Summary
Här tillhandahåller vi ett steg-för-steg-protokoll, med tips för att generera xenografter och riktlinjer för tumörbeteendeanalys, helmonterad immunofluorescens och konfokal avbildnings kvantifiering.
Abstract
Zebrafisk larval xenografts används ofta för cancerforskning för att utföra in vivo- och realtidsstudier av mänsklig cancer. Möjligheten att snabbt visualisera svaret på anti-cancer terapier (kemoterapi, strålbehandling och biologiska läkemedel), angiogenes och metastasering med encellig upplösning, placerar zebrafish xenograft modell som ett toppval för att utveckla prekliniska studier.
Zebrafisk larv xenograft analys presenterar flera experimentella fördelar jämfört med andra modeller, men förmodligen den mest slående är minskningen av storlek skala och följaktligen tid. Denna minskning av skalan möjliggör encellig avbildning, användningen av ett relativt lågt antal mänskliga celler (kompatibla med tarmbiopsier), medium-high-throughput läkemedelsscreening, men viktigast av allt möjliggör en betydande minskning av tiden för analysen. Alla dessa fördelar gör zebrafisk xenograft-analysen extremt attraktiv för framtida personliga medicinska applikationer.
Många zebrafish xenograft protokoll har utvecklats med en stor mångfald av mänskliga tumörer; emellertid saknas fortfarande ett allmänt och standardiserat protokoll för att effektivt generera zebrafisk larv xenografts. Här tillhandahåller vi ett steg-för-steg-protokoll, med tips för att generera xenografter och riktlinjer för tumörbeteendeanalys, helmonterad immunofluorescens och konfokal avbildnings kvantifiering.
Introduction
Zebrafisk (Danio rerio) växer fram som en kraftfull ryggradsdjur modell organism för att studera utveckling och sjukdom. Zebrafisk delar mycket bevarad genetisk (~ 70% genetisk homologi och ~ 84% sjukdomsrelaterade gener) och grundläggande organmorfologiska egenskaper med människor1,2. Denna bevarande gör det möjligt att använda zebrafisk för att modellera flera mänskliga sjukdomar, inklusive cancer3,4.
Hantering och underhåll av zebrafisk är mycket enklare och mer kostnadseffektivt än möss på grund av deras lilla storlek, höga fecundity året runt och extern befruktning3,5. Zebrafiskembryon kräver inte levande utfodring under sina första 5-7 dagar i livet och har använts som en effektiv modell för utveckling, infektion och cancer1,4,6,7. Zebrafiskembryon kläcks vid 48 timmar efter befruktning (hpf) och är fritt simmande djur med alla organ bildade, ett bultande hjärta och funktionellt cirkulationssystem, lever, hjärna, njurmärg etc.1,3. I detta utvecklingsstadium är det också endast medfödd immunitet som är i spel, adaptiv immunitet utvecklas fortfarande, vilket möjliggör en allmän effektiv engraftment av mänskliga celler utan behov av användning av immunkomprometterade mutanter7,8. Det är dock viktigt att notera att inte alla mänskliga celler insuperlika 9 och att det till exempel för leukemiceller visades att fagocyter (neutrofiler och makrofager) måste tömmas för effektiv engraftment10.
Zebrafiskens genetiska dragbarhet och den optiska öppenheten i dess tidiga embryonala stadier möjliggör intravital avbildning med en enda cell med hög upplösning och därmed för inrättandet av toppmoderna bildframställningstekniker inom olika biologiområden. Dessutom, i samband med cancer, är dessa funktioner användbara för realtidsstudier av de tidigaste stadierna av värdtumörinteraktioner, som att studera angiogen och metastaserad potential, liksom interaktioner med det medfödda immunsystemet8,9,11,12,13.
Även om det i den korta xenograftanalysen inte finns tid för metastaserad "evolution"- är det möjligt att analysera tumörcellernas metastaserade kapacitet (dvs. deras effektivitet att gå igenom metastaserade steg som invasion, intravasation, överlevnad i cirkulation, extravasation och kolonisering, och därför studera dessa processer in vivo och i realtid8,11,13,14).
Egenskaperna hos dess livscykel placerar zebrafisken som en unik modell för personlig medicin vid cancer. Analyser kan utföras på kortare tid och resultat som erhållits om några veckor7,8,9,11,12,15,16. Celerity och genomförbarheten av dessa analyser ger läkare och forskare möjlighet att få översättningsresultat som kan vara användbara för cancerpatienter, för vilka tid är ett viktigt behov.
Trots de ökande försöken att generera framgångsrika zebrafisk embryo xenografts, Det finns fortfarande ett behov av standardisering av injektion förfarandet samt utvärdering av cell livskraft och tumör beteende efter injektion.
I detta protokoll ger vi forskare en tydlig och detaljerad steg-för-steg-guide för injektion av mänskliga cancercelllinjer i zebrafiskembryon och efterföljande fixering, immunostaining, avbildning och kvantifiering av tumörcellsbeteende.
Protocol
Modellen för zebrafisk(Danio rerio)hanterades och bibehölls i enlighet med standardprotokollen i den europeiska djurskyddslagstiftningen, direktiv 2010/63/EU (Europeiska kommissionen, 2016) och Champalimaud Fish Platform. Alla protokoll godkändes av Champalimaud Animal Ethical Committee och portugisiska institutionella organisationer-ORBEA (Órgão de Bem-Estar e Ética Animal/Animal Welfare and Ethics Body) och DGAV (Direção Geral de Alimentação e Veterinária/Generaldirektoratet för livsmedel och veterinärfrågor).
OBS: Innan du påbörjar huvudexperimentet, öva med den mänskliga kolorektalcancer (CRC) cellinjen HCT116. Denna cellinje är lätt att förbereda (mycket proliferativ), lätt att injicera och instärk mycket effektivt (cirka 95-100%). Börja med celler i överskott (~ 12x106 celler, T-75 kolv) och överskott av fisk (400 fisk) tills de blir skickliga i tekniken, eftersom många celler och fisk kommer att gå förlorade under träning. Experimenterare är redo när engraftment på ~ 95% uppnås i HCT116 xenografts. Se figur 1 för ett schema över hela protokollet.
1. Inställning för injektion
- Två veckor före injektionen, expandera celler i kultur (se tabell 1 för en detaljerad guide över optimal in vitro-konfluens för injektion av flera cellinjer).
- Tre dagar före injektionen, korsa zebrafisken i önskad bakgrund.
2. 24 timmar före injektion
- Rengör zebrafiskembryonplattorna (kassera alla döda och icke-utvecklade embryon) och uppdatera E3-mediet.
- I cellkulturrummet kasserar du cellkulturmediet från de flaskor som planeras för injektion, tvättar en gång med 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) för att avlägsna de döda cellerna och tillsätta färskt medium.
- Förbered verktygen för injektionsproceduren, t.ex.
- Mikroinjektionsnålar (Figur 2A)
- Använd borosilikatglaskapillärer (4 tum, OD 1,0 mm, Ingen glödtråd i en mikropipettedragare (värme: ≈500; fil: 10; vel: 50; dec: 60; dra: 100).
- Beredning av platta(figur 2B)
- Förbered 2% agarose i H2O, värm upp det och häll ett lager upplöst agarosa i locket på en ren Petri-skål. Låt det polymerisera och med hjälp av en linjal, gör tre till fyra raka agarosalinjer för embryots inriktning.
- Hårnålsuppsättning (Figur 2C-D)
- Placera 1 hår inuti ett kapillärrör i glas och lämna cirka 1 centimeter hår utanför röret.
- Krulla hårets ytterspets med hjälp av tång i glaskapärlingröret som bildar en slinga på ~ 0,5 mm längd.
- Försegla kanten på kapillärröret med en droppe nagellack. Detta hjälper också till att fixa slingan på plats. Låt det torka. Upprepa proceduren på rörets andra kant.
- Skär en bit elektrisk tejp (mer resistent, ogenomtränglig och styv än vanlig tejp).
- Försegla tejpen runt kapillären för att skydda den från att gå sönder.
- Mikroinjektionsnålar (Figur 2A)
3. Injektionsdag
- Separera de kläckta embryona från ouppnäckta ägg. Att lägga till 1x pronas (0,6 mg/ml, tabell 3)till embryomediet i detta skede kan öka kläckningen. Placera embryona i inkubatorn (vid 28 °C) tills de injektionsstället.
OBS: Lämna inte embryona i pronaslösningen längre än 1 timme, eftersom enzymet kommer att verka på de kläckta embryona vilket ökar risken för dödlighet. Se till att embryonas utvecklingsstadium är det som motsvarar 48 hpf (figur 3A,A ') för att undvika risken för ödem och dödlighet. - Förbered 1x Tricaine (från en 25x stock).
OBS: Ett detaljerat recept finns i tabell 3 och på Zebrafish Information Network - ZFIN webbsida17.
4. Cellmärkning för injektion
OBS: Märkning av celler kan utföras antingen direkt i en kolv eller i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör efter enzymatisk lossning. Se Diskussion för mer information.
- Ta bort cellkulturmediet och tvätta kolven två gånger (2x) med 1X PBS.
- Märk cellerna med ett lipofila färgämne antingen direkt i kolven (2 ml lösning/T75-kolv) eller i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör efter enzymatisk lossning. Undvik exponering för lätta och inkuberade celler vid 37 °C (se tabell 1 och tabell 2 för förhållanden/lösningar).
- Om märkning i kolven
- Ta bort färgämnet, tvätta med 1x PBS och lossa cellerna med EDTA och en cellskrapa.
- Överför celler till 1,5 ml mikrocentrifugrör. Centrifugera i 5 minuter vid 300 x g och gå sedan till steg 4,5.
- Om märkning i 1,5 ml mikrocentrifugrör:
- Centrifug 5 minuter vid 300 x g för att ta bort färgämnet och kassera supernatanten. Återanvänd i 1x PBS för att tvätta.
- Centrifugera 5 minuter vid 300 x g och gå sedan till steg 4,5.
- Kassera supernatanten och återanvänd pelleten med cellkulturmedium (för en 50 μL pellet tillsätt ~ 150-200 μL medium).
- Kvantifiera cellens livskraft med hjälp av en Neubauer-kammare med trypanblå uteslutning eller annan valmetod.
- Centrifug i 4 minuter vid 300 x g och kassera supernaten. Återanvänd cellerna i injektionsmediet.
OBS: Den rekommenderade cellkoncentrationen (i allmänhet från 0, 25-0, 5x106 celler/μL) och medium finns i tabell 1. - Från och med nu, håll cellerna på is.
5. Injektionsprocedur
- Söv embryona i 1x Tricaine i 5 minuter.
- Överför en liten mängd (~ 50) bedövade embryon till agarosplattan med en plastad pastörpipett och rikta dem försiktigt mot hjälp av en hårnålsslinga. Se till att hålla avståndet mellan embryona, särskilt mellan äggulan på en och huvudet på nästa (figur 4A).
OBS: Antalet embryon som ska anpassas varierar beroende på graden av expertis hos den forskare som utför injektionerna. Börja med några (~10-20). För ett schema över korrekt placering av embryona i agar/agarosaplattan, se figur 4A. - Se till att de justerade embryona inte torkar ut i agarosplattan för att förhindra dödlighet genom att försiktigt tillsätta 1-3 droppar 1x Tricaine-lösning på plattan.
- Knacka lätt på mikrocentrifugröret för att återanvända cellerna. Ladda tillbaka injektionsnålen med cellfjädringen med hjälp av en mikrolastarspets och undvik luftbubblor, eftersom de kan äventyra embryonas integritet.
- Öppna lufttrycksventilen (40 psi), sätt upp mikroinjektorn och placera försiktigt mikroinjektionsnålen i hållaren.
OBS: Använd följande rekommenderade mikroinjektorinställningar: Håll tryck - ventil (3 psi); Utmatningstryck - ventil; Räckvidd - 100 ms. - Skär mikroinjektionsnålen nära spetsen med Dumont-tången #5 eller liknande under stereomikroskopet.
OBS: Spetsen måste vara trubbig och tunn nog för att cellerna ska kunna passera utan igensättning samt för att undvika att skada embryona och förlora celler. En tjock mikroinjektionsnålspets skadar embryot och främjar bildandet av ödem eller zebrafiskdöd. Graticule används inte för nålkalibrering. Se Diskussion för en detaljerad förklaring. - Innan du injicerar embryona, testa mikroinjektortrycket med början vid det lägsta utmatningstrycket tills i ~ 1-3 pulserar uppnås en volym som liknar storleken på zebrafiskembryonets öga.
OBS: Användning av ett fluorescensstereomikroskop när det är möjligt i början av träningen rekommenderas. Detta kommer att möjliggöra en enklare identifiering av fluorescerande märkta celler. - Genomborra försiktigt i mitten av embryots äggula, sänk nålens vinkel och tryck försiktigt tills nålens spets når det perivitellin utrymmet (PVS) (Figur 4B-D).
- Tryck på mikroinjektorpedalen och injicera cellerna i PVS. Använd embryots öga som guide. Försök att injicera en volym celler som liknar storleken på embryots öga och så långt som möjligt från hjärtat för att förhindra hjärtödem.
- Ta försiktigt bort nålen och gå vidare till nästa embryo.
- Justera mikroinjektortrycket vid behov.
OBS: Celler tenderar att börja täppa till, så trycket kan ökas. Vid behov är det möjligt att skära kapillären (för att öka diametern) samtidigt som trycket minskar. - Överför de injicerade embryona till en ren petriskål(tabell 4)med 1x Tricaine-lösning och låt dem vila i 5-10 minuter. Detta kommer att ge tid för såret att stängas.
OBS: För att överföra embryona från agarplattan till Petri-skålen tillsätt några droppar 1x Tricaine-lösning ovanpå embryona och samla dem försiktigt med en pastapipett av plast. Släpp de insamlade embryona i en ny Petri-maträtt med 1x Tricaine-lösning. - Ta bort 1x Tricaine-lösningen och tillsätt färskt E3-medium.
- Inkubera xenografterna vid 34 °C (en komprometterad temperatur mellan mänskliga cellinjers överlevnad och zebrafiskutveckling8).
6. Metastaserad analys
- Vid ungefär 1 timmes efterinjektion (hpi) screenar du de injicerade embryona på ett fluorescerande stereomikroskop och sorterar xenografterna i 2 grupper, beroende på frånvaron (figur 5A) eller närvaron (figur 5B) av celler i omlopp.
OBS: Även om endast en cancercell upptäcks i hjärtat eller cirkulationen, inkludera dessa xenografter i gruppen xenografter med celler i omlopp. Alternativt kan celler injiceras direkt i omlopp för att öka antalet xenografter i denna grupp.
7. 1 dag efter injektion
- Analysera noggrant varje embryo på ett fluorescerande stereomikroskop och välj de med korrekt injicerade tumörer (figur 6).
OBS: Bedöva vid behov de injicerade embryona med Tricaine 1X-lösning före screening. - Kassera följande embryon/xenografter (figur 6A-A'):
• utan tumör/onormal morfologi/död,
• med hjärt- och/eller äggulaödem,
• med tumörceller endast i äggulan,
• med mycket få cancerceller. - Sortera utvalda xenografter efter deras tumörstorlek. Använd ögats storlek för jämförelse (figur 6B-B', 6C).
• Tumörer som är mindre än ögats storlek (+),
• Tumörer i samma storlek som ögat (++),
• Tumörer större än ögats storlek (+++). - Distribuera xenografts enligt önskad experimentell layout och starta läkemedelsanalysen (kontroll vs läkemedel etc.). Byt ut drogerna och E3 medium dagligen(tabell 4).
- Inkubera xenografterna som bibehåller temperaturen 34°C till slutet av analysen.
8. 4 dagar efter injektion
- På den sista dagen av analysen, bedöva xenografts med 1x Tricaine lösning och försiktigt justera dem på agarplattan.
OBS: Kassera döda eller svullna xenografter. Läkemedelsbehandlingar och vissa tumörceller kan inducera toxicitet och så småningom orsaka xenograft dödlighet. Dessa xenografts är inte ansedda för engraftment kvantifiering. - För att bestämma procentandelen av engraftment: på ett fluorescerande stereomikroskop analysera varje levande xenograft och bedöma frånvaron (Figur 6D) / närvaro (Figur 6E) av tumörer i PVS.
- För att bestämma procentandelen metastasering: på ett fluorescerande stereomikroskop analysera varje xenograft och bedöma förekomsten/frånvaron av mikrometastas i den kaudala hematopoetiska vävnaden (CHT) av de två tidigare definierade grupperna (CIRC och NO CIRC, figur 6F)
- Enligt den experimentella uppsättningen väljer du xenografts av intresse och avlivar dem med 25x Tricaine (Tabell 3).
- Fixera dem i 4% formaldehyd (FA) i minst 4 timmar vid rumstemperatur (RT) eller över natten vid 4 °C.
OBS: Använd metanolfri formaldehyd (16% FA) utspädd vid 4% i PBS/0,1% Triton. Fyll rören till toppen med fixativ. Placera rören horisontellt för att säkerställa en homogen fixering av alla xenografter, öka permeabiliteten och förhindra zebrafisken från att aggregeras längst ner. - Alternativt fixera dem med PIPES (Per 1 ml: 100 μL 1 M RÖR natriumsalt (4 °C); 1 μL 1 M MgSO4 (RT); 4 μL 0,5 M EGTA (RT); 93,7 μL 16% FA (RT); 801,3 μL ddH2O).
OBS: RÖR bevarar fluorescensen hos RFP och mCherry transgena linjer bättre än 4% FA. - Om immunostainingen kommer att utföras på en annan dag, ersätt FA med 100% metanol (MetOH). Xenografts fixerade i 100% metanol kan lagras vid -20 °C på obestämd tid.
METOH kan försämra effektiviteten hos vissa färgningar (dvs. falloidin) och släcka viss fluorescerande märkning. Bekräfta effektiviteten hos antikropparna i MetOH-fasta prover i förväg.
9. Hela fästet immunostaining för konfokal avbildning
OBS: Hela berget immunofluorescens teknik tar 3 dagar uppdelad enligt följande: Den första dagen är för permeabilization av xenografts och primära antikropp inkubation. Den andra dagen för tvättning och sekundär antikroppsinkubation och den tredje dagen för tvätt, fixering av xenografter och lagring i monteringsmedierna.
- Dag 1
- Om xenografterna lagrades i 100% MetOH, rehydrera dem genom en serie minskande MetOH-koncentrationer (75%, 50%, 25% MetOH utspädd i PBS/ 0,1% Triton). Om den är fast i FA ersätter du den med PBS/0,1% Triton.
- Tvätta 4x i 5 minuter i PBS/0,1% Triton.
- Tvätta 1x i 5 minuter i H2O.
OBS: Rören måste placeras horisontellt alltid i fixerings-, genomsläppnings- och tvättsteg om inget annat anges. - Byt ut H2O mot iskallt aceton och inkubera vid -20 °C i 7 minuter.
OBS: Placera ett 50 ml rör med aceton vid -20 °C så att det är klart att användas. Microcentrifuge-rör måste placeras vertikalt på ett rack så att acetonen inte läcker ut. - Tvätta 2x i 10 minuter i PBS/0,1%Triton.
- Inkubera med PBDX_GS blockeringslösning i 1 h vid RT (PBDX_GS blockeringsbuffert: 50 ml 1x PBS; 0,5 g bovint serumalbumin - BSA; 0,5 ml DMSO; 250 μL 10% Triton; 750 μL getserum - GS (15 μL/1 ml)).
- Ta PBDX_GS och tillsätt ~40 μL primär antikroppsutspädning (vanligtvis 1:100).
OBS: Volymen av den primära antikroppsutspädningen varierar beroende på antalet xenografter som finns i mikrocentrifugröret. Se till att alla xenografter är nedsänkta. - Inkubera i 1 timme vid RT och sedan vid 4 °C över natten. Placera rören vertikalt.
- Dag 2
- Ta bort primär antikropp och tvätta 2x i 10 minuter i PBS/0,1% Triton.
- Tvätta 4x i 30 min i PBS/0,05% interpolering.
OBS: Följande steg måste utföras i mörker (använd aluminiumfolie för att skydda rör från ljus). - Ta bort PBS/0,05% interpolering och tillsätt ~50-100 μL sekundär antikroppsutspädning (vanligtvis 1:200 - 1:400) + DAPI (50 μg/ml) utspädd i PBDX_GS.
- Inkubera i 1 timme vid RT och sedan vid 4 °C över natten. Placera rören vertikalt och skydda mot ljus.
- Dag 3 (använd aluminiumfolie för att skydda rör från ljus)
- Ta bort sekundär antikroppsutspädning och tvätta 4x i 15 minuter i PBS/0,05% interpolering.
- Fixera vid rumstemperatur i 20 minuter i 4% FA.
- Tvätta 1x i 5 minuter i PBS/0,05% interpolering.
- Ta bort PBS/0,05% interpolering och tillsätt 1 droppe vattenhaltigt monteringsmedium till varje mikrocentrifugrör. Placera rören vertikalt.
- Montera eller förvara vid 4 °C skyddat mot ljus tills monteringen. Placera rören vertikalt.
10. Montering av xenografter
OBS: Skydda mikrocentrifugrören från ljuset under hela processen. Zebrafisk xenografts är monterade mellan 2 täcken (24 x 60 mm # 1,5). Detta gör det möjligt att vända de monterade xenografts under konfokal avbildning så att båda sidor av tumören (upptill och botten) är tillgängliga. Använd inte plastpipetter med monteringsmedium - xenografterna kan fastna i pipetten. Se figur 7 för schematisk representation av följande steg.
- Märk täcket Y och försegla kanterna på täcket X med petroleumgel eller silikonfett för att undvika läckage av monteringsmediet.
- Överför xenografts med en glas Pasteur pipett till täcket X.
- Rikta försiktigt in dem med en hårnål och ta bort överflödiga vattenhaltiga monteringsmedier.
- Lägg till vattenhaltiga monteringsmedier i täckglaset Y.
- Placera försiktigt täckslip Y ovanpå täckglas X. Tryck inte på täckglasen eftersom detta potentiellt kan störa xenografts.
- Placera de monterade täckena ovanpå en mikroskopbild och fäst dem med transparent tejp. Detta möjliggör enklare manipulering för konfokal avbildning och lagring.
11. Konfokal avbildning
OBS: En apochromatic 25x nedsänkning mållins med vattenkorrigering är optimal för avbildning PVS tumörer med encellsupplösning (se figur 8C-C" och figur 9A för exempel).
- Skaffa prover med z-stackfunktionen med ett intervall på 5 μm mellan varje skiva. För bilder som syftar till 3D-rekonstruktion, särskilt fartyg, använd ett intervall på 1-3 μm mellan skivor (figur 8A).
12. Analys och kvantifiering
- Använd FIJI/ImageJ-programvara eller liknande för konfokal bildbehandling och analys.
- Öppna rådata (.czi, .lsm, etc.) i FIJI programvara.
- Om du vill markera hela eller bara en enda kanal i sammansatt läge klickar du på: Bild > färger > Kanalverktyg .
- Om du vill justera ljusstyrka och kontrastnivåer klickar du på: Bild > Justera > färgbalans.
- För att kvantifiera tumörstorlek
- Välj tre representativa segment av tumören, uppifrån, mitten och botten, per z-stack per xenograft (Bild 8 A).
OBS: Konfokal upplösning uppnår ~60-70 μm tumördjup. Om tumören är stor kanske det inte är möjligt att avbilda dess totala volym. - Öppna ett kalkylblad för att kommentera data.
- Räkna varje DAPI-atomkärnor som motsvarar tumörcellerna i de 3 markerade skivorna (figur 8 A, B). För att göra det:
- Öppna cellräknarplugin från FIJI/ImageJ genom att klicka på Plugins > Analyze > Cell-räknaren.
- Klicka på Initiera i cellräknarverktyget, välj en räknartyp och klicka på bilden för att starta inventeringsläget manuellt. För varje klick lägger räknaren till hur många celler som räknas (antal klick).
- När du har räknat ett helt segment sparar du cellnumret i motsvarande Excel-dokument.
- Tillbaka till Fiji klickar du på Återställ från fönstret Cellräknare för att ta bort informationen om samma räknare ska användas. Annars kan informationen behållas och andra räknare kan användas med andra segment (eller celler).
- Flytta till det andra representativa segmentet och upprepa föregående steg. Samla in all data.
DAPI-motstfining används ofta för att räkna cellnummer på grund av den tydliga definitionen av enskilda celler, men andra cellspecifika färgningar kan användas.
- För att erhålla det totala antalet celler i tumören använd följande formel:
OBS: Korrigeringsnumret på 1,5 uppskattades för celler med en genomsnittlig kärna diameter på ~10-12 μm. Den här korrigeringen kan behöva justeras om cellerna är större/mindre. Mer information om den här metoden finns i Dicussion.
- Välj tre representativa segment av tumören, uppifrån, mitten och botten, per z-stack per xenograft (Bild 8 A).
- För att kvantifiera andra markörer (immunceller, mitotiska figurer, PPH3, aktiverad Caspase3, Ki67, etc.), kvantifiera alla segment med samma plugin (se figur 8C-C'' för mitotiska figurer visualisering). Dividera det totala antalet räknade celler med motsvarande tumörstorlek och multiplicera med 100 för att få procentsatsen.
OBS: Se upp för att vissa celler kommer att placeras mellan två segment, gå fram och tillbaka i z-stacken för att se till att en cell inte räknas två gånger.
Representative Results
Zebrafish xenograft som ett verktyg för att studera cancerbehandlingar.
HCT116 kolorektal cancer cellinje var märkt med CM-DiI och injiceras i PVS av 2 dagar post befruktning (dpf) embryon. Efter injektion inkuberades xenografts vid 34 °C, en temperatur som möjliggör tillväxt av tumörceller utan att äventyra zebrafiskens utveckling. Nästa dag screenades xenografts beroende på närvaron eller frånvaron av en tumörmassa i PVS (inte korrekt injicerade zebrafisk kasserades och avlivades) (Figur 6A-A''). Xenografts grupperades efter deras tumör storlek (Figur 6B-B '') och slumpmässigt distribueras (i en 6-brunnsplatta: ~ 12 xenografts per brunn) i icke-behandlade kontroller och FOLFIRI kemoterapi (0,18 mM Folinsyra, 0,08 mM Irinotecan och 4,2 mM Fluorouracil (5-FU)).
Kontroll E3 och droger ersattes dagligen, och döda zebrafisk kasseras. 4 dpi och tre dagar efter behandling (dpt), var engraftment kvantifieras som i steg 8.2 i protokollet. Engraftment anses vara frekvensen av xenografts som presenterar en tumör massa i PVS vid 4 dpi. Till exempel, om det i slutet av experimentet finns 40 levande larver och 35 av de 40 presenterar en tumör i PVS, är engraftmenthastigheten 87,5%. Xenografts avlivades och fixades för att utvärdera tumör storlek och apoptos av immunofluorescence och confocal mikroskopi.
Immunofluorescens utfördes för att upptäcka apoptotiska celler, med hjälp av anti-cleaved Caspase 3 antikroppar (Asp175) (kanin, 1:100, #CST 9661) och DAPI (50 μg/mL) för nuklei counterstaining. Bildstapeldatamängder (var 5um) förvärvades i ett LSM710 konfokalt mikroskop och dataanalys utförd med FIJI / ImageJ-programvara som förklaras i steg 12. Kvantifiering av mitotiska index, apoptos (% av aktiverade Caspase3) och tumörstorlek, visade att FOLFIRI inducerar en betydande minskning av mitos (Mann Whitney Test, P<0.0001) och en betydande induktion av apoptos (Mann Whitney test, P<0.0001), åtföljd av en 54% minskning av tumörstorlek (P<0.001) (Figur 8C-E, Figur 9A-E).
Dessa funktioner är användbara i hög genomströmning fenotypiska läkemedelsskärmar samt att testa cell inneboende och fysiologiska effekter av flera cancerbehandlingar på kort tid.
Karakterisering av human-zebrafisk xenografts med människospecifika antikroppar
Som i alla xenograftmodeller finns det risk för felidentifiering av cellerna. Till exempel kan makrofager phagocytose mänskliga cancerceller, bli märkta med lipofila färgämnet och sedan resa längs zebrafiskvärden och därmed kan dessa celler misstas för tumörmikrometastas. Därför är märkning av xenografter med specifika mänskliga antikroppar som human hLA, ki-67 eller human mitokondrier (hMITO) avgörande för den första karakteriseringen och även för att bekanta sig med tumörcellernas morfologi (Figur 9F-I).
Zebrafish xenograft för att studera cell-cell interaktioner.
En annan stor fördel med zebrafiskens xenograftmodell är att det är möjligt att studera interaktionerna mellan olika tumörceller och analysera hur varje typ av cell kan påverka den andras beteende. Olika mänskliga cancerceller (olika kloner från samma tumör eller från olika tumörer) kan injiceras samtidigt. I det här exemplet var två CRC cellinjer som härrör från samma patient märkta med olika lipofila färgämnen och blandades i ett förhållande av 1:1 för injektion (Figur 9J-K ').
Vid blandning av mänskliga cellinjer (för att generera polyklonala tumörer) på samma transplantat, undvik att använda DiO-färgämnet eftersom detta resulterar i icke-specifik dubbelfärgning (tabell 2). Använd i stället till exempel CM-DiI (cellinje #1) med grön CMFDA (cellinje #2) eller CM-DiI (cellinje #1) med djuprött (cellinje #2) (Tabell 2, figur 9J-K'), för att få en enkel diskriminering av populationerna i slutet av experimentet. För att kvantifiera frekvensen för varje klon i tumören, använd 2 olika räknartyper i FIJI för att identifiera varje klon och dela sedan med det totala cellnumret (summan av alla kloner) för att få den relativa fraktionen av var och en (%).
Figur 1. Flödesschemasammanfattning av zebrafisk xenograft-protokollet Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 2. Material för zebrafiskembryoninjektion: A. Borosilikat nål B. 2% Agarose tallrik. C (på) Hårnålsslinga D. Steg för att göra en hårnålsslinga: 1. Placera 1 hår inuti ett glas kapillärrör och lämna cirka 1 centimeter hår utanför röret. 2-3. Krulla hårets ytterspets med hjälp av tång i glaskapärlingröret som bildar en slinga på ~ 0,5 mm längd. 4.Försegla kanten på kapillärröret med en droppe nagellack. 5-6.Försegla en bit eltejp runt kapillären för att skydda den från att gå sönder. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Bild 3. Representativa stereomikroskopbilder av zebrafiskembryon vid 48 timmar efter befruktning (48 hpf): A-A". Normal morfologi hos ett zebrafiskembryon vid 48 hpf utveckling, redo för mikroinjektion B-B". Morfologi av ett zebrafiskembryon som inte har uppnått det adekvata utvecklingsstadiet för mikroinjektioner vid 48 hpf och presenterar redan en viss grad av hjärtödem (svart pilspets) och distended äggula. A' och B' är förstoringar av A respektive B. Skalstänger representerar 500 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Schematisk representation av zebrafisk microinjection plattan inrättas: A. Justering av bedövade embryon i 3% Agar/2% Agarose platta. B. Jag är inte så bra på Grafisk representation av ett 2 dagar efter befruktning zebrafisk embryo, med en svart pil som anger perivitelline utrymme (PVS). C och D. Cancerceller kan injiceras med olika vinklar i PVS injiceras i perivitellinutrymmet (PVS) i ett 48 timmar efter befruktning embryo. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 5. Metastaserad analys. Injicerade embryon efter injektionen (1hpi) sorteras efter frånvaron (NO_circ) eller närvaron (CIRC) av tumörceller i omlopp. Vid 4 dagar efter injektion kvantifieras antalet xenografter i båda grupperna som presenterar mikrometastas. Celler i gruppen (A) NO_circ var tvungna att genomgå alla metastaserade steg för att kunna bilda en mikrometastas, medan celler i CIRC-gruppen (B) endast genomgår de sista stegen i den metastaserade kaskaden. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 6. Representativa fluorescerande stereomikroskop bilder av xenografts vid 1 dag efter injektion och 4 dagar efter injektion. Mänskliga cancerceller som uttrycker fluorescerande protein TdTomato (röd) mikroin injicerades i 2 dpf zebrafiskembryon. Vid 1 dpi, screena de injicerade embryona och kassera de illa injicerade embryona eller embryona med ett ödem (A-A'') sortera de väl injicerade embryona enligt tumörstorlekar (B-B'). C. Representativ kvantifiering av det totala antalet celler som finns i de olika tumör storleks kategorierna vid 1 dpi i SW620 xenografts. Varje punkt representerar en xenograft kvantifierad enligt vad som förklaras i avsnitt 12.At 4 dpi, screenar larverna och kvantifierar de olika klasserna: ingen tumör (D) ; med tumör i PVS (E) och med en mikrometastas i CHT (F). Skalstänger representerar 500 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7. Schematisk representation av xenograft montering för confocal imaging. 1. Exempel på märkning i coverlip Y, ljusblå linje i coverlip X representerar omkretsen där petroleumgel/silikonfett appliceras för att förhindra läckage av monteringsmediet. 2. Exempel på xenograftjustering på coverlip X för konfokal avbildning. 3. Vattenhaltiga monteringsmedier (blå pil) används för att binda täckglas Y ovanpå täckglas X. 4. Exempel på korrekt monterade täcken. 5. Täcklips placeras sedan ovanpå en glasrutschbana och säkras med transparent tejp. 6. Monterade xenografter redo för konfokal avbildning. Skapad BioRender.com Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Bild 8. Visuella representation av confocal mikroskop bild kvantifiering av tumör storlek. Konfokala bilder av en HCT116 xenograft vid 4 dagar efter injektion A. Serie z-stackskivor i DAPI-kanalen som förvärvats med ett intervall på 5 μm. Röda streckade linjer cirklar runt de tre representativa segment som används för cellräkning. B. Jag är inte så bra på Illustration av DAPI nuklei kvantifiering med Cell Counter Plugin i ImageJ / Fiji programvara. C-E. Exempel på encellsupplösning i tumören där det är möjligt att visualisera/kvantifiera mitotiska figurer i DAPI eller använda en fosfo-histon H3-antikropp (grön). D och E är förstoringar av C. Skalstänger representerar 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 9. Representativa resultat. A-E. HCT116 kolorektal cancer cellinje var märkt med Vybrant CM-DiI och injiceras i PVS av 2 dagar post befruktning (dpf) embryon. Efter injektion inkuberades xenografts vid 34 °C. Vid 1 dpi screenades xenografts och distribuerades slumpmässigt i icke-behandlade kontroller och FOLFIRI, behandlas i 3 på varandra följande dagar och fixas till 4 dpi. A.Immunofluorescens utfördes för att upptäcka apoptotiska celler, med hjälp av anti-cleaved Caspase 3 antikroppar och DAPI för nuclei counterstaining. Kvantifiering av mitotiska indexet C, apoptos (% av aktiverade caspase3) D, och tumör storlek E, visade att FOLFIRI inducerar en betydande minskning av mitos (Mann Whitney Test, P<0.0001) och en betydande induktion av apoptos (Mann Whitney test, P<0.0001), åtföljd av en 54% minskning av tumörstorlek (P<0.001). Antalet analyserade xenografter anges i figuren och varje punkt representerar en xenograft. F-H. Representativa bilder av kolorektal cancer xenografts vid 4 dagar efter injektion märkt med mänskliga specifika markörer i grönt (human hLA, ki67 och hMITO) i PVS och CHT I. J-J'. Konfokala bilder av polyklonala xenografter, injicerade med två olika mänskliga kolorektal cancer cellinjer märkta med lipofila färgning CellTracker Deep Red (Cy5 - vit), CellTracker Green CMFDA (488 - grön) och DAPI motstlänsning. K-K'. Konfokala bilder av två olika mänskliga kolorektal cancer cellinjer märkta med lipofila färgning CellTracker Deep Red (Cy5 - vit), Vybrant CM DiI (594 - röd) och DAPI motsträvning. Skalstänger representerar 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Cellinje | vävnad | art | morfologi | Tillväxtläge | Idealisk sammanflöde för injektion | Dissocierande medel för injektion | Dissociationstid | Protokoll för märkning | Injektionsmedium | Dividera det totala antalet celler med (för att uppnå idealisk koncentration för injektion) | |||||||
| SW480 (sw480) | Kolorektal adenocarcinom (primär) | mänsklig | Epitelceller | anhängare | 70% - 75 % | PBS/EDTA 2 mM | 5 minuter | flaska | PBS 1x | 0,25 | |||||||
| SW620 (sw620) | Kolorektal adenocarcinom (metastasering) | mänsklig | Epitelceller | anhängare | 70% - 75 % | PBS/EDTA 2 mM | 5 minuter | flaska | PBS 1x | 0,25 | |||||||
| HCT116 (på 116) | Kolorektal carcinom (primär), Kras mutant | mänsklig | Epitelceller | anhängare | 70% - 75 % | PBS/EDTA 2 mM | 5 minuter | flaska | PBS 1x | 0,25 | |||||||
| HKE3 (hke3) | Kolorektal carcinom, Kras WT | mänsklig | Epitelceller | anhängare | 70% - 75 % | PBS/EDTA 2 mM | 5 minuter | flaska | PBS 1x | 0,25 | |||||||
| HT-29 | Kolorektal adenocarcinom (primär) | mänsklig | Epitelceller | anhängare | 70% - 75 % | PBS/EDTA 2 mM | 5 minuter | flaska | PBS 1x | 0,2 | |||||||
| CACO-2 (caco-2) | Kolorektal adenocarcinom (primär) | mänsklig | Epitelceller | anhängare | 70% - 75 % | PBS/EDTA 1 mM | 5 minuter | 1,5 ml mikrocentrifugrör | Komplett medium | 0,25 | |||||||
| MCF-7 (olika) | Bröst adenocarcinom (metastasering) | mänsklig | Epitelceller | anhängare | 70% - 80 % | PBS/EDTA 1 mM | 5 minuter | 1,5 ml mikrocentrifugrör | 60% FBS + 40% komplett medium | 0,5 | |||||||
| Hs578T (på))hs578T | Bröstkarcinom (primär) | mänsklig | Epitelceller | anhängare | 70% - 75 % | PBS/EDTA 1 mM | 2 minuter | 1,5 ml mikrocentrifugrör | 60% FBS + 40% komplett medium | 0,5 | |||||||
| MDA-MB-468 | Bröst adenocarcinom (metastasering) | mänsklig | Epitelceller | anhängare | 70% - 75 % | PBS/EDTA 1 mM | 8 minuter | 1,5 ml mikrocentrifugrör | 60% FBS + 40% komplett medium | 0,5 | |||||||
| MDA-MB-231 | Bröst adenocarcinom (metastasering) | mänsklig | Epitelceller | anhängare | 70% - 75 % | PBS/EDTA 1 mM | 5 minuter | 1,5 ml mikrocentrifugrör | Komplett medium | 0,5 | |||||||
| RT112 (på andra) | Urinblåsan övergångscell carcinom (primär) | mänsklig | Epitelceller | anhängare | 85% - 90% | TrypLE (olika) | 6 minuter + cellskrapa | 1,5 ml mikrocentrifugrör | Komplett medium | 0,5 | |||||||
| BFTC905 (på franska) | Urinblåsan övergångscell carcinom (primär) | mänsklig | Epitelceller | anhängare | 75% - 85% | TrypLE (olika) | 10 minuter | 1,5 ml mikrocentrifugrör | 80% komplett medium + 20% PBS/EDTA 2 mM | 0,5 | |||||||
| J82 (J82) | Urinblåsan övergångscell carcinom (primär) | mänsklig | Epitelceller | anhängare | 85% - 90% | TrypLE (olika) | 10 minuter | 1,5 ml mikrocentrifugrör | Komplett medium | 0,5 | |||||||
| RT4 (på andra) | Urinblåsan övergångscell carcinom (primär) | mänsklig | Epitelceller | anhängare | 85% - 90% | TrypLE (olika) | 6 minuter | 1,5 ml mikrocentrifugrör | Komplett medium | 0,5 | |||||||
| MIA PaCa-2 | Bukspottskörtele epitheliod carcinom (primär) | mänsklig | Epitelceller | anhängare | 80% - 90% | TrypLE (olika) | 3 minuter | 1,5 ml mikrocentrifugrör | 60% FBS + 40% komplett medium | 0,5 | |||||||
| PANC-1 (på 1) | Bukspottskörtele epitheliod carcinom (primär) | mänsklig | Epitelceller | anhängare | 80% | TrypLE (olika) | 5 minuter | 1,5 ml mikrocentrifugrör | PBS/EDTA 2mM | 0,5 | |||||||
| VC8 (på VC8) | Lungfibroblaster, BRCA2-mutant, HR-brist | Kinesisk hamster | Epitelceller | anhängare | 70% - 80 % | PBS/EDTA 1 mM | 5 minuter | 1,5 ml mikrocentrifugrör | Komplett medium | 0,25 | |||||||
| VC8-B2 (på VC8-B2) | Lungfibroblaster, human BRCA2, BRCA2 −/− HR-brist | Kinesisk hamster | Epitelceller | anhängare | 70% - 80 % | PBS/EDTA 1 mM | 5 minuter | 1,5 ml mikrocentrifugrör | Komplett medium | 0,25 | |||||||
Tabell 1: Optimal in vitro-konfluens för injektion av flera cellinjer
| Cellfärg | Katalognummer | Fluorescensspektrum (Exc. - Em.) | Lagerspädning | Arbetsutspädning för att fläcka i en kolv | Arbetsutspädning för att fläcka i en 1,5 ml mikrocentrifug | Inkubationstid | Observationer | ||||||
| Vybrant CM-DiI | V22888 | 549 nm - 569 nm | Redan utspädd | 4:1000 i PBS 1x | 4:1000 i PBS 1x | 15 min @ 37 ºC + 4 min @ 4 ºC | |||||||
| Vybrant DiO | V22886 | 484 nm - 501 nm | Redan utspädd | 5:1000 i PBS 1x | 5:1000 i PBS 1x | 15 min @ 37 ºC + 4 min @ 4 ºC | Inte bra upplösning i konfokal avbildning vid 4 dagar efter injektion | ||||||
| CellTracker djupröd | C34565 (på 34565) | 630 nm - 660 nm | 1 mM i DMSO | 0,5 - 2,5 μM i PBS 1x | 0,5 - 2,5 μM i PBS 1x | 15 min @ 37 ºC | |||||||
| CellTracker Grön CMFDA | C7025 (på 7025) | 492 nm - 517 nm | 10 mM i DMSO | 0,5 - 2,5 μM i PBS 1x | 0,5 - 2,5 μM i PBS 1x | 15 min @ 37 ºC | Produkten läcker till bukhålan 48 timmar efter injektionen, men idealisk för studier med saminjektion | ||||||
Tabell 2: Färgämne och förhållanden
| storlek | # av larver | E3 1x medelhög volym |
| 100 × 15 mm (standard) | Upp till 50 | 20-25 ml |
| 60 × 15 mm | Upp till 20 | 10 ml |
| 6-brunnsplatta | Upp till 15 per brunn | 3-4 ml per brunn |
Tabell 3: Petri skålalternativ
| E3 medium 50x - lager | För 10 liter sterilt vatten: |
| 146,9 g NaCl | |
| 6,3 g KCl | |
| 24,3 g CaCl2·2H2O | |
| 40,7 g MgSO4·7H2O | |
| E3 medium 1x – klar att användas | 400 ml E3 medium 50x |
| 60 ml 0,01% Metylenblå lösning | |
| Fyll upp till 20 liter fisksystemvatten | |
| Tricaine 25x – bestånd och dödshjälp | 2 g trikainpulver |
| 500 ml omvänd osmosvatten | |
| 10 ml 1 M Tris (pH 9) | |
| Justera till pH 7 | |
| Trikain 1x - Anestesi | 20 ml Tricaine 25x |
| Fyll upp till 500 ml systemvatten | |
| 60 mg/ml Pronase - lager 100x | 1 g pronase |
| 16,7 ml sterilt vatten | |
| 0,6 mg/ml Pronase – 1x klar att användas | 100 μL pronas 100x |
| 9,9 ml E3 medium 1x |
Tabell 4: Lösningskompositioner
Discussion
Zebrafiskens ökande betydelse som modell för cancerutveckling och läkemedelsscreening har resulterat i många publikationer3,4,7,13,14,16,18,19,20,21. Injektionen av cancerceller i zebrafiskembryon är dock en teknik som kräver en hög fingerfärdighet som kan vara utmanande för forskare. I detta protokoll strävar vi efter att ge praktisk information och några tips som kan hjälpa till att övervinna de första utmaningarna med att sätta upp zebrafiskembryon xenografts.
Cellhantering före injektion
Detta optimerade protokoll för generering av zebrafisk xenografter med cellinjer kan anpassas till olika typer av (cancer) celler med olika morfologier. Vi rekommenderar att alla cellinjer som används för zebrafisk xenografts är mykoplasmafria. Till skillnad från andra bakteriella föroreningar genererar närvaron av mykoplasma i cellkulturen inte förändringar som lätt kan detekteras under mikroskopet22. Mykoplasmaförorening kan påverka celllinjernas engraftmentpotential, deras känslighet för droger samt zebrafiskembryons livskraft.
Även om celler kan fortsätta att föröka sig under en längre period, kan deras fenotyp och genotyp vara benägna att förändringar. Det är viktigt att bekanta sig med celllinjernas morfologi och beteende i kulturen. Vi rekommenderar att du behåller antalet cellpassager efter upptining mellan 3-12 för att få reproducerbara resultat. Således bör regelbundna mykoplasmatester utföras.
Cellerna bör vara i sin loggfas (exponentiell tillväxtfas innan de når sammanflöde ~70%) på injektionsdagen. Detta kommer att möjliggöra en adekvat engraftment och korrekt utveckling av de särskiljande kännetecknen för tumör. För att förhindra variation i fenotypen av celler inom xenograften är det viktigt att upprätthålla sammanflödet för injektionskonstant mellan experiment. Antalet injicerade celler kan anpassas till egenskaperna hos varje cellinje eftersom vissa kan kräva högre täthet av injektion för att trivas i zebrafiskembryon.
Överväganden om cellmärkning
För att bättre visualisera mänskliga tumörceller för injektion och framtida analys kan tumörceller märkas med fluorescerande färgämnen. På grund av skillnader i cellstorlek varierar det totala antalet celler/cm2 i vidhäftande kulturer mellan cellinjer. Detta kommer att påverka färgningsprotokollets effektivitet samt antalet celler som skördas för injektion. Stora celler som ger låga tal per kolv (dvs. Hs578T) eller växer i kluster (dvs. BFTC905) kommer att kräva sammanslagning av flera flaskor för ett enda experiment. I detta fall bör färgningen av celler inte utföras direkt i kolven eftersom detta kommer att orsaka användning av alltför stora mängder färgämne (hög kostnad). Å andra sidan kan celler som är mycket känsliga för alltför stora centrifugeringscykler samt celler som ger ett högt antal per kolv (dvs. HCT116) färgas direkt i kolven och sedan lossas med EDTA/cellskrapa (För mer information se tabell 1).
När det är möjligt, i stället för att använda ett enzymatiskt tillvägagångssätt, använd EDTA för att lossa cellerna på injektionsdagen, så att cellerna återhämtar sina cellcellskorsningar snabbare och utsätts för mindre centrifugeringssteg. Men om cellerna är känsliga för EDTA, mycket vidhäftande eller växer i kluster - kan en enzymatisk metod tillämpas. Optimeringen av den idealiska koncentrationen för injektion samt injektionsmediet är beroende av egenskaperna hos varje cellinje, vilket kan behöva vissa justeringar (tabell 1).
Kalibrering av mikroinjektion
I motsats till leverans av oligonukleotider eller läkemedel till zebrafiskembryon används inte en gratikule för att kalibrera nålen när man arbetar med cellinjer för xenografter. Efter en tid under injektionen börjar cellerna täppa till, och det är nödvändigt att skära nålens spets för att öka dess diameter eller byta nålen helt och hållet. Denna procedur hindrar graticulekalibreringen.
För att ta itu med denna fråga regleras antalet celler som dispenseras av utmatningstryck och tid som behövs för att nå en storlek som liknar embryoögat inom 1-3 pulser. För att ytterligare kontrollera tumörstorleken, vid 1 dpi, sorteras xenografter efter tumörstorleken som visas i figur 6 B-B". Som representeras i figur 6C-exempel är denna sorteringsmetod effektiv för att minska variationen av tumörstorlekar: om vi slår samman dem alla (+, ++, +++) är STEV ~dubbelt så stor som ++-klassen (~906 celler till ~422 celler) och koefficientvariationen är ~31,9% jämfört med 14,5% i ++-klassen. Eftersom referensen för injektion är volym varierar det totala antalet celler mycket mellan celltyper - beroende på cellernas storlek och form. Till exempel producerar stora celler med mycket cytoplasma som bröstcancer Hs578T, mycket mindre tumörer (~ 600 celler). Dessutom kräver varje cellinje olika antal celler. Till exempel har HT29 CRC och RT112 urinblåsan cancer cellinjer visat att ju högre antalet celler injiceras, desto högre är zebrafiskdödligheten. Därför behövs en optimeringsperiod vid utveckling av xenografterna för att testa om cellinjen har toxiska effekter i embryot eller kräver högre/lägre densiteter av injektion.
Injektionsställe
En av de vanligaste skillnaderna vid generering av zebrafiskembryon xenografter är injektionsstället. Äggulan är vanligtvis platsen för injektion på grund av dess enkla tillgänglighet. Vi har dock observerat att celler som injiceras i äggulan har en högre tendens att dö. Även om det är tekniskt svårare rekommenderar vi att du injicerar i PVS och så långt som möjligt från hjärtat. Inom PVS kan celler aggregera, rekrytera kärl och immunceller och migrera, intravasat, extravasat och bilda mikrometastas, om de visar metastaseradeegenskaper 8,11.
Engraftment effektivitet
Skillnader i engraftment effektivitet och tumör storlek bland cellinjer vid 4 dpi förväntas på grund av deras distinkta grader av basal cell död /överlevnad/spridning men också på grund av den medfödda immunogenicitet som varje cellinje kan visa9.
metastas
Metastasering består av en multistep kaskad av händelser som kan delas in i två godtyckliga stadier. I det första skedet måste tumörceller lossna från den primära platsen, migrera och invadera intilliggande vävnader och sedan intravasera in i blodomloppet. I det andra steget måste tumörceller överleva i omlopp, extravasera från blodet eller lymfkärlen och slutligen kolonisera på sekundära platser23. För att skilja mellan dessa tidiga och sena händelser och ta itu med potentialen/färdigheterna hos de olika tumörcellerna för att utföra dessa steg, utformade vi en enkel analys.
I allmänhet, när injiceras i PVS, tumörceller kan komma in direkt i omlopp och sedan bli fysiskt fångade i caudal hematopoietic vävnad (CHT) (svans regionen). Men enligt egenskaperna hos varje tumörcell - vi har sett att vissa tumörceller förblir vid CHT 4 dpi och kan bilda mikrometastas medan andra tumörceller försvinner (rensas efter att ha fastnat i CHT).
Genom att jämföra mikrometastasens effektivitet (vid 4 dpi) när celler placerades direkt i omlopp - CIRC (celler behöver bara gå igenom de sena stegen av metastasering) jämfört med när inte - INGEN CIRC (celler måste gå igenom tidiga och sena steg för att kunna bilda en mikrometastas) kan vi bedöma deras tidiga eller sena metastaseringspotential. Vi har observerat tumörceller som effektivt kan bilda mikrometastas i CHT i båda grupperna (CIRC och NO CIRC), vilket tyder på att dessa celler har kapacitet att genomgå alla steg i den metastaserade kaskaden (SW480 och MDA-MB-468 till exempel)8,11. Däremot har andra tumörceller en mycket låg metastaserad potential i båda grupperna, vilket nästan aldrig gör mikrometastas, även när de injiceras i omlopp (dvs. synliga i CHT vid 24 hpi, men vid 4 dpi är de inte längre där, Hs578T tillexempel) 8. Vi har dock tydligt hittat en annan grupp - en som bara kan bilda mikrometastas när den injiceras i omlopp (vi kan bara observera mikrometastas i CIRC-gruppen). Detta tyder på att dessa celler har en låg effektivitet när det gäller att utföra de första stegen i den metastaserade kaskaden men å andra sidan kan överleva i omlopp, extravasera och kolonisera en avlägsen plats.
Immunostaining och avbildning
Före fixering kan detta injektionsprotokoll användas för andra live-avbildningsmetoder som DIC-mikroskopi (Live Differential Interference Contrast), snurrande diskmikroskopi, högupplöst levande konfokal avbildning och ljusplåtmikroskopi etc.
Döda celler och cellulära skräp verkar ljusa när de observeras genom det fluorescerande stereomikroskopet och kan misstas för levande celler, särskilt om syftet med studien är att bedöma celllinjernas metastaserade potential. Vi vill betona vikten av att utföra konfokal avbildning med specifika livskraftsmarkörer och DAPI för att bedöma överlevnadstillståndet för tumör och mikrometastas. Det är också grundläggande att använda specifika mänskliga antikroppar för att upptäcka mänskliga celler som anti-mänskliga mitokondrier eller anti-human HLA. När protokollet implementeras tränar du experimentörögon genom att jämföra färgningen i stereomikroskopet med de konfokala bilderna. Efter en tid kan experimenterare tydligt skilja skräp från levande celler i det fluorescerande stereomikroskopet.
Även om andra metoder för att kvantifiera tumör börda såsom hela fluorescens område används i stor utsträckning, rekommenderar vi att utföra hela mount immunostaining och confocal imaging som en mer exakt metod. Inte bara effektiviteten av lipofila färgfärgning är mycket varierande (dvs. vissa celler är mycket väl färgade medan andra inte - förmodligen på grund av lipidinnehållet i deras membran), men också många gånger lipofila färgämnen bildar aggregat, och döda celler tenderar att vara ljusare - vilket skapar flera artefakter som kan misstas för levande celler.
Celler kan transducera med fluorescerande proteiner för att underlätta spårning och hoppa över cellmärkning. Se dock till att de transduced och icke-transduced cellerna producerar samma resultat i zebrafish xenografts.
Dessutom kan makrofager fagocyter dessa fluorescerande cellrester blir fluorescerande märkta och migrera, vilket genererar falska positiva ögonbevarande celler. Således rekommenderar vi en serie analysverktyg, som naturligtvis kan utökas till många andra avläsningar för en mer exakt tolkning av tumörbeteende:
- Spridning - kvantifiering av mitotiska siffror med DAPI eller anti-pHH3Ser10-antikroppar (Merck Millipore Cat. #06-570),
- Celldöd genom apoptos- antikropp antiaktiverad Caspase3Asp175 (Cell Signalling Technologies Cat. #9661) eller motsvarande,
- Tumörstorlek - DAPI-räkning - mänskliga tumörceller visar en mycket distinkt kromatinorganisation, så de skiljer sig lätt från zebrafiskcellerna och är alltid möjliga att dubbelkolla med färgämnet (när du tränar ditt öga),
- För metastaserande studier, för att otvetydigt upptäcka mänskliga celler, - anti-human HLA (Abcam EP1395Y Cat. #ab52922), anti-human mitokondrier (Merck Millipore Cat. #MAB1273- Klon 113-1).
För ett konfokalt förvärv med 5 μm intervall mellan skivor i Z-stacken av kontrollcancercellerna HCT116 (genomsnittlig nukleär storlek på 10-12 μm diameter) med DAPI-motstning, har vi observerat att ~ 50% av cellerna delas mellan två på varandra följande skivor. Därför, om varje segment räknas, finns det en hög risk att räkna samma celler två gånger. Att gå fram och tillbaka mellan segment för att undvika problem med kvantifiering resulterar i en tidskrävande och felbenägen teknik. För att underlätta kvantifieringen av det totala antalet celler och möjliggöra mer reproducerbarhet mellan forskare skapade vi tumörstorleksformeln som tidigare beskrivits i detta protokoll8.
Vi inkluderade ett korrigeringsnummer (1,5) för att ta hänsyn till de ~50% celler som delas mellan segment. Vi fann att det genomsnittliga felet med manuell räkning av hela tumören mellan forskare var 20%. Två forskare som använde formeln hade ett 2% fel. Användningen av denna formel har en noggrannhet på 93% och 98% reproducerbarhetsgrad. Vi testade också automatiserade metoder, men de visade ett fel som var högre än 50% orsakat av tröskelvärden.
På grund av egenskaperna hos apoptotiska celler är kvantifieringen av aktiverade Caspase 3-celler svårare. För att minska antalet misstag och variationer i resultat rekommenderar vi att kontroll- och experimentella prover räknas av samma forskare. När man lär sig denna teknik måste en ny forskare dessutom räkna bilder som redan kvantifierats av mer erfarna forskare för att jämföra resultat och träna.
Analysens längd kan förlängas vid behov. Det är dock viktigt att tänka på att zebrafisklarver kräver levande utfodring från ~ 7 dagar efter befruktning (5 dagar efter injektion). Dessutom kan djurskyddsriktlinjerna och reglerna som tillämpas på larver äldre än 6 dagar efter befruktning variera.
Detta protokoll ger användbara verktyg för att göra det möjligt för en enda forskare att injicera cirka ~ 200-300 zebrafisklarver per timme; och resultat för den fullständiga analysen, inklusive analys och statistisk tolkning, som erhållits om tre veckor. Vi hoppas att detta protokoll kan hjälpa forskare att bli experter på att generera zebrafisk xenografts. Det är inte lätt; Du måste öva, men du kommer dit. Lycka till!
Disclosures
ingen
Acknowledgments
Vi tackar Champalimaud Foundation, Congento (LISBOA-01-0145-FEDER-022170, medfinansierat av FCT/Lisboa2020) för finansiering. FCT-stipendier för VP (SFRH/BD/118252/2016), MML (PD/BD/138203/2018). Alla medlemmar i Fior Lab för kritiska diskussioner; B. Costa och C. Rebelo de Almeida för att dela data; och våra labmedlemmar C. Rebelo de Almeida, M. Barroso och L. Leite för deras deltagande i videon. Vi vill tacka CF Fish Facility (C. Certal, J. Monteiro et al) och Champalimaud Communication, Events and Outreach team i synnerhet Alexandre Azinheira för det fantastiska filmskapandet och Catarina Ramos och Teresa Fernandes för deras hjälp.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar for bacteriology | VWR | 97064-336 | Agar plate |
| anti-Caspase3Asp175 (Rabbit monoclonal) | Cell Signalling Technologies | 9661 | Primary antibody for whole mount immuno staining (Dilution 1:100) |
| anti-human HLA (Rabbit monoclonal) | Abcam EP1395Y | ab52922 | Primary antibody for whole mount immuno staining (Dilution 1:100) |
| anti- 488 (Rabbit monoclonal) | ThermoFisher Scientific | 35552 | Secondary antibody for whole mount immuno staining (Dilution 1:200) |
| anti- 594 (Rabbit monoclonal) | ThermoFisher Scientific | 35560 | Secondary antibody for whole mount immuno staining (Dilution 1:200) |
| CellTracker Deep Red Dye | ThermoFisher Scientific | C34565 | Lipophilic dye (Dilution 1:1000) |
| CellTracker Green CMFDA Dye | ThermoFisher Scientific | C2925 | Lipophilic dye (Dilution 1:1000) |
| Conical Centrifuge tube 50mL | VWR | 525-0610 | |
| Conical Centrifuge tube 15mL | VWR | 525-0604 | |
| DAPI | Nuclear and chromosome counterstain | ||
| Laser-Based Micropipette Puller P-2000 | Sutter-Instrument | Micropipette Puller | |
| Microcentrifuge tube 1.5mL | Abdos | P10202 | |
| Microscope slides, cut edge | RS France | BPB016 | Slides for mounting |
| Mowiol | Sigma-Aldrich | 81381 | Mounting medium |
| Pneumatic Picopump | World Precision Instruments | PV820 | Microinjector |
| Rectangular cover glasses, Menzel Gläser | ThermoFisher Scientific | 631-9430 | Coverslips for mounting |
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | Agar plate |
| Thin Wall Glass Capillaries | World Precision Instruments | TW100-4 | Borosilicate capillaries |
| TrypLE | Gibco | 12605036 | Enzymatic detachment solution |
| Vaseline | Petroleum jelly for slide sealing | ||
| Vybrant CM-DiI Dye | ThermoFisher Scientific | V22888 | Lipophilic dye (Dilution 1:1000) |
| Vybrant DiO Cell-Labeling Solution | ThermoFisher Scientific | V22886 | Lipophilic dye (Dilution 1:1000) |
| ZEISS Axio Zoom.V16 for Biology | ZEISS | Fluorescence Stereo Zoom Microscope | |
| Zeiss LSM 710 | ZEISS | Confocal microscope |
References
- Gut, P., Reischauer, S., Stainier, D. Y. R., Arnaout, R. Little Fish, Big Data: Zebrafish as a Model for Cardiovascular and Metabolic Disease. Physiological Reviews. 97, 889-938 (2017).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496, 498-503 (2013).
- Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. Journal of Clinical Investigation. 122, 2337-2343 (2012).
- Stoletov, K., Klemke, R. Catch of the day: zebrafish as a human cancer model. Oncogene. 27, 4509-4520 (2008).
- Weintraub, A. All eyes on zebrafish. Lab Animals. 46, 323-326 (2017).
- Novoa, B., Figueras, A. Zebrafish: Model for the Study of Inflammation and the Innate Immune Response to Infectious Diseases. Current Topics in Innate Immunity II. Lambris, J. D., Hajishengallis, G. , Springer. 253-275 (2012).
- Fazio, M., Ablain, J., Chuan, Y., Langenau, D. M., Zon, L. I. Zebrafish patient avatars in cancer biology and precision cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 20, 263-273 (2020).
- Fior, R., et al. Single-cell functional and chemosensitive profiling of combinatorial colorectal therapy in zebrafish xenografts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 8234-8243 (2017).
- Póvoa, V., et al. Innate immune evasion revealed in a colorectal zebrafish xenograft model. Nature Communications. 12, 1156 (2021).
- Galletti, G., et al. Targeting Macrophages Sensitizes Chronic Lymphocytic Leukemia to Apoptosis and Inhibits Disease Progression. Cell Reports. 14, 1748-1760 (2016).
- Rebelo de Almeida, C., et al. Zebrafish xenografts as a fast screening platform for bevacizumab cancer therapy. Communications Biology. 3, 1-13 (2020).
- Varanda, A. B., Martins-Logrado, A., Godinho Ferreira, M., Fior, R. Zebrafish Xenografts Unveil Sensitivity to Olaparib beyond BRCA Status. Cancers. 12, 1769 (2020).
- Osmani, N., Goetz, J. G. Multiscale Imaging of Metastasis in Zebrafish. Trends in Cancer. 5, 766-778 (2019).
- Hyenne, V., et al. Studying the Fate of Tumor Extracellular Vesicles at High Spatiotemporal Resolution Using the Zebrafish Embryo. Developmental Cell. 48, 554-572 (2019).
- Costa, B., et al. Developments in zebrafish avatars as radiotherapy sensitivity reporters - towards personalized medicine. EBioMedicine. 51, 102578 (2020).
- Costa, B., Estrada, M. F., Mendes, R. V., Fior, R. Zebrafish Avatars towards Personalized Medicine-A Comparative Review between Avatar Models. Cells. 9, 293 (2020).
- TRICAINE - Protocols. ZFIN Community Wiki. , Available from: https://wiki.zfin.org/display/prot/TRICAINE (2021).
- Zhao, C., et al. A Novel Xenograft Model in Zebrafish for High-Resolution Investigating Dynamics of Neovascularization in Tumors. Plos One. , (2011).
- Veinotte, C. J., Dellaire, G., Berman, J. N. Hooking the big one: the potential of zebrafish xenotransplantation to reform cancer drug screening in the genomic era. Disease Models & Mechanisms. 7, 745-754 (2014).
- Haldi, M., Ton, C., Seng, W. L., McGrath, P. Human melanoma cells transplanted into zebrafish proliferate, migrate, produce melanin, form masses and stimulate angiogenesis in zebrafish. Angiogenesis. 9, 139-151 (2006).
- Zon, L. I., Peterson, R. The New Age of Chemical Screening in Zebrafish. Zebrafish. 7, 1 (2010).
- Mycoplasma Contamination of Cell Cultures. InvivoGen. , Available from: https://www.invivogen.com/review-mycoplasma (2016).
- van Zijl, F., Krupitza, G., Mikulits, W. Initial steps of metastasis: cell invasion and endothelial transmigration. Mutation Research. 728, 23-34 (2011).
