Summary
pH感受性蛍光プローブでマークされたエキソキシティックイベントを検出する自動コンピュータビジョンソフトウェアを開発しました。ここでは、グラフィカルユーザーインターフェースとRStudioを使用して、融合イベントの検出、融合の時空間的パラメータの分析と表示、およびイベントを個別の融合モードに分類する方法を示します。
Abstract
小胞SNAREタンパク質に結合したpH感受性GFP(pHluorin)のタイムラプスTIRF顕微鏡は、細胞培養における単一の小胞性エキサイトイベントを可視化する有効な方法である。このような事象の公平で効率的な同定と分析を行うために、MATLABでコンピュータビジョンベースのアプローチが開発され、実装されました。分析パイプラインは、細胞セグメンテーションとexocytic-イベント識別アルゴリズムで構成されています。コンピュータビジョンアプローチには、蛍光減衰の半減期およびΔF/Fピークを含む単一事象の複数のパラメータを調査するためのツールと、エキソサイトーシスの頻度の全細胞分析が含まれる。これらの融合のパラメータと他のパラメータは、異なる融合モードを区別する分類アプローチで使用されます。ここで新しく構築された GUI は、最初から最後まで分析パイプラインを実行します。R StudioでのリプリーのK関数のさらなる適応は、空間と時間の両方でクラスター化、分散、またはランダムな核融合事象の発生を区別するために使用されます。
Introduction
VAMP-pフルオリン構築物またはトランスフェリン受容体(TfR)-pHuji構築物は、側耳球菌の優れたマーカーであり、これらのpH感受性フルオロフォアは、小胞と形質膜1との間の融合孔口開口の直後に酸性小胞腔および蛍光の中で直ちに消光される。融合孔の開口部に続いて、蛍光は指数関数的に崩壊し、融合事象に関する情報を明らかにするいくつかの異質性がある。ここでは、exocytic イベントを自動的に検出して分析するグラフィカル ユーザー インターフェイス (GUI) アプリケーションについて説明します。このアプリケーションは、pH感受性マーカー2によって明らかにされたexocyticイベントを自動的に検出し、分類目的3(図1A)に使用できる各イベントから特徴を生成することをユーザーに可能にする。また、リプリーのK関数を用いたエキサイトティックイベントクラスタリングの解析も説明する。
異なるエキソサイトモードへのエキサイトティックイベントの自動分類は最近報告されました 3.2つの排泄物症のモード、フルベシクル融合(FVF)およびキスアンドラン融合(KNR)のエキソサイトーシスは、以前に4、5、6、7を説明した。FVFの間に、融合細孔は拡張し、そして小胞は、形質膜に組み込まれる。KNRの間に、融合孔は一時的に開き、4、5、8、9、10を再シールする。神経細胞化の4つのモードは、FVFに関連する2つ、KNRに関連する2つのニューロンの発達において同定された。この研究は、FVFとKNRの両方が、蛍光崩壊が始まる前に融解孔開口部または興奮性事象の後に直ちに蛍光減衰(FVFiおよびKNRi)に進む融合事象にさらに細分化できることを示している(図1B)。分類子は、各フュージョン イベントの exocytosis のモードを識別します。ここでは、この分析は、WindowsおよびMacベースのオペレーティングシステムでMATLABにインストールすることができるGUIに組み込まれています。すべての解析ファイルは、https://drive.google.com/drive/folders/1VCiO-thMEd4jz-tYEL8I4N1Rf_zjnOgB?usp=sharing または
https://github.com/GuptonLab。
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Protocol
1. データセットとディレクトリを選択する
- 分析するデータセットを選択するには、[データセットの 検索] ボタン (図 2A、 赤のボックス 1) をクリックして、データが格納されているフォルダー (たとえば、RawData フォルダー) に移動します。データファイルは、データファイルをリストとして自動的に設定します。フォルダーには複数のデータセットを含めることができます。
- [ ディレクトリの選択 ] ボタンをクリックし、分析されたファイルが入金されるディレクトリ (たとえば Test) を選択します (図 2A、 赤いボックス 2) 。[分析] ボタンを押すと、フォルダと完成した解析ファイルのセットと中間の一時イメージがこのディレクトリに作成されます。ディレクトリが選択されていない場合は、エラーが発生します。
2. ピクセルサイズとフレームレートを設定する
- 適切なフレームレートと画像のピクセルサイズを、適切な「フレームレート」または「ピクセルサイズ」ボックスに入力します(図2A、緑のボックス)。値が指定されていない場合 (デフォルトの "0" に設定されている場合)、プログラムは、ファイルに関連付けられたメタデータを検索して、フレームレートとピクセルサイズを探します。これらの値が見つからない場合、プログラムは、測定用にピクセル単位、タイム ポイントのフレーム単位にデフォルト設定されます。
注: この例では、フレームレートは 100 で、ピクセル サイズは 0.08 です。
3. マスクを選択または作成する
- [ マスク メーカー] ボタンを使用して、ファイル データセット リストのデータのセル マスクを自動的に作成します (図 2A、青いボックス)。 マスクメーカー ボタンを使用すると、選択したディレクトリにMaskFilesという名前の新しいフォルダが作成されます。「実行インジケーター」は、実行中に黄色に変わり、完了すると緑色に戻ります。
注: データ ファイル リストの各ファイルのマスクは、イメージ ファイルの最初の 10 フレーム (イメージ ファイル内に 10 個未満の場合はすべてのフレームから) 作成され、適切な命名スキーム (下記を参照) を使用して MaskFiles フォルダに保存されます。 - マスクファイルが自動的に「マスクファイル」リストに入力されるようにします。ユーザーは、直接分析に進むことができます。
注: マスク ファイルを常に視覚的にチェックし、対象地域全体をキャプチャすることを確認します。選択すると、データ ファイルの最初のフレームとマスク ファイルが UI に表示されます。(図2B)マスクメーカーは、低信号対ノイズの場合にエラーを生成する可能性があるため、マスクファイルが適切であることを検証することは、品質管理にとって重要です。 - マスクメーカーを使用する代わりに、画像のノイズへの信号が不十分な場合は、ImageJで手動でマスクを作成します。
- まず、ImageJ で生画像ファイルを開きます (図 3A)。
- [ ポリゴン選択 ]ボタンをクリックし、セルの周りにマスクを描きます。終了したら、最後のポイントをダブルクリックしてポリゴンを完成させます。
- 完了したら、[ 編集] |選択|マスクを作成 する (図 3B)。新しい反転マスクは、ポリゴンの描画に基づいて作成されます。マスクを、選択したディレクトリの指定された MaskFiles フォルダに保存します。マスク ファイルの命名スキームは、対応する個別のデータ ファイルの後に「_mask_file」を続ける必要があります。たとえば、データ ファイルの名前が "VAMP2_488_WT_1.tif" の場合、対応するマスク ファイルの名前は "VAMP2_488_WT_1_mask_file.tif" にする必要があります。
- [マスクファイルの検索]ボタンを使用して、保存されたカスタム マスク ファイルの選択したフォルダに移動します。マスクは、マスクファイルをリストとして設定します。
注: 分析を実行する前に、すべてのデータ ファイルにマスクを設定することが重要です。
4. 分析と特徴抽出
- ディレクトリを選択し、[データ ファイル] リストと [マスク ファイル] リストにデータを入力したら、[ 分析 ] ボタン (図 4A)をクリックします。exocytic イベントの分類が必要な場合は、手順 5 に進みます。
注: [分析 ] ボタンをクリックすると、データを分析するための一連の自動タスクが実行されます。選択したディレクトリに個別のフォルダを作成し、分析データをデポジットします。実行中に"実行インジケータ"は緑から黄色に変わります(図4A、赤いボックス)。解析が終了すると、緑に戻ります。 - DataFiles フォルダ (図 4B) を検索し、各データ ファイルに従って名前を付けて、分析ファイルの完全なセット (および後で分類で使用する機能抽出ファイル) を検索します (図 4C)。
注: これらの解析ファイルの説明は、以下の「代表的な結果」セクションに記載されています。
5. エキソキシイベントの分類
- 自動検出と exocytic イベントの同時分類を実行するには、[分析] ボタンをクリックする前に[分類] チェックボックスをオンにします。exocytic イベントごとに、各クラスに対して確率スコアを 0 ~ 1 の間で割り当てます。exocytic イベントは、そのクラスの確率スコアが 0.5 >場合、4 つのクラスの 1 つとして分類されます。
注: 分析が完了すると、選択したディレクトリ内に新しいデータ ファイル フォルダが表示されます。フォルダには、各画像ファイルに対応する解析ファイルが含まれます。
6. リプリーのK値を用いたエキソサイトーシスの時空間解析
- 別の「神経突」と「相馬」マスクファイルを作成します。まず、空状から相馬をセグメント化します。神経突起から相馬をセグメント化する公平な方法はないため、ユーザーはコンディショニング実験に目をつぶり、最良の判断を使用する必要があります。明らかな神経突起の拡張子を持たない楕円体が推奨されます。
- 画像J/フィジーを開きます。
- マスクファイルをドラッグアンドドロップするか、 ファイル| マスク ファイルを開いて選択します。
- カラーピッカーツールを使用して、マスクの背景にある黒いピクセルをクリックして、カラーを黒に設定します。
- 多角形選択ツールまたはフリーハンドを使用して、相馬の周囲に輪郭を描き、それをニューライトから分離します。これには、手動での意思決定が必要です。
- [編集] | 選択|マスクを作成します。新しい画像が開き、丸で囲まれた相馬が画像の残りの部分からセグメント化されます。これにより、相馬マスクファイルが作成されます。
- 描画領域を移動せずに、元のマスク ファイルのヘッダーをクリックします。
- [編集] | 円を描いた相馬を埋めるために記入し、神経突起だけがマスクのままになるようにします。
- 別のノイライトとマスクファイルが取得されたら、両方のマスクファイルを 保存 します。
- Matlabで「neurite_2D_network」を開きます。
- MATLAB で、すべての解析データを含むディレクトリに移動します。
- パス「マスク名」をノイライトマスクの名前に変更します。すなわち、「MaskFiles/VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_neurite.tif」。
- 「csv_file_name」をファイル fluorescent_traces.csvがある場所、つまり「MaskFiles/VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_neurite.csv」に変更します。
- [ 実行 ]をクリックして、ノイライトマスクファイルをスケルトン化します。これにより、neurite マスク ファイルのスケルトン化されたバージョンが作成され、マスクファイル フォルダの下に CSV ファイルとして保存されます。
- 次に、ソーマの CSV ファイルを生成します。Matlabで「CSV_mask_creator.m」を開きます。
- 相馬マスクの名前に「マスク名」のパスを入れて、すなわち、「マスクファイル/VAMP2phLuorin_488_wt_4_mask_file_soma.tif
- 作成する csv ファイル名に "書き込みマトリックス" を変更します。つまり、「マスクファイル/VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_soma.csv」
- [ ファイルを実行 ]をクリックします。これにより、新しいVAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_soma.csv ファイルが作成されます。
- マスクファイルごとに6.14を繰り返します。
7. RStudio のセットアップ
- Rstudio を開き、ripleys_k_analysis開きます。R ファイル。
- ツール |にアクセスして、RStudio でパッケージ "spatstat" をインストールします。 パッケージをインストール し、「spatstat」と入力し、「 インストール」をクリックします。
注: この操作は、Rstudio インストールごとに 1 回だけ実行する必要があります。 - 各セッションの開始時に、ライブラリ・スパットスタットを実行します。
- この場合は、"neuron_mask" と "neuron_datapoints" という 2 つの主な変数に注意してください。ニューロンマスクは、実行するマスクファイルのセット、すなわちソーママスクファイルを指しています。
注: Neurite マスク ファイルとは別に、すべての相馬マスク ファイルを同時に実行し、その逆も同様です。 - 分析する各ニューロンのマスクファイルの.csvを読み込みます。
- 追加のneuron_mask_n+1をコピーして、複数のファイルを一度に実行します。これにより、セクション 8 で説明したスクリプトを使用して、リプリーの分析を集計できます。
- 次に、2 番目の変数 "neuron_datapoints" を確認します。
- を読んでください。exocytic イベントの x、y、t 位置、および 2D ネットワークの X,Y 位置の neurite 固有のファイルを含む解析プログラムによって生成された「X_fluorescent_traces.csv」ファイル(すべてのextracted_Rファイルを含む)。これは「neuron_datapoints」の位置に入ります。
- RStudio で コードの選択|実行領域|すべてのを実行します。これにより、グループ化されたリプリーのK値や密度プロットなど、いくつかのプロットが生成されます。
- [エクスポート] に行ってプロットを 保存|イメージを|として保存 適切なイメージ形式とディレクトリを選択し、適切なファイル名を入力して、[ 保存] をクリックします。
注: ヒートマップのプロット関数は、スクリプト内で「plot(density(soma_data,0.4)」を使用して呼び出されます。ここでの数字"0.4"は、密度関数の平滑化を表します。ユーザーデータに適した方法で変更できますが、異なるヒートマップ間で比較を行う場合は、それらの間で同じ数にする必要があります。 - Rstudio からイメージをエクスポートまたは保存します。ヒートマップをさらに編集する必要がある場合は、適切なファイルタイプ(SVG またはEPS)を選択します。
8. リプリーの分析
注:Ripleys_k_analysis。Rファイルも自動的にリプリーのk値プロットを生成しました。スクリプト全体を実行すると、以下に示す関数が自動的に実行されますが、スクリプトの各部分を個別に実行したり、解析を変更したりする場合は、詳細に説明します。
- まず、各セルにエンベロープ関数を実行します。この関数は完全な空間乱数 (CSR) をシミュレートし、興奮性イベント ポイント パターンの Ripley の K 値をテストしました。
Data_envelope_1 = エンベロープ (soma_data_1、ケスト、nsim = 19、セーブファン = TRUE)
Data_envelope_2 = エンベロープ(soma_data_2、ケスト、nsim = 19、セーブファン = 真) - 次に、これらのエンベロープをプールし、グループの CSR の 1 つの見積もりを作成します。
Pool_csr = プール(Data_envelope_1、Data_envelop_2,...)
次に、すべてのデータポイントに対してリプリーのK関数を実行します。
Data_ripleys_k_1 = Kest(soma_data_1、比率 = 真)
Data_ripleys_k_2 = ケスト(soma_data_2、比率 = 真) - 完了したら、リプリーの K 値をプールし、次のコマンドで信頼区間をブートストラップします。
データ プール = プール(Data_ripleys_k_1、Data_ripleys_k_2,...) - 次のコマンドでブートストラップ:
Final_Ripleys_K = varblock(楽しい = ケスト、Data_pool) - データをプロットします。
- ハード統計的な違いが必要な場合は、スパットスタットパッケージに学生化順列テストが含まれ、ポイントパターンのグループ間の違いをテストします。
Test_difference = studpermu.test(all_points_to_test、exocytic_events ~グループ、nperm = np)。
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Representative Results
ここでGUI(図2A)をTIRF(全内部反射蛍光)顕微鏡を用いて3DIVで3つのVAMP2-pHluorin発現ニューロンからのエキソキシティックイベントを解析するために利用した。E15.5皮質ニューロンを単離し、続いてVAMP2-pHluorinを用いたトランスフェクションと、Winkle et al.、2016およびViesselmannら、2011 11、12に記載されているプロトコルを用いたメッキを行った。イメージングパラメータの方法論は、Urbinaら、 20182.簡単に言えば、TIRF顕微鏡を用いて、2分間100ms毎にニューロンの基底原形質膜を画像化した。図2、図3、図4は、エキサイトティック事象を分析するためのステップバイステップガイドを示している。ニューロン画像が配置されているフォルダが選択され、最終解析データファイルを格納するディレクトリが選択されます (図 2A)。MaskMaker 関数を使用して、GUI で検査されるニューロンにマスクが生成されます (図2B)。この場合、セルマスクは良好な品質であり、分析を進めることができます。マスクが不十分な場合は、ImageJ (図3)でマスクを作成できます。MaskMaker 関数を使用するか、ImageJ でマスクを作成し、マスクファイルが配置されているディレクトリを選択すると、解析が実行されます (図 4A)。分析が終了すると、結果は DataFiles フォルダに生成されます (黄色のインジケータが緑色に戻ります) (図 4B)。
データファイルは、提供された生データファイルに従って自動的に生成され、名前が付けられます。
データファイルの名前が X であると仮定します。
X_tracking: このファイルには、各イベントの X、Y 位置、フレーム番号、および各イベントの周囲にボックスを描画するために使用できるバウンディング ボックスが含まれています。[年齢] は、イベントが個別のガウスパンクタである初期検出を過ぎたフレーム数を示します。分類がチェックされると、分類結果がこのファイルに表示され、4 つのクラスのいずれかに属する exocytic イベントの確率が示されます。確率が .5 より大きく、他の確率よりも大きい場合は、exocytic クラスが選択されます。
X_fluorescentトレース: このファイルには、各イベントの X、Y 位置、およびフレーム番号が含まれます。また、各イベントのピークΔF/Fの2秒前および10秒後の各事象の周囲の対象領域における蛍光強度測定が含まれる(Timepointカラムで示される)。
X_cell_statistics: このファイルには、セル領域、合計イメージ時間、および各セルの exocytic イベントの自動的に計算された頻度が含まれます (イベント/mm2/分)。
機能抽出ファイルには、次のものがあります。
X_contrast: 対照。画像全体のピクセルとその隣接部分の間の強度のコントラストの尺度。
X_correlation: 相関。ピクセルが画像全体にわたって隣接するピクセルとどのように関連しているかを示す尺度。
X_energy 総エネルギー。ピクセルの強度の平方和として定義されます。
X_homogeneity は ROI の要素の分布と ROI 対角線の近さを測定します。
X_ring_fluorescence: 境界線ピクセルの平均蛍光。
X_SD: 標準偏差。これは ROI の標準偏差として定義されます。
各エキソキシククラスからのSEM±平均蛍光痕の例は、X_fluorescentトレースファイルからプロットした(図5A)。Cell_statisticsファイルを用いて、各クラスのエキソサイトーシスの頻度をニューロンごとにプロットした(図5B)。[分類] チェック ボックスをクリックすると、図 5Cにプロットされた各 exocytic イベントがクラスに割り当てられます。分類に従って、Ripley の K 分析コードを使用して、exocytic イベントがランダム、クラスター化、または空間と時間に分散しているかどうかを判断しました。exocyticイベントの局在化の密度ヒートマップ(図5D)が生成された。これらは、ニューロンの異なる領域で期待されるクラスター化された「ホットスポット」を明らかにします。次に、時間の経過に合わせ、相腫、神経突起、およびクラスタリングに対してリプリーのK分析を行いました(図5E)。リプリーのK値とSEM(黒い線と青のシェーディング領域)は、完全な空間的ランダム性(赤い点線)のラインの上に上昇し、統計的に有意なクラスタリングを示唆しています。
図1: エキサイト分析と分類の表現( A) GUI の分析パイプラインの概要細胞は、exocytic イベントが識別されて追跡される前に、背景からセグメント化されます。ピークΔF/Fやt1/2 などのパラメータは、イベントのプレフュージョンとポストフュージョンの周りのROIにおけるエキソサイトーシスの蛍光痕から計算されます。(B) エキソサイトーシスの4つのモードと画像モンタージュの例を示す図。融合後、イベントはFVFまたはKNR(FVFiおよびKNRi)に瞬時に進行するか、またはFVFまたはKNR(FVFdおよびKNRd)に融合運命の発症前に遅延が存在する可能性がある。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2: ステップバイステップの解析例. (A) まず、データセットが選択され (1., 赤いボックス)、ディレクトリが選択されて解析ファイルを配置します (2., 赤いボックス)。次に、フレームレートとピクセルサイズを指定します(3.,緑のボックス)。ここでは、0.08μmピクセルサイズと100msフレームレートを使用した。その後、マスクメーカーの機能ボタンが押されます(4.、青いボックス)。選択したディレクトリに、データセット内の各イメージ ファイルのマスク ファイルを含む "MaskFiles" という名前のフォルダーが自動的に作成されます。(B) データセットを読み込むときに、データ ファイルやマスク ファイルを選択すると、比較しやすい画像の最初のフレームが表示されます (緑色のボックス)。マスク ファイルが完全に正しくない可能性があります。このマスクファイルは、エラーを修正することができます、または新しいマスクファイルは、この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください手動で行うことができます。
図3: ImageJ. (A) まず、マスクを作成するためにファイルを開いて、マスクファイルを手動で作成します。「ポリゴン選択」ボタンは赤で輪郭が表示されます。セルのエッジをクリックすると、ポリゴンのアウトラインが作成されます。(B) ポリゴンアウトラインからマスクを作成する方法。[編集] |を選択する選択|マスクを作成する、黒と白のマスクがポリゴン(右画像)から作成されます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4: exocyticイベントの解析(A)解析ボタン(オレンジボックス)のデモンストレーションと実行中の分析分析の実行中に実行インジケータが黄色に変わることに注意してください。(B) 解析が完了したときに選択したディレクトリに作成される分析ファイルの例。DataFiles には、exocytic イベントのすべての分析ファイルが含まれています。(C) DataFiles フォルダに生成された分析ファイル。カラーボックスは、後続の画像で開いているファイルを表します。(D) 開いている3つのファイル、"X_fluorescent_traces.csv"(赤)と"X_Cell_statistics"(緑)、および"X_tracking"(青)。蛍光トレースには、各イベントのX、Y位置、フレーム番号、および各ROIの蛍光強度が含まれています。Cell_statisticsには、エキソサイトーシスの頻度などの全細胞興奮統計の要約情報が含まれています。X_trackingには、各 exocytic イベントの位置と時間の情報、および各イベントの各クラスの exocytosis の確率 >が含まれます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5: 代表的な結果(A)各エキサイトー系クラスからの平均蛍光トレース +/- SEM. (B) 各エキサイトークラスの3つのマウス皮質ニューロンについてプロットされたイベントの頻度。これらのデータ値は、「X_tracking」で割り当てられたクラスを使用して、「X_Cell_statistics」からプロットされました。(C)Aで使用される同じ3つのセルに対する興奮性のクラスの分布。ここで、各モードの比がプロットされる。(D) プロトコルのリプリーの K 分析部分で生成されたエキソキシティック イベントが発生している場所の密度プロット。これは、イベントが発生している場所の空間可能性の「ヒートマップ」として解釈できます。(E)A)およびBに使用される3つの細胞のリプリーのK分析。赤い線は、exocytic イベントの完全に空間的にランダムな分布の値を示します。黒い線は、この例の 3 つのセルのリプリーの K 値の集計を示し、青いシェーディング領域は信頼区間を表します。ここでは、シェーディングされた領域は、特に〜0.25〜1 μmの間の完全な空間的ランダム性のラインの外に落ち、exocyticイベントがそれらの距離でクラスター化されていることを示唆している。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
exocytic検出および解析ソフトウェアを使用する場合、プログラムは入力としてファイル.tif可逆圧縮のみを受け入れることを考慮してください。.tifイメージ ファイルは、8 ビット、16 ビット、または 32 ビットのグレースケール (単一チャネル) イメージです。他の画像形式は、入力前にこれらのタイプのいずれかに変換する必要があります。参考として、ここで使用する例は 16 ビットのグレースケールイメージです。
自動検出プロセスに固有のタイムラプス画像セットは、自動背景減算とフォトブリーチ補正のために処理されます。背景の減算では、マスク ファイルのマスク領域の外側のピクセルは、画像全体のタイムラプスで平均化され、その平均値はイメージ セットから減算されます。フォトブリーチング補正では、ビデオの過程でマスク内のピクセルの平均蛍光に単一指数減衰フィットが適用され、補正された強度は次のように調整されます。
補正された強度 = (時間 t の強度) ÷ exp-k×t (k = 減衰定数)
したがって、入力前に事前処理は必要ありません。しかし、これらのプロセスは、セルをバックグラウンドから効果的に分離するためにイメージマスクに非常に依存しているため、良好な結果を得るためには適切なセルマスクが必要です。
自動セルマスク作成者は、十分な信号対雑音比(理想的には、平均バックグラウンド信号の標準偏差の少なくとも2倍)を持つ均一な信号を必要とします。経験的には、プレニル化時に形質膜に挿入する蛍光タンパク質でタグ付けされたCAAXボックスがうまく機能します。エキサイトーシスのタイムラプスイメージングを通して信号を維持できる必要はなく、シーケンスの最初の10フレームの高い信号から適当なマスクを作成することができる。しかし、イメージングパラダイム中に細胞の形態が大きく変化する場合は、注意が必要です。
自動検出ソフトウェアを使用する場合は、正確な時間および空間出力を得るためのフレームレートとピクセル サイズを含めます。フレームレートまたはピクセル サイズが宣言されていない場合、出力はピクセル単位とフレーム単位になります。経験則として、発達中の小胞径は100nm13のスケールにあり、したがって、イベントの自動検出はサイズが似た小胞に対して働く可能性があります。現状では、自動検出はガウス幅の広い範囲にわたってガウス形の強度に依存するため、検出できる小胞のサイズ(ピクセル面積別)にハード制限はありません。蛍光回折が複数のピクセルにわたって拡大するにつれて、イベントの強度が平均バックグラウンド信号の標準偏差の2倍の信号対雑音基準を満たしている場合、小胞の融合は正確に検出できます。
このプログラムは、ニューロンの開発における興奮性事象を検出するために開発されました。しかし、このソフトウェアは、他の細胞株2のexocyticイベントを正常に検出するために悪用されており、検出アルゴリズムが堅牢であることを示している。非神経細胞型のエキソキティック事象を検出するためのソフトウェアを用いてきたが、細胞タイプ14 間のエキサイトティックイベントモードの違いは、分類アルゴリズムが他の細胞タイプに適していない可能性があることを示している。ニューロンの発達におけるエキサイトティック事象は、もともと階層クラスタリング、動的時間ワープ、主成分分析(PCA)の3つの異なる方法を使用して分類され、4つの異なるクラス3が明らかになった。ここでは、3 つの分類子すべてが GUI で採用され、exocytic イベントをこれら確立された 4 つのクラスのいずれかに分類します。exocytic イベントごとに、4 つの可能なクラスごとに 0 から 1 の確率スコアが割り当てられます。確率スコアが0.5>クラスは、そのクラスと見なされます。この分類は、これまでのニューロンの開発にのみ使用されています。これらのクラスが他の細胞型に存在するか、後でニューロンの発達時ポイントに存在するかは不明である。クラスのいずれかに対して確率スコアが <0.5 のイベントが多数ある場合、分類手順は現在評価されている exocytic イベントに適していない可能性があることを示唆しています。低確率スコアが異なる細胞型のexocyticイベントに割り当てられる場合、これは新しいまたは代替のエキサイトーシスモードが存在する可能性があるため、de novo分類が必要であることを示唆している。ここで使用する分類方法と同じ分類方法を、自動的に検出された exocytic イベントに適用する必要があります。
エキサイトティック事象の空間的および時間的クラスタリングを探索するために、RipleyのK分析15 が利用される。ニューロンのクラスタリングの分析には、相馬用、神経突起用、時間用の3つの別々の分析が含まれます。相腫と神経突起を分割する理由は、多くの場合、2Dネットワークとして扱い、RipleyのK分析の2Dバリアントを適用できるほど薄い神経突起の極端な形態を説明するためです。時間の間、1D リプリーの K 分析は時間的なクラスタリングのために実装されています。リプリーのK分析は、ポイントプロセスのクラスタリングと共局在化を検出するための堅牢な方法です。リプリーのKのグラフは、リプリーのK値+信頼区間は、任意の時点で完全な空間乱数のラインの外に落ちる可能性が5%であり、p値0.05に似ています。値が完全な空間的ランダム性のラインの外にある場合、exocytic イベントはクラスター化されるか (CSR の上) またはそれらの距離 (x 軸) で一定の間隔 (CSR の下) で分離されます。
マスクファイルの作成は、セルの高い初期信号対雑音に依存します。pH感受性マーカーは、プローブがどのタンパク質に結合されているかに応じて、細胞を照させる際に必ずしもうまく機能するとは限りません。エキサイトマーカーのノイズへの信号が細胞の境界線を強調し不足している場合にマスクファイルを作成するもう1つの選択肢は、マスク作成のために第2の蛍光チャネル/画像を採用することです。マスクを作成するために別の蛍光マーカー (たとえば、tagRFP-CAAX) を使用する場合、データセットを選択する際に、まず画像を含むフォルダーに移動してマスクを作成します (たとえば、tagRFP-CAAX イメージを含むフォルダー)。ここでマスクメーカーボタンを使用します。重要なのは、上記の命名スキームと解析する exocytic データファイルに合わせてマスクファイルの名前を変更することを忘れないでください(上記の例に従って、解析対象の VAMP2 イメージセットに合わせて「CAAX_1_mask_file.tif」という名前のマスクファイルを「VAMP2_488_WT_1_mask_file.tif」に変更する必要があります)。マスク ファイルに適切な名前が付いたら、[ データセットの選択] ボタンに戻り、解析する exocytic データセット ファイルに移動します。
エキサイトーシスの検出は非常に感度が高く、エキソシティックイベントはΔF/F0.01の低い信号対雑音比で正確に検出されました。検出の感度は、バックグラウンド蛍光の分散に部分的に依存し、バックグラウンド信号より4標準偏差未満の事象は検出されません。
エキソキシティックイベントの検出は、その一過性の性質に依存しています。一時的なイベントの分析の特徴として、検出コードは exocytic イベントの周囲の 20 秒のウィンドウを探ります。一部の細胞タイプでは、キスアンドステイエキサイトーシスは、ニューロンの発達よりもはるかに長い時間的なウィンドウのために「滞在」する可能性があり、自動検出はこれらのあまり一過性の低いイベントを堅牢に捉えていない可能性があります。この機能はMATLABと快適な人のための容易に変更可能な変数である。20秒ROIの制限と同様に、ビデオの最後の時間枠の前に出現するが消滅しないexocyticイベントは、真のエキサイトーシスとしてカウントされない可能性があり、これは、時系列の全長に基づいて計算される頻度に影響を与える可能性があります。
含まれているマスクメーカーは、設計によって自動化され、背景から複雑な形状をセグメント化する上でうまく機能します。ただし、完全に自動化された設計では、マスクを自動的に生成するために使用できる信号対雑音と信号タイプの範囲が制限されます。ユーザが均一で有意なシグナル対雑音比の蛍光セルマーカーを含めることができない場合、セルマスクは手動で描画する必要があります。
エキサイトーシスのユーザーベースの分析は時間のかかるプロセスであり、イベントが常に他の蛍光から明確に分離されるとは限らないので、個人的なバイアスの対象となります。自動化された解析プログラムを使用して、偏りのない方法でexocyticイベントを正しく識別および分析することで、解析効率が向上し、再現性と厳格性が向上します。
このエキサイトティクス事象検出は、ニューロンの発達におけるpH感受性蛍光を正確に捕捉する働きだけでなく、他の細胞タイプも同様に機能します(Urbina et al., 2018)。分類が他のセルタイプに対して機能するかどうかは、決定が必要です。この技術の将来の応用は、シナプス、非神経細胞型、または最近述べたpHmScarlet16のような興奮性小胞ドッキングおよび融合の新規マーカーで有用であり得る。
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Disclosures
著者らは開示するものは何も宣言しない。
Acknowledgments
コードと GUI のテストに関して、Dustin Revell とレジナルド・エドワーズに感謝します。資金は、R01NS112326(SLG)、R35GM135160(SLG)、F31NS103586(FLU)を含む、この研究を支援する国立衛生研究所によって提供されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | |
| R | R Core Team | https://www.r-project.org/ | |
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References
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