Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Snelle antimicrobiële gevoeligheidstests door gestimuleerde Raman-verstrooiing Beeldvorming van deuteriumincorporatie in een enkele bacterie

Published: February 14, 2022 doi: 10.3791/62398
Automatic Translation
1,2, 3, 1,2,4,5
1Department of Electrical and Computer Engineering, Boston University, 2Boston University Photonics Center, Boston University, 3Department of Biomedical Sciences and Pathobiology, Virginia-Maryland College of Veterinary Medicine, Virginia Polytechnic Institute and State University, 4Department of Biomedical Engineering, Boston University, 5Department of Chemistry, Boston University

Summary

Dit protocol presenteert een snelle antimicrobiële gevoeligheidstest (ASAT) binnen 2,5 uur door eencellige gestimuleerde Raman-verstrooiingsbeeldvorming van het D2O-metabolisme. Deze methode is van toepassing op bacteriën in de urine of volbloedomgeving, die transformerend is voor snelle eencellige fenotypische ASAT in de kliniek.

Abstract

Om de verspreiding van antimicrobieel resistente infecties te vertragen en te voorkomen, is het dringend noodzakelijk om de antimicrobiële effecten op pathogenen kwantitatief te bepalen. Het duurt meestal dagen om de AST te voltooien met conventionele methoden op basis van de langdurige cultuur, en ze werken niet direct voor klinische monsters. Hier rapporteren we een snelle AST-methode die mogelijk wordt gemaakt door gestimuleerde Raman-verstrooiing (SRS) beeldvorming van deuteriumoxide (D2O) metabole opname. Metabole opname van D2O in biomassa en de metabole activiteitsremming bij blootstelling aan antibiotica op het niveau van één bacterie worden gemonitord door SRS-beeldvorming. De single-cell metabolism inactivation concentration (SC-MIC) van bacteriën bij blootstelling aan antibiotica kan worden verkregen na een totaal van 2,5 uur monstervoorbereiding en -detectie. Bovendien is deze snelle AST-methode direct toepasbaar op bacteriële monsters in complexe biologische omgevingen, zoals urine of volbloed. SRS metabole beeldvorming van deuteriumincorporatie is transformerend voor snelle eencellige fenotypische ASAT in de kliniek.

Introduction

Antimicrobiële resistentie (AMR) is een groeiende wereldwijde bedreiging voor de effectieve behandeling van infectieziekten1. Er wordt voorspeld dat AMR tegen 2050 nog eens 10 miljoen doden per jaar en $ 100 biljoen wereldwijd bbp-verlies zal veroorzaken als er geen actie wordt ondernomen voor de bestrijding van antibioticaresistente bacteriën 1,2. Dit benadrukt de dringende behoefte aan snelle en innovatieve diagnostische methoden voor antibioticagevoeligheidstests (ASAT) van infectieuze bacteriën om de opkomst van antibioticaresistente bacteriën te vertragen en het gerelateerde sterftecijfer te verminderen3. Om het best mogelijke klinische resultaat te garanderen, is het cruciaal om binnen 24 uur effectieve therapie te introduceren. De huidige gouden standaardmethode, zoals schijfdiffusie of bouillonverdunningsmethode, vereist echter meestal ten minste 24 uur voor de pre-cubatieprocedure voor klinische monsters en een extra 16-24 uur om de resultaten van de minimale remmende concentratie (MIC) te verkrijgen. Over het algemeen zijn deze methoden te tijdrovend om een onmiddellijke beslissing voor infectieziektebehandeling in de kliniek te begeleiden, wat leidt tot het ontstaan en de verspreiding van antimicrobiële resistentie4.

Genotypische AST-methoden, zoals polymerasekettingreactie (PCR)-gebaseerde technieken5, zijn ontwikkeld voor snelle detectie. Dergelijke technieken meten de specifieke resistentie genetische sequenties om snelle AST-resultaten te verkrijgen. Ze zijn niet afhankelijk van tijdrovende celkweek; alleen specifieke bekende genetische sequenties met resistentie worden echter getest. Daarom is de toepassing ervan beperkt tot verschillende bacteriesoorten of verschillende resistentiemechanismen. Ook kunnen ze geen MIC-resultaten leveren voor therapiebeslissingen 6,7. Bovendien zijn er nieuwe fenotypische methoden voor snelle ASAT in ontwikkeling om deze beperkingen te overwinnen8, waaronder microfluïdische apparaten 9,10,11,12,13, optische apparaten 14,15,16, fenotypische AST die de nucleïnezuren kwantificeert kopie nummer 17,18, en Raman spectroscopische methoden19, 20,21,22,23,24. Deze methoden verkorten de tijd om AST-resultaten te begeleiden, maar de meeste zijn alleen van toepassing op bacteriële isolaten, niet rechtstreeks op klinische monsters, en vereisen nog steeds langdurige pre-incubatie.

In dit werk presenteren we een methode voor snelle bepaling van de gevoeligheid van bacteriën in de urine en volbloed via monitoring van de cellulaire metabole activiteit door SRS-beeldvorming. Water (H2O) neemt deel aan de overgrote meerderheid van essentiële biomoleculaire syntheseprocessen in levende cellen. Als een isotopoloog van water, door middel van een enzymgekatalyseerde H/D-uitwisselingsreactie tussen het redox-actieve waterstofatoom in NADPH en het D-atoom in D2O, kan deuterium worden opgenomen in biomassa in een cel25,26. Een gedeutereerde vetzuursynthesereactie wordt gemedieerd door het deuterium gelabelde NADPH. De D2O-opname in reacties van aminozuren (AA's) resulteert in de gedeutereerde eiwitproductie26 (figuur 1). Op deze manier kunnen de nieuw gesynthetiseerde C-D-bindingsbevattende biomoleculen in enkele microbiële cellen worden gebruikt als een algemene metabole activiteitsmarker die moet worden gedetecteerd. Om de novo gesynthetiseerde C-D-bindingen uit te lezen, wordt Raman-spectroscopie, een veelzijdig analytisch hulpmiddel dat specifieke en kwantitatieve chemische informatie over biomoleculen biedt, veel gebruikt om antimicrobiële gevoeligheid te bepalen en de testtijd aanzienlijk te verkorten tot een paar uur 27,28,29,30 . Vanwege de inherente lage efficiëntie van het Raman-verstrooiingsproces is de spontane Raman-spectroscopie echter van lage detectiegevoeligheid. Daarom is het een uitdaging om real-time beeldresultaten te verkrijgen met behulp van spontane Raman-spectroscopie. Coherente Raman-verstrooiing (CRS), inclusief coherente anti-Stokes Raman-verstrooiing (CARS) en gestimuleerde Raman-verstrooiing (SRS), heeft een hoge detectiegevoeligheid bereikt vanwege het coherente lichtveld om ordes van grootte te genereren die groter zijn dan die van spontane Raman-spectroscopie, waardoor snelle, specifieke en kwantitatieve chemische beeldvorming op het niveau van één cel 31,32,33,34,35 wordt weergegeven ,36,37,38,39.

Hier, op basis van ons meest recente werk40, presenteren we een protocol voor snelle bepaling van de metabole activiteit en antimicrobiële gevoeligheid door femtoseconde SRS C-D beeldvorming van D2O opname van bacteriën in het normale medium, urine en volbloedomgeving op het niveau van één cel. Femtoseconde SRS-beeldvorming vergemakkelijkt het monitoren van de single cell metabolism inactivation concentration (SC-MIC) tegen antibiotica op het niveau van de enkele bacterie binnen 2,5 uur. De SC-MIC-resultaten worden gevalideerd door standaard MIC-test via bouillonmicroverdunning. Onze methode is toepasbaar voor het bepalen van antimicrobiële gevoeligheid van bacteriën urineweginfectie (UTI) en bloedbaaninfectie (BSI) pathogenen met een veel kortere testtijd in vergelijking met de conventionele methode, die de mogelijkheid opent voor snelle fenotypische AST in de kliniek op het niveau van één cel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Het gebruik van menselijke bloedmonsters is in overeenstemming met de richtlijnen van de IRB van Boston University en de National Institutes of Health (NIH). Concreet zijn de exemplaren afkomstig van een bank en zijn ze volledig gedeïdentificeerd. Deze exemplaren worden niet beschouwd als menselijke proefpersonen door het bureau van de Institutional Review Board (IRB) aan de Universiteit van Boston.

1. Bereiding van de voorraadoplossing voor bacteriën en antibiotica

  1. Bereid de antibiotica (gentamicinesulfaat of amoxicilline) stamoplossing in een concentratie van 1 mg / ml opgelost in steriel1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) of dimethylsulfoxide (DMSO) oplosmiddel in microbuizen van 1,5 ml. Los gentamicinesulfaat op in steriele PBS-oplossing en amoxicilline in steriel DMSO-oplosmiddel. Bewaar daarna de antibiotica-oplossing bij 2-8 °C zoals voorgesteld.
  2. Om D2O met kation-aangepaste Mueller-Hinton Broth (MHB) media te maken, voegt u 220 mg MHB-bouillonbasis toe aan 10 ml D2O om 100% D2O-bevattend medium te maken. Steriliseer de oplossing door te filteren met filters van 200 nm poriegrootte.
    OPMERKING: Gebruik dit protocol altijd voor het maken en steriliseren van mediumoplossingen in verdere stappen.
  3. Om bacteriële monsters voor te bereiden op SRS-beeldvorming, voegt u 2 ml normale MHB-media, die geen deuterium bevatten, toe aan een steriele kweekbuis met ronde bodem en vervolgens prewarmen bij 37 °C.
  4. Gebruik een steriele lus om één bacteriële (Escherichia coli BW 25113 of Pseudomonas aeruginosa ATCC 47085) kolonie uit de verse cultuur te selecteren op een tryptische soja-agarplaat. Hang het vervolgens op in de voorgewarmde kweekmedia en vortex voorzichtig om de bacteriesuspensie voor te bereiden.
  5. Incubeer bacteriën bij 37 °C in een shaker met 200 omwentelingen per minuut (rpm) totdat deze de logaritmische fase bereikt.

2. D2O-opnamebehandeling in aanwezigheid van antibiotica (figuur 2a)

  1. Controleer de bacteriële concentratie door de optische dichtheid (OD) te meten met een fotometer op een golflengte van 600 nm.
  2. Verdun de bacteriële oplossing met behulp van het normale MHB-medium, dat geen deuterium bevat, om een uiteindelijke celconcentratie van 8 x 105 CFU / ml te bereiken. Vortex voorzichtig om de bacteriële cellen te mengen.
  3. Bereid 300 μL aliquots van de bacteriële oplossing in zeven microbuizen van 1,5 ml en 600 μL aliquots van de bacteriële oplossing in één microbuis van 1,5 ml.
  4. Voeg 4,8 μL antibioticum (gentamicine of amoxicilline) stamoplossing (1 mg/ml) toe aan de microbuis met 600 μL van de bacteriële oplossing, om de uiteindelijke antibioticaconcentratie op 8 μg/ml te brengen.
  5. Neem 300 μL oplossing uit de 8 μg/ml antibioticabevattende bacterieoplossing en voeg toe aan nog eens 300 μL bacteriële oplossing om een tweevoudige verdunde antibioticum- (4 μg/ml) bevattende bacterieoplossing te maken.
  6. Herhaal de tweevoudige seriële verdunning van de testantibiotica, gentamicine of amoxicilline, totdat de microbuis met de laagste concentratie (0,25 μg/ml) is bereikt en gooi 300 μL uit de buis. Voor zowel gentamicine als amoxicilline variëren de seriële concentraties van 0,25 μg/ml tot 8 μg/ml.
    1. Laat één buis zonder antibiotica voor blanco controle. Dit zal de positieve controle zijn om de bacteriële metabole activiteit te inspecteren zonder antibioticabehandeling maar met D2O-behandeling.
    2. Laat één buis zonder antibiotica en geen D2O voor de negatieve controle.
  7. Incubeer het bacteriële aliquot met het bepaalde antibioticum (gentamicine of amoxicilline) dat MHB-medium bevat gedurende 1 uur.
  8. Bereid tijdens de incubatie een seriële verdunning van antibiotica met 100% D2O bevattend medium met dezelfde concentratiegradiënt van antibiotica bereid in stap 2.6. Voor zowel gentamicine als amoxicilline variëren de seriële concentraties van 0,25 μg/ml tot 8 μg/ml.
  9. Voeg na 1 uur antibioticabehandeling respectievelijk 700 μL serieel verdund antibioticum en 100% D2O-bevattend MHB-medium toe aan de 300 μL antibiotica-voorbehandelde bacteriën in dezelfde antibioticaconcentratie (bereid in stap 2.6).
    1. Voeg bijvoorbeeld 700 μL 100% D2O-bevattend MHB-medium (met 8 μg/ml antibioticum) toe aan de 300 μL van 8 μg/ml antibiotica-voorbehandelde bacteriën. Breng op dezelfde manier over naar de overeenkomstige buizen van de volgende concentratie en homogeniseer door meerdere keren op en neer te pipetteren.
    2. Voeg 700 μL antibioticavrij 100% D2O-bevattend MHB-medium toe aan 300 μL antibioticavrije bacteriën (bereid in stap 2.6.1) als blanco controle.
    3. Incubeer bij 37 °C in een incubatieschudder bij 200 tpm gedurende nog eens 30 minuten.
      OPMERKING: In deze stap is de uiteindelijke concentratie van D2O in het medium voor de test 70%.
  10. Centrifugeer eerst het 1 ml antibioticum en het met D2O behandelde bacteriële monster bij 6200 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C en was vervolgens tweemaal met gezuiverd water. Ten slotte, bevestig monsters in 10% formaline-oplossing en bewaar ze bij 4 °C.

3. Bereiding van bacteriën in urineomgeving (figuur 2b)

  1. Om E. coli BW 25113 in de logaritmische fase te bereiden, volgt u de stappen in 1.4 en 1.5.
  2. Controleer de bacteriële concentratie door de OD te meten met een fotometer op een golflengte van 600 nm.
  3. Om de klinische UTI-monsters 14,18,41 na te bootsen, piekt u de E. coli-oplossing in 10 ml gedeïdentificeerde urine om een uiteindelijke celconcentratie van 10 6 CFU / ml te bereiken.
  4. Filter de E. coli-geprikte urine met behulp van een filter van 5 μm en verdeel vervolgens de bacteriële oplossing in 300 μL-aliquots in zeven microbuizen van 1,5 ml en 600 μL-aliquots van de bacteriële oplossing in één microbuis van 1,5 ml.
  5. Voer de D2O-opnamebehandeling uit in aanwezigheid van antibiotica en monsterverzameling zoals beschreven in de vorige stappen van 2.4 tot 2.10.

4. Bereiding van bacteriën in het bloedmilieu (figuur 2c)

  1. Om Pseudomonas aeruginosa ATCC 47085 in de logaritmische fase te bereiden, volgt u de stappen in 1.4 en 1.5.
  2. Om de klinische bloedbaaninfecties monsters42,43 na te bootsen, spike P. aeruginosa in 1 ml gedeïdentificeerd menselijk bloed om een concentratie van 107 CFU / ml te bereiken.
  3. Voeg 9 ml steriel gezuiverd water toe om het bloed te lyseren.
  4. Filtreer het P. aeruginosa spiked bloed met behulp van een 5 μm filter. Oogst vervolgens bacteriën tot 1 ml volume door centrifugeren bij 6200 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.  Voeg 9 ml voorverwarmde normale MHB toe aan de bacterie-oplossing en vortex voorzichtig. De uiteindelijke concentratie van bacteriën is 106 CFU / ml
  5. Verdeel de P. aeruginosa spiked bloedoplossing in 300 μL aliquots in zeven 1,5 ml microbuizen en 600 μL aliquots van de bacteriële oplossing in één 1,5 ml microbuisjes.
  6. Voer de D2O-opnamebehandeling uit in aanwezigheid van antibiotica en monsterverzameling zoals beschreven in de vorige stappen van 2.4 tot 2.10.

5. SRS-beeldvorming van D2O metabole opname in een enkele bacterie

  1. Was 1 ml vaste bacterieoplossing met gezuiverd water en centrifugeer vervolgens op 6200 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Verwijder het supernatant. Verrijk de bacteriële oplossing tot ongeveer 20 μL.
  2. Deponeer de bacteriële oplossing op een poly-L-lysine gecoat coverglass. Sandwich en verzegel het monster voor SRS-beeldvorming.
  3. Beeld bacteriën op de C-D trillingsfrequentie bij 2168 cm-1 met behulp van een SRS microscoop.
    1. Voer de golflengte van de pomp in en stem deze af op 852 nm met behulp van de besturingssoftware op een computer.
    2. Meet het laservermogen met behulp van een vermogensmeter. Stel het vermogen van de pomplaser op het monster in op ~ 8 mW en het vermogen van de Stokes-laser op het monster op ~ 40 mW door de halfgolfplaat voor de laseruitgang aan te passen.
      OPMERKING: In de SRS-microscoop levert een instelbare femtosecondelaser met een herhalingsfrequentie van 80 MHz de pomp (680 tot 1300 nm) en Stokes (1045 nm) excitatielasers.
  4. Door de schroeven van de reflectiespiegels af te stellen, de pomp- en Stokes-stralen ruimtelijk uit te lijnen en de twee stralen in een rechtopstaande microscoop te leiden die is uitgerust met een 2D galvo-spiegelsysteem voor laserscanning.
    1. Gebruik een 60x water onderdompeling objectief om de pomp en Stokes lasers op het monster te richten.
    2. Gebruik een oliecondensor om de signalen van het monster in voorwaartse richting te verzamelen.
    3. Gebruik een bandpass-filter om de Stokes-laser eruit te filteren voordat u deze in een fotodiode richt.
    4. Extraheer het gestimuleerde Raman-signaal door een lock-in versterker en detecteer de signalen door de fotodiode.
  5. Stel elke SRS-afbeelding in op 200 x 200 pixels en de pixel dwell-tijd op 30 μs in het bedieningspaneel van de software. De totale acquisitietijd voor één afbeelding is ~1,2 s. Stel de stapgrootte in op 150 nm, zodat de afbeeldingsgrootte ongeveer 30 x 30 μm2 is. Afbeelding van ten minste drie weergaven voor elk voorbeeld.

6. Beeldverwerking en data-analyse ( Figuur 3)

  1. Om de gemiddelde C-D signaalintensiteit te verkrijgen, opent en verwerkt u SRS-beelden met ImageJ-software.
  2. Converteer eerst SRS-afbeeldingen naar 8-bits typeafbeeldingen met omgekeerde kleuren door op Afbeelding | Type | 8-bits en vervolgens | bewerken Knoppen omkeren in de ImageJ-software.
  3. Filter vervolgens de afbeeldingen met Gaussiaanse vervaging door te klikken op Proces | Filters | Gaussische vervaging knoppen en stel de Sigma (Radius) in op 1.
  4. Gebruik de aanpassing van de afbeeldingsdrempel om het bacteriële gebied te selecteren. Klik op Afbeelding | | aanpassen Drempelwaarde om ervoor te zorgen dat de geselecteerde bacteriegrootten overeenkomen met die in de oorspronkelijke SRS-afbeeldingen. Elimineer kleine deeltjes door de groottedrempel aan te passen om de deeltjes te bepalen. Klik op Toepassen.
  5. Analyseer | toepassen Deeltjesanalyseknoppen om het gebied van bacteriën te labelen en te bepalen.
  6. Door op de knop Alles weergeven in de ROI-manager naar de oorspronkelijke onbewerkte SRS-afbeelding te klikken, labelt u hetzelfde bacteriegebied en bepaalt u de gemiddelde intensiteit van elk gegevenspunt door op de knop Meten in de ROI-manager te klikken.
  7. Omcirkel het achtergrondgebied in de oorspronkelijke SRS-afbeelding en meet de gemiddelde intensiteit van de achtergrond. De gemiddelde C-D-intensiteiten van elke bacterie worden verkregen door de intensiteit van het achtergrondsignaal af te trekken.

7. Kwantificering van antimicrobiële gevoeligheid via SC-MIC

OPMERKING: De afkapwaarde op 0,60 om de SC-MIC te bepalen, wordt vastgesteld volgens de statistische analyse van de SRS C-D-intensiteiten van de metabolisme-actieve en metabolisme-geremde omstandigheden voor bacteriën bij verschillende concentraties van blootstelling aan geneesmiddelen40. De C-D-intensiteiten voor de antibioticagevoelige en antibioticaresistente groepen werden voorzien van een normale verdeling.

  1. Zet de ROC-curve (Receiver Operating Characteristic) uit en evalueer de afkapdrempel op 0,60. Op basis van deze afkapwaarde kan de SC-MIC als indicator van de werkzaamheid van antibiotica worden gedefinieerd om de metabolisch inactieve en metabolisch actieve groep te bepalen.
  2. Om de SRS-beeldvormingsgegevens kwantitatief te analyseren, plott u de histogrammen van C-D-signaalintensiteiten voor elke bacteriegroep die wordt behandeld met de serieel verdunde antibioticaconcentratie. De gekleurde datapunten staan voor verschillende individuele bacteriën.
  3. Normaliseer de C-D-intensiteiten van de met antibiotica behandelde groep tot de gemiddelde intensiteit van de controlegroep zonder antibioticabehandeling. Bepaal de SC-MIC-resultaten van verschillende bacterie- en antibioticacombinaties door de SRS-signaalintensiteiten in het C-D-gebied versus verschillende concentraties antibiotica te kwantificeren met behulp van de afkapwaarde op 0,60.
  4. Valideer en vergelijk de SC-MIC-uitlezing met de MIC die is bepaald met behulp van conventionele bouillonmicroverdunningstest.
  5. Volgens het Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) wordt de gevoeligheidscategorie op basis van de SRS metabole beeldvormingsresultaten voor elke geteste bacteriestam geïnterpreteerd als "vatbaar", "resistent" of "intermediair".

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Het effect van incubatietijd op de opname van deuterium wordt gemeten door spontane Raman-microspectroscopie in het C-D (2070 tot 2250 cm-1) en C-H (2.800 tot 3.100 cm-1) gebied (figuur 4a). De time-lapse eencellige Raman-spectra van P. aeruginosa gekweekt in 70% D2O met medium vertonen een toenemende CD / CH-intensiteit gedurende de incubatietijd van 0 tot 180 min. (Figuur 4b) De toenemende C-D-abundantie in enkele microbiële cellen onthult dat D2O wordt opgenomen in gedeutereerde biomoleculen in de cel.

D2O-etikettering boven 50% beïnvloedt het bacteriële metabolisme aanzienlijk tijdens een incubatietijd van 23 uur27. We hebben bacteriële groeiremming waargenomen wanneer de D2O-etiketteringsconcentratie hoger is dan 70% tijdens een incubatietijd van 25 uur (figuur S1). We hebben MIC uitgevoerd door gouden standaard bouillonverdunning en SC-MIC-resultaten verkregen in twee P. aeruginosa-stammen (P. aeruginosa ATCC 47085 en P. aeruginosa 1133) (tabel S1). Onze huidige resultaten tonen aan dat 70% D2O geen invloed heeft op de prestaties van onze methode in P. aeruginosa. De categorieovereenkomst van onze SC-MIC-methode met de conventionele op cultuur gebaseerde methode is 100% voor alle geteste P. aeruginosa - en antibioticacombinaties, zoals weergegeven in tabel S1. We schrijven deze goede overeenkomst toe aan de minimale toxiciteit van 70% D2O op P. aeruginosa tijdens de incubatietijd van 30 minuten in SC-MIC-bepaling.

Volgens het protocol werd P. aeruginosa geïncubeerd met serieel verdund gentamicine gedurende 1 uur en vervolgens 70% D2O gedurende nog eens 30 minuten. SRS metabole beeldvorming bij ~2168 cm-1 (figuur 5a) werd uitgevoerd. De C-D-intensiteiten bij antibioticabehandeling worden gedeeld door de gemiddelde waarde van de controlegroep, die geen antibioticabehandeling heeft. De kwantitatieve statistische analyse (figuur 5b) toonde aan dat C-D-signalen van P. aeruginosa significant lager waren bij 2 μg/ml of hogere gentamicineconcentratie dan die zonder gentamicinebehandeling (0 μg/ml). Met behulp van de cut-off drempel op 0,60 werd de P. aeruginosa metabolisch geremd bij 2 μg / ml en hogere concentraties gentamicine. De stippellijn toont de gedefinieerde afkapwaarde op 0,60 in figuur 5b. Op deze manier werd de SC-MIC voor P. aeruginosa tegen gentamicine in normaal MHB-medium bepaald op 2 μg/ml. Deze SC-MIC-waarde wordt geverifieerd binnen het éénvoudige verschilbereik met de MIC (4 μg/ml) bepaald door de bouillonmicroverdunningsmethode (figuur 5c). Alles bij elkaar maakt SC-MIC, bepaald door onze technologie, kwantificering van antimicrobiële gevoeligheid mogelijk.

Om het potentieel van snelle AST door SRS-beeldvorming van deuteriummetabool incorporatie voor klinische toepassingen te onderzoeken, vooral voor de meest voorkomende UTI-infectie, hebben we een urinemonster met bacteriën getest met behulp van E. coli, de meest voorkomende ziekteverwekker die UTI-infectie veroorzaakt44. Om de klinische UTI-monsters na te bootsen bij een relavent bacteriële concentratie, wordt E. coli toegevoegd aan de gedeïdentificeerde urine tot een uiteindelijke concentratie van 106 CFU / ml. Na monsterzuivering werden de urinemonsters geïncubeerd met amoxicilline en D2O. De schone achtergrond in de SRS-beelden toonde aan dat het monstervoorbereidingsprotocol toepasbaar was voor snelle AST-meting (figuur 5d). De SC-MIC voor het E. coli-spiked urinemonster tegen amoxicilline werd vastgesteld op 4 μg/ml (figuur 5e), die dezelfde gevoeligheidsuitlezing heeft als de MIC (8 μg/ml) volgens de conventionele bouillonverdunningsmethode voor zuivere E. coli in normaal MHB-medium (figuur 5f). Deze resultaten toonden gezamenlijk aan dat snelle ASAT door SRS-beeldvorming van deuteriummetaboolische opname een groot potentieel heeft voor klinische diagnose van UTI-infectieuze pathogenen.

In vergelijking met UTI-infectie is snelle AST voor BSI-pathogenen veel uitdagender voor in situ studie van bacteriële metabole activiteit, omdat veel bloedcellen in bloed aanwezig zijn. Om de toepasbaarheid van snelle AST door SRS-beeldvorming van D2O metabole opname voor klinische BSI-monsters te onderzoeken, werd P. aeruginosa in gedeïdentificeerd menselijk bloed gedetecteerd. Zoals te zien is in figuur 5g, werd de C-D-intensiteit van het SRS-beeld bij 2168 cm-1 gedomineerd door bacteriële signalen. Omdat de rode bloedcellen geen metabole activiteit hebben om D2O op te nemen voor verdere biosynthese, zijn de C-D-signalen afkomstig van de metabole deuteriumincorporatie van levende bacteriën. De fase-kruisingsmodulatie of fotothermische signaal van puin of rode bloedcellen droeg bij aan de zwakke achtergrondsignalen, zonder de kwantitatieve analyse van de SC-MIC te beïnvloeden. Het SC-MIC-resultaat voor P. aeruginosa in het bloed werd vastgesteld op 2 μg/ml (figuur 5h), wat goed overeenkwam met het conventionele standaard MIC-resultaat voor P. aeruginosa in normaal groeimedium (figuur 5i). Samen toonden deze resultaten aan dat SRS metabole beeldvorming van deuterium metabole opname een snelle AST-methode kan zijn om de SC-MIC voor bacteriën bij BIS-infecties te bepalen.

Figure 1
Figuur 1: Schema voor D2O-opname in gedeutereerd lipide en eiwit25,26. Deuterium kan worden opgenomen in biomassa in een cel door middel van enzym-gekatalyseerde H / D-uitwisselingsreactie tussen het redox-actieve waterstofatoom in NADPH en het D-atoom in D2O. Gedeutereerde vetzuursynthesereactie wordt gemedieerd door het deuterium gelabelde NADPH. De D2O-opname in reacties van aminozuren resulteert in de productie van gedeutereerde eiwitten. Dit cijfer is gewijzigd van ref.40. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Workflow van snelle ASAT door SRS metabole beeldvorming van deuterium incorporatie. a) D2O-opnamebehandeling in aanwezigheid van antibiotica in MHB-medium en de volgende SRS-beeldvormingsprocedures. b) Bereiding van bacteriën in urinemilieu. c) Bereiding van bacteriën in het bloedmilieu. Dit cijfer is gewijzigd van ref.40. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3. Geautomatiseerde beeldverwerking en gegevensinterpretatie. (a) Onbewerkte SRS-afbeelding. b) Afbeelding na aanpassing van de intensiteitsdrempel om het gebied van bacteriële cellen te bepalen. c) Gegevenspunten die na de deeltjesanalysestap zijn geselecteerd. d) De overeenkomstige gegevenspunten worden geselecteerd in de onbewerkte afbeelding. e) Resultaten van de overeenkomstige gegevenspunten in de onbewerkte afbeelding. f) Statistische resultaten van de gemiddelde intensiteit van de gegevenspunten na aftrek van de achtergrond. Schaalbalk: 10 μm. Dit cijfer is gewijzigd van ref.40. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4. Effect van incubatietijd op de opname van deuterium in bacteriën. (a) Time-lapse-meting in C-D (2070 tot 2250 cm-1) en C-H (2.800 tot 3.100 cm-1) gebied door spontane Raman-microspectroscopie (gemiddeld van 20 spectra). b) Histogramplot van cd/ch-intensiteitsverhouding plot over D2O incubatietijd voor bacteriën in (a). Elk gekleurd punt staat voor een meting van een enkele bacterie. Foutbalken vertegenwoordigen de standaardfout van het gemiddelde (SEM). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 5
Figuur 5. SC-MIC-bepaling met behulp van SRS-beeldvorming van bacteriële metabole opname van D2O tegen antibiotica in normaal medium, urine en bloedomgeving. a) SRS-beeldvorming bij C-D-trillingen (2168 cm-1) en de overeenkomstige transmissiebeelden van P. aeruginosa in aanwezigheid van D2O met toevoeging van serieel verdund gentamicine in normaal MHB-medium. b) Kwantitatieve analyse van de SRS C-D-intensiteit van P. aeruginosa onder a). De gekleurde datapunten in het histogram staan voor de verschillende individuele bacteriën. De stippellijn geeft de afkapwaarde aan op 0,60. c) de vergelijking van de SC-MIC-uitlezing met de MIC door middel van de bouillonmicroverdunningsmethode en de gevoeligheidscategorie voor P. aeruginosa volgens de CLSI. d) SRS-beeldvorming bij C-D-trillingen (2168 cm-1) en overeenkomstige transmissiebeelden van E. coli in de urine na incubatie in D2O met de serieel verdunde amoxicilline. e) Kwantitatieve analyse van de SRS C-D-intensiteit onder d). f) De vergelijking van de SC-MIC-uitlezings- en gevoeligheidscategorie voor E. coli in normale MHB en in urine. g) SRS-beeldvorming bij C-D-trillingen (2168 cm-1) en overeenkomstige transmissiebeelden van P. aeruginosa in bloed na incubatie in D2O met het serieel verdunde gentamicine. h) Kwantitatieve analyse van de SRS C-D-intensiteit onder g). i) De vergelijking van de SC-MIC-uitlezings- en gevoeligheidscategorie voor P. aeruginosa in normale MHB en in bloed. S: gevoelig. Aantal cellen N ≥ 10 per groep. Foutbalken vertegenwoordigen de SEM. Schaalbalk: 10 μm. Dit cijfer is gewijzigd van ref.40. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Probleem Mogelijke reden Oplossing
Weinig of geen bacterieel celnummer in beeldveld Bacteriële dichtheid in de oplossing is te laag Centrifugeer voor langere tijd om bacteriën verder te verrijken
Fotoschade van de bacteriële cellen tijdens SRS-beeldvorming Het gebruikte laservermogen is te hoog Het laservermogen verlagen tot een geschikte waarde
Er is geen SRS-signaal detecteerbaar De ruimtelijke en temporele overlap van de pomp en Stokes-balk is niet geoptimaliseerd Lijn de pomp en stokes-balken uit met behulp van een standaardmonster gedeutereerd dimethylsulfoxide

Tabel 1: Tabel probleemoplossing.

Figuur S1: Testen D2O toxiciteit op P. aeruginosa gekweekt in Lauria-Bertani (LB) medium met verschillende D2O concentraties. Foutbalken geven standaardafwijkingswaarden aan (aantal metingen = 5). Klik hier om deze figuur te downloaden.

Tabel S1. Vergelijking van SC-MIC's en MIC's in normale MHB van P. aeruginosa bij antibioticabehandeling. S: gevoelig; R: resistent; I: Gemiddeld. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Snelle ASAT kan worden verkregen door de respons van bacteriële metabole activiteit op antibioticabehandeling te beoordelen met behulp van eencellige SRS metabole beeldvorming binnen 2,5 uur van het monster tot SC-MIC-resultaten. De respons van bacteriële metabole activiteit en antimicrobiële gevoeligheid kan worden gedetecteerd door de metabole opname van D2O voor biomolecuulsynthese te monitoren met behulp van SRS-beeldvorming van C-D-bindingen. Omdat water alomtegenwoordig wordt gebruikt in levende cellen, biedt SRS metabole beeldvorming een universele methode voor snelle ASAT. De snelle AST-methode is toepasbaar om bacteriën in complexe biologische omgevingen, zoals urine of volbloed, op één bacterieniveau te detecteren. De SC-MIC kan worden bepaald na 1,5 uur cultuur van bacteriën in urine en bloed, wat als transformatief wordt beschouwd om het paradigma van UTI- en BSI-diagnose te verschuiven van een tijdrovende cultuurafhankelijke procedure naar een cultuuronafhankelijke in situ-benadering . Daarom betekent het een enorme verkorting van de diagnosetijd in vergelijking met de conventionele bouillonmicroverdunningsmethode, die de weg vrijmaakt voor klinische vertaling die het mogelijk maakt om tijdig geschikte antimicrobiële middelen te identificeren voor een nauwkeurige behandeling.

De hier beschreven protocollen voor antibioticabehandeling volgen de richtlijnen van de CLSI, waarin het voorgestelde MHB-medium over het algemeen kan worden gebruikt voor de teelt van een breed scala aan micro-organismen. Een belangrijke parameter is dat het bacteriële celnummer dat wordt gebruikt voor antimicrobiële gevoeligheidstests wordt gehouden op ongeveer 5 x 105 CFU / ml zoals aanbevolen in CLSI. Dit is van cruciaal belang voor het verkrijgen van nauwkeurige en reproduceerbare resultaten. In antibioticabehandelingsexperimenten is de bacterieconcentratie vastgesteld op 8 x 105 CFU / ml. Een hogere bacterieconcentratie kan leiden tot een toename van de MIC-resultaten. Zodra de bacteriële suspensie is aangepast, moet deze binnen 30 minuten worden gebruikt om veranderingen in de bacteriële celconcentratie te voorkomen.

Voor gevoeligheidstests van een antibioticum zoals daptomycine wordt aanbevolen om 50 mg / L calcium in de media aan te vullen. Het kationgecorrigeerde MHB-medium bevat 20-25 mg/l Ca2+. Zorg er daarom voor dat het medium verder wordt aangevuld met extra Ca2+ (opgelost in water en filter gesteriliseerd) in de concentratie van 30 mg/L.

Een andere cruciale stap in de gepresenteerde methode is de incubatietijd van bacteriën bij blootstelling aan antibiotica en D2O-opname. Omdat de generatietijd van de bacteriële levenscyclus ongeveer 30 tot 60 minuten is, is het belangrijk om de bacteriële metabole activiteit bij blootstelling aan antibiotica gedurende een bepaalde tijd te beïnvloeden. Deze test is geëvalueerd op een verscheidenheid aan combinaties van bacteriën en antibiotica tot blootstelling aan antibiotica gedurende 1 uur voorafgaand aan 0,5 h D2O-behandeling. De eerste 1 uur antibioticabehandelingsstap is essentieel om de bacteriële metabole activiteit te beïnvloeden. Vervolgens worden bacteriën geïncubeerd met D2O-bevattend en antibioticumbevattend medium gedurende nog eens 30 minuten. De uiteindelijke antibioticaconcentraties worden op hetzelfde niveau gehouden en de uiteindelijke concentratie van D2O wordt aangepast tot 70%. Over het algemeen worden na 1 uur antibioticavoorteelt en na 0,5 uur D2O en antibiotica-opname de SC-MIC-resultaten vervolgens bepaald door SRS metabole beeldvorming van de bacteriële metabole activiteit. Dit ontwerp minimaliseert de impact van D2O-invloed van antimicrobiële activiteit op bacteriën en leidt ook tot een vergelijkbare uitlezing van SC-MIC-resultaten met de MIC's volgens de conventionele methode.

In de SC-MIC-metingen bereiden we parallel 40 monsters voor, waaronder 5 verschillende antibiotica, elk met 8 concentraties tegelijkertijd. Omdat er echter veel handmatige bedieningsprocedures zijn, is de totale testtijd voor het detecteren van de AST voor vijf verschillende combinaties van bacteriën en antibiotica langer dan 2,5 uur. In onze methode werd elke SRS-afbeelding met ~ 20 individuele bacteriële cellen verkregen binnen ~ 1,0 s in één enkele opname met een verblijftijd van 30 μs pixels. We schatten dat de totale AST-testtijd om 10 antibiotica voor één bacteriestam te bestuderen minder dan 2,5 uur zou zijn van monster tot SC-MIC-uitlezing, wat een enorme mogelijkheid heeft om metingen met een hoge doorvoer uit te voeren. In toekomstige werkzaamheden zal een geautomatiseerde methode voor monstervoorbereiding en beeldvormingsgegevensverzameling worden gebruikt om de doorvoer verder te verbeteren. De details voor het oplossen van problemen zijn opgenomen in tabel 1.

In conventionele op cultuur gebaseerde AST-methoden, om bacteriële isolaten te verkrijgen voor verdere metingen, is het noodzakelijk om klinische monsters urenlang vooraf te incuberen. Geavanceerde AST-methoden voor klinische UTI-monsters, zoals Raman-spectroscopie29, nanoliter array6 en digitale nucleïnezuurkwantificering18, zijn ontwikkeld om zich te ontdoen van langdurige pre-incubatie. In vergelijking met UTI-infectie is de BSI of sepsis veel levensbedreigender18,45, waarbij snelle ASAT dringend nodig is voor nauwkeurige diagnostiek in de kliniek. Een microscopische beeldvormingsmethode om bacteriële kolonievorming uit positieve bloedculturen te meten, heeft naar verluidt MIC-resultatenopgeleverd 46. Het duurt echter minstens 6 uur om bacteriën te laten groeien om de AST-test uit te voeren. Bovendien kunnen commerciële automatische systemen47 en massaspectrometrie 48,49-strategieën ASAT-uitlezing bieden van positieve bloedkweken. De MIC-resultaten voor de klinische beslissing kunnen echter niet worden verstrekt. De AST-resultaten en de MIC-uitlezing zijn significant om overmatige dosering van antibiotica aan patiënten te voorkomen om mogelijke bijwerkingen in klinieken te veroorzaken, om de verspreiding van de antimicrobieel resistente infecties te vertragen en te voorkomen50,51. Vergeleken met de bestaande spontane Op Raman-microscopie gebaseerde AST-methoden, vermindert onze technologie de data-acquisitietijd enorm (ca. 600 keer minder) als gevolg van ordes van grootte signaalverbetering. In dit werk demonstreren we snelle ASAT door SRS-beeldvorming van het deuteriummetabolisme in enkele bacteriën bij een klinisch relevante bacteriële concentratie (105 ~ 106 CFU / ml) in urine of volbloedomgeving. Zoals aangetoond in eerdere resultaten, worden de MIC-resultaten bepaald na 1 uur antibioticabehandeling en 30 minuten mengsel van D2O en antibiotica incubatie in bacteriën in urine en bloed. Onze methode kan MIC's en gevoeligheidsclassificatie bieden voor elke stam-antibioticumcombinatie binnen 2,5 uur, en opent daarom een nieuwe weg naar klinische vertaling. Kortom, zonder de noodzaak van preculturatie en bacteriële deling, heeft onze methode een enorm potentieel op het gebied van snelle en hoge doorvoer AST bij infectieziekten.

Onze SC-MIC-methode door SRS metabole beeldvorming is van toepassing om MIC's te detecteren en gevoeligheidsclassificatie te bieden voor infectieuze pathogenen bij het omgaan met overvloedige variëteiten van stam-antibioticumcombinaties voor klinisch gebruik. De SC-MIC wordt bepaald na 30 minuten D2O-opname in bacteriën in urine en bloed, wat een enorme vermindering van de diagnosetijd betekent in vergelijking met de conventionele bouillonverdunningsmethode die 16 tot 24 uur kost voor pre-cubatie. Om pathogeenidentificatie-informatie te leveren voor klinische besluitvorming, kan SRS metabole beeldvormingstechnologie verder worden geïntegreerd met diagnostische platforms die in staat zijn tot snelle identificatie van pathogenen, zoals matrix-geassisteerde laserdesorptie-time-of-flight massaspectrometrie 49,52,53. Het combineren van in situ pathogene identificatie en snelle ASAT-diagnose zou een groot potentieel kunnen hebben voor vertaling naar een kliniek die het mogelijk maakt om tijdig geschikte antimicrobiële middelen te identificeren voor een nauwkeurige behandeling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Acknowledgments

Dit werk werd ondersteund door NIH R01AI141439 naar J.-X.C en M.S, en R35GM136223 naar J.-X.C.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acousto-optic modulation Gooch&Housego R15180-1.06-LTD Modulating stokes laser beam
Amoxicillin Sigma Aldrich A8523-5G
Bandpass filter Chroma HQ825/150m Block the stokes laser beam before the photodiode
Calcium chloride Sigma Aldrich C1016-100G Cation adjustment
Cation-adjusted Mueller-Hinton Broth Fisher Scientific B12322 Antimicrobial susceptibility testing of microorganisms by broth dilution methods
Centrifuge Thermo Scientific 75002542
Cover Glasses VWR 16004-318
Culture tube with snap cap Fisher brand 149569B
Daptomycin Acros A0386346
Deuterium oxide 151882 Organic solvent to dissolve antibiotics
Deuterium oxide-d6 Sigma Aldrich 156914 Organic solvent as a standard to calibrate SRS imaging system
Escherichia coli BW 25113 The Coli Genetic Stock Center 7636
Eppendorf polypropylene microcentrifuge tubes 1.5 mL Fisher brand 05-408-129
Gentamicin sulfate Sigma Aldrich G4918
Hydrophilic Polyvinylidene Fluoride filters Millipore-Sigma SLSV025NB pore size 5 µm
ImageJ software NIH Version: 2.0.0-rc-69/1.52t Image processing and analysis
Incubating orbital shaker set at 37 °C VWR 97009-890
Inoculation loop Sigma BR452201-1000EA
InSight DeepSee femtosecond pulsed laser Spectra-Physics Model: insight X3 Tunable laser source and fixed laser source at 1045 nm for SRS imaging
Lock-in amplifier Zurich Instrument HF2LI Demodulate the SRS signals
Oil condenser Olympus U-AAC NA 1.4
Pseudomonas aeruginosa ATCC 47085 (PAO1) American Type Culture Collection ATCC 47085
Photodiode Hamamatsu S3994-01 Detector
Polypropylene conical tube 15 mL Falcon 14-959-53A
Polypropylene filters Thermo Scientific 726-2520 pore size 0.2 µm
Sterile petri dishes Corning 07-202-031
Syringe 10 mL Fisher brand 14955459
UV/Vis Spectrophotometer Beckman Coulter Model: DU 530 Measuring optical density at wavelength of 600 nm
Vortex mixer VWR 97043-562
Water objective Olympus UPLANAPO/IR 60×, NA 1.2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. O'Neill, J. Tackling drug-resistant infections globally: final report and recommendations. The review on Antimicrobial Resistance. , (2016).
  2. Sugden, R., Kelly, R., Davies, S. Combatting antimicrobial resistance globally. Nature Microbiology. 1 (10), 16187 (2016).
  3. Kumar, A., et al. Duration of hypotension before initiation of effective antimicrobial therapy is the critical determinant of survival in human septic shock. Critical Care Medicine. 34 (6), 1589-1596 (2006).
  4. Reller, L. B., Weinstein, M., Jorgensen, J. H., Ferraro, M. J. Antimicrobial susceptibility testing: a review of general principles and contemporary practices. Clinical Infectious Diseases. 49 (11), 1749-1755 (2009).
  5. Frickmann, H., Masanta, W. O., Zautner, A. E. Emerging rapid resistance testing methods for clinical microbiology laboratories and their potential impact on patient management. BioMed Research International. 2014, 375681 (2014).
  6. Avesar, J., et al. Rapid phenotypic antimicrobial susceptibility testing using nanoliter arrays. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (29), 5787-5795 (2017).
  7. Schoepp, N. G., et al. Digital quantification of DNA replication and chromosome segregation enables determination of antimicrobial susceptibility after only 15 minutes of antibiotic exposure. Angewandte Chemie International Edition. 55 (33), 9557-9561 (2016).
  8. van Belkum, A., et al. Innovative and rapid antimicrobial susceptibility testing systems. Nature Reviews Microbiology. 18 (5), 299-311 (2020).
  9. Hou, Z., An, Y., Hjort, K., Sandegren, L., Wu, Z. Time lapse investigation of antibiotic susceptibility using a microfluidic linear gradient 3D culture device. Lab on a Chip. 14 (17), 3409-3418 (2014).
  10. Choi, J., et al. Rapid antibiotic susceptibility testing by tracking single cell growth in a microfluidic agarose channel system. Lab on a Chip. 13 (2), 280-287 (2013).
  11. Lu, Y., et al. Single cell antimicrobial susceptibility testing by confined microchannels and electrokinetic loading. Analytical Chemistry. 85 (8), 3971-3976 (2013).
  12. Kim, S. C., Cestellosblanco, S., Inoue, K., Zare, R. N. Miniaturized antimicrobial susceptibility test by combining concentration gradient generation and rapid cell culturing. Antibiotics. 4 (4), 455-466 (2015).
  13. Choi, J., et al. A rapid antimicrobial susceptibility test based on single-cell morphological analysis. Science Translational Medicine. 6 (267), (2014).
  14. Baltekin, Ö, Boucharin, A., Tano, E., Andersson, D. I., Elf, J. Antibiotic susceptibility testing in less than 30 min using direct single-cell imaging. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (34), 9170-9175 (2017).
  15. Fredborg, M., et al. Real-time optical antimicrobial susceptibility testing. Journal of Clinical Microbiology. 51 (7), 2047-2053 (2013).
  16. Choi, J., et al. A rapid antimicrobial susceptibility test based on single-cell morphological analysis. Science Translational Medicine. 6 (267), (2014).
  17. Barczak, A. K., Hung, D. T. RNA signatures allow rapid identification of pathogens and antibiotic susceptibilities. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (16), 6217-6222 (2012).
  18. Schoepp, N. G., et al. Rapid pathogen-specific phenotypic antibiotic susceptibility testing using digital LAMP quantification in clinical samples. Science Translational Medicine. 9 (410), (2017).
  19. Novelli-Rousseau, A., et al. Culture-free antibiotic-susceptibility determination from single-bacterium Raman spectra. Scientific Reports. 8 (1), 1-12 (2018).
  20. Schröder, U. -C., et al. Detection of vancomycin resistances in enterococci within 3 1/2 hours. Scientific Reports. 5, 8217 (2015).
  21. Liu, C. -Y., et al. Rapid bacterial antibiotic susceptibility test based on simple surface-enhanced Raman spectroscopic biomarkers. Scientific Reports. 6 (1), 1-15 (2016).
  22. Chang, K. -W., et al. Antibiotic susceptibility test with surface-enhanced raman scattering in a microfluidic system. Analytical Chemistry. 91 (17), 10988-10995 (2019).
  23. Galvan, D. D., Yu, Q. surface-enhanced raman scattering for rapid detection and characterization of antibiotic-resistant bacteria. Advanced Healthcare Materials. 7 (13), 1701335 (2018).
  24. Kirchhoff, J., et al. Simple ciprofloxacin resistance test and determination of minimal inhibitory concentration within 2 h using raman spectroscopy. Analytical Chemistry. 90 (3), 1811-1818 (2018).
  25. Zhang, Z., Chen, L., Liu, L., Su, X., Rabinowitz, J. D. Chemical basis for deuterium labeling of fat and NADPH. Journal of the American Chemical Society. 139 (41), 14368-14371 (2017).
  26. Shi, L., et al. Optical imaging of metabolic dynamics in animals. Nature Communications. 9 (1), 2995 (2018).
  27. Berry, D., et al. Tracking heavy water (D2O) incorporation for identifying and sorting active microbial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (2), 194-203 (2015).
  28. Tao, Y., et al. Metabolic-activity-based assessment of antimicrobial effects by D2O-labeled single-cell raman microspectroscopy. Analytical Chemistry. 89 (7), 4108-4115 (2017).
  29. Yang, K., et al. Rapid antibiotic susceptibility testing of pathogenic bacteria using heavy water-labeled single-cell raman spectroscopy in clinical samples. Analytical Chemistry. 91 (9), 6296-6303 (2019).
  30. Song, Y., et al. Raman-Deuterium Isotope Probing for in-situ identification of antimicrobial resistant bacteria in Thames River. Scientific reports. 7 (1), 16648 (2017).
  31. Freudiger, C. W., et al. Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy. Science. 322 (5909), 1857-1861 (2008).
  32. Cheng, J. -X., Xie, X. S. Vibrational spectroscopic imaging of living systems: An emerging platform for biology and medicine. Science. 350 (6264), (2015).
  33. Zhang, C., Zhang, D., Cheng, J. -X. Coherent Raman scattering microscopy in biology and medicine. Annual Review of Biomedical Engineering. 17, 415-445 (2015).
  34. Yue, S., Cheng, J. -X. Deciphering single cell metabolism by coherent Raman scattering microscopy. Current Opinion in Chemical Biology. 33, 46-57 (2016).
  35. Hu, F., Shi, L., Min, W. Biological imaging of chemical bonds by stimulated Raman scattering microscopy. Nature Methods. 16 (9), 830-842 (2019).
  36. Ji, M., et al. Rapid, Label-free detection of brain tumors with stimulated Raman scattering microscopy. Science Translational Medicine. 5 (201), (2013).
  37. He, R., Liu, Z., Xu, Y., Huang, W., Ma, H., Ji, M. Stimulated Raman scattering microscopy and spectroscopy with a rapid scanning optical delay line. Optics Letters. 42 (4), 659-662 (2017).
  38. Suzuki, Y., et al. Label-free chemical imaging flow cytometry by high-speed multicolor stimulated Raman scattering. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (32), 15842-15848 (2019).
  39. Camp, C. H., et al. High-Speed Coherent Raman Fingerprint Imaging of Biological Tissues. Nature Photonics. 8, 627-634 (2014).
  40. Zhang, M., et al. Rapid determination of antimicrobial susceptibility by stimulated raman scattering imaging of D2O metabolic incorporation in a single bacterium. Advanced Science. 7 (19), 2001452 (2020).
  41. Michael, I., et al. A fidget spinner for the point-of-care diagnosis of urinary tract infection. Nature Biomedical Engineering. 4 (6), 591-600 (2020).
  42. Bhattacharyya, R. P., et al. Simultaneous detection of genotype and phenotype enables rapid and accurate antibiotic susceptibility determination. Nature Medicine. 25 (12), 1858-1864 (2019).
  43. Stupar, P., et al. Nanomechanical sensor applied to blood culture pellets: a fast approach to determine the antibiotic susceptibility against agents of bloodstream infections. Clinical Microbiology and Infection. 23 (6), 400-405 (2017).
  44. Barber, A. E., Norton, J. P., Spivak, A. M., Mulvey, M. A. Urinary Tract Infections: Current and Emerging Management Strategies. Clinical Infectious Diseases. 57 (5), 719-724 (2013).
  45. Cohen, J., et al. Sepsis: a roadmap for future research. The Lancet Infectious Diseases. 15 (5), 581-614 (2015).
  46. Choi, J., et al. rapid antimicrobial susceptibility test from positive blood cultures based on microscopic imaging analysis. Scientific Reports. 7 (1), 1148 (2017).
  47. Gherardi, G., et al. Comparative evaluation of the Vitek-2 Compact and Phoenix systems for rapid identification and antibiotic susceptibility testing directly from blood cultures of Gram-negative and Gram-positive isolates. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 72 (1), 20-31 (2012).
  48. Machen, A., Drake, T., Wang, Y. F. Same day identification and full panel antimicrobial susceptibility testing of bacteria from positive blood culture bottles made possible by a combined lysis-filtration method with MALDI-TOF VITEK mass spectrometry and the VITEK2 system. Plos One. 9, 87870 (2014).
  49. Simon, L., et al. Direct identification of 80 percent of bacteria from blood culture bottles by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry using a 10-minute extraction protocol. Journal of Clinical Microbiology. 57 (2), 01278 (2019).
  50. Leekha, S., Terrell, C. L., Edson, R. S. General principles of antimicrobial therapy. Mayo Clinic Proceedings. 86 (2), 156-167 (2011).
  51. Johnson, L., et al. Emergence of fluoroquinolone resistance in outpatient urinary Escherichia coli isolates. The American Journal of Medicine. 121 (10), 876-884 (2008).
  52. Van Belkum, A., et al. Developmental roadmap for antimicrobial susceptibility testing systems. Nature Reviews Microbiology. 17 (1), 51-62 (2019).
  53. Dubourg, G., Lamy, B., Ruimy, R. Rapid phenotypic methods to improve the diagnosis of bacterial bloodstream infections: meeting the challenge to reduce the time to result. Clinical Microbiology and Infection. 24 (9), 935-943 (2018).

Tags

Biologie Nummer 180
Snelle antimicrobiële gevoeligheidstests door gestimuleerde Raman-verstrooiing Beeldvorming van deuteriumincorporatie in een enkele bacterie
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, M., Seleem, M. N., Cheng, J.… More

Zhang, M., Seleem, M. N., Cheng, J. X. Rapid Antimicrobial Susceptibility Testing by Stimulated Raman Scattering Imaging of Deuterium Incorporation in a Single Bacterium. J. Vis. Exp. (180), e62398, doi:10.3791/62398 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter