Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Snabb testning av antimikrobiell mottaglighet genom stimulerad Raman-spridningsavbildning av deuteriuminkorporering i en enda bakterie

Published: February 14, 2022 doi: 10.3791/62398
Automatic Translation
1,2, 3, 1,2,4,5
1Department of Electrical and Computer Engineering, Boston University, 2Boston University Photonics Center, Boston University, 3Department of Biomedical Sciences and Pathobiology, Virginia-Maryland College of Veterinary Medicine, Virginia Polytechnic Institute and State University, 4Department of Biomedical Engineering, Boston University, 5Department of Chemistry, Boston University

Summary

Detta protokoll presenterar snabb testning av antimikrobiell mottaglighet (AST) inom 2,5 timmar genom encellsstimulerad Raman-spridningsavbildning av D2O-metabolism. Denna metod gäller bakterier i urin- eller helblodsmiljön, vilket är transformativt för snabb encellig fenotypisk AST i kliniken.

Abstract

För att bromsa och förhindra spridningen av infektioner som är resistenta mot antimikrobiella medel är det absolut nödvändigt med snabb testning av antimikrobiell mottaglighet (AST) för att kvantitativt fastställa de antimikrobiella effekterna på patogener. Det tar vanligtvis dagar att slutföra AST med konventionella metoder baserade på den långvariga kulturen, och de fungerar inte direkt för kliniska prover. Här rapporterar vi en snabb AST-metod som möjliggörs genom stimulerad Raman-spridning (SRS) avbildning av deuteriumoxid (D2O) metabolisk inkorporering. Metabolisk inkorporering avD2Oi biomassa och den metaboliska aktivitetshämningen vid exponering för antibiotika på nivån för enskilda bakterier övervakas genom SRS-avbildning. Encellsmetabolismens inaktiveringskoncentration (SC-MIC) av bakterier vid exponering för antibiotika kan erhållas efter totalt 2,5 timmars provberedning och detektion. Dessutom är denna snabba AST-metod direkt tillämplig på bakterieprover i komplexa biologiska miljöer, såsom urin eller helblod. SRS metabolisk avbildning av deuteriuminkorporering är transformativ för snabb encellig fenotypisk AST i kliniken.

Introduction

Antimikrobiell resistens är ett växande globalt hot mot effektiv behandling av infektionssjukdomar1. Det förutspås att antimikrobiell resistens kommer att orsaka ytterligare 10 miljoner dödsfall per år och en global BNP-förlust på 100 biljoner dollar fram till 2050 om inga åtgärder vidtas för att bekämpa antibiotikaresistenta bakterier 1,2. Detta betonar det akuta behovet av snabba och innovativa diagnostiska metoder för antibiotikakänslighetstestning (AST) av smittsamma bakterier för att bromsa uppkomsten av antibiotikaresistenta bakterier och minska den relaterade dödligheten3. För att säkerställa bästa möjliga kliniska resultat är det viktigt att införa effektiv behandling inom 24 timmar. Den nuvarande guldstandardmetoden, som diskdiffusion eller buljongutspädningsmetod, kräver emellertid vanligtvis minst 24 timmar för preinkubationsförfarandet för kliniska prover och ytterligare 16-24 timmar för att erhålla resultaten av minimal hämmande koncentration (MIC). Sammantaget är dessa metoder för tidskrävande för att vägleda ett omedelbart beslut för behandling av infektionssjukdomar i kliniken, vilket leder till uppkomst och spridning av antimikrobiell resistens4.

Genotypiska AST-metoder, såsom polymeraskedjereaktion (PCR)-baserade tekniker5, har utvecklats för snabb detektion. Sådana tekniker mäter de specifika resistensgenetiska sekvenserna för att ge snabba AST-resultat. De förlitar sig inte på tidskrävande cellodling; emellertid testas endast specifika kända genetiska sekvenser med resistens. Därför är dess tillämpning begränsad till olika bakteriearter eller olika resistensmekanismer. De kan inte heller ge MIC-resultat för terapibeslut 6,7. Dessutom är nya fenotypiska metoder för snabb AST under utveckling för att övervinna dessa begränsningar8, inklusive mikrofluidiska anordningar 9,10,11,12,13, optiska enheter 14,15,16, fenotypisk AST som kvantifierar nukleinsyrorna kopia nummer 17,18 och Raman-spektroskopiska metoder 19, 20,21,22,23,24. Dessa metoder minskar tiden för att vägleda AST-resultat, men de flesta av dem är endast tillämpliga på bakterieisolat, inte direkt på kliniska prover, och kräver fortfarande långvarig preinkubation.

I detta arbete presenterar vi en metod för snabb bestämning av mottagligheten hos bakterier i urin och helblod via övervakning av den cellulära metaboliska aktiviteten genom SRS-avbildning. Vatten (H2O) deltar i de allra flesta väsentliga biomolekylära syntesprocesser i levande celler. Som en isotopologue av vatten, genom enzymkatalyserad H/D-utbytesreaktion mellan den redoxaktiva väteatomen i NADPH och D-atomeni D2O, kan deuterium införlivas i biomassa inuti en cell25,26. En deutererad fettsyrasyntesreaktion medieras av deuterium märkt NADPH. D2O-inkorporeringen i reaktioner av aminosyror (AA) resulterar i deutererad proteinproduktion26 (figur 1). På detta sätt kan de nyligen syntetiserade C-D-bindningsinnehållande biomolekylerna i enskilda mikrobiella celler användas som en allmän metabolisk aktivitetsmarkör som ska detekteras. För att läsa ut de novo-syntetiserade C-D-bindningar används Raman-spektroskopi, ett mångsidigt analysverktyg som ger specifik och kvantitativ kemisk information om biomolekyler, i stor utsträckning för att bestämma antimikrobiell mottaglighet och avsevärt minska testtiden till några timmar27,28,29,30 . På grund av den inneboende låga effektiviteten hos Raman-spridningsprocessen är emellertid den spontana Raman-spektroskopin av låg detektionskänslighet. Därför är det utmanande att få bildresultat i realtid med spontan Raman-spektroskopi. Koherent Ramanspridning (CRS), inklusive koherent anti-Stokes Raman-spridning (CARS) och stimulerad Raman-spridning (SRS), har nått hög detektionskänslighet på grund av det koherenta ljusfältet för att generera storleksordningar större än spontan Raman-spektroskopi, vilket ger höghastighets, specifik och kvantitativ kemisk avbildning på encellsnivå 31,32,33,34,35 ,36,37,38,39.

Här, baserat på vårt senaste arbete40, presenterar vi ett protokoll för snabb bestämning av den metaboliska aktiviteten och antimikrobiell mottaglighet genom femtosekund SRS C-D-avbildning av D2O-införlivande av bakterier i det normala mediet, urinen och helblodsmiljön på encellsnivå. Femtosekund SRS-avbildning underlättar övervakning av inaktiveringskoncentration av encellsmetabolism (SC-MIC) mot antibiotika på singelbakterienivå inom 2,5 timmar. SC-MIC-resultaten valideras med standard MIC-test via buljongmikrodilution. Vår metod är tillämplig för att bestämma antimikrobiell mottaglighet för bakterier urinvägsinfektion (UTI) och blodomloppsinfektion (BSI) patogener med en mycket reducerad analystid jämfört med den konventionella metoden, vilket öppnar möjligheten för snabb fenotypisk AST i kliniken på encellsnivå.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Användningen av humana blodprover är i enlighet med riktlinjerna från IRB vid Boston University och National Institutes of Health (NIH). Specifikt är exemplen från en bank och är helt avidentifierade. Dessa exemplar anses inte vara mänskliga ämnen av Institutional Review Board (IRB) kontor vid Boston University.

1. Beredning av stamlösning av bakterier och antibiotika

  1. Bered antibiotika (gentamicinsulfat eller amoxicillin) stamlösning i en koncentration av 1 mg/ml upplöst i sterilt1x fosfatbuffrat saltlösning (PBS) eller dimetylsulfoxidlösningsmedel (DMSO) i 1,5 ml mikrorör. Lös upp gentamicinsulfat i steril PBS-lösning och amoxicillin i sterilt DMSO-lösningsmedel. Förvara därefter antibiotikalösningen vid 2-8 °C enligt förslag.
  2. För att göra D2O-innehållande katjonjusterat Mueller-Hinton-buljongmedel (MHB), tillsätt 220 mg MHB-buljongbas till 10 mlD2O-medelför att göra 100%D2O-innehållandemedium. Sterilisera lösningen genom filtrering med filter med 200 nm porstorlek.
    OBS: Använd detta protokoll alltid för att tillverka och sterilisera medelstora lösningar i ytterligare steg.
  3. För att förbereda bakterieprover för SRS-avbildning, tillsätt 2 ml normalt MHB-medium, som inte innehåller deuterium, till ett sterilt odlingsrör med rundbotten och förvärm det sedan vid 37 °C.
  4. Använd en steril slinga för att välja en bakteriell (Escherichia coli BW 25113 eller Pseudomonas aeruginosa ATCC 47085) koloni från den färska kulturen på en tryptisk sojaagarplatta. Suspendera sedan det i det förvärmda odlingsmediet och virvla försiktigt för att förbereda bakteriesuspensionen.
  5. Inkubera bakterier vid 37 °C i en shaker med 200 varv per minut (rpm) tills den når den logaritmiska fasen.

2. D2O inkorporeringsbehandling i närvaro av antibiotika (figur 2a)

  1. Kontrollera bakteriekoncentrationen genom att mäta den optiska densiteten (OD) med en fotometer vid en våglängd på 600 nm.
  2. Späd bakterielösningen med det normala MHB-mediet, som inte innehåller deuterium, för att nå en slutlig cellkoncentration på 8 x 105 CFU/ml. Vortex försiktigt för att blanda bakteriecellerna.
  3. Bered 300 μl alikvoter av bakterielösningen i sju 1,5 ml mikrorör och 600 μl alikvoter av bakterielösningen i ett 1,5 ml mikrorör.
  4. Tillsätt 4,8 μl stamlösning (gentamicin eller amoxicillin) (1 mg/ml) i mikroröret som innehåller 600 μl av bakterielösningen för att göra den slutliga antibiotikakoncentrationen till 8 μg/ml.
  5. Ta 300 μl lösning ur 8 μg/ml antibiotikainnehållande bakterielösning och tillsätt till ytterligare 300 μl bakterielösning för att göra tvåfaldig utspädd antibiotika- (4 μg/ml) bakterielösning.
  6. Upprepa den tvåfaldiga serieutspädningen av testantibiotika, gentamicin eller amoxicillin, tills mikroröret med den lägsta koncentrationen (0,25 μg/ml) har uppnåtts och kassera 300 μl från röret. För både gentamicin och amoxicillin varierar de seriella koncentrationerna från 0,25 μg/ml - 8 μg/ml.
    1. Lämna ett rör utan antibiotika för blankkontroll. Detta kommer att vara den positiva kontrollen för att inspektera den bakteriella metaboliska aktiviteten utan antibiotikabehandling men med D2O-behandling.
    2. Lämna ett rör utan antibiotika och ingen D2O för den negativa kontrollen.
  7. Inkubera bakteriella alikvoter med ett visst antibiotikum (gentamicin eller amoxicillin) som innehåller MHB-medium i 1 timme.
  8. Bered under inkubationen en seriell utspädning av antibiotika med 100% D 2O-innehållande medium med samma koncentrationsgradient av antibiotika som framställts i steg 2.6. För både gentamicin och amoxicillin varierar de seriella koncentrationerna från 0,25 μg/ml - 8 μg/ml.
  9. Efter 1 h antibiotikabehandling, tillsätt 700 μL seriellt utspädd antibiotika och 100% D 2 O-innehållande MHB-medium till 300 μL antibiotikaförbehandlade bakterier i samma antibiotikakoncentration (beredd i steg2.6).
    1. Tillsätt till exempel 700 μl 100% D2O-innehållande MHB-medium (innehållande 8 μg / ml antibiotikum) till 300 μl 8 μg / ml antibiotikaförbehandlade bakterier. På samma sätt överförs du till motsvarande rör i nästa koncentration och homogeniseras genom att pipettera upp och ner flera gånger.
    2. Tillsätt 700 μl antibiotikafritt 100 % D2O-innehållandeMHB-medium till 300 μl antibiotikafria bakterier (beredda i steg 2.6.1) som en blankkontroll.
    3. Inkubera vid 37 °C i en inkubationsskakare vid 200 rpm i ytterligare 30 minuter.
      OBS: I detta steg är den slutliga koncentrationen avD2OOi mediet för testet 70%.
  10. Centrifugera först 1 ml antibiotika och D2O-behandlat bakterieprov vid 6200 x g i 5 minuter vid 4 °C och tvätta sedan två gånger med renat vatten. Slutligen fixera proverna i 10 % formalinlösning och förvara dem vid 4 °C.

3. Beredning av bakterier i urinmiljö (figur 2b)

  1. För att förbereda E. coli BW 25113 vid logaritmisk fas, följ stegen vid 1,4 och 1,5.
  2. Kontrollera bakteriekoncentrationen genom att mäta OD med en fotometer vid en våglängd på 600 nm.
  3. För att efterlikna de kliniska UTI-proverna 14,18,41, spika E. coli-lösningen i 10 ml avidentifierad urin för att nå en slutlig cellkoncentration på 10 6 CFU/ml.
  4. Filtrera den E. coli-spetsade urinen med ett 5 μm-filter och dela sedan bakterielösningen i 300 μl alikvoter i sju 1,5 ml mikrorör och 600 μl alikvoter av bakterielösningen i ett 1,5 ml mikrorör.
  5. Utför D 2 O-inkorporeringsbehandling i närvaro av antibiotika och provinsamling enligt beskrivningen i föregående steg från 2.4 till2.10.

4. Beredning av bakterier i blodmiljön (figur 2c)

  1. För att förbereda Pseudomonas aeruginosa ATCC 47085 vid logaritmisk fas, följ stegen vid 1,4 och 1,5.
  2. För att efterlikna de kliniska blodomloppsinfektionerna, prover42,43, spik P. aeruginosa i 1 ml avidentifierat humant blod för att nå en koncentration av 107 CFU / ml.
  3. Tillsätt 9 ml sterilt renat vatten för att lysera blodet.
  4. Filtrera P. aeruginosa spikat blod med ett 5 μm filter. Skörda sedan bakterierna till 1 ml volym genom centrifugering vid 6200 x g i 5 minuter vid 4 °C.  Tillsätt 9 ml förvärmd normal MHB i bakterielösningen och virvla försiktigt. Den slutliga koncentrationen av bakterier är 106 CFU/ml
  5. Dela P. aeruginosa spikade blodlösning i 300 μl alikvoter i sju 1,5 ml mikrorör och 600 μL alikvoter av bakterielösningen i ett 1,5 ml mikrorör.
  6. Utför D 2 O-inkorporeringsbehandling i närvaro av antibiotika och provinsamling enligt beskrivningen i föregående steg från 2.4 till2.10.

5. SRS-avbildning av D2O metabolisk inkorporering i en enda bakterie

  1. Tvätta 1 ml fast bakterielösning med renat vatten och centrifugera sedan vid 6200 x g i 5 min vid 4 °C. Ta bort supernatanten. Berika bakterielösningen till ca 20 μl.
  2. Deponera bakterielösningen på ett poly-L-lysinbelagt täckglas. Smörgås och försegla provet för SRS-avbildning.
  3. Avbilda bakterier vid C-D-vibrationsfrekvensen vid 2168 cm-1 med hjälp av ett SRS-mikroskop .
    1. Mata in och ställ in pumpens våglängd till 852 nm med hjälp av styrprogramvaran på en dator.
    2. Mät lasereffekten med en effektmätare. Ställ in pumplaserns effekt vid provet till ~ 8 mW och effekten av Stokes laser vid provet till ~ 40 mW genom att justera halvvågsplattan framför laserutgången.
      OBS: I SRS-mikroskopet ger en avstämbar femtosekundlaser med en 80-MHz repetitionshastighet pumpen (680 till 1300 nm) och Stokes (1045 nm) excitationslasrar.
  4. Genom att justera skruvarna på reflektionsspeglarna justerar du pumpen och Stokes-strålarna rumsligt och riktar de två strålarna till ett upprätt mikroskop utrustat med 2D-spegelsystem för laserskanning.
    1. Använd ett 60x vattensänkningsmål för att fokusera pumpen och Stokes lasrar på provet.
    2. Använd en oljekondensor för att samla upp signalerna från provet i framåtriktningen.
    3. Använd ett bandpassfilter för att filtrera bort Stokes-lasern innan du riktar den till en fotodiod.
    4. Extrahera den stimulerade Raman-signalen med en inlåsningsförstärkare och detektera signalerna från fotodioden.
  5. Ställ in varje SRS-bild så att den innehåller 200 x 200 pixlar och pixeluppehållstiden för 30 μs i programvarans kontrollpanel. Den totala förvärvstiden för en bild är ~ 1,2 s. Ställ in stegstorleken på 150 nm, så bildstorleken är cirka 30 x 30 μm2. Bild minst tre vyfält för varje exempel.

6. Bildbehandling och dataanalys (figur 3)

  1. För att få den genomsnittliga C-D-signalintensiteten, öppna och bearbeta SRS-bilder med ImageJ-programvaran.
  2. Konvertera först SRS-bilder till 8-bitars typbilder med inverterad färg genom att klicka på Bild | Typ | 8-bitars och sedan Redigera | Invertera knappar i ImageJ-programvaran.
  3. Filtrera sedan bilderna med gaussisk oskärpa genom att klicka på Bearbeta | Filter | Gaussiska suddighetsknappar och ställ in Sigma (Radius) på 1.
  4. Använd bildtröskeljustering för att välja bakterieområdet. Klicka på Bild | Justera | Tröskel för att säkerställa att de valda bakteriestorlekarna matchar dem i de ursprungliga SRS-bilderna. Eliminera små partiklar genom att justera storlekströskeln för att bestämma partiklarna. Klicka på Verkställ.
  5. Använd Analysera | Partiklar Analysknappar för att märka och bestämma bakterieområdet.
  6. Genom att klicka på knappen Visa alla i ROI-hanteraren till den ursprungliga obearbetade SRS-bilden, märk samma bakterieområde, bestäm den genomsnittliga intensiteten för varje datapunkt genom att klicka på knappen Mät i ROI-hanteraren.
  7. Ringa in bakgrundsområdet i den ursprungliga SRS-bilden och mät bakgrundens genomsnittliga intensitet. De genomsnittliga C-D-intensiteterna för varje bakterie erhålls genom att dra av bakgrundssignalintensiteten.

7. Kvantifiering av antimikrobiell mottaglighet via SC-MIC

OBS: Brytpunkten vid 0,60 för att bestämma SC-MIC fastställs enligt den statistiska analysen av SRS C-D-intensiteterna för de metabolismaktiva och metabolismhämmade förhållandena för bakterier vid olika koncentrationer av läkemedelsexponering40. C-D-intensiteterna för de antibiotikakänsliga och antibiotikaresistenta grupperna utrustades med normal fördelning.

  1. Rita upp mottagarens driftkarakteristik (ROC) kurva och utvärdera bryttröskeln vid 0,60. Baserat på detta brytvärde kan SC-MIC som en indikator på effekten av antibiotika definieras för att bestämma den metaboliskt inaktiva och metaboliskt aktiva gruppen.
  2. För att kvantitativt analysera SRS-bilddata, plotta histogrammen för C-D-signalintensiteter för varje bakteriegrupp som behandlas med den seriellt utspädda antibiotikakoncentrationen. De färgade datapunkterna står för olika enskilda bakterier.
  3. Normalisera C-D-intensiteterna hos antibiotikabehandlad grupp till kontrollgruppens medelintensitet utan antibiotikabehandling. Bestäm SC-MIC-resultaten för olika bakterie- och antibiotikakombinationer genom att kvantifiera SRS-signalintensiteterna vid C-D-regionen jämfört med olika koncentrationer av antibiotika med hjälp av brytvärdet vid 0,60.
  4. Validera och jämför SC-MIC-avläsningen med MIC bestämd med konventionell buljongmikrodilutionsanalys.
  5. Enligt Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) tolkas känslighetskategorin baserad på SRS metaboliska avbildningsresultat för varje testad bakteriestam som "mottaglig", "resistent" eller "mellanliggande".

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Inkubationstidens effekt på deuteriuminkorporering mäts med spontan Raman-mikroskopi vid C-D (2070 till 2250 cm-1) och C-H (2 800 till 3 100 cm-1) (figur 4a). De encelliga Raman-spektra med tidsfördröjning av P. aeruginosa odlade i 70%D2O-innehållandemedium visar ökande CD/CH-intensitet över inkubationstiden från 0 till 180 min. (Figur 4b) Den ökande C-D-överflödet i enskilda mikrobiella celler avslöjaratt D2Oinförlivas i deutererade biomolekyler inuti cellen.

D2O-märkningöver 50% påverkar bakteriemetabolismen signifikant under en 23 timmars inkubationsperiod27. Vi observerade bakterietillväxthämning när D2O-märkningskoncentrationen är över 70% under en 25 timmars inkubationsperiod (figur S1). Vi har utfört MIC genom guldstandardbuljongutspädning och erhållit SC-MIC-resultat i två P. aeruginosa-stammar (P. aeruginosa ATCC 47085 och P. aeruginosa 1133) (Tabell S1). Våra nuvarande resultat visar att 70% D2O inte påverkar prestandan hos vår metod i P. aeruginosa. Kategoriavtalet för vår SC-MIC-metod med den konventionella odlingsbaserade metoden är 100% för alla testade P. aeruginosa- och antibiotikakombinationer, som visas i tabell S1. Vi tillskriver denna goda överenskommelse till den minimala toxiciteten hos 70%D2Opå P. aeruginosa under 30 minuters inkubationsperiod vid SC-MIC-bestämning.

Efter protokollet inkuberades P. aeruginosa med seriellt utspädd gentamicin i 1 timme och sedan 70% D2O i ytterligare 30 min. SRS metabolisk avbildning vid ~ 2168 cm-1 (figur 5a) utfördes. C-D-intensiteterna vid antibiotikabehandling divideras med medelvärdet för kontrollgruppen, som är utan antibiotikabehandling. Den kvantitativa statistiska analysen (figur 5b) visade att C-D-signaler från P. aeruginosa var signifikant lägre vid 2 μg/ml eller högre gentamicinkoncentration än den utan gentamicinbehandling (0 μg/ml). Med hjälp av cut-off-tröskeln vid 0,60 hämmades P. aeruginosa metaboliskt vid 2 μg/ml och högre koncentrationer av gentamicin. Den streckade linjen visar det definierade brytpunkten vid 0,60 i figur 5b. På detta sätt bestämdes SC-MIC för P. aeruginosa mot gentamicin i normalt MHB-medium till 2 μg / ml. Detta SC-MIC-värde verifieras ligga inom det enfaldiga differensintervallet med MIC (4 μg/ml) som bestäms med buljongmikrodilutionsmetoden (figur 5c). Sammantaget möjliggör SC-MIC som bestäms av vår teknik kvantifiering av antimikrobiell mottaglighet.

För att utforska potentialen för snabb AST genom SRS-avbildning av deuteriummetabolisk inkorporering för kliniska tillämpningar, särskilt för den vanligaste UTI-infektionen, testade vi bakteriespetsat urinprov med E. coli, den vanligaste patogenen för att orsaka UTI-infektion44. För att efterlikna de kliniska UTI-proverna vid en relavent bakteriekoncentration tillsätts E. coli till den avidentifierade urinen till en slutlig koncentration av 106 CFU/ml. Efter provrening inkuberades urinproverna med amoxicillin ochD2O. Den rena bakgrunden i SRS-bilderna visade att provberedningsprotokollet var tillämpligt för snabb AST-mätning (figur 5d). SC-MIC för E. coli-spetsat urinprov mot amoxicillin bestämdes till 4 μg/ml (figur 5e), som har samma känslighetsavläsning med MIC (8 μg/ml) med konventionell buljongutspädningsmetod för ren E. coli i normalt MHB-medium (figur 5f). Dessa resultat visade tillsammans att snabb AST genom SRS-avbildning av deuteriummetabolisk inkorporering har stor potential för klinisk diagnos av UTI-infektiösa patogener.

Jämfört med UTI-infektion är snabb AST för BSI-patogener mycket mer utmanande för in situ-studier av bakteriell metabolisk aktivitet, eftersom många blodkroppar presenteras i blod. För att undersöka tillämpligheten av snabb AST genom SRS-avbildning av D2O metabolisk inkorporering för kliniska BSI-prover upptäcktes P. aeruginosa spetsad i avidentifierat humant blod. Som visas i figur 5g dominerades C-D-intensiteten för SRS-bilden vid 2168 cm-1 av bakteriesignaler. Eftersom de röda blodkropparna inte har metabolisk aktivitet för att ta uppD 2O för ytterligare biosyntes, härstammar C-D-signalerna från den metaboliska deuteriuminkorporeringen av levande bakterier. Korsfasmodulering eller fototermisk signal från skräp eller röda blodkroppar bidrog till de svaga bakgrundssignalerna, utan att påverka den kvantitativa analysen av SC-MIC. SC-MIC-resultatet för P. aeruginosa i blod bestämdes till 2 μg/ml (figur 5h), vilket överensstämde väl med det konventionella standard-MIC-resultatet för P. aeruginosa i normalt tillväxtmedium (figur 5i). Sammantaget visade dessa resultat att SRS metabolisk avbildning av deuteriummetabolisk inkorporering kan vara en snabb AST-metod för att bestämma SC-MIC för bakterier vid BIS-infektioner.

Figure 1
Figur 1: Schema för D 2O-inkorporering i deutererad lipid och protein25,26. Deuterium kan införlivas i biomassa inuti en cell genom enzymkatalyserad H / D-utbytesreaktion mellan den redoxaktiva väteatomen i NADPH och D-atomeni D2O. Deutererad fettsyrasyntesreaktion medieras av deuterium märkt NADPH. D2O-införlivandet i reaktioner av aminosyror resulterar i deutererad proteinproduktion. Denna siffra har modifierats från ref.40. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Arbetsflöde för snabb AST genom SRS metabolisk avbildning av deuteriuminkorporering. a) D2O-inkorporeringsbehandling i närvaro av antibiotika i MHB-medium och följande SRS-avbildningsförfaranden. b) Beredning av bakterier i urinmiljön. c) Beredning av bakterier i blodets miljö. Denna siffra har modifierats från ref.40. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3. Automatiserad bildbehandling och datatolkning. (a) Rå SRS-bild. (b) Bild efter intensitetströskeljustering för att bestämma området för bakterieceller. c) Datapunkter som valts efter partikelanalyssteget. (d) Motsvarande datapunkter väljs i råbilden. (e) Resultat av motsvarande datapunkter i råbilden. f) Statistiska resultat av datapunkternas genomsnittliga intensitet efter subtraktion av bakgrunden. Skalstreck: 10 μm. Denna siffra har modifierats från ref.40. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4. Effekt av inkubationstid på deuteriuminkorporering i bakterier. a) Tidsfördröjningsmätning vid C-D (2070–2250 cm–1) och C–H-området (2 800–3 100 cm–1) genom spontan Ramanmikroskopi (medelvärde från 20 spektra). b) Histogramdiagram över CD/CH-intensitetskvoten över D 2O-inkubationstiden för bakterier i a. Varje färgad punkt står för ett mått från en enda bakterie. Felstaplar representerar medelmåttets standardfel (SEM). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5. SC-MIC-bestämning med SRS-avbildning av bakteriell metabolisk inkorporeringav D2Omot antibiotika i normal medium-, urin- och blodmiljö. a) SRS-avbildning vid C-D-vibration (2168 cm-1) och motsvarande överföringsbilder av P. aeruginosa i närvaro avD2O, med tillsats av seriellt utspätt gentamicin i normalt MHB-medium. b) Kvantitativ analys av SRS C-D-intensiteten hos P. aeruginosa i a. De färgade datapunkterna i histogrammet står för de olika enskilda bakterierna. Den streckade linjen anger brytpunkten vid 0,60. c) Jämförelse av SC-MIC-avläsningen med MIC med hjälp av mikroutspädningsmetod för buljong och känslighetskategori för P. aeruginosa enligt CLSI. d) SRS-avbildning vid C-D-vibration (2168 cm-1) och motsvarande överföringsbilder av E. coli i urinen efter inkubation i D2O-utspädd amoxicillin. e) Kvantitativ analys av SRS C-D-intensitet i led d. f) Jämförelse av SC-MIC-avläsnings- och känslighetskategorin för E. coli vid normal MHB och urin. g) SRS-avbildning vid C-D-vibration (2168 cm-1) och motsvarande överföringsbilder av P. aeruginosa i blod efter inkubation iD2Omed seriellt utspätt gentamicin. h) Kvantitativ analys av SRS C-D-intensitet i g. i) Jämförelse av SC-MIC-avläsningen och känslighetskategorin för P. aeruginosa i normal MHB och i blod. S: känslig. Antal celler N ≥ 10 per grupp. Felstaplar representerar SEM. Skalstreck: 10 μm. Denna siffra har modifierats från ref.40. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Problem Möjlig orsak Lösning
Litet eller inget bakteriecellnummer i bildfältet Bakterietätheten i lösningen är för låg Centrifugera under längre tid för att ytterligare berika bakterier
Fotoskador av bakteriecellerna under SRS-avbildning Lasereffekten som används är för hög Ställ in lasereffekten till ett lämpligt värde
Ingen SRS-signal är detekterbar Den rumsliga och tidsmässiga överlappningen mellan pumpen och Stokes-strålen är inte optimerad Rikta in pumpen och Stokes balkar med hjälp av ett standardprov deutererad dimetylsulfoxid

Tabell 1: Felsökningstabell.

Figur S1: Testning av D2O-toxicitetpå P. aeruginosa odlad i Lauria-Bertani (LB) medium med olika D2O-koncentrationer. Felstaplar anger standardavvikelsevärden (antal mätningar = 5). Klicka här för att ladda ner den här figuren.

Tabell S1. Jämförelse av SC-MICs och MICs i normal MHB av P. aeruginosa vid antibiotikabehandling. S: känslig; R: resistent; I: Mellanliggande. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Snabb AST kan erhållas genom att bedöma svaret på bakteriell metabolisk aktivitet på antibiotikabehandling med hjälp av encells SRS-metabolisk avbildning inom 2,5 timmar från provet till SC-MIC-resultat. Svaret på bakteriell metabolisk aktivitet och antimikrobiell mottaglighet kan detekteras genom att övervaka den metaboliska införlivandetav D2Oför biomolekylsyntes med användning av SRS-avbildning av C-D-bindningar. Eftersom vatten används allestädes närvarande i levande celler, ger SRS metabolisk avbildning en universell metod för snabb AST. Den snabba AST-metoden är tillämplig för att detektera bakterier i komplexa biologiska miljöer, såsom urin eller helblod på en enda bakterienivå. SC-MIC kan bestämmas efter 1,5 h odling av bakterier i urin och blod, vilket anses vara transformativt för att flytta paradigmet för UTI- och BSI-diagnos från ett tidskrävande kulturberoende förfarande till ett kulturoberoende in situ-tillvägagångssätt . Därför innebär det en enorm minskning av diagnostiden jämfört med den konventionella buljongmikrodilutionsmetoden, vilket banar väg för klinisk översättning som möjliggör identifiering i tid av lämpliga antimikrobiella medel för exakt behandling.

Protokollen för antibiotikabehandling som beskrivs här följer riktlinjerna för CLSI, där det föreslagna MHB-mediet i allmänhet kan användas för odling av en mängd olika mikroorganismer. En nyckelparameter är att bakteriecellnumret som används för testning av antimikrobiell mottaglighet hålls på cirka 5 x 105 CFU/ml enligt rekommendationerna i CLSI. Detta är av avgörande betydelse för att få exakta och reproducerbara resultat. I antibiotikabehandlingsexperiment är bakteriekoncentrationen inställd på 8 x 105 CFU/ml. Högre bakteriekoncentration kan leda till en ökning av MIC-resultaten. När bakteriesuspensionen har justerats måste den användas inom 30 minuter för att undvika förändringar i bakteriecellkoncentrationen.

För känslighetstestning av ett antibiotikum som daptomycin rekommenderas att komplettera 50 mg / L kalcium i media. Det katjonjusterade MHB-mediet innehåller 20-25 mg/L Ca2+. Se därför till att mediet kompletteras ytterligare med ytterligare Ca2+ (solubiliserat i vatten och filtrerat steriliserat) i koncentrationen av 30 mg/L.

Ett annat kritiskt steg i den presenterade metoden är inkubationstiden för bakterier vid antibiotikaexponering och D2O-införlivande. Eftersom generationstiden för bakteriens livscykel är ungefär 30 till 60 min, Det är viktigt att påverka bakteriell metabolisk aktivitet vid antibiotikaexponering under en viss tid. Detta test har utvärderats för en mängd olika bakterie-antibiotikakombinationer till antibiotikaexponering i 1 h före 0,5 hD 2O-behandling. Det första 1 h antibiotikabehandlingssteget är viktigt för att påverka den bakteriella metaboliska aktiviteten. Därefter inkuberas bakteriermedD2O-innehållande och antibiotikainnehållande medium i ytterligare 30 minuter. De slutliga antibiotikakoncentrationerna bibehålls på samma nivå och den slutliga koncentrationen avD2Ojusteras till 70%. Sammantaget, efter 1 h antibiotikaförodling och efter 0,5 h D2O och antibiotikainkorporering, bestäms SC-MIC-resultaten sedan av SRS metabolisk avbildning av den bakteriella metaboliska aktiviteten. Denna design minimerar effekten av D2O-påverkan av antimikrobiell aktivitet på bakterier och leder också till en jämförbar avläsning av SC-MIC-resultat med MICs med den konventionella metoden.

I SC-MIC-mätningarna förbereder vi parallellt 40 prover, inklusive 5 olika antibiotika, var och en med 8 koncentrationer samtidigt. Men eftersom det finns många manuella driftsprocedurer är den totala analystiden för att upptäcka AST för fem olika kombinationer av bakterier och antibiotika längre än 2,5 timmar. I vår metod erhölls varje SRS-bild som innehåller ~ 20 enskilda bakterieceller inom ~ 1,0 s i ett enda skott vid 30 μs pixeluppehållstid. Vi uppskattar att den totala AST-analystiden för att studera 10 antibiotika för en bakteriestam skulle vara mindre än 2,5 timmar från prov till SC-MIC-avläsning, vilket har en enorm möjlighet att utföra mätning med hög genomströmning. I det framtida arbetet kommer en automatiserad metod för provberedning och datainsamling att användas för att ytterligare förbättra genomströmningen. Felsökningsinformationen finns i tabell 1.

I konventionella odlingsbaserade AST-metoder, för att erhålla bakterieisolat för ytterligare mätningar, är det nödvändigt att förinkubera kliniska prover i timmar. Avancerade AST-metoder för kliniskt UTI-prov, såsom Raman-spektroskopi29, nanoliter array6 och digital nukleinsyrakvantifiering18, har utvecklats för att bli av med långvarig preinkubation. Jämfört med UTI-infektion är BSI eller sepsis mycket mer livshotande18,45, där snabb AST är brådskande för exakt diagnostik i kliniken. En mikroskopisk avbildningsmetod för att mäta bakteriell kolonibildning från positiva blodkulturer har rapporterats ge MIC-resultat46. Det tar dock minst 6 timmar att odla bakterier för att genomföra AST-analysen. Dessutom kan kommersiella automatiska system47 och masspektrometri48,49 strategier ge AST-avläsning från positiva blodkulturer. MIC-resultaten för det kliniska beslutet kan dock inte tillhandahållas. AST-resultaten och MIC-avläsningen är signifikanta för att undvika överdriven dosering av antibiotika till patienter för att orsaka potentiella biverkningar på kliniker, för att bromsa och förhindra spridning av de antimikrobiellt resistenta infektionerna50,51. Jämfört med de befintliga spontana Raman-mikroskopibaserade AST-metoderna minskar vår teknik enormt datainsamlingstiden (cirka 600 gånger mindre) på grund av signalförbättring av storleksordningar. I detta arbete demonstrerar vi snabb AST genom SRS-avbildning av deuteriummetabolism hos enstaka bakterier vid en kliniskt relevant bakteriekoncentration (105~106 CFU/ml) i antingen urin eller helblodsmiljö. Som visats i tidigare resultat bestäms MIC-resultaten efter 1 h antibiotikabehandling och 30 min blandning av D2O och antibiotikainkubation till bakterier i urin och blod. Vår metod kan ge MICs och känslighetsklassificering för varje kombination av stam-antibiotika inom 2,5 timmar, och öppnar därför en ny väg till klinisk översättning. För att sammanfatta, utan behov av prekulturering och bakteriedelning, har vår metod en enorm potential inom området snabb och hög genomströmning AST vid infektionssjukdomar.

Vår SC-MIC-metod genom SRS metabolisk avbildning är tillämplig för att detektera MICs och ge känslighetsklassificering för infektiösa patogener vid hantering av rikliga sorter av stam-antibiotikakombinationer för klinisk användning. SC-MIC bestäms efter 30 minuters D 2O-införlivande i bakterier i urin och blod, vilket innebär en enorm minskning av diagnostiden jämfört med den konventionella buljongutspädningsmetoden som kostar 16 till24timmar för preinkubation. För att leverera patogenidentifieringsinformation för kliniskt beslutsfattande kan SRS metaboliska avbildningsteknik integreras ytterligare med diagnostiska plattformar som kan identifiera patogener snabbt, såsom matrisassisterad laserdesorptionsjonisering-tid-av-flygning masspektrometri 49,52,53. Att kombinera identifiering av in situ-patogener och snabb AST-diagnos kan vara av stor potential för översättning till klinik som möjliggör identifiering i tid av lämpliga antimikrobiella medel för exakt behandling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av NIH R01AI141439 till J.-X.C och M.S, och R35GM136223 till J.-X.C.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acousto-optic modulation Gooch&Housego R15180-1.06-LTD Modulating stokes laser beam
Amoxicillin Sigma Aldrich A8523-5G
Bandpass filter Chroma HQ825/150m Block the stokes laser beam before the photodiode
Calcium chloride Sigma Aldrich C1016-100G Cation adjustment
Cation-adjusted Mueller-Hinton Broth Fisher Scientific B12322 Antimicrobial susceptibility testing of microorganisms by broth dilution methods
Centrifuge Thermo Scientific 75002542
Cover Glasses VWR 16004-318
Culture tube with snap cap Fisher brand 149569B
Daptomycin Acros A0386346
Deuterium oxide 151882 Organic solvent to dissolve antibiotics
Deuterium oxide-d6 Sigma Aldrich 156914 Organic solvent as a standard to calibrate SRS imaging system
Escherichia coli BW 25113 The Coli Genetic Stock Center 7636
Eppendorf polypropylene microcentrifuge tubes 1.5 mL Fisher brand 05-408-129
Gentamicin sulfate Sigma Aldrich G4918
Hydrophilic Polyvinylidene Fluoride filters Millipore-Sigma SLSV025NB pore size 5 µm
ImageJ software NIH Version: 2.0.0-rc-69/1.52t Image processing and analysis
Incubating orbital shaker set at 37 °C VWR 97009-890
Inoculation loop Sigma BR452201-1000EA
InSight DeepSee femtosecond pulsed laser Spectra-Physics Model: insight X3 Tunable laser source and fixed laser source at 1045 nm for SRS imaging
Lock-in amplifier Zurich Instrument HF2LI Demodulate the SRS signals
Oil condenser Olympus U-AAC NA 1.4
Pseudomonas aeruginosa ATCC 47085 (PAO1) American Type Culture Collection ATCC 47085
Photodiode Hamamatsu S3994-01 Detector
Polypropylene conical tube 15 mL Falcon 14-959-53A
Polypropylene filters Thermo Scientific 726-2520 pore size 0.2 µm
Sterile petri dishes Corning 07-202-031
Syringe 10 mL Fisher brand 14955459
UV/Vis Spectrophotometer Beckman Coulter Model: DU 530 Measuring optical density at wavelength of 600 nm
Vortex mixer VWR 97043-562
Water objective Olympus UPLANAPO/IR 60×, NA 1.2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. O'Neill, J. Tackling drug-resistant infections globally: final report and recommendations. The review on Antimicrobial Resistance. , (2016).
  2. Sugden, R., Kelly, R., Davies, S. Combatting antimicrobial resistance globally. Nature Microbiology. 1 (10), 16187 (2016).
  3. Kumar, A., et al. Duration of hypotension before initiation of effective antimicrobial therapy is the critical determinant of survival in human septic shock. Critical Care Medicine. 34 (6), 1589-1596 (2006).
  4. Reller, L. B., Weinstein, M., Jorgensen, J. H., Ferraro, M. J. Antimicrobial susceptibility testing: a review of general principles and contemporary practices. Clinical Infectious Diseases. 49 (11), 1749-1755 (2009).
  5. Frickmann, H., Masanta, W. O., Zautner, A. E. Emerging rapid resistance testing methods for clinical microbiology laboratories and their potential impact on patient management. BioMed Research International. 2014, 375681 (2014).
  6. Avesar, J., et al. Rapid phenotypic antimicrobial susceptibility testing using nanoliter arrays. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (29), 5787-5795 (2017).
  7. Schoepp, N. G., et al. Digital quantification of DNA replication and chromosome segregation enables determination of antimicrobial susceptibility after only 15 minutes of antibiotic exposure. Angewandte Chemie International Edition. 55 (33), 9557-9561 (2016).
  8. van Belkum, A., et al. Innovative and rapid antimicrobial susceptibility testing systems. Nature Reviews Microbiology. 18 (5), 299-311 (2020).
  9. Hou, Z., An, Y., Hjort, K., Sandegren, L., Wu, Z. Time lapse investigation of antibiotic susceptibility using a microfluidic linear gradient 3D culture device. Lab on a Chip. 14 (17), 3409-3418 (2014).
  10. Choi, J., et al. Rapid antibiotic susceptibility testing by tracking single cell growth in a microfluidic agarose channel system. Lab on a Chip. 13 (2), 280-287 (2013).
  11. Lu, Y., et al. Single cell antimicrobial susceptibility testing by confined microchannels and electrokinetic loading. Analytical Chemistry. 85 (8), 3971-3976 (2013).
  12. Kim, S. C., Cestellosblanco, S., Inoue, K., Zare, R. N. Miniaturized antimicrobial susceptibility test by combining concentration gradient generation and rapid cell culturing. Antibiotics. 4 (4), 455-466 (2015).
  13. Choi, J., et al. A rapid antimicrobial susceptibility test based on single-cell morphological analysis. Science Translational Medicine. 6 (267), (2014).
  14. Baltekin, Ö, Boucharin, A., Tano, E., Andersson, D. I., Elf, J. Antibiotic susceptibility testing in less than 30 min using direct single-cell imaging. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (34), 9170-9175 (2017).
  15. Fredborg, M., et al. Real-time optical antimicrobial susceptibility testing. Journal of Clinical Microbiology. 51 (7), 2047-2053 (2013).
  16. Choi, J., et al. A rapid antimicrobial susceptibility test based on single-cell morphological analysis. Science Translational Medicine. 6 (267), (2014).
  17. Barczak, A. K., Hung, D. T. RNA signatures allow rapid identification of pathogens and antibiotic susceptibilities. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (16), 6217-6222 (2012).
  18. Schoepp, N. G., et al. Rapid pathogen-specific phenotypic antibiotic susceptibility testing using digital LAMP quantification in clinical samples. Science Translational Medicine. 9 (410), (2017).
  19. Novelli-Rousseau, A., et al. Culture-free antibiotic-susceptibility determination from single-bacterium Raman spectra. Scientific Reports. 8 (1), 1-12 (2018).
  20. Schröder, U. -C., et al. Detection of vancomycin resistances in enterococci within 3 1/2 hours. Scientific Reports. 5, 8217 (2015).
  21. Liu, C. -Y., et al. Rapid bacterial antibiotic susceptibility test based on simple surface-enhanced Raman spectroscopic biomarkers. Scientific Reports. 6 (1), 1-15 (2016).
  22. Chang, K. -W., et al. Antibiotic susceptibility test with surface-enhanced raman scattering in a microfluidic system. Analytical Chemistry. 91 (17), 10988-10995 (2019).
  23. Galvan, D. D., Yu, Q. surface-enhanced raman scattering for rapid detection and characterization of antibiotic-resistant bacteria. Advanced Healthcare Materials. 7 (13), 1701335 (2018).
  24. Kirchhoff, J., et al. Simple ciprofloxacin resistance test and determination of minimal inhibitory concentration within 2 h using raman spectroscopy. Analytical Chemistry. 90 (3), 1811-1818 (2018).
  25. Zhang, Z., Chen, L., Liu, L., Su, X., Rabinowitz, J. D. Chemical basis for deuterium labeling of fat and NADPH. Journal of the American Chemical Society. 139 (41), 14368-14371 (2017).
  26. Shi, L., et al. Optical imaging of metabolic dynamics in animals. Nature Communications. 9 (1), 2995 (2018).
  27. Berry, D., et al. Tracking heavy water (D2O) incorporation for identifying and sorting active microbial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (2), 194-203 (2015).
  28. Tao, Y., et al. Metabolic-activity-based assessment of antimicrobial effects by D2O-labeled single-cell raman microspectroscopy. Analytical Chemistry. 89 (7), 4108-4115 (2017).
  29. Yang, K., et al. Rapid antibiotic susceptibility testing of pathogenic bacteria using heavy water-labeled single-cell raman spectroscopy in clinical samples. Analytical Chemistry. 91 (9), 6296-6303 (2019).
  30. Song, Y., et al. Raman-Deuterium Isotope Probing for in-situ identification of antimicrobial resistant bacteria in Thames River. Scientific reports. 7 (1), 16648 (2017).
  31. Freudiger, C. W., et al. Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy. Science. 322 (5909), 1857-1861 (2008).
  32. Cheng, J. -X., Xie, X. S. Vibrational spectroscopic imaging of living systems: An emerging platform for biology and medicine. Science. 350 (6264), (2015).
  33. Zhang, C., Zhang, D., Cheng, J. -X. Coherent Raman scattering microscopy in biology and medicine. Annual Review of Biomedical Engineering. 17, 415-445 (2015).
  34. Yue, S., Cheng, J. -X. Deciphering single cell metabolism by coherent Raman scattering microscopy. Current Opinion in Chemical Biology. 33, 46-57 (2016).
  35. Hu, F., Shi, L., Min, W. Biological imaging of chemical bonds by stimulated Raman scattering microscopy. Nature Methods. 16 (9), 830-842 (2019).
  36. Ji, M., et al. Rapid, Label-free detection of brain tumors with stimulated Raman scattering microscopy. Science Translational Medicine. 5 (201), (2013).
  37. He, R., Liu, Z., Xu, Y., Huang, W., Ma, H., Ji, M. Stimulated Raman scattering microscopy and spectroscopy with a rapid scanning optical delay line. Optics Letters. 42 (4), 659-662 (2017).
  38. Suzuki, Y., et al. Label-free chemical imaging flow cytometry by high-speed multicolor stimulated Raman scattering. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (32), 15842-15848 (2019).
  39. Camp, C. H., et al. High-Speed Coherent Raman Fingerprint Imaging of Biological Tissues. Nature Photonics. 8, 627-634 (2014).
  40. Zhang, M., et al. Rapid determination of antimicrobial susceptibility by stimulated raman scattering imaging of D2O metabolic incorporation in a single bacterium. Advanced Science. 7 (19), 2001452 (2020).
  41. Michael, I., et al. A fidget spinner for the point-of-care diagnosis of urinary tract infection. Nature Biomedical Engineering. 4 (6), 591-600 (2020).
  42. Bhattacharyya, R. P., et al. Simultaneous detection of genotype and phenotype enables rapid and accurate antibiotic susceptibility determination. Nature Medicine. 25 (12), 1858-1864 (2019).
  43. Stupar, P., et al. Nanomechanical sensor applied to blood culture pellets: a fast approach to determine the antibiotic susceptibility against agents of bloodstream infections. Clinical Microbiology and Infection. 23 (6), 400-405 (2017).
  44. Barber, A. E., Norton, J. P., Spivak, A. M., Mulvey, M. A. Urinary Tract Infections: Current and Emerging Management Strategies. Clinical Infectious Diseases. 57 (5), 719-724 (2013).
  45. Cohen, J., et al. Sepsis: a roadmap for future research. The Lancet Infectious Diseases. 15 (5), 581-614 (2015).
  46. Choi, J., et al. rapid antimicrobial susceptibility test from positive blood cultures based on microscopic imaging analysis. Scientific Reports. 7 (1), 1148 (2017).
  47. Gherardi, G., et al. Comparative evaluation of the Vitek-2 Compact and Phoenix systems for rapid identification and antibiotic susceptibility testing directly from blood cultures of Gram-negative and Gram-positive isolates. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 72 (1), 20-31 (2012).
  48. Machen, A., Drake, T., Wang, Y. F. Same day identification and full panel antimicrobial susceptibility testing of bacteria from positive blood culture bottles made possible by a combined lysis-filtration method with MALDI-TOF VITEK mass spectrometry and the VITEK2 system. Plos One. 9, 87870 (2014).
  49. Simon, L., et al. Direct identification of 80 percent of bacteria from blood culture bottles by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry using a 10-minute extraction protocol. Journal of Clinical Microbiology. 57 (2), 01278 (2019).
  50. Leekha, S., Terrell, C. L., Edson, R. S. General principles of antimicrobial therapy. Mayo Clinic Proceedings. 86 (2), 156-167 (2011).
  51. Johnson, L., et al. Emergence of fluoroquinolone resistance in outpatient urinary Escherichia coli isolates. The American Journal of Medicine. 121 (10), 876-884 (2008).
  52. Van Belkum, A., et al. Developmental roadmap for antimicrobial susceptibility testing systems. Nature Reviews Microbiology. 17 (1), 51-62 (2019).
  53. Dubourg, G., Lamy, B., Ruimy, R. Rapid phenotypic methods to improve the diagnosis of bacterial bloodstream infections: meeting the challenge to reduce the time to result. Clinical Microbiology and Infection. 24 (9), 935-943 (2018).

Tags

Biologi utgåva 180
Snabb testning av antimikrobiell mottaglighet genom stimulerad Raman-spridningsavbildning av deuteriuminkorporering i en enda bakterie
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, M., Seleem, M. N., Cheng, J.… More

Zhang, M., Seleem, M. N., Cheng, J. X. Rapid Antimicrobial Susceptibility Testing by Stimulated Raman Scattering Imaging of Deuterium Incorporation in a Single Bacterium. J. Vis. Exp. (180), e62398, doi:10.3791/62398 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter