Summary
Her tilbyr vi en trinnvis protokoll, med tips for å generere xenografter og retningslinjer for tumoradferdsanalyse, helmontert immunfluorescens og konfokal bilde kvantifisering.
Abstract
Zebrafish larval xenografts blir mye brukt til kreftforskning for å utføre in vivo og sanntidsstudier av human kreft. Muligheten for raskt å visualisere responsen på antikreftbehandlinger (kjemo, strålebehandling og biologisk), angiogenese og metastase med enkeltcelleoppløsning, plasserer sebrafisk xenograftmodellen som et toppvalg for å utvikle prekliniske studier.
Sebrafisk larval xenograft analysen presenterer flere eksperimentelle fordeler sammenlignet med andre modeller, men sannsynligvis er den mest slående reduksjonen av størrelsesskala og dermed tid. Denne reduksjonen av skala tillater enkeltcelleavbildning, bruk av et relativt lavt antall menneskelige celler (kompatibel med biopsier), middels høy-gjennomstrømning narkotika screenings, men viktigst av alt muliggjør en betydelig reduksjon av tiden av analysen. Alle disse fordelene gjør sebrafisk xenograftanalysen ekstremt attraktiv for fremtidige personlige medisinapplikasjoner.
Mange sebrafisk xenograft protokoller har blitt utviklet med et bredt mangfold av menneskelige svulster; Imidlertid mangler fortsatt en generell og standardisert protokoll for effektivt å generere sebrafisk larval xenografts. Her tilbyr vi en trinnvis protokoll, med tips for å generere xenografter og retningslinjer for tumoradferdsanalyse, helmontert immunfluorescens og konfokal bilde kvantifisering.
Introduction
Sebrafisk (Danio rerio) dukker opp som en kraftig virveldyrmodellorganisme for å studere utvikling og sykdom. Sebrafisk deler svært konservert genetisk (~ 70% genetisk homologi og ~ 84% sykdomsrelaterte gener) og grunnleggende organmorfologiske egenskaper med mennesker1,2. Denne bevaringen tillater bruk av sebrafisk for å modellere flere menneskelige sykdommer, inkludert kreft3,4.
Håndtering og vedlikehold av sebrafisk er mye enklere og mer kostnadseffektivt enn mus på grunn av deres lille størrelse, høy fecundity hele året og ekstern befruktning3,5. Sebrafisk embryoer krever ikke levende fôring i løpet av de første 5-7 dagene av livet og har blitt brukt som en effektiv modell for utvikling, infeksjon og kreft1,4,6,7. Sebrafisk embryoer klekkes på 48 timer etter befruktning (hpf) og er frittsvømmende dyr med alle organer dannet, et bankende hjerte og funksjonelt sirkulasjonssystem, lever, hjerne, nyremarg, etc.1,3. Også på dette utviklingsstadiet er bare medfødt immunitet i spill, adaptiv immunitet utvikler seg fortsatt, noe som gir en generell effektiv engraftment av menneskelige celler uten behov for bruk av immunkompromitterte mutanter7,8. Likevel er det viktig å merke seg at ikke alle menneskelige celler engraft like9, og at for eksempel for leukemiceller ble det vist at fagocytter (nøytrofiler og makrofager) må tømmes for effektiv engraftment10.
Sebrafiskgenetisk tractability og den optiske gjennomsiktigheten av sine tidlige embryonale stadier tillater enkeltcellet intravital avbildning med høy oppløsning og dermed for etablering av toppmoderne bildeteknikker innen ulike biologiområder. Videre, i sammenheng med kreft, er disse funksjonene nyttige for sanntidsstudier av de tidligste stadiene av vertssvulstinteraksjoner, som å studere angiogent og metastatisk potensial, samt interaksjoner med det medfødte immunforsvaret8,9,11,12,13.
Selv om det i den korte xenograftanalysen ikke er tid for metastatisk "evolusjon"- er det mulig å analysere tumorcellenes metastatiske kapasitet (dvs. deres effektivitet til å gå gjennom metastatiske trinn som invasjon, intravasasjon, overlevelse i omløp, ekstravasasjon og kolonisering, og derfor studere disse prosessene in vivo og i sanntid8,11,13,14).
Egenskapene til livssyklusen plasserer sebrafisken som en unik modell for personlig medisin i kreft. Analyser kan utføres i et kortere tidsrom og resultater oppnådd i noen uker7,8,9,11,12,15,16. Celerity og gjennomførbarhet av disse analysene gir leger og forskere muligheten til å oppnå oversettelsesresultater som kan være nyttige for kreftpasienter, for hvem tid er et viktig behov.
Til tross for de økende forsøkene på å generere vellykkede sebrafisk embryo xenografts, er det fortsatt behov for standardisering av injeksjonsprosedyren samt evaluering av celle levedyktighet og tumoradferd etter injeksjon.
I denne protokollen gir vi forskere en klar og detaljert trinnvis guide for injeksjon av menneskelige kreftcellelinjer i sebrafiskembryoer og etterfølgende fiksering, immunsitting, avbildning og kvantifisering av tumorcelleadferd.
Protocol
Sebrafiskmodellen(Danio rerio) ble håndtert og vedlikeholdt i henhold til standardprotokollene i den europeiske dyrevelferdslovgivningen, direktiv 2010/63/EU (Europakommisjonen, 2016) og Champalimaud fiskeplattform. Alle protokollene ble godkjent av Champalimaud Animal Ethical Committee og portugisiske institusjonelle organisasjoner-ORBEA (Órgão de Bem-Estar e Ética Animal/Animal Welfare and Ethics Body) og DGAV (Direção Geral de Alimentação e Veterinária/Directorate General for Food and Veterinary).
MERK: Før du starter hovedeksperimentet, må du øve deg med cellelinjen HCT116 (Human Colorectal Cancer). Denne cellelinjen er lett å forberede (svært proliferativ), lett å injisere og engrafts veldig effektivt (rundt 95-100%). Start med celler i overkant (~ 12x106 celler, T-75 kolbe) og overflødig fisk (400 fisk) til de blir dyktige i teknikken, siden mange celler og fisk vil gå tapt under trening. Eksperimentere er klare når engraftmentet på ~ 95% er oppnådd i HCT116 xenografts. Se figur 1 hvis du vil ha et skjema for hele protokollen.
1. Oppsett for injeksjon
- To uker før injeksjon utvider du celler i kultur (se tabell 1 for en detaljert veiledning av optimal in vitro-sammenløp for injeksjon av flere cellelinjer).
- Tre dager før injeksjonen, kryss sebrafisken av ønsket bakgrunn.
2. 24 timer før injeksjon
- Rengjør sebrafisk embryoplatene (kast bort alle døde og ikke-utviklede embryoer) og oppdater E3-mediet.
- I cellekulturrommet, kast cellekulturmediet fra kolber planlagt for injeksjon, vask en gang med 1x fosfatbufret saltvann (PBS) for å fjerne døde celler og legge til friskt medium.
- Forbered verktøyene for injeksjonsprosedyren, for eksempel: mikroinjeksjonsnåler, agaroseplater og hårnåler for å justere embryoer for injeksjon (Figur 2A-D, detaljert nedenfor).
- Mikroinjeksjonsnåler (Figur 2A)
- Bruk borosilikatglass kapillærer (4 tommer, OD 1,0 mm, Ingen filament i en mikropipettetrekker (varme: ≈500; fil: 10; vel: 50; fell: 60; trekk: 100).
- Plateforberedelse (Figur 2B)
- Forbered 2% agarose i H2O, varm den opp og hell ett lag oppløst agarose i lokket på en ren Petri-tallerken. La det polymerisere og ved hjelp av en linjal, lag tre til fire rette agarose linjer for justering av embryoene.
- Hårnålsenhet (figur 2C-D)
- Plasser 1 hår inne i et glasskapillært rør som etterlater ca. 1 centimeter hår utenfor røret.
- Krøll den ytre spissen av håret ved hjelp av tang i glasskapillærrøret som danner en løkke på ~ 0,5 mm lengde.
- Forsegle kanten på kapillærrøret med en dråpe neglelakk. Dette vil også bidra til å fikse løkken på plass. La det tørke. Gjenta prosedyren på den andre kanten av røret.
- Klipp et stykke elektrisk tape (mer motstandsdyktig, ugjennomtrengelig og stiv enn vanlig tape).
- Forsegle båndet rundt kapillæren for å beskytte den mot brudd.
- Mikroinjeksjonsnåler (Figur 2A)
3. Injeksjonsdag
- Skill de klekkede embryoene fra unhatched egg. Tilsetning av 1x pronase (0,6 mg/ml, tabell 3) til embryomediet på dette stadiet kan øke klekkingen. Plasser embryoene i inkubatoren (ved 28 °C) til injeksjon.
MERK: Ikke la embryoene ligge i pronaseoppløsningen i mer enn 1 time, siden enzymet vil virke på de klekkede embryoene og øke risikoen for dødelighet. Påse at embryoets utviklingsstadium er det som tilsvarer 48 hkf (figur 3A, A') for å unngå risiko for ødem og dødelighet. - Forbered 1x Tricaine (fra en 25x lager).
MERK: En detaljert oppskrift finner du i tabell 3 og på Zebrafish Information Network - ZFIN nettside17.
4. Cellemerking for injeksjon
MERK: Merking av celler kan utføres enten direkte i en kolbe eller i et 1,5 ml mikrosenterrør etter enzymatisk løsrivelse. Se Diskusjon hvis du vil ha mer informasjon.
- Fjern cellekulturmediet og vask kolben to ganger (2x) med 1X PBS.
- Merk cellene med et lipofilt fargestoff av valg enten direkte i kolben (2 ml oppløsning / T75 kolbe) eller i et 1,5 ml mikrosenterrør etter enzymatisk løsrivelse. Unngå eksponering for lys og inkuber celler ved 37 °C (se tabell 1 og tabell 2 for forhold/løsninger).
- Hvis merking i kolben
- Fjern fargestoffet, vask med 1x PBS og løsne cellene med EDTA og en celleskraper.
- Overfør celler til 1,5 ml mikrosenterrør. Sentrifuge i 5 minutter ved 300 x g, og gå deretter til trinn 4.5.
- Hvis merking i 1,5 ml mikrosenterrør:
- Sentrifuge 5 minutter ved 300 x g for å fjerne fargestoffet og kaste supernatanten. Resuspend i 1x PBS til vask.
- Sentrifuge 5 minutter ved 300 x g og gå deretter til trinn 4.5.
- Kast supernatanten og resuspend pellet med cellekulturmediet (for en 50 μL pellets tilsett ~ 150-200 μL medium).
- Kvantifisere celle levedyktighet ved hjelp av et Neubauer-kammer med Trypan blå ekskludering eller annen metode for valg.
- Sentrifuge i 4 minutter ved 300 x g og kast supernatanten. Resuspend cellene i injeksjonsmediet.
MERK: Anbefalt cellekonsentrasjon (generelt fra 0,25-0,5x106 celler/μL) og medium finnes i tabell 1. - Fra dette tidspunktet og utover, hold cellene på is.
5. Injeksjonsprosedyre
- Bedøv embryoene i 1x Tricaine i 5 minutter.
- Med en pasteurpipette i plast overfører du en liten mengde (~50) bedøvede embryoer til agaroseplaten og justerer dem forsiktig ved hjelp av en hårnålssløyfe. Sørg for å opprettholde avstanden mellom embryoene, spesielt mellom eggeplommen til en og hodet til den neste (Figur 4A).
MERK: Antall embryoer som skal justeres vil variere i henhold til forskernivået som utfører injeksjonene. Start med noen få (~10-20). For et skjematisk skjema for riktig plassering av embryoene i agar/agaroseplaten, se figur 4A. - Sørg for at de justerte embryoene ikke tørker ut i agaroseplaten for å forhindre dødelighet, ved å forsiktig legge 1-3 dråper 1x Tricaine-løsning til platen.
- Trykk lett på mikrosenterrøret for å resuspendere cellene. Last injeksjonsnålen tilbake med cellefjæringen ved hjelp av en mikroloaderspiss som unngår luftbobler, da de kan kompromittere embryoenes integritet.
- Åpne lufttrykkventilen (40 psi), sett opp mikroinjektoren og plasser mikroinjeksjonsnålen forsiktig inn i holderen.
MERK: Bruk følgende anbefalte mikroinjektorinnstillinger: Hold trykket - ventilen (3 psi); Utkast trykk - ventilasjon; Område - 100 ms. - Klipp mikroinjeksjonsnålen nær spissen med Dumont-tang #5 eller lignende under stereomikroskopet.
MERK: Spissen må være stump og tynn nok til at cellene kan passere uten tilstopping, samt for å unngå å skade embryoene og miste celler. En tykk mikroinjeksjon nålespiss vil skade embryoet og fremme dannelsen av ødem eller sebrafiskdød. Graticule brukes ikke til nålkalibrering. Se Diskusjon hvis du vil ha en detaljert forklaring. - Før du injiserer embryoene, test mikroinjektortrykket som starter med det laveste utløsertrykket til i ~ 1-3 pulser oppnås et volum som ligner størrelsen på sebrafiskembryoets øye.
MERK: Bruk av et fluorescenssteremkroroskop når det er mulig i begynnelsen av treningen anbefales. Dette vil tillate en enklere identifisering av fluorescerende merkede celler. - Gjennombor forsiktig midt i embryoets eggeplomme, senk nålens vinkel og skyv forsiktig til nålens spiss når perivitellinerommet (PVS) (Figur 4B-D).
- Trykk på mikroinjektorpedalen og injiser cellene i PVS. Bruk embryoets øye som guide. Prøv å injisere et volum av celler som ligner på størrelsen på embryoets øye og så langt som mulig fra hjertet for å forhindre hjerteødem.
- Fjern nålen forsiktig og gå videre til neste embryo.
- Juster mikroinjektortrykket om nødvendig.
MERK: Celler har en tendens til å begynne å tette, så trykket kan økes. Om nødvendig er det mulig å kutte kapillæren (for å øke diameteren) samtidig som trykket reduseres. - Overfør de injiserte embryoene til en ren Petri-tallerken (Tabell 4) med 1x Tricaine-oppløsning og la dem hvile i 5-10 minutter. Dette vil gi tid til såret å lukke.
MERK: For å overføre embryoene fra agarplaten til Petri-parabolen, legg til noen dråper 1x Tricaine-løsning på toppen av embryoene og samle dem forsiktig med en pasteurpipette i plast. Slipp de innsamlede embryoene i en ny Petri-tallerken med 1x Tricaine-oppløsning. - Fjern 1x Tricaine-oppløsningen og tilsett ferskT E3-medium.
- Inkuber xenograftene ved 34 °C (en kompromittert temperatur mellom overlevelse av menneskelige cellelinjer og sebrafiskutvikling8).
6. Metastatisk analyse
- Ved ca. 1 time etter injeksjon (hpi) kan du screene de injiserte embryoene på et fluorescerende stereomikroskop og sortere xenograftene i 2 grupper, i henhold til fraværet (figur 5A) eller tilstedeværelse (figur 5B) av celler i omløp.
MERK: Selv om bare en kreftcelle oppdages i hjertet eller sirkulasjonen, inkluderer disse xenograftene i gruppen av xenografter med celler i omløp. Alternativt kan celler injiseres direkte i sirkulasjon for å øke antall xenografter i denne gruppen.
7. 1 dag etter injeksjon
- På et fluorescerende stereomikroskop analyserer du forsiktig hvert embryo og velger de med riktig injiserte svulster (figur 6).
MERK: Bedøv om nødvendig de injiserte embryoene med Tricaine 1X-oppløsning før screening. - Kast følgende embryoer/xenografts (Figur 6A-A''):
• uten tumor/unormal morfologi/død,
• med hjerte- og/eller eggeplommeødem,
• med tumorceller bare i eggeplommen,
• med svært få kreftceller. - Sorter utvalgte xenografts i henhold til deres tumorstørrelse. Bruk størrelsen på øyet til sammenligning (Figur 6B-B'', 6C).
• Svulster mindre enn øyets størrelse (+),
• Svulster av samme størrelse som øyet (++),
• Svulster større enn øyets størrelse (+++). - Fordel xenograftene i henhold til ønsket eksperimentell layout og start legemiddelanalysen (kontroll vs legemiddel, etc.). Skift ut legemidlene og E3 middels daglig (Tabell 4).
- Inkuber xenograftene som opprettholder temperaturen på 34 °C til slutten av analysen.
8. 4 dager etter injeksjon
- På den siste dagen av analysen bedøves xenografts med 1x Tricaine-løsning og juster dem forsiktig på agarplaten.
MERK: Kast eventuelle døde eller hovne xenografter. Narkotikabehandlinger og noen tumorceller kan indusere toksisitet og til slutt forårsake xenograft dødelighet. Disse xenograftene vurderes ikke for engraftment-kvantifisering. - For å bestemme prosentandelen av engraftment: på et fluorescerende stereomikroskop analyserer hver levende xenograft og vurderer fraværet (Figur 6D) / tilstedeværelse (Figur 6E) av svulster i PVS.
- For å bestemme prosentandelen av metastase: på et fluorescerende stereomikroskop analysere hver xenograft og vurdere tilstedeværelse / fravær av mikrometastasis i kaudal hematopoietisk vev (CHT) av de 2 tidligere definerte gruppene (CIRC og NO CIRC, figur 6F)
- I henhold til det eksperimentelle oppsettet velger du xenograftene av interesse og euthanize dem med 25x Tricaine (Tabell 3).
- Fest dem i 4% formaldehyd (FA) i minst 4 timer ved romtemperatur (RT) eller over natten ved 4 °C.
MERK: Bruk metanolfri formaldehyd (16 % FA) fortynnet med 4 % i PBS/0,1 % Triton. Fyll rørene til toppen med fikseringsmiddel. Plasser rørene horisontalt for å sikre en homogen fiksering av alle xenografts, øke permeabiliteten og forhindre at sebrafisken samler seg nederst. - Alternativt kan du fikse dem med PIPES (Per 1 ml: 100 μL 1 M PIPES natriumsalt (4 °C); 1 μL 1 M MgSO4 (RT); 4 μL 0,5 M EGTA (RT); 93,7 μL 16 % FA (RT); 801,3 μL ddH2O).
MERK: RØR bevarer fluorescensen til RFP og mCherry transgene linjer bedre enn 4% FA. - Hvis immunostaining vil bli utført på en annen dag, erstatt FA med 100% metanol (MetOH). Xenografts festet i 100% metanol kan lagres ved -20 °C på ubestemt tid.
MERK: MetOH kan svekke effektiviteten til noen flekker (dvs. falloidin) og slukke fluorescerende merking. Bekreft effektiviteten av antistoffene i MetOH faste prøver på forhånd.
9. Helmonteringsimmunisering for konfikal avbildning
MERK: Hele mount immunfluorescence teknikken tar 3 dager delt som følger: Den første dagen er for permeabilisering av xenografts og primære antistoff inkubasjon. Den andre dagen for vask og sekundær antistoffinkubasjon og den tredje dagen for vasking, fiksering av xenografts og lagring i monteringsmediet.
- Dag 1
- Hvis xenograftene ble lagret i 100% MetOH, rehydrer dem med en rekke avtagende MetOH-konsentrasjoner (75%, 50%, 25% MetOH fortynnet i PBS / 0,1% Triton). Hvis den er fast i FA, må du erstatte den med PBS/0,1 % Triton.
- Vask 4x i 5 minutter i PBS/0,1% Triton.
- Vask 1x i 5 minutter i H2O.
MERK: Rørene må alltid plasseres horisontalt i fikserings-, permeabiliserings- og vasketrinn med mindre annet er oppgitt. - Bytt ut H2O for iskald aceton og inkuber ved -20 °C i 7 minutter.
MERK: Plasser et 50 ml rør med aceton ved -20 °C, slik at det er klart til bruk. Mikrosentrifugerør må plasseres vertikalt på et stativ slik at acetonen ikke lekker ut. - Vask 2x i 10 minutter i PBS/0,1%Triton.
- Inkuber med PBDX_GS blokkeringsløsning i 1 time ved RT (PBDX_GS blokkeringsbuffer: 50 ml 1x PBS; 0,5 g bovint serumalbumin - BSA; 0,5 ml DMSO; 250 μL 10% Triton; 750 μL geitserum - GS (15 μL / 1 ml)).
- Fjern PBDX_GS og tilsett ~40 μL primær antistofffortynning (vanligvis 1:100).
MERK: Volumet av den primære antistofffortynning varierer avhengig av antall xenografter som er tilstede i mikrocentrifugerøret. Kontroller at alle xenograftene er nedsenket. - Inkuber i 1 time ved RT og deretter ved 4 °C over natten. Plasser rørene vertikalt.
- Dag 2
- Fjern primær antistoff og vask 2x i 10 minutter i PBS/0,1% Triton.
- Vask 4x i 30 min i PBS/0,05% Tween.
MERK: Følgende trinn må utføres i mørket (bruk aluminiumsfolie for å beskytte rør mot lys). - Fjern PBS/0,05% Tween og tilsett ~50-100 μL sekundær antistofffortynning (vanligvis 1:200 - 1:400) + DAPI (50 μg/ml) fortynnet i PBDX_GS.
- Inkuber i 1 time ved RT og deretter ved 4 °C over natten. Plasser rørene vertikalt og beskytt mot lys.
- Dag 3 (bruk aluminiumsfolie for å beskytte rør mot lys)
- Fjern sekundær antistofffortynning og vask 4x i 15 minutter i PBS/ 0,05% Tween.
- Fest ved romtemperatur i 20 minutter i 4% FA.
- Vask 1x i 5 minutter i PBS/0,05% Tween.
- Fjern PBS/0,05% Tween og tilsett 1 dråpe vandig monteringsmedium til hvert mikrocentrifugerør. Plasser rørene vertikalt.
- Monter eller oppbevar ved 4 °C beskyttet mot lys til montering. Plasser rørene vertikalt.
10. Montering av xenografts
MERK: Beskytt mikrosentrifugerørene mot lyset gjennom hele prosessen. Sebrafisk xenografts er montert mellom 2 deksler (24 x 60 mm # 1,5). Dette gjør det mulig å snu de monterte xenograftene under konfikal avbildning slik at begge sider av svulsten (topp og bunn) er tilgjengelige. Ikke bruk plastpipetter med monteringsmedium - xenograftene kan sette seg fast i pipetten. Se figur 7 for skjematisk representasjon av følgende trinn.
- Merk dekslene Y og forsegle kantene på dekslene X med petroleumjell eller silikonfett for å unngå lekkasje av monteringsmediet.
- Overfør xenografts med en glass Pasteur pipette til coverlip X.
- Juster dem forsiktig etter en hårnål og fjern overflødig vandige monteringsmedier.
- Legg til vandige monteringsmedier på deksler Y.
- Plasser forsiktig dekslene Y på toppen av dekslene på X. Ikke trykk på dekslene, da dette potensielt kan forstyrre xenograftene.
- Plasser de monterte dekslene på toppen av et mikroskop og fest dem med gjennomsiktig tape. Dette gir en enklere manipulering for konfikal avbildning og lagring.
11. Konfekt bildebehandling
MERK: En apochromatisk 25x nedsenking objektiv linse med vannkorreksjon er optimal for avbildning PVS svulster med encellet oppløsning (se figur 8C-C" og figur 9A for eksempel).
- Hent prøver ved hjelp av z-stack-funksjonen med et intervall på 5 μm mellom hver sektor. For bilder som er rettet mot 3D-rekonstruksjon, bruker du i spesielt fartøy et intervall på 1-3 μm mellom skiver (figur 8A).
12. Analyse og kvantifisering
- Bruk FIJI/ImageJ-programvare eller lignende for konfikal bildebehandling og analyse.
- Åpne rådataene (*.czi, .lsm osv.) i FIJI-programvare.
- Hvis du vil merke hele eller bare én enkelt kanal i sammensatt modus, klikker du: Bilde > Farger > kanalverktøy.
- Hvis du vil justere lysstyrke- og kontrastnivåer, klikker du: Bilde > Juster > fargebalanse.
- Å kvantifisere tumorstørrelse
- Velg tre representative skiver av svulsten, fra toppen, midten og bunnen, per z-stabel per xenograft (figur 8 A).
MERK: Konfektoppløsning oppnår ~ 60-70 μm tumordybde. Hvis svulsten er stor, kan det ikke være mulig å bilde det totale volumet. - Åpne et regneark for å sette inn merknader i dataene.
- Tell hver DAPI-kjerne som tilsvarer tumorcellene i de 3 valgte skivene (Figur 8 A, B). Slik gjør du det:
- Åpne plugin-modulen for celleteller fra FIJI/ImageJ ved å klikke Plugins > Analyze > Cell counter.
- Klikk Initialiseri celletellerverktøyet, velg en tellertype, og klikk bildet for å starte tellemodus manuelt. For hvert klikk legger telleren til hvor mange celler som telles (antall klikk).
- Når du har talt ett fullstendig stykke, lagrer du cellenummeret i det tilsvarende Excel-dokumentet.
- Tilbake til Fiji klikker du tilbakestill fra celletellervinduet for å slette informasjonen hvis den samme telleren skal brukes. Ellers kan informasjonen beholdes, og andre tellere kan brukes med andre stykker (eller celler).
- Gå til det andre representative stykket, og gjenta de forrige trinnene. Samle alle data.
MERK: DAPI-tellere brukes vanligvis til å telle celletall på grunn av den klare definisjonen av individuelle celler, men andre cellespesifikke flekker kan brukes.
- For å oppnå totalt antall celler i svulsten, bruk følgende formel:
MERK: Korreksjonsnummeret på 1,5 ble estimert for celler som har en gjennomsnittlig kjernediameter på ~10-12 μm. Denne rettelsen kan trenge justering hvis cellene er større/mindre. Se Dicussion for mer informasjon om denne metoden.
- Velg tre representative skiver av svulsten, fra toppen, midten og bunnen, per z-stabel per xenograft (figur 8 A).
- For å kvantifisere andre markører (immunceller, mititotiske figurer, PPH3, aktivert Caspase3, Ki67, etc.), kvantifisere alle skiver ved hjelp av samme plugin (se figur 8C-C'' for visualisering av mititotiske figurer). Del det totale antallet telte celler med den tilsvarende tumorstørrelsen og multipliser med 100 for å få prosentandelen.
MERK: Pass på at noen celler vil være plassert mellom to skiver, gå frem og tilbake i z-stabelen for å sikre at en celle ikke telles to ganger.
Representative Results
Sebrafisk xenograft som et verktøy for å studere anti-kreft terapier.
HCT116 kolorektal kreftcellelinje ble merket med CM-DiI og injisert i PVS av 2 dager etter befruktning (dpf) embryoer. Etter injeksjon ble xenografts inkubert ved 34 °C, en temperatur som tillater vekst av tumorceller uten at det går ut over sebrafiskutviklingen. Neste dag ble xenografts screenet i henhold til tilstedeværelsen eller fraværet av en tumormasse i PVS (ikke riktig injisert sebrafisk ble kassert og euthanized) (Figur 6A-A''). Xenografts ble gruppert i henhold til deres tumorstørrelse (Figur 6B-B'') og tilfeldig fordelt (i en 6-brønns plate: ~ 12 xenograft per brønn) i ikke-behandlede kontroller og FOLFIRI kjemoterapi (0,18 mM folinsyre, 0,08 mM irinotekan og 4,2 mM fluorouracil (5-FU)).
Kontroll E3 og narkotika ble erstattet daglig, og død sebrafisk ble kassert. 4 dpi, og tre dager etter behandling (dpt), ble engraftmentet kvantifisert som i trinn 8.2 i protokollen. Engraftment betraktes som frekvensen av xenografter som presenterer en tumormasse i PVS ved 4 dpi. For eksempel, hvis det på slutten av eksperimentet er 40 levende larver og 35 av de 40 presenterer en svulst i PVS, er engraftmenthastigheten 87,5%. Xenografts ble euthanized og fast for å evaluere tumorstørrelse og apoptose ved immunfluorescens og konfokal mikroskopi.
Immunfluorescence ble utført for å oppdage apoptotiske celler, ved hjelp av anti-cleaved Caspase 3 antistoff (Asp175) (kanin, 1:100, #CST 9661) og DAPI (50 μg/ml) for nuklei motoppsigelse. Datasett for bildestakk (hver 5um) ble samlet inn i et LSM710 konfokalt mikroskop og dataanalyse utført med FIJI/ImageJ-programvare som forklart i trinn 12. Kvantifisering av mititotisk indeks, apoptose (% av aktivert caspase3) og tumorstørrelse, avdekket at FOLFIRI induserer en signifikant reduksjon av mitose (Mann Whitney Test, P<0.0001) og en signifikant induksjon av apoptose (Mann Whitney test, P<0.0001), ledsaget av en 54% reduksjon av tumorstørrelse (P<0.001) (Figur 8C-E, Figur 9A-E).
Disse funksjonene er nyttige i høy gjennomstrømning fenotypiske narkotika skjermer samt å teste cellen iboende og fysiologiske effekter av flere kreftbehandlinger på kort tid.
Karakterisering av humane sebrafisk xenografter med menneskespesifikke antistoffer
Som i alle xenograftmodeller er det fare for misidentifisering av cellene. For eksempel kan makrofager fagocytose humane kreftceller, bli merket med lipofil fargestoff, og deretter reise langs sebrafiskverten, og dermed kan disse cellene forveksles med tumormikrometastase. Derfor er merking av xenografter med spesifikke menneskelige antistoffer som human hLA, ki-67 eller human mitokondrier (hMITO) avgjørende for innledende karakterisering og også å bli kjent med morfologien til tumorcellene (Figur 9F-I).
Sebrafisk xenograft for å studere cellecelleinteraksjoner.
En annen stor fordel med sebrafisk xenograft-modellen er at det er mulig å studere samspillet mellom forskjellige tumorceller og analysere hvordan hver type celle kan påvirke den andres oppførsel. Ulike humane kreftceller (forskjellige kloner fra samme svulst eller fra forskjellige svulster) kan injiseres samtidig. I dette eksemplet ble to CRC-cellelinjer avledet fra samme pasient merket med forskjellige lipofile fargestoffer og blandet i forholdet 1:1 for injeksjon (Figur 9J-K').
Når du blander menneskelige cellelinjer (for å generere polyklonale svulster) på samme graft, unngå å bruke DiO-fargestoffet, da dette resulterer i ikke-spesifikk dobbel farging (Tabell 2). Bruk i stedet CM-DiI (cellelinje #1) med grønn CMFDA (cellelinje #2) eller CM-DiI (cellelinje #1) med Dyp rød (cellelinje #2) (Tabell 2, Figur 9J-K'), for å få en enkel diskriminering av populasjonene på slutten av eksperimentet. For å kvantifisere frekvensen av hver klone i svulsten, bruk 2 forskjellige tellertyper i FIJI for å identifisere hver klone og deretter dele med det totale cellenummeret (summen av alle kloner) for å få den relative brøkdelen av hver enkelt (%).
Figur 1. Flytskjemaoppsummering av zebrafish xenograft-protokollen Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2. Materialer for sebrafisk embryoinjeksjon: A. Borosilikat nål B. 2% Agarose plate. C Hårnålsløkke D. Fremgangsmåte for å lage en hårnålssløyfe: 1. Plasser 1 hår inne i et glasskapillært rør som etterlater ca. 1 centimeter hår utenfor røret. 2-3. Krøll den utvendige spissen av håret ved hjelp av tang i glasskapillærrøret som danner en løkke på ~ 0,5 mm lengde. 4. Forsegle kanten på kapillærrøret med en dråpe neglelakk. 5-6. Forsegle et stykke elektrisk tape rundt kapillæren for å beskytte den mot brudd. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3. Representative stereomikroskopbilder av sebrafiskembryoer etter 48 timer etter befruktning (48 hkf): A-A'. Normal morfologi av et sebrafiskembryo ved 48 hk utvikling, klar for mikroinjeksjon B-B'. Morfologi av et sebrafiskembryo som ikke har oppnådd tilstrekkelig utviklingsstadium for mikroinjeksjoner ved 48 hkf og presenterer allerede en viss grad av hjerteødem (svart pilspiss) og distended eggeplomme. A' og B' er forstørrelser av henholdsvis A og B. Skalastenger representerer 500 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4. Skjematisk representasjon av sebrafisk mikroinjeksjonsplate satt opp: A. Justering av bedøvede embryoer i 3% Agar / 2% Agarose plate. B. Grafisk representasjon av et 2 dager etter befruktning sebrafisk embryo, med en svart pil som indikerer perivitelline plass (PVS). C og D. Kreftceller kan injiseres med forskjellige vinkler i PVS injisert i perivitellinerommet (PVS) av et 48 timer etter befruktning embryo. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5. Metastatisk analyse. 1 time etter injeksjon (1hpi) injiserte embryoer sorteres i henhold til fraværet (NO_circ) eller tilstedeværelse (CIRC) av tumorceller i omløp. Ved 4 dager etter injeksjon kvantifiseres antall xenografter i begge gruppene som presenterer mikrometastase. Celler i NO_circ gruppen (A) måtte gjennomgå alle de metastatiske trinnene for å kunne danne en mikrometastase, mens celler i CIRC-gruppen (B) bare gjennomgår de siste trinnene i den metastatiske kaskaden. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6. Representative fluorescerende stereomikroskopbilder av xenografts ved 1 dag etter injeksjon og 4 dager etter injeksjon. Humane kreftceller som uttrykker fluorescerende protein TdTomato (rød) ble mikroinjisert i 2 dpf sebrafisk embryoer. Ved 1 dpi, screen de injiserte embryoene og kast de dårlig injiserte eller embryoene med ødem (A-A'') sortere de godt injiserte embryoene i henhold til tumorstørrelser (B-B''). C. Representativ kvantifisering av totalt antall celler tilstede i de forskjellige tumorstørrelseskategoriene ved 1 dpi i SW620 xenografts. Hver prikk representerer en xenograft kvantifisert som forklart i avsnitt 12.At 4 dpi, screen larver og kvantifisere de forskjellige klassene: ingen svulst (D); med svulst i PVS (E) og med mikrometastase i CHT (F). Skalastenger representerer 500 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7. Skjematisk representasjon av xenograftmontering for konfikal avbildning. 1. Eksempel på merking i deksler Y, lyseblå linje i deksler X representerer omkretsen der petroleumjell/silikonfett påføres for å forhindre lekkasje av monteringsmediet. 2. Eksempler på xenograftjustering på coverlip X for konfomisk avbildning. 3. Vandige monteringsmedier (blå pil) brukes til å binde deksler Y på toppen av dekslene X. 4. Eksempel på riktig monterte deksler. 5. Deksler plasseres deretter på toppen av en glasssklie og festes med gjennomsiktig tape. 6. Monterte xenografter klare for konfektavbildning. Opprettet med BioRender.com Klikk her for å se en større versjon av denne illustrasjonen.
Figur 8. Visuell representasjon av konfikalt mikroskopbilde kvantifisering av tumorstørrelse. Konfokale bilder av en HCT116 xenograft ved 4 dager etter injeksjon A. Serie med z-stack-stykker i DAPI-kanalen som er anskaffet med et intervall på 5 μm. Røde stiplede linjer sirkler rundt de tre representative stykkene som brukes til celletelling. B. Illustrasjon av DAPI nuclei kvantifisering med Cell Counter Plugin i ImageJ / Fiji programvare. C-E. Eksempel på enkeltcelleoppløsning i svulsten der det er mulig å visualisere/kvantifisere mititotiske figurer i DAPI eller bruke et fosfo-histon H3 antistoff (grønt). D og E er forstørrelser av C. Skalastenger representerer 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 9. Representative resultater. A-E. HCT116 kolorektal kreftcellelinje ble merket med Vybrant CM-DiI og injisert i PVS på 2 dager etter befruktning (dpf) embryoer. Etter injeksjon ble xenografts inkubert ved 34 °C. Ved 1 ppt ble xenografts screenet og tilfeldig fordelt i ikke-behandlede kontroller og FOLFIRI, behandlet i 3 påfølgende dager og fikset ved 4 dpi. A. Immunfluorescence ble utført for å oppdage apoptotiske celler, ved hjelp av anti-cleaved Caspase 3 antistoff og DAPI for nuklei counterstaining. Kvantifisering av mititotisk indeks C, apoptose (% av aktivert caspase3) D, og tumor størrelse E, avslørte at FOLFIRI induserer en betydelig reduksjon av mitose (Mann Whitney Test, P<0.0001) og en betydelig induksjon av apoptose (Mann Whitney test, P<0.0001), ledsaget av en 54% reduksjon av tumorstørrelse (P<0.001). Antall xenografter som analyseres er angitt i figuren, og hver prikk representerer en xenograft. F-H. Representative bilder av kolorektal kreft xenografts på 4 dager etter injeksjon merket med menneskelige spesifikke markører i grønt (human HLA, ki67 og hMITO) i PVS og CHT I. J-J'. Confocal bilder av polyklonale xenografts, injisert med to forskjellige menneskelige colorectal kreft celle linjer merket med lipofil farging CellTracker Deep Red (Cy5 - hvit), CellTracker Green CMFDA (488 - grønn) og DAPI counterstaining. K-K'. Confocal bilder av to forskjellige menneskelige colorectal kreft celle linjer merket med lipofil farging CellTracker Deep Red (Cy5 - hvit), Vybrant CM DiI (594 - rød) og DAPI counterstaining. Skalastenger representerer 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Cellelinje | vev | art | morfologi | Vekst-modus | Ideell sammenløp for injeksjon | Dissosierende injeksjonsmiddel | Dissosiasjonstid | Protokoll for merking | Injeksjonsmedium | Del totalt antall celler med (for å oppnå ideell konsentrasjon for injeksjon) | |||||||
| SW480 | Kolorektalt adenokarsinom (primært) | menneske | Epitelial | tilhenger | 70% - 75 % | PBS/EDTA 2 mM | 5 minutter | kolbe | PBS 1x | 0,25 | |||||||
| SW620 | Kolorektalt adenokarsinom (metastase) | menneske | Epitelial | tilhenger | 70% - 75 % | PBS/EDTA 2 mM | 5 minutter | kolbe | PBS 1x | 0,25 | |||||||
| HCT116 | Kolorektalt karsinom (primær), Kras mutant | menneske | Epitelial | tilhenger | 70% - 75 % | PBS/EDTA 2 mM | 5 minutter | kolbe | PBS 1x | 0,25 | |||||||
| HKE3 | Kolorektalt karsinom, Kras WT | menneske | Epitelial | tilhenger | 70% - 75 % | PBS/EDTA 2 mM | 5 minutter | kolbe | PBS 1x | 0,25 | |||||||
| HT-29 | Kolorektalt adenokarsinom (primært) | menneske | Epitelial | tilhenger | 70% - 75 % | PBS/EDTA 2 mM | 5 minutter | kolbe | PBS 1x | 0,2 | |||||||
| CACO-2 | Kolorektalt adenokarsinom (primært) | menneske | Epitelial | tilhenger | 70% - 75 % | PBS/EDTA 1 mM | 5 minutter | 1,5 ml mikrosentrifugerør | Komplett medium | 0,25 | |||||||
| MCF-7 | Brystadenokarsinom (metastase) | menneske | Epitelial | tilhenger | 70% - 80 % | PBS/EDTA 1 mM | 5 minutter | 1,5 ml mikrosentrifugerør | 60% FBS + 40% komplett medium | 0,5 | |||||||
| Hs578T | Brystkarsinom (primær) | menneske | Epitelial | tilhenger | 70% - 75 % | PBS/EDTA 1 mM | 2 minutter | 1,5 ml mikrosentrifugerør | 60% FBS + 40% komplett medium | 0,5 | |||||||
| MDA-MB-468 | Brystadenokarsinom (metastase) | menneske | Epitelial | tilhenger | 70% - 75 % | PBS/EDTA 1 mM | 8 minutter | 1,5 ml mikrosentrifugerør | 60% FBS + 40% komplett medium | 0,5 | |||||||
| MDA-MB-231 | Brystadenokarsinom (metastase) | menneske | Epitelial | tilhenger | 70% - 75 % | PBS/EDTA 1 mM | 5 minutter | 1,5 ml mikrosentrifugerør | Komplett medium | 0,5 | |||||||
| RT112 | Urinblære overgangscellekarsinom (primær) | menneske | Epitelial | tilhenger | 85% - 90% | Prøv åle | 6 minutter + celleskraper | 1,5 ml mikrosentrifugerør | Komplett medium | 0,5 | |||||||
| BFTC905 | Urinblære overgangscellekarsinom (primær) | menneske | Epitelial | tilhenger | 75% - 85% | Prøv åle | 10 minutter | 1,5 ml mikrosentrifugerør | 80 % komplett medium + 20 % PBS/EDTA 2 mM | 0,5 | |||||||
| J82 | Urinblære overgangscellekarsinom (primær) | menneske | Epitelial | tilhenger | 85% - 90% | Prøv åle | 10 minutter | 1,5 ml mikrosentrifugerør | Komplett medium | 0,5 | |||||||
| RT4 | Urinblære overgangscellekarsinom (primær) | menneske | Epitelial | tilhenger | 85% - 90% | Prøv åle | 6 minutter | 1,5 ml mikrosentrifugerør | Komplett medium | 0,5 | |||||||
| MIA PaCa-2 | Pankreas epitheliod karsinom (primær) | menneske | Epitelial | tilhenger | 80% - 90% | Prøv åle | 3 minutter | 1,5 ml mikrosentrifugerør | 60% FBS + 40% komplett medium | 0,5 | |||||||
| PANC-1 | Pankreas epitheliod karsinom (primær) | menneske | Epitelial | tilhenger | 80% | Prøv åle | 5 minutter | 1,5 ml mikrosentrifugerør | PBS/EDTA 2mM | 0,5 | |||||||
| VC8 | Lungefibroblaster, BRCA2 mutant, HR-mangelfull | Kinesisk hamster | Epitelial | tilhenger | 70% - 80 % | PBS/EDTA 1 mM | 5 minutter | 1,5 ml mikrosentrifugerør | Komplett medium | 0,25 | |||||||
| VC8-B2 | Lungefibroblaster, human BRCA2, BRCA2 −/− HR-mangelfull | Kinesisk hamster | Epitelial | tilhenger | 70% - 80 % | PBS/EDTA 1 mM | 5 minutter | 1,5 ml mikrosentrifugerør | Komplett medium | 0,25 | |||||||
Tabell 1: Optimal in vitro-sammenløp for injeksjon av flere cellelinjer
| Cellefarge | Katalognummer | Fluorescensspektrum (eks. - em.) | Fortynning av lager | Arbeid fortynning for å flekke i en kolbe | Arbeid fortynning for å flekke i en 1,5 ml mikrosenter | Inkubasjonstid | Observasjoner | ||||||
| Vybrant CM-DiI | V22888 | 549 nm - 569 nm | Allerede fortynnet | 4:1000 i PBS 1x | 4:1000 i PBS 1x | 15 min ved 37 ºC + 4 min ved 4 ºC | |||||||
| Vybrant DiO | V22886 | 484 nm - 501 nm | Allerede fortynnet | 5:1000 i PBS 1x | 5:1000 i PBS 1x | 15 min ved 37 ºC + 4 min ved 4 ºC | Ikke god oppløsning ved konfektavbildning etter 4 dager etter injeksjon | ||||||
| CellTracker dyp rød | C34565 | 630 nm - 660 nm | 1 mM i DMSO | 0,5 - 2,5 μM i PBS 1x | 0,5 - 2,5 μM i PBS 1x | 15 min ved 37 ºC | |||||||
| CellTracker Grønn CMFDA | C7025 | 492 nm - 517 nm | 10 mM i DMSO | 0,5 - 2,5 μM i PBS 1x | 0,5 - 2,5 μM i PBS 1x | 15 min ved 37 ºC | Produktlekkasjer til bukhulen 48 timer etter injeksjon, men ideell for saminjeksjonsstudier | ||||||
Tabell 2: Fargestoff og betingelser
| størrelse | Antall larver | E3 1x middels volum |
| 100 mm x 15 mm (standard) | Opptil 50 | 20-25 ml |
| 60 mm x 15 mm | Opptil 20 | 10 ml |
| 6-brønns plate | Opptil 15 per brønn | 3-4 ml per brønn |
Tabell 3: Alternativer for Petri-tallerken
| E3 medium 50x - lager | For 10 liter sterilt vann: |
| 146.9 g NaCl | |
| 6,3 g KCl | |
| 24.3 g CaCl2·2H2O | |
| 40,7 g MgSO4·7H2O | |
| E3 medium 1x – klar til bruk | 400 ml E3 medium 50x |
| 60 ml 0,01 % metylenblå oppløsning | |
| Fyll opp til 20 liter fiskesystemvann | |
| Tricaine 25x – lager og eutanasi | 2 g trikainpulver |
| 500 ml omvendt osmosevann | |
| 10 ml 1 M tris (pH 9) | |
| Juster til pH 7 | |
| Trikain 1x - Anestesi | 20 ml trikain 25x |
| Fyll opptil 500 ml systemvann | |
| 60 mg/ml pronase - lager 100x | 1 g pronase |
| 16,7 ml sterilt vann | |
| 0,6 mg/ml pronase – 1x klar til bruk | 100 μL pronase 100x |
| 9,9 ml E3 middels 1x |
Tabell 4: Løsningssammensetninger
Discussion
Den økende betydningen av sebrafisken som modell for kreftutvikling og legemiddelscreening har resultert i en rekke publikasjoner3,4,7,13,14,16,18,19,20,21. Imidlertid er injeksjon av kreftceller i sebrafiskembryoer en teknikk som krever et høyt nivå av fingerferdighet som kan være utfordrende for forskere. I denne protokollen tar vi sikte på å gi praktisk informasjon og noen tips som kan bidra til å overvinne de første utfordringene med å sette opp sebrafisk embryo xenografts.
Cellehåndtering før injeksjon
Denne optimaliserte protokollen for generering av sebrafisk xenografts med cellelinjer kan tilpasses ulike typer (kreft) celler med forskjellige morfologier. Vi anbefaler at alle cellelinjene som brukes til sebrafisk xenografts er mykoplasmafrie. I motsetning til andre bakterielle forurensninger genererer tilstedeværelsen av mykoplasma i cellekultur ikke endringer som lett kan oppdages under mikroskopet22. Mykoplasmaforurensning kan påvirke engraftmentpotensialet til cellelinjene, deres følsomhet for narkotika, samt levedyktigheten til sebrafiskembryoene.
Selv om celler kan fortsette å spre seg i en lengre periode, kan deres fenotype og genotype være utsatt for endringer. Det er viktig å bli kjent med morfologien og oppførselen til cellelinjene i kulturen. Vi anbefaler å holde antall cellepassasjer etter opptining mellom 3-12 for å få reproduserbare resultater. Dermed bør vanlige mykoplasma tester utføres.
Celler bør være i loggfasen (eksponentiell vekstfase før de når sammenløpet ~ 70%) på injeksjonsdagen. Dette vil muliggjøre en tilstrekkelig engraftment og riktig utvikling av svulstens særegne kjennetegn. For å forhindre variasjon i fenotypen av celler i xenograft, er det viktig å opprettholde sammenløpet for injeksjonskonstant mellom eksperimenter. Antall injiserte celler kan tilpasses egenskapene til hver cellelinje, da noen kan kreve høyere tetthet av injeksjon for å trives i sebrafiskembryoene.
Hensyn ved cellemerking
For bedre å visualisere menneskelige tumorceller for injeksjon og fremtidig analyse, kan tumorceller merkes med fluorescerende fargestoffer. På grunn av forskjeller i cellulær størrelse varierer det totale antall celler / cm2 i tilhengerkulturer mellom cellelinjer. Dette vil påvirke effekten av fargingsprotokollen samt antall celler høstet til injeksjon. Store celler som gir lave tall per kolbe (dvs. Hs578T) eller vokser i klynger (dvs. BFTC905) vil kreve sammenslåing av flere kolber for et enkelt eksperiment. I dette tilfellet bør farging av celler ikke utføres direkte i kolben, da dette vil føre til bruk av store mengder fargestoff (høy pris). På den annen side kan celler som er svært følsomme for overdreven sykluser med sentrifugering, samt de som gir høye tall per kolbe (dvs. HCT116) farges direkte i kolben og deretter løsnes med EDTA/celleskraper (for mer informasjon se tabell 1).
Når det er mulig, i stedet for å bruke en enzymatisk tilnærming, bruk EDTA til å løsne cellene på injeksjonsdagen, slik at cellene gjenoppretter cellecellekryssene raskere og blir utsatt for mindre sentrifugeringstrinn. Likevel, hvis cellene er følsomme for EDTA, veldig tilhenger eller vokser i klynger - kan en enzymatisk metode brukes. Optimaliseringen av den ideelle injeksjonskonsentrasjonen samt injeksjonsmediet er avhengig av egenskapene til hver cellelinje, og det kan derfor trenge noen justeringer (Tabell 1).
Mikroinjeksjonskalibrering
I motsetning til levering av oligonukleotider eller legemidler i sebrafiskembryoet, brukes ikke en graticule til å kalibrere nålen når du arbeider med cellelinjer for xenografts. Etter en tid under injeksjonen vil cellene begynne å tette, og det er nødvendig å kutte spissen av nålen for å øke diameteren eller endre nålen helt. Denne prosedyren hindrer graticule kalibrering.
For å løse dette problemet reguleres antall celler som dispenseres av utkasttrykk og tid som trengs for å nå en størrelse som ligner embryoøyet innen 1-3 pulser. Deretter, for å kontrollere tumorstørrelsen ytterligere, ved 1 dpi, sorteres xenografts i henhold til tumorstørrelsen som vist i figur 6 B-B". Som representert i figur 6C-eksemplet, er denne sorteringsmetoden effektiv for å redusere variasjonen av tumorstørrelser: Hvis vi samler dem alle sammen (+, ++, +++) er STEV ~ dobbelt så stor som ++-klassen (~906 celler til ~422 celler) og koeffisientvariasjonen er ~ 31,9% sammenlignet med 14,5% i ++klassen. Siden referansen til injeksjon er volum, varierer det totale antall celler mye mellom celletyper - avhengig av størrelsen og formen på cellene. For eksempel produserer store celler med mye cytoplasma som brystkreft Hs578T, mye mindre svulster (~ 600 celler). Hver cellelinje krever også forskjellig antall celler. For eksempel har HT29 CRC og RT112 urinblærekreftcellelinjer vist at jo høyere antall celler som injiseres, jo høyere er sebrafiskdødeligheten. Derfor er det nødvendig med en periode med optimalisering mens du utvikler xenografts for å teste om cellelinjen har toksiske effekter i embryoet eller krever høyere / lavere tetthet av injeksjon.
Injeksjonssted
En av de vanligste avvikene ved generering av sebrafisk embryo xenografts er injeksjonsstedet. Eggeplommen er vanligvis stedet for injeksjon på grunn av sin enkle tilgjengelighet. Vi har imidlertid observert at celler injisert i eggeplommen har en høyere tendens til å dø. Selv om det er teknisk vanskeligere, anbefaler vi å injisere i PVS og så langt som mulig fra hjertet. Innenfor PVS kan celler aggregere, rekruttere kar og immunceller, og migrere, intravasere, ekstravasat og danne mikrometastase, hvis de viser metastatiske egenskaper8,11.
Effektivitet i engraftment
Forskjeller i engraftment effektivitet og tumor størrelse blant cellelinjer på 4 dpi forventes på grunn av deres distinkte grader av basal celle død / overlevelse / spredning, men også på grunn av medfødt immunogenisitet som hver celle linje kan vise9.
Metastasering
Metastase består av en multistep kaskade av hendelser som kan deles inn i to vilkårlige stadier. I første fase må tumorceller løsne fra det primære stedet, migrere og invadere tilstøtende vev og deretter intravasere inn i blodet. I andre fase må tumorceller overleve i omløp, ekstravasere fra blodet eller lymfekarene, og til slutt kolonisere på sekundære steder23. For å skille mellom disse tidlige og sene hendelsene og adressere potensialet / ferdighetene til de forskjellige tumorcellene for å utføre disse trinnene, designet vi en enkel analyse.
Generelt, når de injiseres i PVS, kan tumorceller komme direkte inn i sirkulasjon og deretter bli fysisk fanget i kaudalt hematopoietisk vev (CHT) (haleregion). Men i henhold til egenskapene til hver tumorcelle - har vi sett at noen tumorceller forblir på CHT 4 dpi og er i stand til å danne mikrometastasis mens andre tumorceller forsvinner (ryddet etter å ha blitt fanget i CHT).
Derfor, ved å sammenligne mikrometastaseeffektiviteten (ved 4 dpi) når celler ble plassert direkte i sirkulasjon - CIRC (celler trenger bare å gå gjennom de sene trinnene i metastase) vs. når ikke - NO CIRC (celler må gå gjennom tidlige og sene trinn for å kunne danne en mikrometastase) kan vi vurdere deres tidlige eller sene metastatiske potensial. Vi har observert tumorceller som effektivt kan danne mikrometastase i CHT i begge gruppene (CIRC og NO CIRC), noe som tyder på at disse cellene har kapasitet til å gjennomgå alle trinnene i den metastatiske kaskaden (SW480 og MDA-MB-468 for eksempel)8,11. I motsetning har andre tumorceller et svært lavt metastatisk potensial i begge gruppene, som nesten aldri gjør mikrometastase, selv når de injiseres i sirkulasjon (dvs. synlig i CHT ved 24 hpi, men ved 4 dpi er de ikke lenger der, Hs578T for eksempel)8. Imidlertid har vi tydelig funnet en annen gruppe - en som bare er i stand til å danne mikrometastasis når den injiseres i sirkulasjon (vi kan bare observere mikrometastasis i CIRC-gruppen). Dette antyder at disse cellene har lav effektivitet i å utføre de første trinnene i den metastatiske kaskaden, men på den annen side er i stand til å overleve i omløp, ekstravasere og kolonisere et fjernt sted.
Immunstaining og avbildning
Før fiksering kan denne injeksjonsprotokollen brukes til andre levende avbildningsmetoder som levende differensialinterferenskontrast (DIC) mikroskopi, spinnende diskmikroskopi, høyoppløselig levende konføling og lysarkmikroskopi, etc.
Døde celler og cellulære rusk vises lyse når de observeres gjennom det fluorescerende stereomikroskopet og kan forveksles med levende celler, spesielt hvis målet med studien vurderer cellelinjenes metastatiske potensial. Vi vil understreke viktigheten av å utføre konfikal avbildning med spesifikke levedyktighetsmarkører og DAPI for å vurdere overlevelsestilstanden til svulsten og mikrometastase. Det er også grunnleggende å bruke spesifikke menneskelige antistoffer for å oppdage menneskelige celler som antimenneskelig mitokondrier eller antimenneskelig HLA. Når du implementerer protokollen, trene eksperimenterer øyne ved å sammenligne farging i stereomikroskopet med de konfekt bilder. Etter en tid kan eksperimenter tydelig skille rusk fra levende celler i det fluorescerende stereomikroskopet.
Selv om andre metoder for å kvantifisere tumorbyrde som hele fluorescensområdet er mye brukt, anbefaler vi å utføre hele mount immunostaining og konfokal avbildning som en mer nøyaktig metode. Ikke bare effektiviteten av lipofil fargestofffarging er svært variabel (dvs. noen celler er veldig godt farget, mens andre ikke er - sannsynligvis på grunn av lipidinnholdet i membranene), men også mange ganger lipofile fargestoffer danner aggregater, og døde celler har en tendens til å være lysere - og skaper flere gjenstander som kan forveksles med levende celler.
Celler kan transduseres med fluorescerende proteiner for å hjelpe til med sporingen og for å hoppe over cellemerking. Sørg imidlertid for at de transinduserte og ikke-transinduserte cellene gir de samme resultatene i sebrafisk xenografts.
I tillegg kan makrofager fagocytt disse fluorescerende celleavfallene bli fluorescerende merket og migrere, og generere falske positive metastatiske celler. Dermed anbefaler vi en rekke analytiske verktøy, som selvfølgelig kan utvides til mange andre avlesninger for en mer nøyaktig tolkning av tumoradferd:
- Spredning - kvantifisering av mititotiske figurer med DAPI eller anti-pHH3Ser10 antistoff (Merck Millipore Cat. #06-570),
- Celledød ved apoptose- antistoff antiaktivert Caspase3Asp175 (Cell Signalling Technologies Cat. #9661) eller tilsvarende,
- Tumorstørrelse - DAPI-telling - menneskelige tumorceller viser en veldig distinkt kromatinorganisasjon, slik at de lett skiller seg fra sebrafiskcellene og er alltid mulig å dobbeltsjekke med fargestoffet (når du trener øyet),
- For metastatiske studier, for entydig å oppdage menneskelige celler, - anti-menneskelig HLA (Abcam EP1395Y Cat. #ab52922), anti-menneskelige mitokondrier (Merck Millipore Cat. #MAB1273- Klone 113-1).
For et konfokalt oppkjøp med 5 μm intervall mellom skiver i Z-stabelen av kontrollkreftcellene HCT116 (gjennomsnittlig kjernefysisk størrelse på 10-12 μm diameter) med DAPI-motstaining, har vi observert at ~ 50% av cellene deles mellom to påfølgende skiver. Derfor, hvis hver skive telles, er det stor risiko for å telle de samme cellene to ganger. Å gå frem og tilbake mellom skiver for å unngå problemer med kvantifisering resulterer i en tidkrevende og feilutsatt teknikk. For å lette kvantifiseringen av det totale antall celler og gi mer reproduserbarhet mellom forskere, opprettet vi tumorstørrelsesformelen som tidligere er beskrevet i denne protokollen8.
Vi inkluderte et korreksjonsnummer (1,5) for å gjøre rede for ~50% cellene som deles mellom stykker. Vi fant at den gjennomsnittlige feilen ved manuell telling av hele svulsten mellom forskere var 20%. To forskere som brukte formelen hadde en 2% feil. Bruken av denne formelen har en nøyaktighetsgrad på 93% og 98% reproduserbarhetshastighet. Vi testet også automatiserte metoder, men de viste en feil høyere enn 50% forårsaket av terskelinnstillinger.
På grunn av egenskapene til apoptotiske celler er kvantifiseringen av aktiverte Caspase 3-celler vanskeligere. For å redusere antall feil og variasjoner i resultatene, anbefaler vi at kontroll- og eksperimentelle prøver telles av samme forsker. I tillegg, når man lærer denne teknikken, må en ny forsker telle bilder som allerede var kvantifisert av mer erfarne forskere for å sammenligne resultater og trene.
Lengden på analysen kan forlenges om nødvendig. Det er imidlertid viktig å vurdere at sebrafisk larver krever levende fôring fra ~ 7 dager etter befruktning (5 dager etter injeksjon). I tillegg kan dyrevelferdsretningslinjene og forskriftene som brukes på larver eldre enn 6 dager etter befruktning variere.
Denne protokollen gir nyttige verktøy for å gjøre det mulig for en enkelt forsker å injisere omtrent ~ 200-300 sebrafisk larver per time; og resultater for hele analysen, inkludert analyse og statistisk tolkning, oppnådd om tre uker. Vi håper at denne protokollen kan hjelpe forskere med å bli eksperter på å generere sebrafisk xenografts. Det er ikke lett; du må øve, men du kommer dit. lykke til!
Disclosures
ingen
Acknowledgments
Vi takker Champalimaud Foundation, Congento (LISBOA-01-0145-FEDER-022170, finansiert av FCT/Lisboa2020) for finansiering. FCT-stipendiatstillinger for VP (SFRH/BD/118252/2016), MML (PD/BD/138203/2018). Alle medlemmer av Fior Lab for kritiske diskusjoner; B. Costa og C. Rebelo de Almeida for deling av data; og våre Lab-medlemmer C. Rebelo de Almeida, M. Barroso og L. Leite for deres deltakelse i videoen. Vi vil gjerne takke CF Fish Facility (C. Certal, J. Monteiro et al) og Champalimaud Communication, Events and Outreach team spesielt Alexandre Azinheira for den fantastiske filmproduksjon og Catarina Ramos og Teresa Fernandes for deres hjelp.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar for bacteriology | VWR | 97064-336 | Agar plate |
| anti-Caspase3Asp175 (Rabbit monoclonal) | Cell Signalling Technologies | 9661 | Primary antibody for whole mount immuno staining (Dilution 1:100) |
| anti-human HLA (Rabbit monoclonal) | Abcam EP1395Y | ab52922 | Primary antibody for whole mount immuno staining (Dilution 1:100) |
| anti- 488 (Rabbit monoclonal) | ThermoFisher Scientific | 35552 | Secondary antibody for whole mount immuno staining (Dilution 1:200) |
| anti- 594 (Rabbit monoclonal) | ThermoFisher Scientific | 35560 | Secondary antibody for whole mount immuno staining (Dilution 1:200) |
| CellTracker Deep Red Dye | ThermoFisher Scientific | C34565 | Lipophilic dye (Dilution 1:1000) |
| CellTracker Green CMFDA Dye | ThermoFisher Scientific | C2925 | Lipophilic dye (Dilution 1:1000) |
| Conical Centrifuge tube 50mL | VWR | 525-0610 | |
| Conical Centrifuge tube 15mL | VWR | 525-0604 | |
| DAPI | Nuclear and chromosome counterstain | ||
| Laser-Based Micropipette Puller P-2000 | Sutter-Instrument | Micropipette Puller | |
| Microcentrifuge tube 1.5mL | Abdos | P10202 | |
| Microscope slides, cut edge | RS France | BPB016 | Slides for mounting |
| Mowiol | Sigma-Aldrich | 81381 | Mounting medium |
| Pneumatic Picopump | World Precision Instruments | PV820 | Microinjector |
| Rectangular cover glasses, Menzel Gläser | ThermoFisher Scientific | 631-9430 | Coverslips for mounting |
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | Agar plate |
| Thin Wall Glass Capillaries | World Precision Instruments | TW100-4 | Borosilicate capillaries |
| TrypLE | Gibco | 12605036 | Enzymatic detachment solution |
| Vaseline | Petroleum jelly for slide sealing | ||
| Vybrant CM-DiI Dye | ThermoFisher Scientific | V22888 | Lipophilic dye (Dilution 1:1000) |
| Vybrant DiO Cell-Labeling Solution | ThermoFisher Scientific | V22886 | Lipophilic dye (Dilution 1:1000) |
| ZEISS Axio Zoom.V16 for Biology | ZEISS | Fluorescence Stereo Zoom Microscope | |
| Zeiss LSM 710 | ZEISS | Confocal microscope |
References
- Gut, P., Reischauer, S., Stainier, D. Y. R., Arnaout, R. Little Fish, Big Data: Zebrafish as a Model for Cardiovascular and Metabolic Disease. Physiological Reviews. 97, 889-938 (2017).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496, 498-503 (2013).
- Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. Journal of Clinical Investigation. 122, 2337-2343 (2012).
- Stoletov, K., Klemke, R. Catch of the day: zebrafish as a human cancer model. Oncogene. 27, 4509-4520 (2008).
- Weintraub, A. All eyes on zebrafish. Lab Animals. 46, 323-326 (2017).
- Novoa, B., Figueras, A. Zebrafish: Model for the Study of Inflammation and the Innate Immune Response to Infectious Diseases. Current Topics in Innate Immunity II. Lambris, J. D., Hajishengallis, G. , Springer. 253-275 (2012).
- Fazio, M., Ablain, J., Chuan, Y., Langenau, D. M., Zon, L. I. Zebrafish patient avatars in cancer biology and precision cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 20, 263-273 (2020).
- Fior, R., et al. Single-cell functional and chemosensitive profiling of combinatorial colorectal therapy in zebrafish xenografts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 8234-8243 (2017).
- Póvoa, V., et al. Innate immune evasion revealed in a colorectal zebrafish xenograft model. Nature Communications. 12, 1156 (2021).
- Galletti, G., et al. Targeting Macrophages Sensitizes Chronic Lymphocytic Leukemia to Apoptosis and Inhibits Disease Progression. Cell Reports. 14, 1748-1760 (2016).
- Rebelo de Almeida, C., et al. Zebrafish xenografts as a fast screening platform for bevacizumab cancer therapy. Communications Biology. 3, 1-13 (2020).
- Varanda, A. B., Martins-Logrado, A., Godinho Ferreira, M., Fior, R. Zebrafish Xenografts Unveil Sensitivity to Olaparib beyond BRCA Status. Cancers. 12, 1769 (2020).
- Osmani, N., Goetz, J. G. Multiscale Imaging of Metastasis in Zebrafish. Trends in Cancer. 5, 766-778 (2019).
- Hyenne, V., et al. Studying the Fate of Tumor Extracellular Vesicles at High Spatiotemporal Resolution Using the Zebrafish Embryo. Developmental Cell. 48, 554-572 (2019).
- Costa, B., et al. Developments in zebrafish avatars as radiotherapy sensitivity reporters - towards personalized medicine. EBioMedicine. 51, 102578 (2020).
- Costa, B., Estrada, M. F., Mendes, R. V., Fior, R. Zebrafish Avatars towards Personalized Medicine-A Comparative Review between Avatar Models. Cells. 9, 293 (2020).
- TRICAINE - Protocols. ZFIN Community Wiki. , Available from: https://wiki.zfin.org/display/prot/TRICAINE (2021).
- Zhao, C., et al. A Novel Xenograft Model in Zebrafish for High-Resolution Investigating Dynamics of Neovascularization in Tumors. Plos One. , (2011).
- Veinotte, C. J., Dellaire, G., Berman, J. N. Hooking the big one: the potential of zebrafish xenotransplantation to reform cancer drug screening in the genomic era. Disease Models & Mechanisms. 7, 745-754 (2014).
- Haldi, M., Ton, C., Seng, W. L., McGrath, P. Human melanoma cells transplanted into zebrafish proliferate, migrate, produce melanin, form masses and stimulate angiogenesis in zebrafish. Angiogenesis. 9, 139-151 (2006).
- Zon, L. I., Peterson, R. The New Age of Chemical Screening in Zebrafish. Zebrafish. 7, 1 (2010).
- Mycoplasma Contamination of Cell Cultures. InvivoGen. , Available from: https://www.invivogen.com/review-mycoplasma (2016).
- van Zijl, F., Krupitza, G., Mikulits, W. Initial steps of metastasis: cell invasion and endothelial transmigration. Mutation Research. 728, 23-34 (2011).
