Her tilbyr vi en trinnvis protokoll, med tips for å generere xenografter og retningslinjer for tumoradferdsanalyse, helmontert immunfluorescens og konfokal bilde kvantifisering.
Zebrafish larval xenografts blir mye brukt til kreftforskning for å utføre in vivo og sanntidsstudier av human kreft. Muligheten for raskt å visualisere responsen på antikreftbehandlinger (kjemo, strålebehandling og biologisk), angiogenese og metastase med enkeltcelleoppløsning, plasserer sebrafisk xenograftmodellen som et toppvalg for å utvikle prekliniske studier.
Sebrafisk larval xenograft analysen presenterer flere eksperimentelle fordeler sammenlignet med andre modeller, men sannsynligvis er den mest slående reduksjonen av størrelsesskala og dermed tid. Denne reduksjonen av skala tillater enkeltcelleavbildning, bruk av et relativt lavt antall menneskelige celler (kompatibel med biopsier), middels høy-gjennomstrømning narkotika screenings, men viktigst av alt muliggjør en betydelig reduksjon av tiden av analysen. Alle disse fordelene gjør sebrafisk xenograftanalysen ekstremt attraktiv for fremtidige personlige medisinapplikasjoner.
Mange sebrafisk xenograft protokoller har blitt utviklet med et bredt mangfold av menneskelige svulster; Imidlertid mangler fortsatt en generell og standardisert protokoll for effektivt å generere sebrafisk larval xenografts. Her tilbyr vi en trinnvis protokoll, med tips for å generere xenografter og retningslinjer for tumoradferdsanalyse, helmontert immunfluorescens og konfokal bilde kvantifisering.
Sebrafisk (Danio rerio) dukker opp som en kraftig virveldyrmodellorganisme for å studere utvikling og sykdom. Sebrafisk deler svært konservert genetisk (~ 70% genetisk homologi og ~ 84% sykdomsrelaterte gener) og grunnleggende organmorfologiske egenskaper med mennesker1,2. Denne bevaringen tillater bruk av sebrafisk for å modellere flere menneskelige sykdommer, inkludert kreft3,4.
Håndtering og vedlikehold av sebrafisk er mye enklere og mer kostnadseffektivt enn mus på grunn av deres lille størrelse, høy fecundity hele året og ekstern befruktning3,5. Sebrafisk embryoer krever ikke levende fôring i løpet av de første 5-7 dagene av livet og har blitt brukt som en effektiv modell for utvikling, infeksjon og kreft1,4,6,7. Sebrafisk embryoer klekkes på 48 timer etter befruktning (hpf) og er frittsvømmende dyr med alle organer dannet, et bankende hjerte og funksjonelt sirkulasjonssystem, lever, hjerne, nyremarg, etc.1,3. Også på dette utviklingsstadiet er bare medfødt immunitet i spill, adaptiv immunitet utvikler seg fortsatt, noe som gir en generell effektiv engraftment av menneskelige celler uten behov for bruk av immunkompromitterte mutanter7,8. Likevel er det viktig å merke seg at ikke alle menneskelige celler engraft like9, og at for eksempel for leukemiceller ble det vist at fagocytter (nøytrofiler og makrofager) må tømmes for effektiv engraftment10.
Sebrafiskgenetisk tractability og den optiske gjennomsiktigheten av sine tidlige embryonale stadier tillater enkeltcellet intravital avbildning med høy oppløsning og dermed for etablering av toppmoderne bildeteknikker innen ulike biologiområder. Videre, i sammenheng med kreft, er disse funksjonene nyttige for sanntidsstudier av de tidligste stadiene av vertssvulstinteraksjoner, som å studere angiogent og metastatisk potensial, samt interaksjoner med det medfødte immunforsvaret8,9,11,12,13.
Selv om det i den korte xenograftanalysen ikke er tid for metastatisk “evolusjon”- er det mulig å analysere tumorcellenes metastatiske kapasitet (dvs. deres effektivitet til å gå gjennom metastatiske trinn som invasjon, intravasasjon, overlevelse i omløp, ekstravasasjon og kolonisering, og derfor studere disse prosessene in vivo og i sanntid8,11,13,14).
Egenskapene til livssyklusen plasserer sebrafisken som en unik modell for personlig medisin i kreft. Analyser kan utføres i et kortere tidsrom og resultater oppnådd i noen uker7,8,9,11,12,15,16. Celerity og gjennomførbarhet av disse analysene gir leger og forskere muligheten til å oppnå oversettelsesresultater som kan være nyttige for kreftpasienter, for hvem tid er et viktig behov.
Til tross for de økende forsøkene på å generere vellykkede sebrafisk embryo xenografts, er det fortsatt behov for standardisering av injeksjonsprosedyren samt evaluering av celle levedyktighet og tumoradferd etter injeksjon.
I denne protokollen gir vi forskere en klar og detaljert trinnvis guide for injeksjon av menneskelige kreftcellelinjer i sebrafiskembryoer og etterfølgende fiksering, immunsitting, avbildning og kvantifisering av tumorcelleadferd.
Den økende betydningen av sebrafisken som modell for kreftutvikling og legemiddelscreening har resultert i en rekke publikasjoner3,4,7,13,14,16,18,19,20,21. Imidlertid er injeksjon av kreftceller i sebrafiskembryoer en teknikk som krever et høyt nivå av fingerferdighet som kan være utfordrende for forskere. I denne protokollen tar vi sikte på å gi praktisk informasjon og noen tips som kan bidra til å overvinne de første utfordringene med å sette opp sebrafisk embryo xenografts.
Cellehåndtering før injeksjon
Denne optimaliserte protokollen for generering av sebrafisk xenografts med cellelinjer kan tilpasses ulike typer (kreft) celler med forskjellige morfologier. Vi anbefaler at alle cellelinjene som brukes til sebrafisk xenografts er mykoplasmafrie. I motsetning til andre bakterielle forurensninger genererer tilstedeværelsen av mykoplasma i cellekultur ikke endringer som lett kan oppdages under mikroskopet22. Mykoplasmaforurensning kan påvirke engraftmentpotensialet til cellelinjene, deres følsomhet for narkotika, samt levedyktigheten til sebrafiskembryoene.
Selv om celler kan fortsette å spre seg i en lengre periode, kan deres fenotype og genotype være utsatt for endringer. Det er viktig å bli kjent med morfologien og oppførselen til cellelinjene i kulturen. Vi anbefaler å holde antall cellepassasjer etter opptining mellom 3-12 for å få reproduserbare resultater. Dermed bør vanlige mykoplasma tester utføres.
Celler bør være i loggfasen (eksponentiell vekstfase før de når sammenløpet ~ 70%) på injeksjonsdagen. Dette vil muliggjøre en tilstrekkelig engraftment og riktig utvikling av svulstens særegne kjennetegn. For å forhindre variasjon i fenotypen av celler i xenograft, er det viktig å opprettholde sammenløpet for injeksjonskonstant mellom eksperimenter. Antall injiserte celler kan tilpasses egenskapene til hver cellelinje, da noen kan kreve høyere tetthet av injeksjon for å trives i sebrafiskembryoene.
Hensyn ved cellemerking
For bedre å visualisere menneskelige tumorceller for injeksjon og fremtidig analyse, kan tumorceller merkes med fluorescerende fargestoffer. På grunn av forskjeller i cellulær størrelse varierer det totale antall celler / cm2 i tilhengerkulturer mellom cellelinjer. Dette vil påvirke effekten av fargingsprotokollen samt antall celler høstet til injeksjon. Store celler som gir lave tall per kolbe (dvs. Hs578T) eller vokser i klynger (dvs. BFTC905) vil kreve sammenslåing av flere kolber for et enkelt eksperiment. I dette tilfellet bør farging av celler ikke utføres direkte i kolben, da dette vil føre til bruk av store mengder fargestoff (høy pris). På den annen side kan celler som er svært følsomme for overdreven sykluser med sentrifugering, samt de som gir høye tall per kolbe (dvs. HCT116) farges direkte i kolben og deretter løsnes med EDTA/celleskraper (for mer informasjon se tabell 1).
Når det er mulig, i stedet for å bruke en enzymatisk tilnærming, bruk EDTA til å løsne cellene på injeksjonsdagen, slik at cellene gjenoppretter cellecellekryssene raskere og blir utsatt for mindre sentrifugeringstrinn. Likevel, hvis cellene er følsomme for EDTA, veldig tilhenger eller vokser i klynger – kan en enzymatisk metode brukes. Optimaliseringen av den ideelle injeksjonskonsentrasjonen samt injeksjonsmediet er avhengig av egenskapene til hver cellelinje, og det kan derfor trenge noen justeringer (Tabell 1).
Mikroinjeksjonskalibrering
I motsetning til levering av oligonukleotider eller legemidler i sebrafiskembryoet, brukes ikke en graticule til å kalibrere nålen når du arbeider med cellelinjer for xenografts. Etter en tid under injeksjonen vil cellene begynne å tette, og det er nødvendig å kutte spissen av nålen for å øke diameteren eller endre nålen helt. Denne prosedyren hindrer graticule kalibrering.
For å løse dette problemet reguleres antall celler som dispenseres av utkasttrykk og tid som trengs for å nå en størrelse som ligner embryoøyet innen 1-3 pulser. Deretter, for å kontrollere tumorstørrelsen ytterligere, ved 1 dpi, sorteres xenografts i henhold til tumorstørrelsen som vist i figur 6 B-B”. Som representert i figur 6C-eksemplet, er denne sorteringsmetoden effektiv for å redusere variasjonen av tumorstørrelser: Hvis vi samler dem alle sammen (+, ++, +++) er STEV ~ dobbelt så stor som ++-klassen (~906 celler til ~422 celler) og koeffisientvariasjonen er ~ 31,9% sammenlignet med 14,5% i ++klassen. Siden referansen til injeksjon er volum, varierer det totale antall celler mye mellom celletyper – avhengig av størrelsen og formen på cellene. For eksempel produserer store celler med mye cytoplasma som brystkreft Hs578T, mye mindre svulster (~ 600 celler). Hver cellelinje krever også forskjellig antall celler. For eksempel har HT29 CRC og RT112 urinblærekreftcellelinjer vist at jo høyere antall celler som injiseres, jo høyere er sebrafiskdødeligheten. Derfor er det nødvendig med en periode med optimalisering mens du utvikler xenografts for å teste om cellelinjen har toksiske effekter i embryoet eller krever høyere / lavere tetthet av injeksjon.
Injeksjonssted
En av de vanligste avvikene ved generering av sebrafisk embryo xenografts er injeksjonsstedet. Eggeplommen er vanligvis stedet for injeksjon på grunn av sin enkle tilgjengelighet. Vi har imidlertid observert at celler injisert i eggeplommen har en høyere tendens til å dø. Selv om det er teknisk vanskeligere, anbefaler vi å injisere i PVS og så langt som mulig fra hjertet. Innenfor PVS kan celler aggregere, rekruttere kar og immunceller, og migrere, intravasere, ekstravasat og danne mikrometastase, hvis de viser metastatiske egenskaper8,11.
Effektivitet i engraftment
Forskjeller i engraftment effektivitet og tumor størrelse blant cellelinjer på 4 dpi forventes på grunn av deres distinkte grader av basal celle død / overlevelse / spredning, men også på grunn av medfødt immunogenisitet som hver celle linje kan vise9.
Metastasering
Metastase består av en multistep kaskade av hendelser som kan deles inn i to vilkårlige stadier. I første fase må tumorceller løsne fra det primære stedet, migrere og invadere tilstøtende vev og deretter intravasere inn i blodet. I andre fase må tumorceller overleve i omløp, ekstravasere fra blodet eller lymfekarene, og til slutt kolonisere på sekundære steder23. For å skille mellom disse tidlige og sene hendelsene og adressere potensialet / ferdighetene til de forskjellige tumorcellene for å utføre disse trinnene, designet vi en enkel analyse.
Generelt, når de injiseres i PVS, kan tumorceller komme direkte inn i sirkulasjon og deretter bli fysisk fanget i kaudalt hematopoietisk vev (CHT) (haleregion). Men i henhold til egenskapene til hver tumorcelle – har vi sett at noen tumorceller forblir på CHT 4 dpi og er i stand til å danne mikrometastasis mens andre tumorceller forsvinner (ryddet etter å ha blitt fanget i CHT).
Derfor, ved å sammenligne mikrometastaseeffektiviteten (ved 4 dpi) når celler ble plassert direkte i sirkulasjon – CIRC (celler trenger bare å gå gjennom de sene trinnene i metastase) vs. når ikke – NO CIRC (celler må gå gjennom tidlige og sene trinn for å kunne danne en mikrometastase) kan vi vurdere deres tidlige eller sene metastatiske potensial. Vi har observert tumorceller som effektivt kan danne mikrometastase i CHT i begge gruppene (CIRC og NO CIRC), noe som tyder på at disse cellene har kapasitet til å gjennomgå alle trinnene i den metastatiske kaskaden (SW480 og MDA-MB-468 for eksempel)8,11. I motsetning har andre tumorceller et svært lavt metastatisk potensial i begge gruppene, som nesten aldri gjør mikrometastase, selv når de injiseres i sirkulasjon (dvs. synlig i CHT ved 24 hpi, men ved 4 dpi er de ikke lenger der, Hs578T for eksempel)8. Imidlertid har vi tydelig funnet en annen gruppe – en som bare er i stand til å danne mikrometastasis når den injiseres i sirkulasjon (vi kan bare observere mikrometastasis i CIRC-gruppen). Dette antyder at disse cellene har lav effektivitet i å utføre de første trinnene i den metastatiske kaskaden, men på den annen side er i stand til å overleve i omløp, ekstravasere og kolonisere et fjernt sted.
Immunstaining og avbildning
Før fiksering kan denne injeksjonsprotokollen brukes til andre levende avbildningsmetoder som levende differensialinterferenskontrast (DIC) mikroskopi, spinnende diskmikroskopi, høyoppløselig levende konføling og lysarkmikroskopi, etc.
Døde celler og cellulære rusk vises lyse når de observeres gjennom det fluorescerende stereomikroskopet og kan forveksles med levende celler, spesielt hvis målet med studien vurderer cellelinjenes metastatiske potensial. Vi vil understreke viktigheten av å utføre konfikal avbildning med spesifikke levedyktighetsmarkører og DAPI for å vurdere overlevelsestilstanden til svulsten og mikrometastase. Det er også grunnleggende å bruke spesifikke menneskelige antistoffer for å oppdage menneskelige celler som antimenneskelig mitokondrier eller antimenneskelig HLA. Når du implementerer protokollen, trene eksperimenterer øyne ved å sammenligne farging i stereomikroskopet med de konfekt bilder. Etter en tid kan eksperimenter tydelig skille rusk fra levende celler i det fluorescerende stereomikroskopet.
Selv om andre metoder for å kvantifisere tumorbyrde som hele fluorescensområdet er mye brukt, anbefaler vi å utføre hele mount immunostaining og konfokal avbildning som en mer nøyaktig metode. Ikke bare effektiviteten av lipofil fargestofffarging er svært variabel (dvs. noen celler er veldig godt farget, mens andre ikke er – sannsynligvis på grunn av lipidinnholdet i membranene), men også mange ganger lipofile fargestoffer danner aggregater, og døde celler har en tendens til å være lysere – og skaper flere gjenstander som kan forveksles med levende celler.
Celler kan transduseres med fluorescerende proteiner for å hjelpe til med sporingen og for å hoppe over cellemerking. Sørg imidlertid for at de transinduserte og ikke-transinduserte cellene gir de samme resultatene i sebrafisk xenografts.
I tillegg kan makrofager fagocytt disse fluorescerende celleavfallene bli fluorescerende merket og migrere, og generere falske positive metastatiske celler. Dermed anbefaler vi en rekke analytiske verktøy, som selvfølgelig kan utvides til mange andre avlesninger for en mer nøyaktig tolkning av tumoradferd:
For et konfokalt oppkjøp med 5 μm intervall mellom skiver i Z-stabelen av kontrollkreftcellene HCT116 (gjennomsnittlig kjernefysisk størrelse på 10-12 μm diameter) med DAPI-motstaining, har vi observert at ~ 50% av cellene deles mellom to påfølgende skiver. Derfor, hvis hver skive telles, er det stor risiko for å telle de samme cellene to ganger. Å gå frem og tilbake mellom skiver for å unngå problemer med kvantifisering resulterer i en tidkrevende og feilutsatt teknikk. For å lette kvantifiseringen av det totale antall celler og gi mer reproduserbarhet mellom forskere, opprettet vi tumorstørrelsesformelen som tidligere er beskrevet i denne protokollen8.
Vi inkluderte et korreksjonsnummer (1,5) for å gjøre rede for ~50% cellene som deles mellom stykker. Vi fant at den gjennomsnittlige feilen ved manuell telling av hele svulsten mellom forskere var 20%. To forskere som brukte formelen hadde en 2% feil. Bruken av denne formelen har en nøyaktighetsgrad på 93% og 98% reproduserbarhetshastighet. Vi testet også automatiserte metoder, men de viste en feil høyere enn 50% forårsaket av terskelinnstillinger.
På grunn av egenskapene til apoptotiske celler er kvantifiseringen av aktiverte Caspase 3-celler vanskeligere. For å redusere antall feil og variasjoner i resultatene, anbefaler vi at kontroll- og eksperimentelle prøver telles av samme forsker. I tillegg, når man lærer denne teknikken, må en ny forsker telle bilder som allerede var kvantifisert av mer erfarne forskere for å sammenligne resultater og trene.
Lengden på analysen kan forlenges om nødvendig. Det er imidlertid viktig å vurdere at sebrafisk larver krever levende fôring fra ~ 7 dager etter befruktning (5 dager etter injeksjon). I tillegg kan dyrevelferdsretningslinjene og forskriftene som brukes på larver eldre enn 6 dager etter befruktning variere.
Denne protokollen gir nyttige verktøy for å gjøre det mulig for en enkelt forsker å injisere omtrent ~ 200-300 sebrafisk larver per time; og resultater for hele analysen, inkludert analyse og statistisk tolkning, oppnådd om tre uker. Vi håper at denne protokollen kan hjelpe forskere med å bli eksperter på å generere sebrafisk xenografts. Det er ikke lett; du må øve, men du kommer dit. lykke til!
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Champalimaud Foundation, Congento (LISBOA-01-0145-FEDER-022170, finansiert av FCT/Lisboa2020) for finansiering. FCT-stipendiatstillinger for VP (SFRH/BD/118252/2016), MML (PD/BD/138203/2018). Alle medlemmer av Fior Lab for kritiske diskusjoner; B. Costa og C. Rebelo de Almeida for deling av data; og våre Lab-medlemmer C. Rebelo de Almeida, M. Barroso og L. Leite for deres deltakelse i videoen. Vi vil gjerne takke CF Fish Facility (C. Certal, J. Monteiro et al) og Champalimaud Communication, Events and Outreach team spesielt Alexandre Azinheira for den fantastiske filmproduksjon og Catarina Ramos og Teresa Fernandes for deres hjelp.
Agar for bacteriology | VWR | 97064-336 | Agar plate |
anti-Caspase3Asp175 (Rabbit monoclonal) | Cell Signalling Technologies | 9661 | Primary antibody for whole mount immuno staining (Dilution 1:100) |
anti-human HLA (Rabbit monoclonal) | Abcam EP1395Y | ab52922 | Primary antibody for whole mount immuno staining (Dilution 1:100) |
anti- 488 (Rabbit monoclonal) | ThermoFisher Scientific | 35552 | Secondary antibody for whole mount immuno staining (Dilution 1:200) |
anti- 594 (Rabbit monoclonal) | ThermoFisher Scientific | 35560 | Secondary antibody for whole mount immuno staining (Dilution 1:200) |
CellTracker Deep Red Dye | ThermoFisher Scientific | C34565 | Lipophilic dye (Dilution 1:1000) |
CellTracker Green CMFDA Dye | ThermoFisher Scientific | C2925 | Lipophilic dye (Dilution 1:1000) |
Conical Centrifuge tube 50mL | VWR | 525-0610 | |
Conical Centrifuge tube 15mL | VWR | 525-0604 | |
DAPI | Nuclear and chromosome counterstain | ||
Laser-Based Micropipette Puller P-2000 | Sutter-Instrument | Micropipette Puller | |
Microcentrifuge tube 1.5mL | Abdos | P10202 | |
Microscope slides, cut edge | RS France | BPB016 | Slides for mounting |
Mowiol | Sigma-Aldrich | 81381 | Mounting medium |
Pneumatic Picopump | World Precision Instruments | PV820 | Microinjector |
Rectangular cover glasses, Menzel Gläser | ThermoFisher Scientific | 631-9430 | Coverslips for mounting |
SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | Agar plate |
Thin Wall Glass Capillaries | World Precision Instruments | TW100-4 | Borosilicate capillaries |
TrypLE | Gibco | 12605036 | Enzymatic detachment solution |
Vaseline | Petroleum jelly for slide sealing | ||
Vybrant CM-DiI Dye | ThermoFisher Scientific | V22888 | Lipophilic dye (Dilution 1:1000) |
Vybrant DiO Cell-Labeling Solution | ThermoFisher Scientific | V22886 | Lipophilic dye (Dilution 1:1000) |
ZEISS Axio Zoom.V16 for Biology | ZEISS | Fluorescence Stereo Zoom Microscope | |
Zeiss LSM 710 | ZEISS | Confocal microscope |