i begge grupper, der præsenterer mikrometastase. Celler i (A) NO_circ gruppen skulle gennemgå alle de metastatiske trin for at kunne danne en mikrometastase, mens celler i CIRC-gruppen (B) kun gennemgår de sidste trin i den metastatiske kaskade. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6. Repræsentative fluorescerende stereomikroskopbilleder af xenografter ved 1 dag efter injektionen og 4 dage efter injektionen. Humane kræftceller, der udtrykker fluorescerende protein TdTomato (rød) blev mikroin injiceret i 2 dpf zebrafisk embryoner. Ved 1 dpi screenes de injicerede embryoner, og de dårligt injicerede embryoner eller embryoner kasseres med et ødem (A-A'') sorterer de godt injicerede embryoner efter tumorstørrelser (B-B''). C. Repræsentativ kvantificering af det samlede antal celler til stede i de forskellige tumor størrelse kategorier på 1 dpi i SW620 xenografts. Hver prik repræsenterer en xenograft kvantificeret som forklaret i afsnit 12.At 4 dpi, screen larverne og kvantificere de forskellige klasser: ingen tumor (D); med tumor i PVS (E) og med en mikrometastase i CHT (F). Skalalinjer repræsenterer 500 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7. Skematisk repræsentation af xenograft-montering til konfokal billedbehandling. 1. Eksempel på mærkning i coverslip Y, lyseblå linje i coverslip X repræsenterer den omkreds, hvor vaseline/silikonefedt påføres for at forhindre lækage af monteringsmediet. 2. Eksempler på xenograftjustering på coverslip X til konfokal billeddannelse. 3. Vandige monteringsmedier (blå pil) bruges til at binde coverlip Y oven på coverslip X. 4. Eksempel på korrekt monterede coverlips. 5. Coverslips placeres derefter oven på en glassjebane og fastgøres med gennemsigtigt tape. 6. Monterede xenografter klar til konfokal billeddannelse. Oprettet med BioRender.com Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8. Visuel repræsentation af konfokal mikroskop billede kvantificering af tumor størrelse. Konfokale billeder af en HCT116 xenograft ved 4 dage efter injektion A. Serie af z-stack skiver i DAPI-kanalen erhvervet med et interval på 5 μm. Røde stiplede linjer kredser om de tre repræsentative udsnit, der bruges til celleoptælling. B. Illustration af DAPI-nuklei-kvantificering med celltæller-pluginet i ImageJ/Fiji-softwaren. C-E. Eksempel på enkeltcelleopløsning i tumoren, hvor det er muligt at visualisere/kvantificere mitotiske figurer i DAPI eller ved hjælp af et fosfor-histone H3-antistof (grønt). D og E er forstørrelser af C. Skalalinjer repræsenterer 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 9. Repræsentative resultater. A-E. HCT116 kolorektal cancer celle linje blev mærket med Vybrant CM-DiI og injiceres i PVS af 2 dage efter befrugtning (dpf) embryoner. Efter injektionen blev xenografts inkuberet ved 34 °C. Ved 1 dpi blev xenografts screenet og tilfældigt fordelt i ikke-behandlede kontroller og FOLFIRI, behandlet i 3 på hinanden følgende dage og fastgjort til 4 dpi. A.Immunofluorescens blev udført for at opdage apoptotiske celler, ved hjælp af anti-kløvet Caspase 3 antistof og DAPI for kerner counterstaining. Kvantificering af det mitotiske indeks C, apoptose (% af aktiveret Caspase3) D, og tumor størrelse E, afslørede, at FOLFIRI fremkalder et betydeligt fald i mitose (Mann Whitney Test, P<0.0001) og en betydelig induktion af apoptose (Mann Whitney test, P<0.0001), ledsaget af en 54% reduktion af tumor størrelse (P<0.001). Antallet af analyserede xenografter er angivet i figuren, og hver prik repræsenterer en xenograft. F-H. Repræsentative billeder af tyktarmskræft xenografts på 4 dage efter injektion mærket med humane specifikke markører i grønt (human HLA, ki67 og hMITO) i PVS og CHT I. J-J'. Konfokale billeder af polyklonale xenografter, injiceret med to forskellige humane kolorektal cancer cellelinjer mærket med lipofil farvning CellTracker Deep Red (Cy5 - hvid), CellTracker Green CMFDA (488 - grøn) og DAPI modstaining. K-K'. Konfokale billeder af to forskellige humane kolorektal cancer cellelinjer mærket med lipofile farvning CellTracker Deep Red (Cy5 - hvid), Vybrant CM DiI (594 - rød) og DAPI modbefarvning. Skalalinjer repræsenterer 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Cellelinje | væv | art | morfologi | Væksttilstand | Ideelt sammenløb til injektion | Dissocierende middel til injektion | Dissociationstid | Protokol om mærkning | Injektionsmedium | Divider det samlede antal celler med (for at opnå ideel koncentration til injektion) | |||||||
| SW480 | Kolorektal adenocarcinoma (primær) | menneskelig | Epitel | tilhænger | 70% - 75 % | PBS/EDTA 2 mM | 5 minutter | feltflaske | PBS 1x | 0,25 | |||||||
| SW620 | Kolorektal adenocarcinoma (metastase) | menneskelig | Epitel | tilhænger | 70% - 75 % | PBS/EDTA 2 mM | 5 minutter | feltflaske | PBS 1x | 0,25 | |||||||
| HCT116 | Kolorektal carcinom (primær), Kras mutant | menneskelig | Epitel | tilhænger | 70% - 75 % | PBS/EDTA 2 mM | 5 minutter | feltflaske | PBS 1x | 0,25 | |||||||
| HKE3 | Kolorektal carcinom, Kras WT | menneskelig | Epitel | tilhænger | 70% - 75 % | PBS/EDTA 2 mM | 5 minutter | feltflaske | PBS 1x | 0,25 | |||||||
| HT-29 | Kolorektal adenocarcinoma (primær) | menneskelig | Epitel | tilhænger | 70% - 75 % | PBS/EDTA 2 mM | 5 minutter | feltflaske | PBS 1x | 0,2 | |||||||
| CACO-2 | Kolorektal adenocarcinoma (primær) | menneskelig | Epitel | tilhænger | 70% - 75 % | PBS/EDTA 1 mM | 5 minutter | 1,5 mL mikrocentrifugerør | Komplet medie | 0,25 | |||||||
| MCF-7 | Bryst adenocarcinom (metastase) | menneskelig | Epitel | tilhænger | 70% - 80 % | PBS/EDTA 1 mM | 5 minutter | 1,5 mL mikrocentrifugerør | 60% FBS + 40% komplet medium | 0,5 | |||||||
| Hs578T | Brystkarcinom (primær) | menneskelig | Epitel | tilhænger | 70% - 75 % | PBS/EDTA 1 mM | 2 minutter | 1,5 mL mikrocentrifugerør | 60% FBS + 40% komplet medium | 0,5 | |||||||
| MDA-MB-468 | Bryst adenocarcinom (metastase) | menneskelig | Epitel | tilhænger | 70% - 75 % | PBS/EDTA 1 mM | 8 minutter | 1,5 mL mikrocentrifugerør | 60% FBS + 40% komplet medium | 0,5 | |||||||
| MDA-MB-231 | Bryst adenocarcinom (metastase) | menneskelig | Epitel | tilhænger | 70% - 75 % | PBS/EDTA 1 mM | 5 minutter | 1,5 mL mikrocentrifugerør | Komplet medie | 0,5 | |||||||
| RTforst ret til arbejde (441 | Urinblære overgangscelle karcinom (primær) | menneskelig | Epitel | tilhænger | 85% - 90% | TrypLE | 6 minutter + celle scrapper | 1,5 mL mikrocentrifugerør | Komplet medie | 0,5 | |||||||
| BFTC905 | Urinblære overgangscelle karcinom (primær) | menneskelig | Epitel | tilhænger | 75% - 85% | TrypLE | 10 minutter | 1,5 mL mikrocentrifugerør | 80% komplet medium + 20% PBS/EDTA 2 mM | 0,5 | |||||||
| J82 | Urinblære overgangscelle karcinom (primær) | menneskelig | Epitel | tilhænger | 85% - 90% | TrypLE | 10 minutter | 1,5 mL mikrocentrifugerør | Komplet medie | 0,5 | |||||||
| RTforst blevet | Urinblære overgangscelle karcinom (primær) | menneskelig | Epitel | tilhænger | 85% - 90% | TrypLE | 6 minutter | 1,5 mL mikrocentrifugerør | Komplet medie | 0,5 | |||||||
| MIA PaCa-2 | Epitheliodcarcinom i bugspytkirtlen (primær) | menneskelig | Epitel | tilhænger | 80% - 90% | TrypLE | 3 minutter | 1,5 mL mikrocentrifugerør | 60% FBS + 40% komplet medium | 0,5 | |||||||
| PANC-1 | Epitheliodcarcinom i bugspytkirtlen (primær) | menneskelig | Epitel | tilhænger | 80% | TrypLE | 5 minutter | 1,5 mL mikrocentrifugerør | PBS/EDTA 2mM | 0,5 | |||||||
| VC8 | Lungefibroblaster, BRCA2 mutant, HR-mangelfuld | Kinesisk hamster | Epitel | tilhænger | 70% - 80 % | PBS/EDTA 1 mM | 5 minutter | 1,5 mL mikrocentrifugerør | Komplet medie | 0,25 | |||||||
| VC8-B2 | Lungefibroblaster, human BRCA2, BRCA2 −/− HR-mangelfuld | Kinesisk hamster | Epitel | tilhænger | 70% - 80 % | PBS/EDTA 1 mM | 5 minutter | 1,5 mL mikrocentrifugerør | Komplet medie | 0,25 | |||||||
Tabel 1: Optimalt in vitro-sammenløb ved injektion af flere cellelinjer
| Cellefarve | Katalognummer | Fluorescens spektrum (Exc. - Em.) | Fortynding af lager | Arbejde fortynding til pletten i en kolbe | Arbejde fortynding til pletten i en 1,5 mL mikrocentrifuge | Inkubationstidspunkt | Observationer | ||||||
| Vybrant CM-DiI | V22888 | 549 nm - 569 nm | Allerede fortyndet | 4:1000 i PBS 1x | 4:1000 i PBS 1x | 15 min @ 37 ºC + 4 min @ 4 ºC | |||||||
| Vybrant DiO | V22886 | 484 nm - 501 nm | Allerede fortyndet | 5:1000 i PBS 1x | 5:1000 i PBS 1x | 15 min @ 37 ºC + 4 min @ 4 ºC | Ikke god opløsning i konfokal billeddannelse ved 4 dage efter injektion | ||||||
| CellTracker dyb rød | C3-4565/96 af 28. | 630 nm - 660 nm | 1 mM i DMSO | 0,5 - 2,5 μM i PBS 1x | 0,5 - 2,5 μM i PBS 1x | 15 min @ 37 ºC | |||||||
| CellTracker Grøn CMFDA | C7025 | 492 nm - 517 nm | 10 mM i DMSO | 0,5 - 2,5 μM i PBS 1x | 0,5 - 2,5 μM i PBS 1x | 15 min @ 37 ºC | Produktlækager til bughulen 48 timer efter injektion, men ideel til co-injektion undersøgelser | ||||||
Tabel 2: Farvestof og betingelser
| størrelse | # af larver | E3 1x mellemstor volumen |
| 100 mm x 15 mm (standard) | Op til 50 | 20-25 mL |
| 60 mm x 15 mm | Op til 20 | 10 mL |
| 6-brønds plade | Op til 15 pr. brønd | 3-4 mL pr. brønd |
Tabel 3: Petriskål muligheder
| E3 medium 50x - lager | For 10 liter sterilt vand: |
| 146,9 g af NaCl | |
| 6,3 g KCl | |
| 24,3 g caCl2·2H2O | |
| 40,7 g mgSO4·7H2O | |
| E3 medium 1x – klar til brug | 400 mL E3 medium 50x |
| 60 ml 0,01% methylenblåt opløsning | |
| Fyld op til 20 liter fiskesystemvand | |
| Tricain 25x – lager og aktiv dødshjælp | 2 g trikainpulver |
| 500 mL omvendt osmosevand | |
| 10 mL af 1 M Tris (pH 9) | |
| Juster til pH 7 | |
| Tricain 1x - Anæstesi | 20 mL Tricaine 25x |
| Fyld op til 500 mL systemvand | |
| 60 mg/mL Pronase - lager 100x | 1 g pronase |
| 16,7 mL sterilt vand | |
| 0,6 mg/mL Pronase – 1x klar til brug | 100 μL pronase 100x |
| 9,9 mL E3 medium 1x |
Tabel 4: Opløsningssammensætninger
Discussion
Zebrafiskens stigende betydning som model for kræftudvikling og lægemiddelscreening har resulteret i talrige publikationer3,4,7,13,14,16,18,19,20,21. Men injektion af kræftceller i zebrafisk embryoner er en teknik, der kræver en høj grad af fingerfærdighed, som kan være udfordrende for forskere. I denne protokol sigter vi mod at give praktiske oplysninger og nogle tips, der kan hjælpe med at overvinde de indledende udfordringer ved at oprette zebrafiskembryo xenografts.
Cellehåndtering før injektion
Denne optimerede protokol til generering af zebrafisk xenografts med cellelinjer kan tilpasses forskellige typer (kræft) celler med forskellige morfologier. Vi anbefaler, at alle de cellelinjer, der bruges til zebrafisk xenografts, er mycoplasmafri. I modsætning til andre bakterielle forureninger genererer tilstedeværelsen af mycoplasma i cellekultur ikke ændringer, der let kan påvises under mikroskopet22. Mycoplasmaforurening kan påvirke cellelinjernes indskrivningspotentiale, deres følsomhed over for stoffer samt zebrafiskembryoernes levedygtighed.
Selvom celler kan fortsætte med at formere sig i en længere periode, kan deres fænotype og genotype være tilbøjelige til ændringer. Det er vigtigt at blive fortrolig med morfologien og adfærden af cellelinjerne i kulturen. Vi anbefaler at holde antallet af cellepassager efter optøning mellem 3-12 for at få reproducerbare resultater. Således bør der udføres regelmæssige mycoplasmatest.
Cellerne skal være i deres logfase (eksponentiel vækstfase, før de når sammenløb ~70%) på injektionsdagen. Dette vil muliggøre en passende engraftment og korrekt udvikling af de karakteristiske kendetegn ved tumoren. For at forhindre variation i fosotypen af celler i xenograft er det afgørende at opretholde sammenløbet for injektionskonstant mellem eksperimenter. Antallet af injicerede celler kan tilpasses hver cellelinjes karakteristika, da nogle kan kræve højere indsprøjtningstætheder for at trives i zebrafiskembryoner.
Overvejelser i forbindelse med cellemærkning
For bedre at visualisere menneskelige tumorceller til injektion og fremtidig analyse kan tumorceller mærkes med fluorescerende farvestoffer. På grund af forskelle i cellestørrelse varierer det samlede antal celler/cm2 i klæbende kulturer mellem cellelinjer. Dette vil påvirke effekten af farvningsprotokollen samt antallet af celler, der høstes til injektion. Store celler, der giver lave tal pr. kolbe (dvs. Hs578T) eller vokser i klynger (dvs. I dette tilfælde bør farvning af celler ikke udføres direkte i kolben, da dette vil medføre brug af store mængder farvestof (høje omkostninger). På den anden side kan celler, der er meget følsomme over for for store cyklusser af centrifugering, samt celler, der giver et højt antal pr. kolbe (dvs.
Når det er muligt, skal du i stedet for at bruge en enzymatisk tilgang bruge EDTA til at løsne cellerne på injektionsdagen, så cellerne genvinder deres cellecellekryds hurtigere og udsættes for mindre centrifugeringstrin. Ikke desto mindre, hvis cellerne er følsomme over for EDTA, meget vedhængende eller vokser i klynger - kan der anvendes en enzymatisk metode. Optimeringen af den ideelle koncentration til injektion samt injektionsmediet afhænger af hver cellelinjes karakteristika, og det kan derfor være nødvendigt at foretage visse justeringer (tabel 1).
Kalibrering af mikroinjektion
I modsætning til levering af oligonukleotider eller lægemidler til zebrafiskembryoet anvendes en graticule ikke til at kalibrere nålen, når du arbejder med cellelinjer til xenografter. Efter nogen tid under injektionen begynder cellerne at tilstoppe, og det er nødvendigt at skære nålespidsen for at øge dens diameter eller ændre nålen helt. Denne procedure hindrer graticulekalibreringen.
For at løse dette problem reguleres antallet af udleverede celler af udslyngningstryk og den tid, der er nødvendig for at nå en størrelse svarende til embryoøjet inden for 1-3 impulser. Derefter, for yderligere at kontrollere tumor størrelse, på 1 dpi, xenografts sorteres i henhold til tumor størrelse som vist i figur 6 B-B ". Som repræsenteret i figur 6C eksempel, denne metode til sortering er effektiv til at reducere variationen af tumor størrelser: hvis vi samle dem alle sammen (+, ++, +++ ) STEV er ~ dobbelt af ++ klasse (~ 906 celler til ~ 422 celler) og koefficienten variation er ~ 31,9% i forhold til 14,5% i ++klassen. Da referencen til injektion er volumen, varierer det samlede antal celler meget mellem celletyper - afhængigt af cellernes størrelse og form. For eksempel, store celler med en masse cytoplasma som brystkræft Hs578T, producere meget mindre tumorer (~ 600 celler). Hver cellelinje kræver også forskellige antal celler. For eksempel har HT29 CRC og RT112 urinblære kræft cellelinjer vist, at jo højere antallet af injicerede celler, jo højere zebrafisk dødelighed. Derfor er en optimeringsperiode, samtidig med at xenografterne udvikles, nødvendig for at teste, om cellelinjen har toksiske virkninger i embryoet eller kræver højere/lavere injektionstæthed.
Injektionssted
En af de mest almindelige uoverensstemmelser ved generering af zebrafisk embryo xenografts er injektionsstedet. Æggeblommen er normalt det foretrukne sted for injektion på grund af dens nemme tilgængelighed. Vi har dog observeret, at celler injiceret i æggeblommen har en højere tendens til at dø. Selvom det er teknisk vanskeligere, anbefaler vi injektion i PVS og så vidt muligt fra hjertet. Inden for PVS kan celler samle, rekruttere beholdere og immunceller og migrere, intravasere, ekstravasere og danne mikrometastase, hvis de udviser metastatiske egenskaber8,11.
Engraftment effektivitet
Forskelle i engraftment effektivitet og tumor størrelse blandt cellelinjer på 4 dpi forventes på grund af deres forskellige grader af basal celle død / overlevelse / spredning, men også på grund af den medfødte immunogenicitet, at hver celle linje kan vise9.
metastase
Metastaser består af en multistep kaskade af begivenheder, der kan opdeles i to vilkårlige faser. I første fase skal tumorceller løsne sig fra det primære sted, migrere og invadere tilstødende væv og derefter intravasere ind i blodbanen. I anden fase skal tumorceller overleve i omløb, ekstravasere fra blodet eller lymfekar og endelig kolonisere på sekundære steder23. At skelne mellem disse tidlige og sene begivenheder og løse de potentielle / færdigheder i de forskellige tumorceller til at udføre disse trin, vi designet en simpel analyse.
Generelt, når injiceres i PVS, tumorceller kan komme direkte i omløb og derefter få fysisk fanget i kaudale hæmatopoietiske væv (CHT) (hale region). Men i henhold til de særlige kendetegn ved hver tumor celle - vi har set, at nogle tumorceller forbliver på CHT 4 dpi og er i stand til at danne mikrometastase, mens andre tumorceller forsvinder (ryddet efter at blive fanget i CHT).
Derfor, ved at sammenligne mikrometastase effektivitet (ved 4 dpi), når cellerne blev placeret direkte i omløb - CIRC (celler behøver kun at gå gennem de sene trin i metastaser) vs når ikke - INGEN CIRC (celler skal gå gennem tidlige og sene skridt for at kunne danne en mikrometastase) kan vi vurdere deres tidlige eller sene metastatiske potentiale. Vi har observeret tumorceller, der effektivt kan danne mikrometastase i CHT i begge grupper (CIRC og NO CIRC), hvilket tyder på, at disse celler har kapacitet til at gennemgå alle trin i den metastatiske kaskade (SW480 og MDA-MB-468 for eksempel)8,11. I modsætning hertil har andre tumorceller et meget lavt metastatisk potentiale i begge grupper, næppe nogensinde at lave mikrometastase, selv når de injiceres i omløb (dvs. synlig i CHT ved 24 hpi, men ved 4 dpi er de ikke længere der, Hs578T for eksempel)8. Vi har imidlertid klart fundet en anden gruppe - en gruppe, der kun er i stand til at danne mikrometastase, når den injiceres i omløb (vi kan kun observere mikrometastase i CIRC-gruppen). Dette tyder på, at disse celler har en lav effektivitet i at udføre de første trin i den metastatiske kaskade, men på den anden side er i stand til at overleve i omløb, ekstravasere og kolonisere et fjernt sted.
Immunostaining og billeddannelse
Før fiksering kan denne injektionsprotokol bruges til andre live billeddannelsesmetoder som levende differentialinterferenskontrastkontrofelli, roterende diskmikroskopi, højopløsnings live konfokal billeddannelse og lysarkmikroskopi osv.
Døde celler og celleaffald fremstår lyse, når de observeres gennem det fluorescerende stereomikroskop og kan forveksles med levende celler, især hvis formålet med undersøgelsen er at vurdere cellelinjernes metastatiske potentiale. Vi vil gerne understrege vigtigheden af at udføre konfokal billeddannelse med specifikke levedygtighedsmarkører og DAPI for at vurdere tumorens og mikrometastastastasens overlevelsestilstand. Det er også grundlæggende at bruge specifikke menneskelige antistoffer til at opdage menneskelige celler som anti-human mitokondrier eller anti-human HLA. Ved implementering af protokollen, tog experimenter øjne ved at sammenligne farvning i stereomikroskop med konfokale billeder. Efter nogen tid kan eksperimenter klart skelne snavs fra levende celler i det fluorescerende stereomikroskop.
Selvom andre metoder til at kvantificere tumorbyrde som hele fluorescensområdet er meget udbredt, anbefaler vi at udføre hele monteringsim immunostaining og konfokal billeddannelse som en mere præcis metode. Ikke kun effektiviteten af lipophilic farvestof farvning er meget variabel (dvs. nogle celler er meget godt farves mens andre ikke-sandsynligvis på grund af lipid indholdet af deres membraner), men også mange gange lipofile farvestoffer form aggregater, og døde celler tendens til at være lysere - at skabe flere artefakter, der kan forveksles med levende celler.
Celler kan transduceres med fluorescerende proteiner for at hjælpe med deres sporing og springe cellemærkning over. Men sørg for, at de transducerede og ikke-transducerede celler producerer de samme resultater i zebrafisk xenografts.
Derudover kan makrofager fyagocytter disse fluorescerende cellerester bliver fluorescerende mærket og migrere, generere falske positive metastatiske celler. Således anbefaler vi en række analytiske værktøjer, som naturligvis kan udvides til mange andre udlæsninger for en mere præcis fortolkning af tumoradfærd:
- Spredning - kvantificering af mitotiske tal med DAPI- eller anti-pHH3Ser10-antistof (Merck Millipore Cat. #06-570)
- Celledød ved apoptose- antistof antiaktiveret Caspase3Asp175 (Cell Signalling Technologies Cat. #9661) eller tilsvarende,
- Tumor størrelse - DAPI tælle-menneskelige tumorceller viser en meget tydelig chromatin organisation, så de er let skelnes fra zebrafisk celler og er altid muligt at dobbelttjekke med farvestof (når du træner øjet),
- For metastatiske undersøgelser, at utvetydigt opdage menneskelige celler, - anti-human HLA (Abcam EP1395Y Cat. #ab52922), anti-menneskelige mitokondrier (Merck Millipore Cat. #MAB1273- Klon 113-1).
For en konfokal erhvervelse med 5 μm interval mellem skiver i Z-stakken af kontrol kræftceller HCT116 (gennemsnitlig nuklear størrelse på 10-12 μm diameter) med DAPI modstaining, har vi observeret, at ~ 50% af cellerne deles mellem to på hinanden følgende skiver. Derfor, hvis hver skive tælles, er der stor risiko for at tælle de samme celler to gange. At gå frem og tilbage mellem skiver for at undgå problemer med kvantificering resulterer i en tidskrævende og fejlbehæftet teknik. For at lette kvantificeringen af det samlede antal celler og give mulighed for mere reproducerbarhed mellem forskere, skabte vi tumorstørrelsesformlen, der tidligere er beskrevet i denne protokol8.
Vi inkluderede et korrektionsnummer (1,5) for at tage højde for de ~50% celler, der deles mellem udsnit. Vi fandt ud af, at den gennemsnitlige fejl ved manuel optælling af hele tumoren mellem forskere var 20%. To forskere ved hjælp af formlen havde en 2% fejl. Brugen af denne formel har en nøjagtighedsgrad på 93% og 98% reproducerbarhedshastighed. Vi testede også automatiserede metoder, men de viste en fejl, der var højere end 50 % forårsaget af tærskelindstillinger.
På grund af apoptotiske cellers egenskaber er kvantificeringen af aktiverede Caspase 3-celler vanskeligere. For at reducere antallet af fejl og variation i resultaterne anbefaler vi, at kontrol- og forsøgsprøver tælles af den samme forsker. Derudover, når man lærer denne teknik, skal en ny forsker tælle billeder, der allerede var kvantificeret af mere erfarne forskere for at sammenligne resultater og træne.
Analysens længde kan forlænges, hvis det er nødvendigt. Det er dog vigtigt at overveje, at zebrafisklarver kræver levende fodring fra ~ 7 dage efter befrugtning (5 dage efter injektion). Derudover kan dyrevelfærdsretningslinjerne og -reglerne for larver, der er ældre end 6 dage efter befrugtningen, variere.
Denne protokol giver nyttige værktøjer til at gøre det muligt for en enkelt forsker at injicere ca ~ 200-300 zebrafisk larver i timen; og resultater for den fuldstændige analyse, herunder analyse og statistisk fortolkning, opnået på tre uger. Vi håber, at denne protokol kan hjælpe forskere med at blive eksperter i at generere zebrafisk xenografts. Det er ikke let. du har brug for at øve, men du vil komme dertil. Held og lykke!
Disclosures
ingen
Acknowledgments
Vi takker Champalimaud Foundation, Congento (LISBOA-01-0145-FEDER-022170, medfinansieret af FCT/Lisboa202020) for finansiering. FCT-stipendier til VP (SFRH/BD/118252/2016), MML (PD/BD/138203/2018). Alle medlemmer af Fior Lab til kritiske diskussioner; B. Costa og C. Rebelo de Almeida til deling af data; og vores Lab medlemmer C. Rebelo de Almeida, M. Barroso og L. Leite for deres deltagelse i videoen. Vi vil gerne takke CF Fish Facility (C. Certal, J. Monteiro et al) og Champalimaud Communication, Events and Outreach team især Alexandre Azinheira for den fantastiske filmproduktion og Catarina Ramos og Teresa Fernandes for deres hjælp.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar for bacteriology | VWR | 97064-336 | Agar plate |
| anti-Caspase3Asp175 (Rabbit monoclonal) | Cell Signalling Technologies | 9661 | Primary antibody for whole mount immuno staining (Dilution 1:100) |
| anti-human HLA (Rabbit monoclonal) | Abcam EP1395Y | ab52922 | Primary antibody for whole mount immuno staining (Dilution 1:100) |
| anti- 488 (Rabbit monoclonal) | ThermoFisher Scientific | 35552 | Secondary antibody for whole mount immuno staining (Dilution 1:200) |
| anti- 594 (Rabbit monoclonal) | ThermoFisher Scientific | 35560 | Secondary antibody for whole mount immuno staining (Dilution 1:200) |
| CellTracker Deep Red Dye | ThermoFisher Scientific | C34565 | Lipophilic dye (Dilution 1:1000) |
| CellTracker Green CMFDA Dye | ThermoFisher Scientific | C2925 | Lipophilic dye (Dilution 1:1000) |
| Conical Centrifuge tube 50mL | VWR | 525-0610 | |
| Conical Centrifuge tube 15mL | VWR | 525-0604 | |
| DAPI | Nuclear and chromosome counterstain | ||
| Laser-Based Micropipette Puller P-2000 | Sutter-Instrument | Micropipette Puller | |
| Microcentrifuge tube 1.5mL | Abdos | P10202 | |
| Microscope slides, cut edge | RS France | BPB016 | Slides for mounting |
| Mowiol | Sigma-Aldrich | 81381 | Mounting medium |
| Pneumatic Picopump | World Precision Instruments | PV820 | Microinjector |
| Rectangular cover glasses, Menzel Gläser | ThermoFisher Scientific | 631-9430 | Coverslips for mounting |
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | Agar plate |
| Thin Wall Glass Capillaries | World Precision Instruments | TW100-4 | Borosilicate capillaries |
| TrypLE | Gibco | 12605036 | Enzymatic detachment solution |
| Vaseline | Petroleum jelly for slide sealing | ||
| Vybrant CM-DiI Dye | ThermoFisher Scientific | V22888 | Lipophilic dye (Dilution 1:1000) |
| Vybrant DiO Cell-Labeling Solution | ThermoFisher Scientific | V22886 | Lipophilic dye (Dilution 1:1000) |
| ZEISS Axio Zoom.V16 for Biology | ZEISS | Fluorescence Stereo Zoom Microscope | |
| Zeiss LSM 710 | ZEISS | Confocal microscope |
References
- Gut, P., Reischauer, S., Stainier, D. Y. R., Arnaout, R. Little Fish, Big Data: Zebrafish as a Model for Cardiovascular and Metabolic Disease. Physiological Reviews. 97, 889-938 (2017).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496, 498-503 (2013).
- Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. Journal of Clinical Investigation. 122, 2337-2343 (2012).
- Stoletov, K., Klemke, R. Catch of the day: zebrafish as a human cancer model. Oncogene. 27, 4509-4520 (2008).
- Weintraub, A. All eyes on zebrafish. Lab Animals. 46, 323-326 (2017).
- Novoa, B., Figueras, A. Zebrafish: Model for the Study of Inflammation and the Innate Immune Response to Infectious Diseases. Current Topics in Innate Immunity II. Lambris, J. D., Hajishengallis, G. , Springer. 253-275 (2012).
- Fazio, M., Ablain, J., Chuan, Y., Langenau, D. M., Zon, L. I. Zebrafish patient avatars in cancer biology and precision cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 20, 263-273 (2020).
- Fior, R., et al. Single-cell functional and chemosensitive profiling of combinatorial colorectal therapy in zebrafish xenografts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 8234-8243 (2017).
- Póvoa, V., et al. Innate immune evasion revealed in a colorectal zebrafish xenograft model. Nature Communications. 12, 1156 (2021).
- Galletti, G., et al. Targeting Macrophages Sensitizes Chronic Lymphocytic Leukemia to Apoptosis and Inhibits Disease Progression. Cell Reports. 14, 1748-1760 (2016).
- Rebelo de Almeida, C., et al. Zebrafish xenografts as a fast screening platform for bevacizumab cancer therapy. Communications Biology. 3, 1-13 (2020).
- Varanda, A. B., Martins-Logrado, A., Godinho Ferreira, M., Fior, R. Zebrafish Xenografts Unveil Sensitivity to Olaparib beyond BRCA Status. Cancers. 12, 1769 (2020).
- Osmani, N., Goetz, J. G. Multiscale Imaging of Metastasis in Zebrafish. Trends in Cancer. 5, 766-778 (2019).
- Hyenne, V., et al. Studying the Fate of Tumor Extracellular Vesicles at High Spatiotemporal Resolution Using the Zebrafish Embryo. Developmental Cell. 48, 554-572 (2019).
- Costa, B., et al. Developments in zebrafish avatars as radiotherapy sensitivity reporters - towards personalized medicine. EBioMedicine. 51, 102578 (2020).
- Costa, B., Estrada, M. F., Mendes, R. V., Fior, R. Zebrafish Avatars towards Personalized Medicine-A Comparative Review between Avatar Models. Cells. 9, 293 (2020).
- TRICAINE - Protocols. ZFIN Community Wiki. , Available from: https://wiki.zfin.org/display/prot/TRICAINE (2021).
- Zhao, C., et al. A Novel Xenograft Model in Zebrafish for High-Resolution Investigating Dynamics of Neovascularization in Tumors. Plos One. , (2011).
- Veinotte, C. J., Dellaire, G., Berman, J. N. Hooking the big one: the potential of zebrafish xenotransplantation to reform cancer drug screening in the genomic era. Disease Models & Mechanisms. 7, 745-754 (2014).
- Haldi, M., Ton, C., Seng, W. L., McGrath, P. Human melanoma cells transplanted into zebrafish proliferate, migrate, produce melanin, form masses and stimulate angiogenesis in zebrafish. Angiogenesis. 9, 139-151 (2006).
- Zon, L. I., Peterson, R. The New Age of Chemical Screening in Zebrafish. Zebrafish. 7, 1 (2010).
- Mycoplasma Contamination of Cell Cultures. InvivoGen. , Available from: https://www.invivogen.com/review-mycoplasma (2016).
- van Zijl, F., Krupitza, G., Mikulits, W. Initial steps of metastasis: cell invasion and endothelial transmigration. Mutation Research. 728, 23-34 (2011).
