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Cancer Research

जेब्राफिश लार्वाल Xenografts और ट्यूमर व्यवहार विश्लेषण की पीढ़ी

Published: June 19, 2021 doi: 10.3791/62373
Automatic Translation
1,2, 1, 1
1Champalimaud Centre for the Unknown, Champalimaud Foundation, 2Instituto Gulbenkian de Ciência

Summary

यहां, हम ट्यूमर व्यवहार विश्लेषण, पूरे माउंट इम्यूनोफ्लोरेसेंस, और कॉन्फोकल इमेजिंग क्वांटिफिकेशन के लिए ज़ेनोग्रफ्ट और दिशानिर्देश उत्पन्न करने के सुझावों के साथ एक कदम-दर-कदम प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं।

Abstract

ज़ेब्राफिश लार्वा ज़ेनोग्राफ्ट का व्यापक रूप से उपयोग कैंसर अनुसंधान के लिए वीवो और मानव कैंसर के वास्तविक समय के अध्ययन में करने के लिए किया जा रहा है। कैंसर विरोधी उपचारों (कीमो, रेडियोथेरेपी, और जैविक), एंजियोजेनेसिस और मेटास्टेसिस के साथ एकल सेल रिज़ॉल्यूशन के साथ प्रतिक्रिया को तेजी से कल्पना करने की संभावना, प्रीक्लिनिकल अध्ययन विकसित करने के लिए जेब्राफिश ज़ेनोबेड़ा मॉडल को एक शीर्ष विकल्प के रूप में रखता है।

जेब्राफिश लार्वा xenograft परख अन्य मॉडलों की तुलना में कई प्रयोगात्मक लाभ प्रस्तुत करता है, लेकिन शायद सबसे हड़ताली आकार पैमाने की कमी और फलस्वरूप समय है। पैमाने की यह कमी एकल सेल इमेजिंग, मानव कोशिकाओं की अपेक्षाकृत कम संख्या (बायोप्सी के साथ संगत), मध्यम उच्च-थ्रूपुट दवा स्क्रीनिंग का उपयोग करने की अनुमति देती है, लेकिन सबसे महत्वपूर्ण बात यह है कि परख के समय में महत्वपूर्ण कमी सक्षम हो। ये सभी फायदे भविष्य के व्यक्तिगत दवा अनुप्रयोगों के लिए जेब्राफिश ज़ेनोबेड़ा परख को बेहद आकर्षक बनाते हैं।

मानव ट्यूमर की व्यापक विविधता के साथ कई जेब्राफिश ज़ेनोबेड़ा प्रोटोकॉल विकसित किए गए हैं; हालांकि, जेब्राफिश लार्वा ज़ेनोग्राफ्ट को कुशलतापूर्वक उत्पन्न करने के लिए एक सामान्य और मानकीकृत प्रोटोकॉल अभी भी कमी है। यहां हम एक कदम-दर-कदम प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं, जिसमें ट्यूमर व्यवहार विश्लेषण, पूरे माउंट इम्यूनोफ्लोरेसेंस और कॉन्फोकल इमेजिंग क्वांटिफिकेशन के लिए ज़ेनोग्रफ्ट और दिशानिर्देश उत्पन्न करने के टिप्स दिए जाते हैं।

Introduction

ज़ेब्राफिश (डैनियो रेरियो) विकास और बीमारी का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली कशेरुकी मॉडल जीव के रूप में उभर रहा है। ज़ेब्राफ़िश अत्यधिक संरक्षित आनुवंशिक (~ 70% जेनेटिक होमोलॉजी और ~ 84% रोग से संबंधित जीन) और मनुष्यों के साथ बुनियादी अंग रूपात्मक विशेषताएं साझा करता है1,2। यह संरक्षण जेब्राफिश के उपयोग को कैंसर3, 4सहित कई मानव रोगों को मॉडल करने की अनुमतिदेताहै।

जेब्राफिश की हैंडलिंग और रखरखाव चूहों की तुलना में उनके छोटे आकार, पूरे वर्ष उच्च फीकीपन और बाहरी निषेचन3,5के कारण बहुत आसान और अधिक लागत प्रभावी है। ज़ेब्राफ़िश भ्रूण को अपने जीवन के पहले 5-7 दिनों के दौरान जीवित भोजन की आवश्यकता नहीं होती है और इसे विकास, संक्रमण औरकैंसर1, 4,6,7के लिए एक प्रभावी मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया गया है। ज़ेब्राफ़िश भ्रूण निषेचन (एचपीएफ) के बाद 48 घंटे में निकलते हैं और सभी अंगों के साथ मुक्त तैराकी वाले जानवर हैं, एक धड़कन दिल और कार्यात्मक संचार प्रणाली, यकृत, मस्तिष्क, गुर्दे का मैरो, आदि1,3। इसके अलावा, विकास के इस चरण में केवल सहज प्रतिरक्षा खेलने पर है, अनुकूली प्रतिरक्षा अभी भी विकसित हो रही है, जिससे मानव कोशिकाओं के सामान्य कुशल एनग्रेफ्टमेंट की अनुमति मिल रही है, जिसमें इम्यूनोसमझे हुए म्यूटेंट7,8के उपयोग की कोई आवश्यकता नहीं है। फिर भी, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि सभी मानव कोशिकाएं समान रूप से9 को engraft नहीं करती हैं और उदाहरण के लिए, ल्यूकेमिया कोशिकाओं के लिए यह दिखाया गया था कि फगोसाइट्स (न्यूट्रोफिल और मैक्रोफेज) को कुशल एनग्रफ्टमेंट10के लिए समाप्त करने की आवश्यकता है।

ज़ेब्राफ़िश जेनेटिक ट्रैक्टेबिलिटी और इसके शुरुआती भ्रूणीय चरणों की ऑप्टिकल पारदर्शिता एक उच्च संकल्प पर एकल कोशिका इंट्राविटल इमेजिंग के लिए अनुमति देती है और इस प्रकार, जीव विज्ञान के विविध क्षेत्रों में अत्याधुनिक इमेजिंग तकनीकों की स्थापना के लिए। इसके अलावा, कैंसर के संदर्भ में, ये विशेषताएं मेजबान-ट्यूमर इंटरैक्शन के शुरुआती चरणों के वास्तविक समय के अध्ययन के लिए उपयोगी हैं, जैसे एंजियोजेनिक और मेटास्टैटिक क्षमता का अध्ययन करना, साथ ही जन्मजात प्रतिरक्षा प्रणाली8,9,11,12, 13के साथ बातचीत।

हालांकि छोटे ज़ेनोबेड़ा परख में मेटास्टैटिक "विकास" के लिए कोई समय नहीं है - ट्यूमर कोशिकाओं की मेटास्टैटिक क्षमता का विश्लेषण करना संभव है (यानी, आक्रमण, इंट्रावेशन, परिसंचरण में अस्तित्व, अतिवेवास और उपनिवेशीकरण जैसे मेटास्टैटिक चरणों से गुजरना उनकी दक्षता, और इसलिए वीवो में इन प्रक्रियाओं का अध्ययन करें और वास्तविक समय8,11,13,14)।

इसके जीवन चक्र की विशेषताएं जेब्राफिश को कैंसर में व्यक्तिगत चिकित्सा के लिए एक अद्वितीय मॉडल के रूप में रखें। परख कम समय में की जा सकती है और कुछ ही हफ्तों में प्राप्त परिणाम7,8, 9,11,12,15,16. इन परखों की सेलेरिटी और व्यवहार्यता डॉक्टरों और शोधकर्ताओं को ट्रांसलेशनल परिणाम प्राप्त करने की संभावना प्रदान करती है जो कैंसर रोगियों के लिए उपयोगी हो सकती है, जिनके लिए समय एक आवश्यक आवश्यकता है।

सफल ज़ेब्राफ़िश भ्रूण xenografts पैदा करने में बढ़ते प्रयासों के बावजूद, इंजेक्शन प्रक्रिया के मानकीकरण के साथ-साथ इंजेक्शन के बाद सेल व्यवहार्यता और ट्यूमर व्यवहार के मूल्यांकन की अभी भी आवश्यकता है।

इस प्रोटोकॉल में हम शोधकर्ताओं को जेब्राफिश भ्रूण में मानव कैंसर सेल लाइनों के इंजेक्शन और बाद में फिक्सेशन, इम्यूनोदाते, इमेजिंग और ट्यूमर सेल व्यवहार के मात्राकरण के लिए एक स्पष्ट और विस्तृत कदम-दर-कदम गाइड प्रदान करते हैं।

Protocol

जेब्राफिश(Danio rerio)मॉडल को यूरोपीय पशु कल्याण कानून, निर्देश 2010/63/EU (यूरोपीय आयोग, २०१६) और चंपालिमौद मछली मंच के मानक प्रोटोकॉल के अनुसार संभाला और बनाए रखा गया था । सभी प्रोटोकॉल चंपालिमौद पशु नैतिक समिति और पुर्तगाली संस्थागत संगठनों-ORBEA (Órgão de Bem-Estar e Ética पशु/पशु कल्याण और नैतिकता शरीर) और DGAV (Direção Geral de Alimentação e Veterinária/खाद्य और पशु चिकित्सा के लिए महानिदेशालय द्वारा अनुमोदित किया गया।

नोट: मुख्य प्रयोग शुरू करने से पहले, मानव कोलोरेक्टल कैंसर (सीआरसी) सेल लाइन HCT116 के साथ अभ्यास करें। इस सेल लाइन को तैयार करना आसान है (अत्यधिक प्रसार), इंजेक्शन और एनग्रैफ्ट करना बहुत कुशलता से (लगभग 95-100%) अतिरिक्त में कोशिकाओं के साथ शुरू (~ 12x106 कोशिकाओं, टी-७५ फ्लास्क) और अतिरिक्त मछली (४०० मछली) तकनीक में कुशल बनने तक, के बाद से कई कोशिकाओं और मछली प्रशिक्षण के दौरान खो जाएगा । एचसीटी116 ज़ेनोग्राफ्ट्स में ~ 95% की एनग्रफ्टमेंट हासिल होने के बाद प्रयोगकर्ता तैयार हो जाते हैं। पूर्ण प्रोटोकॉल की एक योजनाबद्ध के लिए चित्रा 1 देखें।

1. इंजेक्शन के लिए स्थापना

  1. इंजेक्शन से दो सप्ताह पहले, संस्कृति में कोशिकाओं का विस्तार करें (कई सेल लाइनों के इंजेक्शन के लिए इष्टतम इन विट्रो संगम के विस्तृत गाइड के लिए तालिका 1 देखें)।
  2. इंजेक्शन से तीन दिन पहले, वांछित पृष्ठभूमि की जेब्राफिश को पार करें।

2. इंजेक्शन से पहले 24 घंटे

  1. जेब्राफिश भ्रूण प्लेटों को साफ करें (सभी मृत और गैर-विकसित भ्रूण को त्यागें) और ताज़ा E3 माध्यम।
  2. सेल कल्चर रूम में, इंजेक्शन के लिए नियोजित फ्लैक्स से सेल कल्चर मीडियम को त्यागें, मृत कोशिकाओं को हटाने और ताजा माध्यम जोड़ने के लिए 1x फॉस्फेट-बफर नमकीन (पीबीएस) के साथ एक बार धोएं।
  3. इंजेक्शन प्रक्रिया के लिए उपकरण तैयार करें, जैसे: माइक्रोइंजेक्शन सुई, एगरजर्जिंग प्लेट्स और हेयरपिन इंजेक्शन के लिए भ्रूण को संरेखित करने के लिए(चित्रा 2A-D,नीचे विस्तृत)।
    1. माइक्रोइंजेक्शन सुई(चित्रा 2A)
      1. बोरोसिलिकेट ग्लास केशिकाओं (4 इंच, ओडी 1.0 मिमी, माइक्रोपिपेट पुलर में कोई फिलामेंट (गर्मी: ≈500; फिल: 10; वेल: 50; दिसंबर: 60; पुल: 100) का उपयोग करें।
    2. प्लेट तैयार करना(चित्रा 2B)
      1. एच 2 ओ में2%एगर उठे तैयार करें, इसे गर्म करें और एक साफ पेट्री डिश के ढक्कन में घुलित एगर उठी की एक परत डालें। इसे बहुलक होने दें और एक शासक की मदद से, भ्रूण के संरेखण के लिए तीन से चार सीधे एग्राजिंग लाइनें बनाएं।
    3. हेयरपिन असेंबली(चित्रा 2C-D)
      1. एक ग्लास केशिका ट्यूब के अंदर 1 बाल रखें ट्यूब के बाहर लगभग 1 सेंटीमीटर बाल छोड़ दें।
      2. ~ 0.5 मिमी लंबाई का एक पाश बनाने ग्लास केशिका ट्यूब में संदंश की मदद से बालों के बाहर की नोक कर्ल करें।
      3. नेल पॉलिश की एक बूंद के साथ केशिका ट्यूब के किनारे सील करें। इससे लूप को जगह-जगह ठीक करने में भी मदद मिलेगी। इसे सूखने दें। ट्यूब के दूसरे किनारे पर प्रक्रिया दोहराएं।
      4. बिजली के टेप का एक टुकड़ा काटें (नियमित चिपकने वाले टेप की तुलना में अधिक प्रतिरोधी, अभेद्य और कठोर)।
      5. इसे तोड़ने से बचाने के लिए केशिका के चारों ओर टेप सील करें।

3. इंजेक्शन दिवस

  1. रची भ्रूण को अनचेड अंडे से अलग करें। इस स्तर पर भ्रूण माध्यम में 1x प्रोन्स (0.6 मिलीग्राम/एमएल, टेबल 3)जोड़ने से हैचिंग को बढ़ावा मिल सकता है। इंजेक्शन तक भ्रूण को इनक्यूबेटर (28 डिग्री सेल्सियस पर) में रखें।
    नोट: 1 घंटे से अधिक समय के लिए प्रोनेस समाधान में भ्रूण मत छोड़ो, क्योंकि एंजाइम रची भ्रूण पर कार्रवाई करेगा मृत्यु के अपने जोखिम को बढ़ाने । सुनिश्चित करें कि भ्रूण के विकास के चरण 48 एचपीएफ(चित्रा 3 ए,ए)के अनुरूप है ताकि एडीमा और मृत्यु दर के जोखिम से बचा जा सके।
  2. 1x ट्राइकेन (25x स्टॉक से) तैयार करें।
    नोट: एक विस्तृत नुस्खा तालिका 3 में और ज़ेब्राफ़िश सूचना नेटवर्क - ZFIN वेबपेज17में पाया जा सकता है।

4. इंजेक्शन के लिए सेल लेबलिंग

नोट: कोशिकाओं की लेबलिंग या तो सीधे एक कुप्पी में या एंजाइमेटिक टुकड़ी के बाद १.५ एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में किया जा सकता है । अधिक जानकारी के लिए चर्चा देखें।

  1. सेल कल्चर मीडियम निकालें और 1X पीबीएस के साथ दो बार (2x) फ्लास्क धोएं।
  2. कोशिकाओं को या तो सीधे फ्लास्क (2 एमएल सॉल्यूशन/टी 75 फ्लास्क) में या एंजाइमेटिक टुकड़ी के बाद 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में पसंद के लिपोफिलिक डाई के साथ लेबल करें। 37 डिग्री सेल्सियस पर प्रकाश और इनक्यूबेट कोशिकाओं के संपर्क में आने से बचें (शर्तों/समाधानों के लिए तालिका 1 और तालिका 2 देखें)।
  3. यदि फ्लास्क में लेबलिंग
    1. डाई निकालें, 1x पीबीएस के साथ धोएं और ईडीटीए और एक सेल स्क्रैपर के साथ कोशिकाओं को अलग करें।
    2. कोशिकाओं को 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। 300 x g पर 5 मिनट के लिए सेंट्रलाइज फिर 4.5 चरण पर जाएं।
  4. यदि 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में लेबलिंग:
    1. डाई को हटाने और सुपरनेट को त्यागने के लिए 300 x g पर 5 मिनट सेंट्रलाइज करें। धोने के लिए 1x पीबीएस में पुनर्सुपेंड।
    2. सेंट्रलाइज 300 x g पर 5 मिनट और फिर 4.5 कदम पर जाएं।
  5. सुपरनैंट को त्यागें और पेलेट को सेल कल्चर माध्यम के साथ फिर से व्यतीत करें (50 माइक्रोन गोली के लिए ~ 150-200 माइक्रोन मध्यम जोड़ें)।
  6. ट्राइपैन ब्लू अपवर्जन या पसंद की अन्य विधि के साथ एक न्यूबॉयर चैंबर का उपयोग करके सेल व्यवहार्यता की मात्रा निर्धारित करें।
  7. 300 x g पर 4 मिनट के लिए सेंट्रलाइज करें और सुपरनेट को त्यागें। इंजेक्शन माध्यम में कोशिकाओं को फिर से खर्च करें।
    नोट: अनुशंसित सेल एकाग्रता (सामान्य तौर पर 0.25-0.5x106 कोशिकाओं/μL से) और मध्यम तालिका 1में पाया जा सकता है ।
  8. इस बिंदु के बाद से, कोशिकाओं को बर्फ पर रखें।

5. इंजेक्शन प्रक्रिया

  1. 5 मिनट के लिए 1x ट्राइकेन में भ्रूण को एनेस्थेटाइज करें।
  2. एक प्लास्टिक पाश्चर पिपेट के साथ, एनेस्थेटाइज्ड भ्रूण की एक छोटी राशि (~ 50) को एगर उठे प्लेट में स्थानांतरित करें और उन्हें हेयरपिन लूप की मदद से सावधानीपूर्वक संरेखित करें। भ्रूण के बीच दूरी बनाए रखना सुनिश्चित करें, विशेष रूप से एक की जर्दी और अगले एक(चित्रा 4A)के सिर के बीच।
    नोट: संरेखित करने के लिए भ्रूण की संख्या इंजेक्शन प्रदर्शन शोधकर्ता की विशेषज्ञता के स्तर के अनुसार भिंन होगा । कुछ (~ 10-20) के साथ शुरू करो । आगर/agarose प्लेट में भ्रूण की सही स्थिति की एक योजनाबद्ध के लिए चित्रा 4Aदेखें ।
  3. सुनिश्चित करें कि गठबंधन भ्रूण मृत्यु दर को रोकने के लिए एगर उठे प्लेट में सूख न जाएं, ध्यान से प्लेट में 1x ट्राइकेन समाधान की 1-3 बूंदें जोड़कर।
  4. कोशिकाओं को फिर से खर्च करने के लिए माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब को हल्के से टैप करें। हवा के बुलबुले से बचने के लिए माइक्रोलोडर टिप का उपयोग करके सेल निलंबन के साथ इंजेक्शन सुई को बैकलोड करें, क्योंकि वे भ्रूण की अखंडता से समझौता कर सकते हैं।
  5. एयर प्रेशर वाल्व (40 साई) खोलें, माइक्रोइंजेक्टर को सेट करें और ध्यान से माइक्रोइंजेक्शन सुई को धारक में रखें।
    नोट: निम्नलिखित अनुशंसित माइक्रोइंजेक्टर सेटिंग्स का उपयोग करें: दबाव पकड़ो - वेंट (3 साई); प्रेशर को बाहर निकालें - वेंट; रेंज - 100 एमएस।
  6. स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत डुमोंट संदंश #5 या इसी तरह के साथ टिप के करीब माइक्रोइंजेक्शन सुई काटें।
    नोट: टिप कुंद और काफी पतली कोशिकाओं को clogging के बिना पारित करने के लिए के रूप में अच्छी तरह से भ्रूण को नुकसान पहुंचाने और कोशिकाओं को खोने से बचने के लिए अनुमति देने के लिए होना चाहिए । एक मोटी माइक्रोइंजेक्शन सुई टिप भ्रूण को घायल कर देगी और एडीमा या जेब्राफिश मौत के गठन को बढ़ावा देगी। सुई अंशांकन के लिए ग्रेटिक्यूल का उपयोग नहीं किया जाता है। विस्तृत विवरण के लिए चर्चा देखें।
  7. भ्रूण इंजेक्शन से पहले, माइक्रोइंजेक्टर दबाव का परीक्षण करना सबसे कम बाहर निकालने के दबाव से शुरू होता है जब तक ~ 1-3 दालों में जेब्राफिश भ्रूण की आंख के आकार के समान मात्रा हासिल की जाती है।
    नोट: प्रशिक्षण की शुरुआत में जब भी संभव हो फ्लोरेसेंस स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के उपयोग की सिफारिश की जाती है। यह फ्लोरोसेंटली लेबल कोशिकाओं की एक आसान पहचान की अनुमति देगा ।
  8. ध्यान से भ्रूण की जर्दी के बीच में छेद, सुई के कोण को कम करने और सावधानी से धक्का जब तक सुई की नोक पेरिविटेललाइन अंतरिक्ष (पीवीएस)(चित्रा 4B-D)तक पहुंचताहै।
  9. माइक्रोइंजेक्टर पेडल दबाएं और कोशिकाओं को पीवीएस में इंजेक्ट करें। एक गाइड के रूप में भ्रूण की आंख का उपयोग करें। भ्रूण की आंख के आकार के समान कोशिकाओं की मात्रा इंजेक्ट करने की कोशिश करें और जहां तक संभव हो हृदय एडीमा को रोकने के लिए दिल से।
  10. ध्यान से सुई निकालें और अगले भ्रूण पर चलते हैं।
  11. जरूरत पड़ने पर माइक्रोइंजेक्टर प्रेशर को एडजस्ट करें।
    नोट: कोशिकाओं को रोकना शुरू करते हैं, तो दबाव बढ़ाया जा सकता है । यदि आवश्यक हो, तो दबाव को कम करते हुए केशिका (व्यास बढ़ाने के लिए) में कटौती करना संभव है।
  12. इंजेक्शन भ्रूण को 1x ट्राइकेन समाधान के साथ एक साफ पेट्री डिश(टेबल 4)में स्थानांतरित करें और उन्हें 5-10 मिनट के लिए आराम करने के लिए छोड़ दें। इससे घाव बंद होने में समय लगेगा।
    नोट: एगर प्लेट से पेट्री डिश में भ्रूण को स्थानांतरित करने के लिए भ्रूण के शीर्ष पर 1x ट्राइकेन समाधान की कुछ बूंदें जोड़ें और ध्यान से उन्हें प्लास्टिक पाश्चर पिपेट के साथ इकट्ठा करें। 1x ट्राइकेन समाधान के साथ एक नई पेट्री डिश में एकत्र भ्रूण ड्रॉप।
  13. 1x ट्राइकेन समाधान निकालें और ताजा E3 माध्यम जोड़ें।
  14. 34 डिग्री सेल्सियस (मानव कोशिका लाइनों के अस्तित्व और जेब्राफिश विकास8के बीच एक समझौता तापमान) पर xenografts इनक्यूबेट।

6. मेटास्टेटिक परख

  1. लगभग 1 घंटे के बाद इंजेक्शन (hpi) में, एक फ्लोरोसेंट स्टीरियोमाइक्रोस्कोप पर इंजेक्शन भ्रूण स्क्रीन और 2 समूहों में xenografts सॉर्ट, अनुपस्थिति के अनुसार(चित्रा 5A)या उपस्थिति(चित्रा 5B)संचलन में कोशिकाओं की ।
    नोट: भले ही दिल या परिसंचरण में केवल एक कैंसर सेल का पता चला है, इन xenografts परिसंचरण में कोशिकाओं के साथ xenografts के समूह में शामिल हैं । वैकल्पिक रूप से, इस समूह में ज़ेनोबेड़ा की संख्या बढ़ाने के लिए कोशिकाओं को सीधे प्रचलन में इंजेक्ट किया जा सकता है।

7. 1 दिन के बाद इंजेक्शन

  1. फ्लोरोसेंट स्टीरियोमाइक्रोस्कोप पर ध्यान से प्रत्येक भ्रूण का विश्लेषण और ठीक से इंजेक्शन ट्यूमर(चित्रा 6)के साथ उन लोगों का चयन करें ।
    नोट: यदि आवश्यक हो, तो स्क्रीनिंग से पहले ट्राइकेन 1X समाधान के साथ इंजेक्शन भ्रूण को एनेस्थेटाइज करें।
  2. निम्नलिखित भ्रूण/xenografts त्यागें(चित्रा 6A-A'):
    • ट्यूमर/असामान्य आकृति विज्ञान/मृत के बिना,
    • कार्डियक और/या जर्दी एडिमा के साथ,
    • ट्यूमर कोशिकाओं के साथ ही जर्दी में,
    • बहुत कम कैंसर कोशिकाओं के साथ।
  3. उनके ट्यूमर के आकार के अनुसार चयनित xenografts सॉर्ट करें। तुलना के लिए आंख के आकार का उपयोग करें(चित्रा 6B-B'', 6C)।
    • ट्यूमर आंख के आकार से छोटा (+),
    • ट्यूमर आंख के समान आकार (++),
    • ट्यूमर आंख के आकार से बड़ा (+++)।
  4. वांछित प्रायोगिक लेआउट के अनुसार ज़ेनोग्राफ्ट वितरित करें और दवा परख (नियंत्रण बनाम दवा, आदि) शुरू करें। दवाओं और E3 मध्यम दैनिक(तालिका 4) कीजगह ।
  5. परख के अंत तक 34 डिग्री सेल्सियस के तापमान को बनाए रखने वाले ज़ेनोग्रफ्ट को इनक्यूबेट करें।

8. इंजेक्शन के बाद 4 दिन

  1. परख के अंतिम दिन, 1x ट्राइकेन समाधान के साथ ज़ेनोबेड़ा को एनेस्थेटाइज करें और उन्हें आगर प्लेट पर सावधानी से संरेखित करें।
    नोट: किसी भी मृत या सूजन xenografts त्यागें। दवा उपचार और कुछ ट्यूमर कोशिकाएं विषाक्तता को प्रेरित कर सकती हैं और अंततः ज़ेनोबेड़ा मृत्यु दर का कारण बन सकती हैं। इन विद्वेष मात्राकरण के लिए विचार नहीं कर रहे हैं।
  2. एनग्रेफ्टमेंट का प्रतिशत निर्धारित करने के लिए: फ्लोरोसेंट स्टीरियोमाइक्रोस्कोप पर प्रत्येक जीवित ज़ेनोग्रॉफ्ट का विश्लेषण करें और पीवीएस में ट्यूमर की अनुपस्थिति(चित्रा 6डी)/ उपस्थिति(चित्रा 6E)का आकलन करें।
    Equation 1
  3. मेटास्टेसिस का प्रतिशत निर्धारित करने के लिए: फ्लोरोसेंट स्टीरियोमाइक्रोस्कोप पर प्रत्येक ज़ेनोग्रेफ्ट का विश्लेषण करें और 2 पहले परिभाषित समूहों (सीआईआरसी और नो सीआईआरसी, फिगर 6एफ)के कौडल हेमेटोपोइटिक ऊतक (सीएचटी) में माइक्रोमेटास्टेसिस की उपस्थिति/अनुपस्थिति का आकलन करें
    Equation 2
  4. प्रायोगिक सेट अप के अनुसार, ब्याज के ज़ेनोग्रफ्ट का चयन करें और उन्हें 25x ट्राइकेन(तालिका 3)के साथ इच्छामृत्यु दें।
  5. उन्हें कमरे के तापमान (आरटी) पर कम से कम 4 घंटे या रात 4 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 4 घंटे के लिए 4% फॉर्मलडिहाइड (एफए) में ठीक करें।
    नोट: पीबीएस/0.1% ट्राइटन में 4% पर पतला मेथनॉल-फ्री फॉर्मलडिहाइड (16% एफए) का उपयोग करें। ठीकरा के साथ शीर्ष करने के लिए ट्यूबों भरें। सभी ज़ेनोबेड़ाओं का सजातीय निर्धारण सुनिश्चित करने, पारगम्यता बढ़ाने और जेब्राफिश को नीचे एकत्र होने से रोकने के लिए ट्यूबों को क्षैतिज रूप से रखें।
  6. वैकल्पिक रूप से उन्हें पाइप (प्रति 1 एमसीएल: 1 एम पाइप सोडियम नमक (4 डिग्री सेल्सियस) के 100 माइक्रोन के साथ ठीक करें; 1 एम एमजीएसओ 4 (आरटी) का1 माइक्रोन; 0.5 एम ईजीटीए (आरटी) का 4 माइक्रोन; 16% एफए (आरटी) का 93.7 माइक्रोन; 801.3 डीडीएच2ओ का माइक्रोन।
    नोट: पाइप आरएफपी और रीचेरी ट्रांसजेनिक लाइनों के फ्लोरेसेंस को 4% एफए से बेहतर संरक्षित करता है।
  7. यदि इम्यूनोस्टेटिंग एक अलग दिन पर किया जाएगा, तो एफए को 100% मेथनॉल (MetOH) से बदल दें। 100% मेथनॉल में तय किए गए ज़ेनोग्राफ्ट को अनिश्चित काल के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
    नोट: MetOH कुछ धुंधला (यानी, phalloidin) की दक्षता ख़राब और कुछ फ्लोरोसेंट लेबलिंग बुझाना कर सकते हैं । मेटोह फिक्स्ड नमूनों में एंटीबॉडी की दक्षता की पुष्टि पहले से करें।

9. कॉन्फोकल इमेजिंग के लिए पूरे माउंट इम्यूनोस्टेटिंग

नोट: पूरे माउंट इम्यूनोफ्लोरेसेंस तकनीक में 3 दिन लगते हैं जो इस प्रकार विभाजित होते हैं: पहला दिन इनक्यूबेशन के ज़ेनोग्राफ्ट और प्राथमिक एंटीबॉडी के पारमेबिलाइजेशन के लिए है। धुलाई और माध्यमिक एंटीबॉडी के लिए दूसरे दिन इनक्यूबेशन और तीसरे दिन धोने के लिए, xenografts और बढ़ते मीडिया में भंडारण के निर्धारण ।

  1. दिन 1
    1. यदि ज़ेनोग्राफ्ट को 100% मेटोह में संग्रहीत किया गया था, तो उन्हें कम मेटोह सांद्रता (75%, 50%, 25% मेटोह पीबीएस/0.1% ट्राइटन में पतला) की एक श्रृंखला द्वारा फिर से हाइड्रेट करें। यदि एफए में तय किया जाता है, तो इसे पीबीएस/0.1% ट्राइटन द्वारा प्रतिस्थापित करें।
    2. पीबीएस/0.1% ट्राइटन में 5 मिनट के लिए 4x धोएं।
    3. एच2ओ में 5 मिनट के लिए 1x धोएं।
      नोट: ट्यूबों को क्षैतिज रूप से हमेशा निर्धारण, पारमेबिलाइजेशन और धोने के चरणों में तैनात किया जाना चाहिए जब तक कि अन्यथा नहीं कहा जाता है।
    4. बर्फ ठंड एसीटोन के लिए एच2ओ को बदलें और 7 मिनट के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
      नोट: एसीटोन के साथ 50 एमएल ट्यूब को -20 डिग्री सेल्सियस पर रखें ताकि यह उपयोग करने के लिए तैयार हो। माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूबों को रैक पर खड़ी तैनात किया जाना चाहिए ताकि एसीटोन लीक न हो।
    5. पीबीएस/0.1% ट्राइटन में 10 मिनट के लिए 2x धोएं।
    6. आरटी में 1 घंटे के लिए PBDX_GS अवरुद्ध समाधान के साथ इनक्यूबेटिंग (PBDX_GS बफर अवरुद्ध: 1x पीबीएस के 50 एमएल; 0.5 ग्राम गोजातीय सीरम एल्बुमिन - बीएसए; डीएमएसओ का 0.5 एमएल; 10% ट्राइटन का 250 माइक्रोन; बकरी सीरम का 750 माइक्रोन - जीएस (15 माइक्रोनल/1 एमएल)) ।
    7. PBDX_GS निकालें और प्राथमिक एंटीबॉडी कमजोर पड़ने के ~ 40 माइक्रोन जोड़ें (आम तौर पर 1:100)।
      नोट: प्राथमिक एंटीबॉडी कमजोर पड़ने की मात्रा माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में मौजूद ज़ेनोग्रफ्ट की संख्या के आधार पर भिन्न होती है। सुनिश्चित करें कि सभी ज़ेनोबेड़ा जलमग्न हैं।
    8. आरटी में 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट और फिर रात 4 डिग्री सेल्सियस पर। स्थिति ट्यूब खड़ी।
  2. दूसरा दिन
    1. प्राथमिक एंटीबॉडी निकालें और PBS/0.1% ट्राइटन में 10 मिनट के लिए 2x धोएं ।
    2. PBS/0.05% ट्वीन में 30 मिनट के लिए 4x धोएं।
      नोट: निम्नलिखित चरणों को अंधेरे में किया जाना चाहिए (ट्यूबों को प्रकाश से बचाने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी का उपयोग करें)।
    3. PBS/0.05% ट्वीन निकालें और PBDX_GS में पतला माध्यमिक एंटीबॉडी कमजोर पड़ने के ~ 50-100 μL (आम तौर पर 1:200-1:400) + DAPI (50 μg/l) जोड़ें।
    4. आरटी में 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट और फिर रात 4 डिग्री सेल्सियस पर। स्थिति ट्यूब खड़ी और प्रकाश से रक्षा।
  3. 3 दिन (प्रकाश से ट्यूबों की रक्षा के लिए एल्यूमीनियम पन्नी का उपयोग करें)
    1. माध्यमिक एंटीबॉडी कमजोर पड़ने निकालें और PBS/0.05% ट्वीन में 15 मिनट के लिए 4x धोएं।
    2. 4% एफए में 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ठीक करें।
    3. PBS/0.05% ट्वीन में 5 मिनट के लिए 1x धोएं।
    4. PBS/0.05% ट्वीन निकालें और प्रत्येक माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब के लिए जलीय बढ़ते माध्यम की 1 बूंद जोड़ें। ट्यूबों को खड़ी रखें।
    5. माउंट या 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर बढ़ते तक प्रकाश से संरक्षित। ट्यूबों को खड़ी रखें।

10. xenografts के बढ़ते

नोट: प्रक्रिया के दौरान प्रकाश से माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूबों की रक्षा करें। जेब्राफिश ज़ेनोग्राफ्ट 2 कवरस्लिप (24 x 60 मिमी # 1.5) के बीच घुड़सवार हैं। यह कॉन्फोकल इमेजिंग के दौरान घुड़सवार ज़ेनोग्राफ्ट को फ्लिप करने की अनुमति देता है ताकि ट्यूमर के दोनों पक्ष (ऊपर और नीचे) सुलभ हों। बढ़ते माध्यम के साथ प्लास्टिक पिपेट का उपयोग न करें - ज़ेनोग्राफ्ट पिपेट में फंस सकते हैं। निम्नलिखित चरणों के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व के लिए चित्रा 7 देखें।

  1. कवरस्लिप वाई को लेबल करें और बढ़ते मीडिया के रिसाव से बचने के लिए पेट्रोलियम जेली या सिलिकॉन तेल के साथ कवरस्लिप एक्स के किनारों को सील करें।
  2. एक ग्लास पाश्चर पिपेट के साथ ज़ेनोग्राफ्ट को कवरस्लिप एक्स में स्थानांतरित करें।
  3. उन्हें हेयरपिन के साथ सावधानी से संरेखित करें और अतिरिक्त जलीय बढ़ते मीडिया को हटा दें।
  4. कवरलिप वाई के लिए जलीय बढ़ते मीडिया जोड़ें ।
  5. ध्यान से कवरस्लिप एक्स के शीर्ष पर कवरस्लिप वाई रखें। कवर्लिप्स को दबाएं नहीं क्योंकि यह संभावित रूप से ज़ेनोग्राफ्ट को बाधित कर सकता है।
  6. एक माइक्रोस्कोप स्लाइड के शीर्ष पर इकट्ठे हुए कवर्लिप्स रखें और पारदर्शी चिपकने वाले टेप के साथ उन्हें सुरक्षित करें। यह कॉन्फोकल इमेजिंग और स्टोरेज के लिए एक आसान हेरफेर की अनुमति देता है।

11. कॉन्फोकल इमेजिंग

नोट: पानी सुधार के साथ एक Apochromatic 25x विसर्जन उद्देश्य लेंस एकल सेल रिज़ॉल्यूशन के साथ पीवीएस ट्यूमर इमेजिंग के लिए इष्टतम है (चित्रा 8C-C देखें" और उदाहरण के लिए चित्रा 9A)।

  1. प्रत्येक स्लाइस के बीच 5μm के अंतराल के साथ जेड-स्टैक फ़ंक्शन का उपयोग करके नमूने प्राप्त करें। 3 डी पुनर्निर्माण के उद्देश्य से छवियों के लिए, विशेष रूप से जहाजों में, स्लाइस(चित्रा 8A)के बीच 1-3μm के अंतराल का उपयोग करें ।

12. विश्लेषण और परिमाणीकरण

  1. फिजी/इमेजजे सॉफ्टवेयर या कॉन्फोकल इमेज प्रोसेसिंग और विश्लेषण के लिए इसी तरह का उपयोग करें।
  2. फिजी सॉफ्टवेयर में कच्चे डेटा (.czi, .lsm, आदि) खोलें।
  3. समग्र मोड में सभी या सिर्फ एक चैनल का चयन करने के लिए, क्लिक करें: इमेज > कलर्स > चैनल टूल।
  4. चमक और इसके विपरीत स्तर को समायोजित करने के लिए, क्लिक करें: छवि > रंग संतुलन > समायोजित करें।
  5. ट्यूमर के आकार की मात्रा निर्धारित करने के लिए
    1. ट्यूमर के तीन प्रतिनिधि स्लाइस का चयन करें, ऊपर, मध्य और नीचे से, प्रति जेड-स्टैक प्रति xenograft(चित्रा 8 ए)।
      नोट: कॉन्फोकल रिज़ॉल्यूशन ट्यूमर गहराई के ~ 60-70 माइक्रोन प्राप्त करता है। यदि ट्यूमर बड़ा है, तो इसकी कुल मात्रा को छवि देना संभव नहीं हो सकता है।
    2. डेटा को एनोटेट करने के लिए एक स्प्रेडशीट खोलें।
    3. 3 चयनित स्लाइस(चित्रा 8 ए, बी)में ट्यूमर कोशिकाओं से मेल खाती है कि हर DAPI नाभिक गिनती। ऐसा करने के लिए:
      1. > सेल काउंटर का विश्लेषण > प्लगइन क्लिक करके फिजी/इमेजजे से सेल काउंटर प्लगइन खोलें।
      2. सेल काउंटर टूल में, आरंभिकरूप से क्लिक करें, काउंटर प्रकार का चयन करें, और मैन्युअल रूप से गिनती मोड शुरू करने के लिए छवि पर क्लिक करें। हर क्लिक के लिए, काउंटर जोड़ता है कि कितनी कोशिकाओं की गणना की जाती है (क्लिक की संख्या)।
      3. एक पूर्ण टुकड़ा गिनने के बाद, संबंधित एक्सेल दस्तावेज़ में सेल नंबर को सहेजें।
      4. फिजी के लिए वापस, एक ही काउंटर का उपयोग किया जाएगा, तो जानकारी को हटाने के लिए सेल काउंटर विंडो से रीसेट पर क्लिक करें। अन्यथा, जानकारी रखी जा सकती है, और अन्य काउंटरों का उपयोग अन्य स्लाइस (या कोशिकाओं) के साथ किया जा सकता है।
      5. दूसरे प्रतिनिधि स्लाइस पर जाएं और पिछले चरणों को दोहराएं। सभी डेटा इकट्ठा करें।
        नोट: DAPI काउंटरस्टैनिंग आमतौर पर व्यक्तिगत कोशिकाओं की स्पष्ट परिभाषा के कारण सेल संख्या गिनती करने के लिए प्रयोग किया जाता है, हालांकि, अन्य सेल विशिष्ट धुंधला इस्तेमाल किया जा सकता है।
    4. ट्यूमर में कोशिकाओं की कुल संख्या प्राप्त करने के लिए निम्नलिखित सूत्र का उपयोग करें:
      Equation 3
      नोट: 1.5 सुधार संख्या उन कोशिकाओं के लिए अनुमानित की गई थी जिनका औसत नाभिक व्यास ~ 10-12 माइक्रोन है। यदि कोशिकाएं बड़ी/छोटी हैं तो इस सुधार को समायोजन की आवश्यकता हो सकती है । इस विधि के बारे में अधिक जानकारी के लिए Dicussion देखें।
  6. अन्य मार्कर (प्रतिरक्षा कोशिकाओं, मिटोटिक आंकड़े, PPH3, सक्रिय Caspase3, Ki67, आदि) की मात्रा निर्धारित करने के लिए, एक ही प्लगइन का उपयोग करके सभी स्लाइस की मात्रा निर्धारित करें (मिटोटिक आंकड़ों के दृश्य के लिए चित्रा 8C-C'') देखें।) । इसी ट्यूमर आकार द्वारा गिना कोशिकाओं की कुल संख्या विभाजित और प्रतिशत प्राप्त करने के लिए १०० से गुणा ।
    नोट: सावधान रहें कि कुछ कोशिकाएं दो स्लाइस के बीच स्थित होंगी, यह सुनिश्चित करने के लिए जेड-स्टैक में आगे-पीछे जाएं कि एक सेल को दो बार नहीं गिना जा रहा है।

Representative Results

कैंसर रोधी उपचारों का अध्ययन करने के लिए एक उपकरण के रूप में जेब्राफिश ज़ेनोबेड़ा।
HCT116 कोलोरेक्टल कैंसर सेल लाइन सीएम-डीआईआई के साथ लेबल किया गया था और निषेचन (डीपीएफ) भ्रूण के बाद 2 दिनों के पीवीएस में इंजेक्शन दिया गया था। इंजेक्शन के बाद, ज़ेनोग्राफ्ट को 34 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटेड किया गया था, एक तापमान जो जेब्राफिश विकास से समझौता किए बिना ट्यूमर कोशिकाओं के विकास की अनुमति देता है। अगले दिन, पीवीएस में ट्यूमर द्रव्यमान की उपस्थिति या अनुपस्थिति के अनुसार ज़ेनोग्राफ्ट की जांच की गई (ठीक से इंजेक्शन नहीं जेब्राफिश को त्याग दिया गया और इच्छामृत्यु नहीं दी गई)(चित्रा 6A-A'')। Xenografts उनके ट्यूमर आकार के अनुसार समूहीकृत किया गया(चित्रा 6B-B'')और बेतरतीब ढंग से वितरित (एक 6-अच्छी तरह से प्लेट में: ~ 12 xenografts प्रति अच्छी तरह) गैर-इलाज नियंत्रण और FOLFIRI कीमोथेरेपी (०.१८ m M Folinic एसिड, ०.०८ mM Irinotecan और ४.२ m Fluorocil (FU--)) में ।

नियंत्रण E3 और दवाओं को दैनिक रूप से प्रतिस्थापित किया गया था, और मृत जेब्राफिश को छोड़ दिया गया था। 4 डीपीआई, और तीन दिन के बाद उपचार (डीपीटी), एनग्रफ्टमेंट प्रोटोकॉल के चरण 8.2 में निर्धारित किया गया था। एनग्रफ्टमेंट को 4 डीपीआई पर पीवीएस में ट्यूमर द्रव्यमान पेश करने वाले ज़ेनोग्राफ्ट की आवृत्ति के रूप में माना जाता है। उदाहरण के लिए, यदि प्रयोग के अंत में 40 जीवित लार्वा हैं और 40 में से 35 पीवीएस में ट्यूमर पेश करते हैं, तो एनग्रेफ्टमेंट दर 87.5% है। इम्यूनोफ्लोरेसेंस और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा ट्यूमर के आकार और एपोप्टोसिस का मूल्यांकन करने के लिए ज़ेनोग्राफ को इच्छामृत्युकृत और तय किया गया था।

इम्यूनोफ्लोरेसेंस को एंटी-क्लीव्ड कैप्पाज़ 3 एंटीबॉडी (Asp175) (खरगोश, 1:100, #CST 9661) और डीएपीआई (50 μg/mL) का उपयोग करके एपोप्टोटिक कोशिकाओं का पता लगाने के लिए किया गया था। इमेज स्टैक डेटासेट (हर 5um) को एलएसएम 710 कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप और फिजी/इमेजजे सॉफ्टवेयर के साथ किए गए डेटा विश्लेषण में अधिग्रहीत किया गया था जैसा कि चरण 12में समझाया गया था । माइटोटिक इंडेक्स, एपोप्टोसिस (सक्रिय कैपासे3 का%) और ट्यूमर आकार का मात्राकरण, पता चला कि FOLFIRI माइटोसिस (मान व्हिटनी टेस्ट, पी<0.0001) और एपोप्टोसिस (मान व्हिटनी टेस्ट, पी<0.0001) के एक महत्वपूर्ण प्रेरण की एक महत्वपूर्ण कमी लाती है, जिसके साथ ट्यूमर के आकार (पी<0.001)(चित्रा 8C-E, चित्रा 9A-E)की 54% कमीहै।

ये विशेषताएं उच्च थ्रूपुट फेनोटाइपिक दवा स्क्रीन में उपयोगी हैं और साथ ही कम समय सीमा में कई कैंसर उपचारों के सेल आंतरिक और शारीरिक प्रभावों का परीक्षण करने के लिए हैं।

मानव-विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ मानव-ज़ेब्राफिश ज़ेनोग्रैफ्ट का लक्षण वर्णन
जैसा कि सभी ज़ेनोबेड़ा मॉडल में, कोशिकाओं को गलत पहचानने का खतरा है। उदाहरण के लिए, मैक्रोफेज मानव कैंसर कोशिकाओं को फैगोसाइटोज़ कर सकते हैं, लिपोफिलिक डाई के साथ लेबल किया जा सकता है, और फिर जेब्राफिश होस्ट के साथ यात्रा करते हैं और इस प्रकार, इन कोशिकाओं को ट्यूमर माइक्रोमेटास्टेसिस के लिए गलत किया जा सकता है। इसलिए, मानव एचएलए, की-67 या मानव माइटोकॉन्ड्रिया (एचएमआईटीओ) जैसे विशिष्ट मानव एंटीबॉडी के साथ ज़ेनोग्राफ्ट लेबलिंग प्रारंभिक लक्षण वर्णन के लिए महत्वपूर्ण है और ट्यूमर कोशिकाओं(चित्रा 9F-I)के आकृति विज्ञान से परिचित होने के लिए भी महत्वपूर्ण है।

सेल-सेल इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए जेब्राफिश ज़ेनोबेड़ा।
जेब्राफिश ज़ेनोबेड़ा मॉडल का एक और बड़ा लाभ यह है कि विभिन्न ट्यूमर कोशिकाओं की बातचीत का अध्ययन करना और विश्लेषण करना संभव है कि प्रत्येक प्रकार की कोशिका दूसरे के व्यवहार को कैसे प्रभावित कर सकती है। विभिन्न मानव कैंसर कोशिकाओं (एक ही ट्यूमर से या विभिन्न ट्यूमर से अलग क्लोन) सह इंजेक्शन किया जा सकता है। इस उदाहरण में, एक ही रोगी से प्राप्त दो सीआरसी सेल लाइनों को विभिन्न लिपोफिलिक रंगों के साथ लेबल किया गया था और इंजेक्शन के लिए 1:1 के अनुपात में मिलाया गया था(चित्रा 9J-K')।

एक ही भ्रष्टाचार पर मानव कोशिका लाइनों (पॉलीक्लोनल ट्यूमर उत्पन्न करने के लिए) मिश्रण करते समय, डायओ डाई का उपयोग करने से बचें क्योंकि इसके परिणामस्वरूप गैर-विशिष्ट डबल धुंधला(तालिका 2)। इसके बजाय उदाहरण के लिए उपयोग करें, सीएम-डीआईआई (सेल लाइन #1) हरे सीएमएफडीए (सेल लाइन #2), या सीएम-डीआईआई (सेल लाइन #1) के साथ डीप रेड (सेल लाइन #2)(टेबल 2, चित्रा 9J-K'के साथ, प्रयोग के अंत में आबादी का आसान भेदभाव प्राप्त करने के लिए। ट्यूमर के भीतर प्रत्येक क्लोन की आवृत्ति की मात्रा निर्धारित करने के लिए, प्रत्येक क्लोन की पहचान करने के लिए फिजी में 2 अलग-अलग काउंटर प्रकारों का उपयोग करें और फिर प्रत्येक के सापेक्ष अंश (%) प्राप्त करने के लिए कुल सेल संख्या (सभी क्लोनों की राशि) द्वारा विभाजित करें।

Figure 1
चित्रा 1। जेब्राफिश ज़ेनोबेड़ा प्रोटोकॉल का फ्लो चार्ट सारांश कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2। जेब्राफिश भ्रूण इंजेक्शन के लिए सामग्री: ए। बोरोसिलिकेट सुई बी 2% एगर उठे प्लेट। C हेयरपिन लूप डी। हेयरपिन लूप बनाने के उपाय: 1. एक ग्लास केशिका ट्यूब के अंदर 1 बाल रखें जिससे ट्यूब के बाहर लगभग 1 सेंटीमीटर बाल छोड़े जाएं। 2-3. ~ 0.5 मिमी लंबाई का एक पाश बनाने ग्लास केशिका ट्यूब में संदंश की मदद से बालों के बाहर की नोक कर्ल करें। 4.नेल पॉलिश की एक बूंद के साथ केशिका ट्यूब के किनारे सील करें। 5-6. इसे तोड़ने से बचाने के लिए केशिका के चारों ओर बिजली के टेप का एक टुकड़ा सील करें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3। 48 घंटे बाद निषेचन (48 एचपीएफ): ए-ए'पर जेब्राफिश भ्रूण की प्रतिनिधि स्टीरियोमाइक्रोस्कोप छवियां। विकास के 48 एचपीएफ में एक जेब्राफिश भ्रूण की सामान्य आकृति विज्ञान, माइक्रोइंजेक्शन बी-बी के लिए तैयार है। एक जेब्राफिश भ्रूण की आकृति विज्ञान जिसने 48 एचपीएफ में माइक्रोइंजेक्शन के लिए पर्याप्त विकासात्मक चरण हासिल नहीं किया है और पहले से ही कुछ हद तक कार्डियक एडीमा (काला एरोहेड) और डिटेन्ड जर्दी प्रस्तुत करता है। ए और बी ' क्रमशः ए और बी के आवर्धन हैं । स्केल बार 500 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करते हैं. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4। जेब्राफिश माइक्रोइंजेक्शन प्लेट का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व स्थापित: ए। 3% एगर/2% एगर उठे प्लेट में एनेस्थेटाइज्ड भ्रूण का संरेखण। B. एक काले तीर के साथ, एक 2 दिनों के बाद निषेचन ज़ेब्राफ़िश भ्रूण का ग्राफिक प्रतिनिधित्व पेरिविटेललाइन अंतरिक्ष (पीवीएस) का संकेत है। सी और डी कैंसर कोशिकाओं को निषेचन के बाद 48 घंटे के पेरिविटेललाइन स्पेस (पीवीएस) में इंजेक्ट किए गए पीवीएस में विभिन्न कोणों के साथ इंजेक्ट किया जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5। मेटास्टैटिक परख। 1 घंटे के बाद इंजेक्शन (1hpi) इंजेक्शन भ्रूण अनुपस्थिति (NO_circ) या उपस्थिति (सीआईआरसी) संचलन में ट्यूमर कोशिकाओं के अनुसार हल कर रहे हैं । इंजेक्शन के बाद 4 दिनों में दोनों समूहों में ज़ेनोग्रफ्ट की संख्या जो वर्तमान माइक्रोमेटास्टेसिस की मात्रा निर्धारित की जाती है। (ए)NO_circ समूह की कोशिकाओं को माइक्रोमेटास्टेसिस बनाने में सक्षम होने के लिए सभी मेटास्टैटिक चरणों से गुजरना पड़ता था, जबकि सीआईआरसी समूह(बी)में कोशिकाएं केवल मेटास्टैटिक झरना के अंतिम चरणों से गुजरती हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6। 1 दिन के बाद इंजेक्शन और 4 दिन के बाद इंजेक्शन पर xenografts के प्रतिनिधि फ्लोरोसेंट स्टीरियोमाइक्रोस्कोप छवियां। फ्लोरोसेंट प्रोटीन टीडीटोमाटो (लाल) को व्यक्त करने वाली मानव कैंसर कोशिकाओं को 2 डीपीएफ जेब्राफिश भ्रूण में माइक्रोइंट्रेक्ट किया गया था। 1 डीपीआई में, इंजेक्शन वाले भ्रूण को स्क्रीन करें और बुरी तरह से इंजेक्ट किए गए लोगों या भ्रूणों को एडीमा(ए-ए')के साथ त्यागें, ट्यूमर आकार(बी-बी' केअनुसार अच्छी तरह से इंजेक्शन वाले भ्रूण को सॉर्टकरें। C. SW620 xenografts में 1 डीपीआई में विभिन्न ट्यूमर आकार श्रेणियों में मौजूद कोशिकाओं की कुल संख्या का प्रतिनिधि मात्राकरण। प्रत्येक डॉट एक ज़ेनोबेड़ा मात्रा का प्रतिनिधित्व करता है जैसा कि 4 डीपीआई 12.At अनुभाग में समझाया गया है, लार्वा को स्क्रीन करें और विभिन्न वर्गों की मात्रा निर्धारित करें: कोई ट्यूमर(डी); पीवीएस(ई)में ट्यूमर के साथ और सीएचटी(एफ)में एक माइक्रोमेटास्टेसिस के साथ। स्केल बार 500 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करते हैं. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 7
चित्रा 7। कॉन्फोकल इमेजिंग के लिए बढ़ते ज़ेनोबेड़ा का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। 1. कवरस्लिप वाई में लेबलिंग का उदाहरण, कवरस्लिप एक्स में हल्की नीली रेखा परिधि का प्रतिनिधित्व करती है जिसमें बढ़ते मीडिया के रिसाव को रोकने के लिए पेट्रोलियम जेली/सिलिकॉन तेल लागू किया जाता है । 2. कॉन्फोकल इमेजिंग के लिए कवरस्लिप एक्स पर ज़ेनोबेड़ा अलाइनमेंट के उदाहरण। 3. जलीय बढ़ते मीडिया (नीला तीर) का उपयोग कवरलिप एक्स 4 के शीर्ष पर कवरस्लिप वाई को बांधने के लिए किया जाता है। ठीक से घुड़सवार कवर्लिप्स का उदाहरण। 5. कवरस्लिप को ग्लास स्लाइड के शीर्ष पर रखा जाता है और पारदर्शी टेप के साथ सुरक्षित किया जाता है। 6. लेप्ड ज़ेनोग्राफ्ट कॉन्फोकल इमेजिंग के लिए तैयार हैं। BioRender.com के साथ बनाया कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 8
चित्रा 8। ट्यूमर के आकार के कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप छवि क्वांटिफिकेशन का दृश्य प्रतिनिधित्व। इंजेक्शन ए के बाद 4 दिनों में एचसीटी 116 ज़ेनोबेड़ा की कॉन्फोकल छवियां। DAPI चैनल में जेड-स्टैक स्लाइस की श्रृंखला 5 माइक्रोन अंतराल के साथ अधिग्रहीत की गई। लाल धराशायी लाइनें सेल काउंटिंग के लिए इस्तेमाल होने वाले तीन प्रतिनिधि स्लाइस को सर्कल करती हैं । B. इमेजजे/फिजी सॉफ्टवेयर में सेल काउंटर प्लगइन के साथ DAPI नाभिक मात्रा का चित्रण। सी-ई। ट्यूमर के भीतर एकल सेल रिज़ॉल्यूशन का उदाहरण जिसमें DAPI में मिटोटिक आंकड़ों की कल्पना/मात्रा करना संभव है या फॉस्फो-हिस्टोन एच 3 एंटीबॉडी (हरा) का उपयोग करना संभव है। डी और ई सी के आवर्धन कर रहे हैं । स्केल बार 50 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 9
चित्रा 9। प्रतिनिधि परिणाम। ए-ई। HCT116 कोलोरेक्टल कैंसर सेल लाइन को व्याब्रेंट सीएम-डीआईआई के साथ लेबल किया गया था और 2 दिनों के बाद निषेचन (डीपीएफ) भ्रूण के पीवीएस में इंजेक्ट किया गया था। इंजेक्शन के बाद 34 डिग्री सेल्सियस पर जेनोग्राफर को इनक्यूबेटेड किया गया। 1 डीपीआई पर, xenografts की जांच की गई और बेतरतीब ढंग से गैर-उपचारित नियंत्रण और FOLFIRI में वितरित किया गया, लगातार 3 दिनों के लिए इलाज किया गया और 4 डीपीआई पर तय किया गया। ए.इम्यूनोफ्लोरेसेंस को एपोप्टिक कोशिकाओं का पता लगाने के लिए किया गया था, जिसमें नाभिक प्रतिपस्तिग्न होने के लिए एंटी-क्लीव्ड कैपेस 3 एंटीबॉडी और डीएपीआई का उपयोग किया गया था। माइटोटिक इंडेक्स सी,एपोप्टोसिस (सक्रिय कैपासे3 का%) डी का मात्राकरण, और ट्यूमर आकार ई,पता चला कि FOLFIRI माइटोसिस (मान व्हिटनी टेस्ट, पी<0.0001) और एपोप्टोसिस (मान व्हिटनी टेस्ट, पी<0.0001) के एक महत्वपूर्ण प्रेरण की एक महत्वपूर्ण कमी लाती है, ट्यूमर के आकार (पी<0.001) की 54% कमी के साथ। विश्लेषण किए गए ज़ेनोग्राफ्ट की संख्या आकृति में इंगित की गई है और प्रत्येक डॉट एक ज़ेनोबेड़ा का प्रतिनिधित्व करता है। एफ-एच। पीवीएस और सीएचटी Iमें हरे रंग (मानव एचएलए, कि67 और एचएमआईटीओ) में मानव विशिष्ट मार्कर के साथ लेबल किए गए 4 दिनों के बाद इंजेक्शन में कोलोरेक्टल कैंसर ज़ेनोग्राफ्ट की प्रतिनिधि छवियां। जम्मू-जम्मू'। पॉलीक्लोनल ज़ेनोग्राफ्ट की कॉन्फोकल छवियां, लिपोफिलिक स्टेनिंग सेलट्रैकर डीप रेड (Cy5 - सफेद), सेलट्रैकर ग्रीन सीएमएफडीए (488 - ग्रीन) और डीएपीआई काउंटरटेनिंग के साथ लेबल किए गए दो अलग-अलग मानव कोलोरेक्टल कैंसर सेल लाइनों के साथ इंजेक्ट की गई हैं। कश्मीर'। लिपोफिलिक स्टेनिंग सेलट्रैकर डीप रेड (Cy5 - सफेद), व्याब्रंट सीएम डीआईआई (594 - लाल) और DAPI काउंटरटेनिंग के साथ लेबल किए गए दो अलग-अलग मानव कोलोरेक्टल कैंसर सेल लाइनों की कॉन्फोकल छवियां। स्केल बार 50 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

सेल लाइन टिशू पेपर प्रजातियां शब्‍दरूप विज्ञान विकास मोड इंजेक्शन के लिए आदर्श संगम इंजेक्शन के लिए एजेंट को अलग करना वियोजन का समय लेबलिंग के लिए प्रोटोकॉल इंजेक्शन माध्यम द्वारा कोशिकाओं की कुल संख्या विभाजित (इंजेक्शन के लिए आदर्श एकाग्रता प्राप्त करने के लिए)
SW480 कोलोरेक्टल एडेनोकार्सिनोमा (प्राथमिक) मनुष्‍य उपकला अनुयायी 70% - 75 % पीबीएस/ईडीटीए 2 mM 5 मिनट कुप्पी पीबीएस 1x 0,25
SW620 कोलोरेक्टल एडेनोकार्सिनोमा (मेटास्टेसिस) मनुष्‍य उपकला अनुयायी 70% - 75 % पीबीएस/ईडीटीए 2 mM 5 मिनट कुप्पी पीबीएस 1x 0,25
एचसीटी116 कोलोरेक्टल कार्सिनोमा (प्राथमिक), क्रास उत्परिवर्ती मनुष्‍य उपकला अनुयायी 70% - 75 % पीबीएस/ईडीटीए 2 mM 5 मिनट कुप्पी पीबीएस 1x 0,25
एचकेई3 कोलोरेक्टल कार्सिनोमा, क्रास डब्ल्यूटी मनुष्‍य उपकला अनुयायी 70% - 75 % पीबीएस/ईडीटीए 2 mM 5 मिनट कुप्पी पीबीएस 1x 0,25
एचटी-29 कोलोरेक्टल एडेनोकार्सिनोमा (प्राथमिक) मनुष्‍य उपकला अनुयायी 70% - 75 % पीबीएस/ईडीटीए 2 mM 5 मिनट कुप्पी पीबीएस 1x 0,2
कैस्को-2 कोलोरेक्टल एडेनोकार्सिनोमा (प्राथमिक) मनुष्‍य उपकला अनुयायी 70% - 75 % पीबीएस/ईडीटीए 1 mM 5 मिनट 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब पूरा माध्यम 0,25
एमसीएफ-7 स्तन एडेनोकार्सिनोमा (मेटास्टेसिस) मनुष्‍य उपकला अनुयायी 70% - 80 % पीबीएस/ईडीटीए 1 mM 5 मिनट 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब 60% एफबीएस + 40% पूर्ण माध्यम 0,5
Hs578T स्तन कार्सिनोमा (प्राथमिक) मनुष्‍य उपकला अनुयायी 70% - 75 % पीबीएस/ईडीटीए 1 mM 2 मिनट 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब 60% एफबीएस + 40% पूर्ण माध्यम 0,5
एमडीए-एमबी-468 स्तन एडेनोकार्सिनोमा (मेटास्टेसिस) मनुष्‍य उपकला अनुयायी 70% - 75 % पीबीएस/ईडीटीए 1 mM 8 मिनट 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब 60% एफबीएस + 40% पूर्ण माध्यम 0,5
एमडीए-एमबी-231 स्तन एडेनोकार्सिनोमा (मेटास्टेसिस) मनुष्‍य उपकला अनुयायी 70% - 75 % पीबीएस/ईडीटीए 1 mM 5 मिनट 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब पूरा माध्यम 0,5
RT112 मूत्राशय संक्रमणकालीन सेल कार्सिनोमा (प्राथमिक) मनुष्‍य उपकला अनुयायी 85% - 90% ट्रिपल 6 मिनट + सेल स्क्रैपर 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब पूरा माध्यम 0,5
बीएफटीसी905 मूत्राशय संक्रमणकालीन सेल कार्सिनोमा (प्राथमिक) मनुष्‍य उपकला अनुयायी 75% - 85% ट्रिपल 10 मिनट 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब 80% पूरा माध्यम + 20% पीबीएस/ईडीटीए 2 mM 0,5
J82 मूत्राशय संक्रमणकालीन सेल कार्सिनोमा (प्राथमिक) मनुष्‍य उपकला अनुयायी 85% - 90% ट्रिपल 10 मिनट 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब पूरा माध्यम 0,5
आरटी4 मूत्राशय संक्रमणकालीन सेल कार्सिनोमा (प्राथमिक) मनुष्‍य उपकला अनुयायी 85% - 90% ट्रिपल 6 मिनट 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब पूरा माध्यम 0,5
एमआईए PaCa-2 अग्नाशय एपिथेलियोड कार्सिनोमा (प्राथमिक) मनुष्‍य उपकला अनुयायी 80% - 90% ट्रिपल 3 मिनट 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब 60% एफबीएस + 40% पूर्ण माध्यम 0,5
पैनी-1 अग्नाशय एपिथेलियोड कार्सिनोमा (प्राथमिक) मनुष्‍य उपकला अनुयायी 80% ट्रिपल 5 मिनट 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब PBS/EDTA 2mM 0,5
वीसी8 फेफड़ों फाइब्रोब्लास्ट, BRCA2 उत्परिवर्ती, मानव संसाधन की कमी चीनी हम्सटर उपकला अनुयायी 70% - 80 % पीबीएस/ईडीटीए 1 mM 5 मिनट 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब पूरा माध्यम 0,25
VC8-B2 फेफड़ों के फाइब्रोब्लास्ट, मानव बीआरसीए2, बीआरसीए2 −/− एचआर की कमी चीनी हम्सटर उपकला अनुयायी 70% - 80 % पीबीएस/ईडीटीए 1 mM 5 मिनट 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब पूरा माध्यम 0,25

तालिका 1: कई सेल लाइनों के इंजेक्शन के लिए इष्टतम इन विट्रो संगम

सेल डाई सूची संख्या फ्लोरेसेंस स्पेक्ट्रम (Exc.- Em.) स्टॉक कमजोर पड़ने एक कुप्पी में दाग करने के लिए काम कमजोर पड़ने 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज में दाग करने के लिए काम कमजोर पड़ने इनक्यूबेशन समय टिप्पणियों
व्याब्रंट सीएम-डीआईआई V22888 549 एनएम - 569 एनएम पहले से ही पतला पीबीएस 1x में 4:1000 पीबीएस 1x में 4:1000 15 मिनट @ 37 ºC + 4 मिनट @ 4 ºC
व्याब्रंट डायो V22886 484 एनएम - 501 एनएम पहले से ही पतला पीबीएस 1x में 5:1000 पीबीएस 1x में 5:1000 15 मिनट @ 37 ºC + 4 मिनट @ 4 ºC इंजेक्शन के बाद 4 दिनों में कॉन्फोकल इमेजिंग में अच्छा संकल्प नहीं
सेलट्रैकर डीप रेड C34565 630 एनएम - 660 एनएम डीएमएसओ में 1 mM 0.5 - पीबीएस 1x में 2.5 माइक्रोनएम 0.5 - पीबीएस 1x में 2.5 माइक्रोनएम 15 मिनट @ 37 ºC
सेलट्रैकर ग्रीन सीएमएफडीए C7025 492 एनएम - 517 एनएम डीएमएसओ में 10 एमएमएम 0.5 - पीबीएस 1x में 2.5 माइक्रोनएम 0.5 - पीबीएस 1x में 2.5 माइक्रोनएम 15 मिनट @ 37 ºC उत्पाद पेट गुहा के लिए लीक ४८ घंटे के बाद इंजेक्शन, लेकिन सह इंजेक्शन अध्ययन के लिए आदर्श

तालिका 2: डाई और शर्तें

आकार वाला # लार्वा का E3 1x मध्यम मात्रा
100 मिमी x 15 मिमी (मानक) 50 तक 20-25 एमएल
60 मिमी x 15 मिमी 20 तक 10 एमएल
6-अच्छी थाली 15 तक प्रति कुएं 3-4 एमएल प्रति अच्छी तरह से

तालिका 3: पेट्री डिश विकल्प

E3 मध्यम 50x - स्टॉक बाँझ पानी के 10 लीटर के लिए:
146.9 ग्राम नैक का
केसीएल के 6.3 ग्राम
24.3 ग्राम सीएसीएल2· 2एच2ओ
40.7 ग्राम एमजीएसओ4·7एच2ओ
E3 मध्यम 1x - उपयोग करने के लिए तैयार 400 एमएल का ई3 मीडियम 50x
0.01% मेथिलीन ब्लू सॉल्यूशन के 60 मिलील
मछली प्रणाली पानी के 20 लीटर तक भरें
ट्राइकेन 25x - स्टॉक और इच्छामृत्यु 2 ग्राम ट्राइकेन पाउडर
रिवर्स ऑस्मोसिस पानी की 500 एमएल
1 एम ट्रिस के 10 एमएल (पीएच 9)
पीएच 7 को समायोजित करें
ट्राइकेन 1x - एनेस्थीसिया ट्राइकेन 25x के 20 एमएल
सिस्टम पानी के 500 एमएल तक भरें
60 मिलीग्राम/एमएल प्रोनस - स्टॉक 100x 1 ग्राम का उच्चारण
16.7 एमएल बाँझ पानी
0.6 मिलीग्राम/एमएल प्रोनेज - 1x उपयोग करने के लिए तैयार 100 माइक्रोल प्रोन्स 100x
9.9 एमएल का ई3 मीडियम 1x

तालिका 4: समाधान रचनाएं

Discussion

कैंसर के विकास और दवा जांच के लिए एक मॉडल के रूप में जेब्राफिश के बढ़ते महत्व के परिणामस्वरूप 3 , 4,7,13,14,16,18,19,20,21. हालांकि, जेब्राफिश भ्रूण में कैंसर कोशिकाओं का इंजेक्शन एक ऐसी तकनीक है जिसके लिए उच्च स्तर की निपुणता की आवश्यकता होती है जो शोधकर्ताओं के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकती है। इस प्रोटोकॉल में हमारा उद्देश्य व्यावहारिक जानकारी और कुछ सुझाव प्रदान करना है जो जेब्राफिश भ्रूण ज़ेनोग्राफ्ट की स्थापना की प्रारंभिक चुनौतियों को दूर करने में मदद कर सकते हैं।

सेल हैंडलिंग पूर्व इंजेक्शन
सेल लाइनों के साथ जेब्राफिश क्सेनोग्राफ्ट की पीढ़ी के लिए इस अनुकूलित प्रोटोकॉल को विभिन्न प्रकार के (कैंसर) कोशिकाओं के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। हम अनुशंसा करते हैं कि जेब्राफिश ज़ेनोग्राफ्ट के लिए उपयोग की जाने वाली सभी सेल लाइनें माइकोप्लाज्मा मुक्त हैं। अन्य जीवाणु संदूषणों के विपरीत, कोशिका संस्कृति में माइकोप्लाज्मा की उपस्थिति ऐसे परिवर्तन उत्पन्न नहीं करती है जिन्हें माइक्रोस्कोप22के तहत आसानी से पता लगाया जा सकता है। माइकोप्लाज्मा संदूषण सेल लाइनों की एनग्रफ्टमेंट क्षमता, दवाओं के प्रति उनकी संवेदनशीलता के साथ-साथ जेब्राफिश भ्रूण की व्यवहार्यता को प्रभावित कर सकता है।

हालांकि कोशिकाओं को एक विस्तारित अवधि के लिए पैदा करने के लिए जारी रख सकते हैं, उनके फेनोटाइप और जीनोटाइप परिवर्तन के लिए प्रवण हो सकता है । संस्कृति में कोशिका रेखाओं के आकृति विज्ञान और व्यवहार से परिचित होना महत्वपूर्ण है। हम प्रजनन योग्य परिणाम प्राप्त करने के लिए 3-12 के बीच विगलन के बाद सेल मार्ग की संख्या रखने की सलाह देते हैं। इस प्रकार, नियमित माइकोप्लाज्मा परीक्षण किया जाना चाहिए।

कोशिकाओं को अपने लॉग चरण में होना चाहिए (संगम तक पहुंचने से पहले घातीय विकास चरण ~ 70%) इंजेक्शन के दिन। यह ट्यूमर की विशिष्ट पहचान का पर्याप्त एनग्रेफ्टमेंट और उचित विकास कर सकेगा। ज़ेनोबेड़ा के भीतर कोशिकाओं के फेनोटाइप में भिन्नता को रोकने के लिए, प्रयोगों के बीच निरंतर इंजेक्शन के लिए संगम को बनाए रखना महत्वपूर्ण है। इंजेक्शन कोशिकाओं की संख्या प्रत्येक सेल लाइन की विशेषताओं के लिए अनुकूलित किया जा सकता है के रूप में कुछ इंजेक्शन के उच्च घनत्व की आवश्यकता हो सकती है ताकि जेब्राफिश भ्रूण में पनपे ।

सेल लेबलिंग विचार
इंजेक्शन और भविष्य के विश्लेषण के लिए मानव ट्यूमर कोशिकाओं की बेहतर कल्पना करने के लिए, ट्यूमर कोशिकाओं को फ्लोरोसेंट रंगों के साथ लेबल किया जा सकता है। सेलुलर आकार में अंतर के कारण, अनुयायी संस्कृतियों में कोशिकाओं/सेमी2 की कुल संख्या कोशिका लाइनों के बीच भिन्न होती है । यह धुंधला प्रोटोकॉल की प्रभावकारिता के साथ-साथ इंजेक्शन के लिए काटी गई कोशिकाओं की संख्या को प्रभावित करेगा। बड़ी कोशिकाएं जो प्रति फ्लास्क (यानी Hs578T) कम संख्या में पैदा होती हैं या क्लस्टर (यानी, BFTC905) में बढ़ती हैं, उन्हें एक ही प्रयोग के लिए कई फ्लास्क की पूलिंग की आवश्यकता होगी । इस मामले में, कोशिकाओं के धुंधला सीधे फ्लास्क में प्रदर्शन नहीं किया जाना चाहिए क्योंकि इससे डाई (उच्च लागत) की अत्यधिक मात्रा का उपयोग होगा। दूसरी ओर, कोशिकाएं जो अपकेंद्रित्र के अत्यधिक चक्रों के प्रति अत्यधिक संवेदनशील होती हैं और साथ ही उन लोगों को जो प्रति फ्लास्क (यानी, एचसीटी 116) उच्च संख्या में पैदा होती हैं, सीधे फ्लास्क में दाग दी जा सकती हैं और फिर EDTA/सेल स्क्रैपर के साथ अलग हो सकती हैं (अधिक जानकारी के लिए तालिका 1देखें)।

जब भी संभव हो, एंजाइमेटिक दृष्टिकोण का उपयोग करने के बजाय, इंजेक्शन के दिन कोशिकाओं को अलग करने के लिए ईडीटीए का उपयोग करें, ताकि कोशिकाएं अपने सेल-सेल जंक्शनों को अधिक तेजी से ठीक करें और कम अपकेंद्रित्र चरणों के अधीन हों। फिर भी, यदि कोशिकाएं EDTA के प्रति संवेदनशील हैं, तो बहुत अनुयायी या समूहों में वृद्धि होती है - एक एंजाइमेटिक विधि लागू की जा सकती है। इंजेक्शन के साथ-साथ इंजेक्शन माध्यम के लिए आदर्श एकाग्रता का अनुकूलन प्रत्येक सेल लाइन की विशेषताओं पर निर्भर है, इस प्रकार इसे कुछ समायोजन(तालिका 1)की आवश्यकता हो सकती है।

माइक्रोइंजेक्शन अंशांकन
जेब्राफिश भ्रूण में ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स या दवाओं के वितरण के विपरीत, ज़ेनोग्राफ के लिए सेल लाइनों के साथ काम करते समय सुई को कैलिब्रेट करने के लिए एक ग्रेटिकल का उपयोग नहीं किया जाता है। इंजेक्शन के दौरान कुछ समय बाद, कोशिकाएं रोकना शुरू कर देंगी, और इसके व्यास को बढ़ाने या सुई को पूरी तरह बदलने के लिए सुई की नोक को काटना आवश्यक है। यह प्रक्रिया ग्रेटिकल कैलिब्रेशन में बाधा डालती है।

इस समस्या को हल करने के लिए, तिरस्कृत कोशिकाओं की संख्या को 1-3 दालों के भीतर भ्रूण आंख के समान आकार तक पहुंचने के लिए आवश्यक दबाव और समय को बाहर निकालने के द्वारा विनियमित किया जाता है। फिर, ट्यूमर के आकार को और नियंत्रित करने के लिए, 1 डीपीआई पर, जेनोग्राफ्ट को ट्यूमर के आकार के अनुसार हल किया जाता है जैसा कि चित्र 6 बी-बीमें दिखाया गया है। जैसा कि चित्रा 6C उदाहरण में दर्शाया गया है, छंटाई की यह विधि ट्यूमर के आकार की भिन्नता को कम करने में कुशल है: यदि हम उन सभी को एक साथ पूल करते हैं (+, ++, +++++ एसटीईवी + वर्ग (~ 906 कोशिकाओं से ~ 422 कोशिकाओं) का ~ दोगुना है और गुणांक भिन्नता + + वर्ग में 14,5% की तुलना में ~ 31.9% है। चूंकि इंजेक्शन के लिए संदर्भ मात्रा है, कोशिकाओं की कुल संख्या कोशिका प्रकारों के बीच बहुत भिन्न होती है - कोशिकाओं के आकार और आकार पर निर्भर होना। उदाहरण के लिए, स्तन कैंसर Hs578T जैसे बहुत सारे साइटोप्लाज्म वाली बड़ी कोशिकाएं, बहुत छोटे ट्यूमर (~ 600 कोशिकाओं) का उत्पादन करती हैं। इसके अलावा, प्रत्येक सेल लाइन कोशिकाओं की अलग-अलग संख्या की आवश्यकता होती है। उदाहरण के लिए, HT29 सीआरसी और RT112 मूत्राशय कैंसर सेल लाइनों से पता चला है कि कोशिकाओं की संख्या अधिक इंजेक्शन, जेब्राफिश मृत्यु दर अधिक है । इसलिए, यदि कोशिका रेखा भ्रूण में विषाक्त प्रभाव पड़ता है या इंजेक्शन के उच्च/कम घनत्व की आवश्यकता होती है तो परीक्षण करने के लिए ज़ेनोग्रफ्ट विकसित करते समय अनुकूलन की अवधि की आवश्यकता होती है।

इंजेक्शन साइट
ज़ेब्राफ़िश भ्रूण ज़ेनोग्राफ़ पैदा करते समय सबसे आम विसंगतियों में से एक इंजेक्शन की साइट है। जर्दी आमतौर पर अपनी आसान पहुंच के कारण इंजेक्शन के लिए पसंद की जगह है। हालांकि, हमने देखा है कि जर्दी में इंजेक्ट की गई कोशिकाओं में मरने की प्रवृत्ति अधिक होती है । हालांकि तकनीकी रूप से अधिक कठिन है, हम पीवीएस में इंजेक्शन और जहां तक संभव हो दिल से सलाह देते हैं। पीवीएस के भीतर, कोशिकाएं कुल, जहाजों और प्रतिरक्षा कोशिकाओं की भर्ती कर सकती हैं, और यदि मेटास्टैटिक विशेषताओंकोप्रदर्शित करती हैं, तो इंट्रावेट, एक्सट्रावेट और फॉर्म माइक्रोमेटास्टेसिस स्थानांतरित करसकतीहैं।

एनग्रफ्टमेंट दक्षता
4 डीपीआई पर सेल लाइनों के बीच एनग्रफ्टमेंट दक्षता और ट्यूमर के आकार में अंतर बेसल सेल डेथ/सर्वाइवल/प्रसार की अपनी अलग डिग्री के कारण, लेकिन यह भी जन्मजात इम्यूनोजेनिसिटी के कारण उम्मीद है कि प्रत्येक सेल लाइन9प्रदर्शित कर सकती है ।

मेटास्टेसिस
मेटास्टेसिस में घटनाओं का एक बहुस्टेप झरना शामिल है जिसे दो मनमाने चरणों में विभाजित किया जा सकता है। पहले चरण में, ट्यूमर कोशिकाओं को प्राथमिक स्थल से अलग करना पड़ता है, आसन्न ऊतकों को स्थानांतरित करना और आक्रमण करना होता है और फिर खून में बदलना पड़ता है। दूसरे चरण में, ट्यूमर कोशिकाओं को परिसंचरण में जीवित रहना चाहिए, रक्त या लसीका जहाजों से अतिव्यवसंवणित करना चाहिए, और अंत में माध्यमिक साइटों पर उपनिवेश23। इन शुरुआती और देर से घटनाओं के बीच अंतर करने और इन चरणों को करने के लिए विभिन्न ट्यूमर कोशिकाओं की क्षमता/प्रवीणता को संबोधित करने के लिए, हमने एक सरल परख तैयार की ।

सामान्य तौर पर, जब पीवीएस में इंजेक्शन दिया जाता है, तो ट्यूमर कोशिकाएं सीधे परिसंचरण में प्रवेश कर सकती हैं और फिर शारीरिक रूप से कौडल हेमेटोपोइटिक ऊतक (सीएचटी) (पूंछ क्षेत्र) में फंस जाती हैं। हालांकि, प्रत्येक ट्यूमर सेल की विशेषताओं के अनुसार - हमने देखा है कि कुछ ट्यूमर कोशिकाएं सीएचटी 4 डीपीआई पर रहती हैं और माइक्रोमेटास्टेसिस बनाने में सक्षम होती हैं जबकि अन्य ट्यूमर कोशिकाएं गायब हो जाती हैं (सीएचटी में पकड़े जाने के बाद मंजूरी दे दी गई)।

इसलिए, माइक्रोमेटास्टेसिस दक्षता (4 डीपीआई पर) की तुलना करके जब कोशिकाओं को सीधे परिसंचरण में रखा गया था - सीआईआरसी (कोशिकाओं को केवल मेटास्टेसिस के देर से चरणों के माध्यम से जाना पड़ता है) बनाम जब नहीं - कोई सीआईआरसी (कोशिकाओं को माइक्रोमेटास्टेसिस बनाने में सक्षम होने के लिए जल्दी और देर से कदम उठाने की आवश्यकता होती है) हम उनकी शुरुआती या देर से मेटास्टैटिक क्षमता का आकलन कर सकते हैं। हमने ट्यूमर कोशिकाओं को देखा है जो दोनों समूहों (सीआईआरसी और एनईआरसी) में सीएचटी में माइक्रोमेटास्टेसिस को कुशलतापूर्वक बना सकते हैं, सुझाव देते हैं कि इन कोशिकाओं में मेटास्टैटिक झरना (SW480 और एमडीए-एमबी-468 उदाहरण के लिए)8,11के सभी चरणों से गुजरने की क्षमता है। इसके विपरीत, अन्य ट्यूमर कोशिकाओं में दोनों समूहों में बहुत कम मेटास्टैटिक क्षमता होती है, शायद ही कभी माइक्रोमेटास्टेसिस बनाते हैं, यहां तक कि जब संचलन में इंजेक्ट किया जाता है (यानी, 24 एचपीआई में सीएचटी में दिखाई देता है, लेकिन 4 डीपीआई में वे अब वहां नहीं हैं, उदाहरण के लिए Hs578T)8। हालांकि, हमें स्पष्ट रूप से एक और समूह मिला है - एक जो केवल परिसंचरण में इंजेक्शन होने पर माइक्रोमेटासिस बनाने में सक्षम है (हम केवल सीआईआरसी समूह में माइक्रोमेटास्टेसिस का निरीक्षण कर सकते हैं)। इससे पता चलता है कि मेटास्टैटिक झरना के पहले चरणों को करने में इन कोशिकाओं की दक्षता कम होती है लेकिन दूसरी ओर परिसंचरण में जीवित रहने, अतिवेवण और एक दूर की साइट उपनिवेश करने में सक्षम हैं।

इम्यूनोदाता और इमेजिंग
निर्धारण से पहले, इस इंजेक्शन प्रोटोकॉल का उपयोग लाइव अंतर हस्तक्षेप कंट्रास्ट (डीआईसी) माइक्रोस्कोपी, कताई डिस्क माइक्रोस्कोपी, हाई-रेजोल्यूशन लाइव कॉन्फोकल इमेजिंग और लाइट शीट माइक्रोस्कोपी आदि जैसे अन्य लाइव इमेजिंग दृष्टिकोणों के लिए किया जा सकता है।

फ्लोरोसेंट स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के माध्यम से मनाए जाने पर मृत कोशिकाएं और सेलुलर मलबे उज्ज्वल दिखाई देते हैं और जीवित कोशिकाओं के लिए गलत हो सकते हैं, खासकर यदि अध्ययन का उद्देश्य कोशिका रेखाओं की मेटास्टैटिक क्षमता का आकलन कर रहा है। हम ट्यूमर और माइक्रोमेटास्टेसिस के अस्तित्व की स्थिति का आकलन करने के लिए विशिष्ट व्यवहार्यता मार्कर और DAPI के साथ कॉन्फोकल इमेजिंग प्रदर्शन के महत्व पर जोर देना चाहते हैं। इसके अलावा, मानव विरोधी माइटोकॉन्ड्रिया या मानव विरोधी एचएलए जैसी मानव कोशिकाओं का पता लगाने के लिए विशिष्ट मानव एंटीबॉडी का उपयोग करना मौलिक है। प्रोटोकॉल को लागू करते समय, कॉन्फोकल छवियों के साथ स्टीरियोमाइक्रोस्कोप में धुंधला की तुलना करके प्रयोगकर्ता आंखों को प्रशिक्षित करें। कुछ समय बाद, प्रयोगकर्ता फ्लोरोसेंट स्टीरियोमाइक्रोस्कोप में जीवित कोशिकाओं से मलबे को स्पष्ट रूप से अलग कर सकते हैं।

यद्यपि ट्यूमर के बोझ जैसे पूरे फ्लोरेसेंस क्षेत्र को व्यापक रूप से निर्धारित करने के अन्य तरीकों का व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है, हम पूरे माउंट इम्यूनोदाता और कॉन्फोकल इमेजिंग को अधिक सटीक विधि के रूप में प्रदर्शन करने की सलाह देते हैं। न केवल लिपोफिलिक डाई धुंधला की दक्षता बहुत चर है (यानी, कुछ कोशिकाएं बहुत अच्छी तरह से दाग रही हैं जबकि अन्य नहीं हैं - शायद उनकी झिल्ली की लिपिड सामग्री के कारण), लेकिन कई बार लिपोफिलिक रंग भी एकत्रित होते हैं, और मृत कोशिकाएं उज्जवल होती हैं - कई कलाकृतियों का निर्माण करना जो जीवित कोशिकाओं के लिए गलत हो सकते हैं।

कोशिकाओं को फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ स्थानांतरित किया जा सकता है ताकि वे अपनी ट्रैकिंग में सहायता कर सकें और सेल लेबलिंग को छोड़ सकें । हालांकि, सुनिश्चित करें कि ट्रांसड्यूडेड और गैर-ट्रांसड्यूड कोशिकाएं जेब्राफिश ज़ेनोग्राफ्ट में समान परिणाम उत्पन्न करती हैं।

इसके अलावा, मैक्रोफेज इन फ्लोरोसेंट सेल मलबे को फ्लोरोसेंट रूप से लेबल और माइग्रेट कर सकते हैं, जिससे झूठी सकारात्मक मेटास्टैटिक कोशिकाएं उत्पन्न होती हैं। इस प्रकार, हम विश्लेषणात्मक उपकरणों की एक श्रृंखला की सलाह देते हैं, जिसे निश्चित रूप से ट्यूमर व्यवहार की अधिक सटीक व्याख्या के लिए कई अन्य readouts तक बढ़ाया जा सकता है:

  • प्रसार - DAPI या विरोधी pHH3Ser10 एंटीबॉडी (मर्क मिलिपोर बिल्ली #06-570) के साथ मिटोटिक आंकड़ों का मात्राकरण,
  • एपोप्टोसिस द्वारा सेल डेथ- एंटीबॉडी एंटी-एक्टिवेटेड Caspase3Asp175 (सेल सिग्नलिंग टेक्नोलॉजीज कैट #9661) या समकक्ष,
  • ट्यूमर का आकार - DAPI गिनती - मानव ट्यूमर कोशिकाओं को एक बहुत ही अलग क्रोमेटिन संगठन दिखाते हैं, इसलिए वे आसानी से जेब्राफिश कोशिकाओं से प्रतिष्ठित होते हैं और डाई के साथ दोहरी जांच करना हमेशा संभव होता है (जब आप अपनी आंख को प्रशिक्षित कर रहे हैं),
  • मेटास्टैटिक अध्ययन के लिए,स्पष्ट रूप से मानव कोशिकाओं का पता लगाने के लिए, - मानव विरोधी एचएलए (एबीसीएम ईपी1395वाई कैट. #ab52922), मानव विरोधी माइटोकॉन्ड्रिया (मर्क मिलिपोर कैट। #MAB1273- क्लोन 113-1)।

नियंत्रण कैंसर कोशिकाओं HCT116 (व्यास के 10-12 माइक्रोन के औसत परमाणु आकार) के जेड-स्टैक में स्लाइस के बीच 5 माइक्रोन अंतराल के साथ एक कॉन्फोकल अधिग्रहण के लिए, हमने देखा है कि ~ 50% कोशिकाओं को लगातार दो स्लाइस के बीच साझा किया जाता है। इसलिए, यदि हर टुकड़ा गिना जाता है, तो एक ही कोशिकाओं को दो बार गिनने का खतरा अधिक होता है। मात्राकरण में समस्याओं से बचने के लिए स्लाइस के बीच आगे-पीछे जा रहे हैं, जिसके परिणामस्वरूप समय लेने वाली और त्रुटि प्रवण तकनीक होती है। कोशिकाओं की कुल संख्या की मात्रा को कम करने और शोधकर्ताओं के बीच अधिक प्रजनन क्षमता के लिए अनुमति देने के लिए, हमने पहले इस प्रोटोकॉल8में वर्णित ट्यूमर आकार फार्मूला बनाया।

हमने स्लाइस के बीच साझा ~ 50% कोशिकाओं के लिए खाते में एक सुधार संख्या (1.5) शामिल किया। हमने पाया कि शोधकर्ताओं के बीच पूरे ट्यूमर की मैनुअल गिनती की औसत त्रुटि 20% थी । सूत्र का उपयोग कर दो शोधकर्ताओं में 2% त्रुटि थी। इस फॉर्मूले के इस्तेमाल में 93% सटीकता दर और 98% प्रजनन दर है। हमने स्वचालित तरीकों का भी परीक्षण किया, लेकिन उन्होंने थ्रेसहोल्ड सेटिंग्स के कारण 50% से अधिक त्रुटि का प्रदर्शन किया।

एपोप्टोटिक कोशिकाओं की विशेषताओं के कारण, सक्रिय कैस्पाज़ 3 कोशिकाओं का मात्राकरण अधिक कठिन है। गलतियों की संख्या और परिणामों में भिन्नता को कम करने के लिए, हम अनुशंसा करते हैं कि नियंत्रण और प्रयोगात्मक नमूनों को एक ही शोधकर्ता द्वारा गिना जाता है। इसके अतिरिक्त, जब इस तकनीक को सीखने, एक नए शोधकर्ता छवियों है कि पहले से ही अधिक अनुभवी शोधकर्ताओं द्वारा मात्रा निर्धारित करने के लिए परिणाम और ट्रेन की तुलना में गिनती चाहिए ।

जरूरत पड़ने पर परख की लंबाई बढ़ाई जा सकती है। हालांकि, यह विचार करना महत्वपूर्ण है कि जेब्राफिश लार्वा को निषेचन के बाद ~ 7 दिनों (इंजेक्शन के बाद) से शुरू लाइव फीडिंग की आवश्यकता होती है। इसके अतिरिक्त, निषेचन के बाद 6 दिनों से पुराने लार्वा पर लागू पशु कल्याण दिशानिर्देश और विनियम भिन्न हो सकते हैं।

यह प्रोटोकॉल एक एकल शोधकर्ता को प्रति घंटे लगभग ~ 200-300 जेब्राफिश लार्वा इंजेक्ट करने में सक्षम बनाने के लिए उपयोगी उपकरण प्रदान करता है; और विश्लेषण और सांख्यिकीय व्याख्या सहित पूर्ण परख के लिए परिणाम, तीन सप्ताह में प्राप्त की । हमें उम्मीद है कि यह प्रोटोकॉल शोधकर्ताओं को जेब्राफिश ज़ेनोबेड़ा पैदा करने में विशेषज्ञ बनने में मदद कर सकता है। यह आसान नहीं है; आप अभ्यास करने की जरूरत है, लेकिन आप वहां मिल जाएगा । शुभकामनाएँ!

Disclosures

कोई नहीं

Acknowledgments

हम चंपालिमौद फाउंडेशन, Congento (LISBOA-01-0145-FEDER-022170, सह एफसीटी द्वारा वित्त पोषित/Lisboa2020) के वित्तपोषण के लिए धन्यवाद । वीपी के लिए एफसीटी फैलोशिप (एसएफआरएच/बीडी/118252/2016), एमएमएल (पीडी/बीडी/138203/2018) । महत्वपूर्ण चर्चाओं के लिए फियोर लैब के सभी सदस्य; डेटा साझा करने के लिए बी कोस्टा और सी रेरेलो डी अल्मेडा; और हमारे लैब सदस्यों सी रेरेलो डी अल्मेडा, एम बरासो और एल Leite वीडियो में उनकी भागीदारी के लिए । हम सीएफ फिश फैसिलिटी (सी सेर्टल, जे मोंटेरो एट अल) और चंपालिमौद कम्युनिकेशन, इवेंट्स एंड आउटरीच टीम को शानदार फिल्म मेकिंग और कातारीना रामोस और टेरेसा फर्नांडिस को उनकी मदद के लिए धन्यवाद देना चाहेंगे ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar for bacteriology VWR 97064-336 Agar plate
anti-Caspase3Asp175 (Rabbit monoclonal) Cell Signalling Technologies 9661 Primary antibody for whole mount immuno staining (Dilution 1:100)
anti-human HLA (Rabbit monoclonal) Abcam EP1395Y ab52922 Primary antibody for whole mount immuno staining (Dilution 1:100)
anti- 488 (Rabbit monoclonal) ThermoFisher Scientific 35552 Secondary antibody for whole mount immuno staining (Dilution 1:200)
anti- 594 (Rabbit monoclonal) ThermoFisher Scientific 35560 Secondary antibody for whole mount immuno staining (Dilution 1:200)
CellTracker Deep Red Dye ThermoFisher Scientific C34565 Lipophilic dye (Dilution 1:1000)
CellTracker Green CMFDA Dye ThermoFisher Scientific C2925 Lipophilic dye (Dilution 1:1000)
Conical Centrifuge tube 50mL VWR 525-0610
Conical Centrifuge tube 15mL VWR 525-0604
DAPI Nuclear and chromosome counterstain
Laser-Based Micropipette Puller P-2000 Sutter-Instrument Micropipette Puller
Microcentrifuge tube 1.5mL Abdos P10202
Microscope slides, cut edge RS France BPB016 Slides for mounting
Mowiol Sigma-Aldrich 81381 Mounting medium
Pneumatic Picopump World Precision Instruments PV820 Microinjector
Rectangular cover glasses, Menzel Gläser ThermoFisher Scientific 631-9430 Coverslips for mounting
SeaKem LE Agarose Lonza 50004 Agar plate
Thin Wall Glass Capillaries World Precision Instruments TW100-4 Borosilicate capillaries
TrypLE Gibco 12605036 Enzymatic detachment solution
Vaseline Petroleum jelly for slide sealing
Vybrant CM-DiI Dye ThermoFisher Scientific V22888 Lipophilic dye (Dilution 1:1000)
Vybrant DiO Cell-Labeling Solution ThermoFisher Scientific V22886 Lipophilic dye (Dilution 1:1000)
ZEISS Axio Zoom.V16 for Biology ZEISS  Fluorescence Stereo Zoom Microscope
Zeiss LSM 710 ZEISS Confocal microscope

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References

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कैंसर अनुसंधान अंक 172
जेब्राफिश लार्वाल Xenografts और ट्यूमर व्यवहार विश्लेषण की पीढ़ी
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Martinez-Lopez, M., Póvoa, V., Fior, R. Generation of Zebrafish Larval Xenografts and Tumor Behavior Analysis. J. Vis. Exp. (172), e62373, doi:10.3791/62373 (2021).

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