Summary
Desarrollamos un software automatizado de visión por computadora para detectar eventos exocióticos marcados por sondas fluorescentes sensibles al pH. Aquí, demostramos el uso de una interfaz gráfica de usuario y RStudio para detectar eventos de fusión, analizar y mostrar parámetros espaciotemporales de fusión y clasificar eventos en distintos modos de fusión.
Abstract
La microscopía TIRF de lapso de tiempo de GFP sensible al pH (pHluorin) unida a las proteínas SNARE de vesícula es un método eficaz para visualizar eventos exocíticos de vesícula única en cultivo celular. Para realizar una identificación y análisis imparcial y eficiente de dichos eventos, se desarrolló e implementó en MATLAB un enfoque basado en la visión por computadora. La canalización de análisis consiste en un algoritmo de segmentación celular e identificación de eventos exocíticos. El enfoque de visión por computadora incluye herramientas para investigar múltiples parámetros de eventos individuales, incluida la vida media de la desintegración por fluorescencia y el pico de ΔF / F, así como el análisis de células enteras de la frecuencia de la exocitosis. Estos y otros parámetros de fusión se utilizan en un enfoque de clasificación para distinguir distintos modos de fusión. Aquí, una GUI recién construida realiza la canalización de análisis de principio a fin. La adaptación adicional de la función K de Ripley en R Studio se utiliza para distinguir entre la ocurrencia agrupada, dispersa o aleatoria de eventos de fusión tanto en el espacio como en el tiempo.
Introduction
Las construcciones VAMP-pHluorin o el receptor de transferrina (TfR)-pHuji son excelentes marcadores de eventos exocióticos, ya que estos fluoróforos sensibles al pH se apagan dentro de la luz de la vesícula ácida y la fluorescencia inmediatamente después de la apertura del poro de fusión entre la vesícula y la membrana plasmática1. Después de la apertura del poro de fusión, la fluorescencia decae exponencialmente, con cierta heterogeneidad que revela información sobre el evento de fusión. Aquí, se describe una aplicación de interfaz gráfica de usuario (GUI) que detecta y analiza automáticamente los eventos exocióticos. Esta aplicación permite al usuario detectar automáticamente eventos exocióticos revelados por marcadores sensibles al pH2 y generar características a partir de cada evento que pueden ser utilizadas para fines de clasificación3 (Figura 1A). Además, se describe el análisis de la agrupación de eventos exocióticos utilizando la función K de Ripley.
Recientemente se informó de la clasificación automatizada de eventos exocióticos en diferentes modos exocióticos3. Se han descrito previamente dos modos de exocitosis, la fusión de vesícula completa (FVF) y la exocitosis de fusión de beso y corrido (KNR)4,5,6,7. Durante la FVF, el poro de fusión se dilata y la vesícula se incorpora a la membrana plasmática. Durante KNR, el poro de fusión se abre transitoriamente y luego vuelve a sesar4,5,8,9,10. Se identificaron cuatro modos de exocitosis en neuronas en desarrollo, dos relacionados con FVF y dos relacionados con KNR. Este trabajo demuestra que tanto FVF como KNR se pueden subdividir en eventos de fusión que proceden inmediatamente a la desintegración de la fluorescencia (FVFi y KNRi) después de la apertura del poro de fusión o eventos exocíticos que exhiben un retraso después de la apertura del poro de fusión antes de que comience la desintegración por fluorescencia (FVFd y KNRd)(Figura 1B). El clasificador identifica el modo de exocitosis para cada evento de fusión. Aquí este análisis se ha incorporado en una GUI que se puede instalar en MATLAB en sistemas operativos basados en Windows y Mac. Todos los archivos de análisis se pueden encontrar en https://drive.google.com/drive/folders/1VCiO-thMEd4jz-tYEL8I4N1Rf_zjnOgB?usp=sharing o
https://github.com/GuptonLab.
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Protocol
1. Elija conjuntos de datos y directorio
- Para seleccionar conjuntos de datos para su análisis, haga clic en el botón Buscar conjuntos de datos ( Figura2A, cuadro rojo 1) para navegar a la carpeta donde se depositan los datos (por ejemplo, la carpeta RawData). Los archivos de datos rellenarán automáticamente los archivos de datos como una lista. Puede haber más de un conjunto de datos en la carpeta.
- Haga clic en el botón Elegir directorio y seleccione el directorio (por ejemplo, Prueba) donde se depositarán los archivos analizados(Figura 2A,cuadro rojo 2). Se creará un conjunto de carpetas y archivos de análisis terminados, así como imágenes temporales intermedias en este directorio cuando se presione el botón Análisis. Se producirán errores si no se elige un directorio.
2. Establece el tamaño de píxel y la velocidad de fotogramas
- Rellene la velocidad de fotogramas y el tamaño de píxel apropiados de las imágenes en el cuadro "Velocidad de fotogramas" o "Tamaño de píxel" apropiado(Figura 2A,cuadro verde). Si no se proporcionan valores (se establecen en el "0" predeterminado), el programa buscará en los metadatos asociados con el archivo la velocidad de fotogramas y el tamaño de píxel. Si no se pueden encontrar estos valores, el programa tendrá como valor predeterminado por píxel para la medición y por fotograma para los puntos de tiempo.
NOTA: En el ejemplo proporcionado, la velocidad de fotogramas es 100 y el tamaño de píxel es 0,08.
3. Elige o haz máscaras
- Utilice el botón Creador de máscaras para crear automáticamente máscaras de celda para los datos de la lista de conjuntos de datos de archivos(Figura 2A,cuadro azul). Al usar el botón Creador de máscaras, se creará una nueva carpeta en el directorio elegido llamada MaskFiles. El "Indicador de ejecución" se volverá amarillo mientras se ejecuta y volverá a verde cuando se complete.
NOTA: Se creará una máscara para cada archivo de la lista Archivos de datos a partir de los primeros 10 fotogramas del archivo de imagen (o de todos los fotogramas si hay menos de 10 en el archivo de imagen) y se depositará en la carpeta MaskFiles utilizando el esquema de nomenclatura adecuado (que se describe a continuación). - Asegúrese de que los archivos de máscara rellenan automáticamente la lista Archivos de máscara. El usuario podrá proceder directamente al análisis.
NOTA: Siempre verifique visualmente los archivos de máscara y confirme que capturan toda la región de interés. El primer fotograma del archivo de datos y el archivo de máscara se muestran en la interfaz de usuario cuando se seleccionan. (Figura 2B). El fabricante de máscaras puede producir errores en el caso de baja señal a ruido, por lo que validar que los archivos de máscara son apropiados es fundamental para el control de calidad. - Como alternativa al uso de Mask Maker, si la señal de ruido de las imágenes es insuficiente, cree máscaras manualmente en ImageJ.
- Primero, abra el archivo de imagen sin procesar en ImageJ(Figura 3A).
- Haga clic en el botón Selección de polígono y haga clic para dibujar una máscara alrededor de la celda. Una vez terminado, haga doble clic en el último punto para completar el polígono.
- Una vez terminado, vaya a Editar | Selección | Crear máscara (Figura 3B). Se creará una nueva máscara invertida basada en el dibujo del polígono. Guarde las máscaras en una carpeta MaskFiles designada en el directorio elegido. El esquema de nomenclatura de archivos de máscara debe coincidir con los archivos de datos individuales correspondientes seguidos de "_mask_file". Por ejemplo, si un archivo de datos se denomina "VAMP2_488_WT_1.tif", el archivo de máscara correspondiente debe llamarse "VAMP2_488_WT_1_mask_file.tif".
- Utilice el botón Buscar archivos de máscara para navegar a la carpeta elegida de archivos de máscara personalizados depositados. Las máscaras rellenarán los archivos de máscara como una lista.
NOTA: Es importante tener una máscara para cada archivo de datos antes de ejecutar el análisis.
4. Análisis y extracción de características
- Una vez elegido el directorio y rellenados la lista Archivos de datos y la lista De archivos máscara, haga clic en el botón Análisis (Figura 4A). Si se requiere la clasificación de eventos exocióticos, vaya al paso 5.
NOTA: El clic del botón Análisis realizará una serie de tareas automatizadas para analizar los datos. Creará carpetas individuales en el directorio elegido para depositar los datos analizados. Mientras se ejecuta, el "indicador de ejecución" cambiará de verde a amarillo(Figura 4A,cuadro rojo). Una vez finalizado el análisis, esto volverá a cambiar a verde. - Busque una carpeta DataFiles(Figura 4B)con el conjunto completo de archivos de análisis (así como archivos de extracción de características, que se utilizarán en la clasificación posterior) nombrados de acuerdo con cada archivo de datos(Figura 4C).
NOTA: A continuación se incluye una descripción de estos archivos de análisis en la sección Resultados representativos.
5. Clasificación de eventos exocióticos
- Para realizar la clasificación simultánea de eventos exocióticos con detección automatizada, marque la casilla de verificación Clasificación antes de hacer clic en el botón Análisis. Para cada evento exocítico, asigne una puntuación de probabilidad entre 0-1 para cada clase. Un evento exocítico se considera clasificado como una de las cuatro clases si la puntuación de probabilidad para esa clase es > 0,5.
NOTA: Una vez completado el análisis, aparecerá una nueva carpeta de archivos de datos dentro del directorio elegido. La carpeta contendrá archivos de análisis correspondientes a cada archivo de imagen.
6. Análisis espaciotemporal de la exocitosis utilizando los valores K de Ripley
- Cree un archivo de máscara "neurite" y "soma" separado. Primero, segmentar el soma de la neurita. No existe un método imparcial para segmentar el soma de las neuritas, por lo que el usuario debe cegarse al experimento de condicionamiento y usar el mejor juicio; se sugiere un elipsoide sin extensiones de neurita obvias.
- Abra ImageJ/Fiji.
- Arrastre y suelte el archivo de máscara o use file | Abra y luego seleccione el archivo de máscara.
- Utilice la herramienta de selección de color y haga clic en cualquiera de los píxeles negros en el fondo de la máscara para establecer el color en negro.
- Utilice la herramienta de selección de polígonos o a mano alzada para dibujar un contorno alrededor del soma, separándolo de las neuritas. Esto requiere una toma de decisiones manual.
- Haz clic en Editar | Selección | Hacer máscara. Se abrirá una nueva imagen con el soma en círculos segmentado del resto de la imagen. Esto creará un archivo de máscara soma.
- Sin mover la región dibujada, haga clic en el encabezado del archivo de máscara original.
- Haz clic en Editar | Rellene para rellenar el soma en círculos de modo que solo queden las neuritas de la máscara.
- Una vez que se obtengan los archivos de neurita y máscara separados, guarde ambos archivos de máscara.
- Abra "neurite_2D_network" en Matlab.
- En MATLAB, desplácese hasta el directorio con todos los datos de análisis.
- Cambie la ruta "nombre de máscara" por el nombre de la máscara de neurita, es decir, "MaskFiles/VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_neurite.tif"
- Cambie el "csv_file_name" a donde se encuentra fluorescent_traces.csv archivo, es decir, "MaskFiles/VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_neurite.csv".
- Haga clic en Ejecutar para esqueletizar el archivo de máscara de neurita. Esto crea una versión esqueletizada del archivo de máscara de neurita y lo deposita como un archivo CSV en la carpeta maskfiles.
- A continuación, genere un archivo CSV para el soma. Abra "CSV_mask_creator.m" en Matlab.
- Coloque la ruta para el "nombre de la máscara" al nombre de la máscara soma, es decir, "MaskFiles/VAMP2phLuorin_488_wt_4_mask_file_soma.tif
- Cambie el "writematrix" al nombre de archivo csv que se creará, es decir, "MaskFiles/VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_soma.csv"
- Haga clic en Ejecutar. Esto crea el nuevo archivo de VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_soma.csv.
- Repita la versión 6.14 para cada archivo de máscara.
7. Configuración de RStudio
- Abra Rstudio y abra ripleys_k_analysis. Archivo R.
- Instale el paquete "spatstat" en RStudio yendo a Herramientas | Instale paquetes y escriba "spatstat" seguido de hacer clic en Instalar.
NOTA: Esto solo debe realizarse una vez por instalación de Rstudio. - Ejecute el spatstat de biblioteca al comienzo de cada sesión.
- Preste atención a dos variables principales en este caso: "neuron_mask" y "neuron_datapoints". Neuron Mask apunta al conjunto de archivos de máscara para ejecutar, es decir, archivos de máscara de soma".
NOTA: Ejecute todos los archivos de máscara soma juntos, por separado de los archivos de máscara Neurite, y viceversa. - Lea en el .csv de los archivos de máscara para cada una de las neuronas a analizar.
- Ejecute varios archivos a la vez copiando neuron_mask_n+1 adicionales. Esto permitirá agregar el análisis de Ripley juntos, utilizando el script descrito en la sección 8.
- Ahora verifique la segunda variable, "neuron_datapoints".
- Lea en el." X_fluorescent_traces.csv" generado por el programa de análisis (por características de todos los extracted_R archivo) con las posiciones x, y, t de los eventos exocíticos, así como el archivo específico de neurita de las posiciones x, y para la red 2D. Esto va en la posición de "neuron_datapoints".
- En RStudio, seleccione el código | Ejecutar | de región Ejecute todo. Esto genera varias gráficas, incluidos los valores K de Ripley agrupados, así como las gráficas de densidad.
- Guarde parcelas yendo a Exportar | Guardar imagen como | Seleccione el formato de imagen y el directorio adecuados, introduzca el nombre de archivo adecuado y, a continuación, haga clic en Guardar.
NOTA: La función de trazado para los mapas de calor se llama en el script usando "plot(density(soma_data,0.4))". El número "0.4" aquí representa cuán suavizada debería ser la función de densidad. Se puede cambiar para ajustarse a los datos del usuario de una manera significativa, pero si se van a realizar comparaciones entre diferentes mapas de calor, el número debe ser el mismo entre ellos. - Exportar o guardar imagen desde Rstudio. Si un mapa de calor requiere una edición adicional, elija un tipo de archivo apropiado (SVG o EPS).
8. Análisis de Ripley
NOTA: El Ripleys_k_analysis. El archivo R también generó automáticamente los gráficos de valores k de Ripley. La ejecución de todo el script ejecutará automáticamente las funciones mencionadas a continuación, pero se incluye en detalle si se desea ejecutar cada parte del script individualmente o realizar cambios en el análisis.
- Primero, ejecute la función de envolvente para cada celda. Esta función simuló la aleatoriedad espacial completa (CSR) para probar el valor K de Ripley del patrón de punto de evento exocítico en contra.
Data_envelope_1 = sobre(soma_data_1, Kest, nsim = 19, savefuns = TRUE)
Data_envelope_2 = sobre(soma_data_2, Kest, nsim = 19, savefuns = TRUE) - A continuación, agrupo estos sobres y cree una estimación de la RSE para el grupo:
Pool_csr = piscina(Data_envelope_1, Data_envelop_2,...)
A continuación, ejecute la función K de Ripley para todos los puntos de datos.
Data_ripleys_k_1 = Kest(soma_data_1, ratio = TRUE)
Data_ripleys_k_2 = Kest(soma_data_2, ratio = TRUE) - Una vez completado, aglutine los valores K de Ripley y arranque sus intervalos de confianza con el siguiente comando:
Grupo de datos = grupo(Data_ripleys_k_1, Data_ripleys_k_2,...) - Bootstrap con el siguiente comando:
Final_Ripleys_K = varblock(diversión = Kest, Data_pool) - Trazar los datos.
- Si se requiere una diferencia estadística dura, la prueba de permutación studentizada se incluye en el paquete spatstat para probar una diferencia entre grupos de patrones de puntos:
Test_difference = studpermu.test(all_points_to_test, exocytic_events ~ grupo, nperm = np).
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Representative Results
Aquí se utilizó la GUI(Figura 2A)para analizar eventos exocíticos de tres neuronas que expresan VAMP2-pHluorin a 3 DIV utilizando microscopía TIRF (fluorescencia de reflexión interna total). Se aislaron las neuronas corticales E15.5, seguidas de la transfección con VAMP2-pHluorin y el recubrimiento utilizando los protocolos descritos en Winkle et al., 2016 y Viesselmann et al., 201111,12. La metodología de los parámetros de imagen es la descrita en Urbina et al., 20182. Brevemente, se utilizó la microscopía TIRF para obtener imágenes de la membrana plasmática basal de las neuronas cada 100 ms durante 2 min. Figura 2, Figura 3, Figura 4 muestran una guía paso a paso para analizar eventos exocióticos. Se selecciona la carpeta donde se encuentran las imágenes neuronales y se elige un directorio para depositar los archivos de datos de análisis final (Figura 2A). Usando la función MaskMaker, se genera una máscara para las neuronas, que se inspecciona en la GUI(Figura 2B). En este caso, la máscara celular es de buena calidad y el análisis puede continuar. Si una máscara es insuficiente, se puede crear una máscara en ImageJ (Figura 3). Después de utilizar la función MaskMaker o crear una máscara en ImageJ y seleccionar el directorio donde se encuentran los archivos de máscara, se realiza el análisis (Figura 4A). Los resultados se generan en la carpeta DataFiles cuando finaliza el análisis (el indicador amarillo vuelve a cambiar a verde) (Figura 4B).
Los archivos de datos se generan y nombran automáticamente de acuerdo con los archivos de datos sin procesar proporcionados.
Suponiendo que el archivo de datos se denomina X:
X_tracking: Este archivo incluye la posición x, y y el número de fotograma de cada evento, así como cuadros delimitadores que se pueden usar para dibujar cuadros alrededor de cada evento. La edad indica el número de fotogramas pasados de la detección inicial donde un evento es un punto gaussiano distinto. Si se comprueba la clasificación, los resultados de la clasificación aparecerán en este archivo, que indica la probabilidad de un evento exocítico perteneciente a una de las cuatro clases. Si la probabilidad es mayor que .5, y mayor que otras probabilidades, entonces se eligió una clase exocítica.
X_fluorescent rastros: Este archivo incluye la posición x,y y el número de fotograma de cada evento. Además, incluye medidas de intensidad fluorescente en una región de interés alrededor de cada evento 2 segundos antes y 10 segundos después del pico ΔF / F para cada evento (indicado por las columnas Timepoint).
X_cell_statistics: Este archivo incluye el área de la celda, el tiempo total de la imagen y la frecuencia calculada automáticamente de los eventos exocíticos para cada celda (en eventos/mm2/minuto).
Los archivos de extracción de características incluyen:
X_contrast: Contraste. Una medida del contraste de intensidad entre un píxel y su vecino en toda la imagen.
X_correlation: Correlación. Una medida de qué tan correlacionado está un píxel con su vecino en toda la imagen.
X_energy Energía total. Definida como la suma al cuadrado de la intensidad de píxeles.
X_homogeneity mide la cercanía de la distribución de elementos en el ROI a la diagonal del ROI.
X_ring_fluorescence: la fluorescencia promedio de los píxeles de borde.
X_SD: Desviación estándar. Esto se define como la desviación estándar del ROI.
Ejemplos de trazas de fluorescencia promedio ± SEM de cada clase exocítica se trazaron a partir de X_fluorescent archivo de trazas(Figura 5A). Utilizando el archivo Cell_statistics, se trazó la frecuencia de exocitosis para cada clase para cada neurona(Figura 5B). Con la casilla de verificación Clasificación pulsada, el programa asigna cada evento exocítico a una clase, trazada en la Figura 5C. Después de la clasificación, se utilizó el código de análisis K de Ripley para determinar si los eventos exocíticos son aleatorios, agrupados o dispersos en el espacio y el tiempo. Se generaron mapas de calor de densidad de la localización de eventos exocíticos (Figura 5D). Estos revelan "puntos calientes" agrupados esperados en distintas regiones de la neurona. A continuación, se realizó el análisis K de Ripley para el soma, la neurita y el agrupamiento a lo largo del tiempo(Figura 5E). El valor K de Ripley y el SEM (línea negra y región sombreada azul, respectivamente) se elevan por encima de la línea de aleatoriedad espacial completa (línea punteada roja), lo que sugiere una agrupación estadísticamente significativa.
Figura 1: Representación del análisis y clasificación exocítica. (A) Esquema de la tubería de análisis para la GUI. Las células se segmentan desde el fondo antes de que se identifiquen y rastreen los eventos exocióticos. Parámetros como el pico ΔF/F y t1/2 se calculan a partir de trazas fluorescentes de exocitosis en un ROI alrededor del evento pre y post-fusión. (B) ilustración de los cuatro modos de exocitosis y montajes de imágenes de ejemplo. Después de la fusión, los eventos pueden proceder instantáneamente a FVF o KNR (FVFi y KNRi), o puede haber un retraso antes del inicio del destino de fusión a FVF o KNR (FVFd y KNRd). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Análisis de ejemplo paso a paso. (A) En primer lugar, se eligen los conjuntos de datos (1., cuadro rojo) y se elige un directorio para colocar los archivos de análisis (2., cuadro rojo). A continuación, se especifican la velocidad de fotogramas y el tamaño de píxel (3., cuadro verde). Aquí, se utilizó un tamaño de píxel de 0,08 μm y una velocidad de fotogramas de 100 ms. A continuación, se pulsa el botón de función MaskMaker (4., cuadro azul). Se crea automáticamente una carpeta titulada "MaskFiles" en el directorio elegido que contiene un archivo de máscara para cada archivo de imagen del conjunto de datos. (B) Cuando se cargan conjuntos de datos, al seleccionar un archivo de datos y/o un archivo de máscara se mostrará el primer fotograma de las imágenes para facilitar la comparación (cuadro verde). Es posible que los archivos de máscara no sean completamente correctos; este archivo de máscara se puede corregir por errores, o se puede hacer un nuevo archivo de máscara manualmente Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Creación manual de un archivo de máscara en ImageJ. (A) Primero, abra el archivo para crear una máscara. El botón "Selecciones de polígonos" está delineado en rojo. Al hacer clic alrededor del borde de la celda, se crea un contorno de polígono. (B) Cómo crear una máscara a partir del contorno del polígono. Seleccionando Editar | Selección | Crear máscara,se creará una máscara en blanco y negro a partir del polígono (imagen de la derecha). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Análisis de eventos exocióticos. (A) Demostración del botón de análisis (cuadro naranja) y un análisis en ejecución. Observe que el indicador de ejecución se vuelve amarillo mientras se realiza un análisis. (B) Ejemplo de archivos de análisis que se crean en el directorio elegido cuando se completa el análisis. DataFiles contiene todos los archivos de análisis del evento exocítico. (C) Archivos de análisis generados en la carpeta DataFiles. Los cuadros de color representan los archivos abiertos en imágenes posteriores. (D) Tres archivos abiertos, "X_fluorescent_traces.csv" (rojo) y "X_Cell_statistics" (verde), y "X_tracking" (azul). Las trazas fluorescentes contienen la posición x,y y y el número de fotogramas de cada evento, así como la intensidad fluorescente en cada ROI. Cell_statistics contiene información resumida de estadísticas exocíticas de células enteras, como la frecuencia de la exocitosis. X_tracking contiene información de posición y tiempo para cada evento exocítico, así como la probabilidad de cada clase de exocitosis para cada evento, representado como un número entre 0-1 (>0.5 indica que un evento pertenece a una clase en particular). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Resultados representativos. (A) Trazas de fluorescencia media +/- SEM de cada clase exocítica. (B) Frecuencia de eventos trazados para tres neuronas corticales murinas para cada clase exocítica. Estos valores de datos se trazaron a partir de "X_Cell_statistics", utilizando las clases asignadas en "X_tracking". (C) Distribución de las clases de exocitosis para las mismas tres células utilizadas en A). Aquí, se traza la proporción de cada modo. (D) Diagrama de densidad de donde ocurren los eventos exocíticos como se genera en la parte del análisis K de Ripley del protocolo. Esto puede interpretarse como un "mapa de calor" de la probabilidad espacial de dónde están ocurriendo los eventos. (E) Análisis K de Ripley de tres células utilizadas para A) y B). La línea roja indica qué valor tendría la distribución completamente aleatoria espacialmente de los eventos exocióticos. La línea negra indica el valor K de Ripley agregado para las tres celdas de este ejemplo, y la región sombreada azul representa el intervalo de confianza. Aquí, la región sombreada cae notablemente fuera de la línea de aleatoriedad espacial completa entre ~ 0.25-1 μm, lo que sugiere que los eventos exocíticos se agrupan a esas distancias. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Al utilizar el software de detección y análisis exocítico, tenga en cuenta que el programa solo acepta la compresión sin pérdidas .tif archivos como entrada. Los archivos de imagen .tif pueden ser imágenes de escala de grises (un solo canal) de 8 bits, 16 bits o 32 bits. Otros formatos de imagen deben convertirse a uno de estos tipos antes de la entrada. Como referencia, los ejemplos utilizados aquí son imágenes en escala de grises de 16 bits.
Inherentes al proceso de detección automatizada, los conjuntos de imágenes timelapse se procesan para la sustracción automatizada de fondo y la corrección de fotobleaching. Para la resta de fondo, los píxeles fuera de la región enmascarada del archivo de máscara se promedian a lo largo del lapso de tiempo de toda la imagen y el valor promedio se resta del conjunto de imágenes. Para la corrección del fotoblanqueo, se aplica un ajuste de desintegración mono exponencial a la fluorescencia promedio de píxeles en la máscara en el transcurso del video, con la intensidad corregida ajustada de la siguiente manera:
Intensidad corregida = (Intensidad en el tiempo t) ÷ exp-k×t donde k = constante de decaimiento
Por lo tanto, no es necesario ningún procesamiento previo antes de la entrada. Estos procesos, sin embargo, dependen críticamente de la máscara de imagen para separar efectivamente la celda del fondo, y por lo tanto una máscara celular adecuada es necesaria para obtener buenos resultados.
El creador automatizado de máscaras celulares requiere una señal uniforme con una relación señal-ruido suficiente (idealmente, al menos 2 veces la desviación estándar de la señal de fondo promedio) para funcionar bien. Empíricamente, la caja CAAX marcada con una proteína fluorescente, que se inserta en la membrana plasmática tras la prenilación, funciona bien. No es necesario que la señal se pueda mantener durante todo el lapso de tiempo de la exocitosis, ya que se puede crear una máscara adecuada a partir de una señal alta en los primeros 10 fotogramas de la secuencia. Sin embargo, si la morfología celular cambia significativamente durante el paradigma de imagen, se debe tener cuidado.
Cuando utilice el software de detección automatizada, incluya la velocidad de fotogramas y el tamaño de píxel para obtener salidas temporales y espaciales precisas. Si no se declara ninguna velocidad de fotogramas o tamaño de píxel, la salida será por píxel y por fotograma. Como regla general, los diámetros de las vesículas en las neuronas en desarrollo están en la escala de ~ 100 nm13, y por lo tanto la detección automatizada de eventos puede funcionar para vesículas similares en tamaño. Tal como está, no hay un límite estricto en el tamaño de las vesículas que se pueden detectar (por área de píxeles), ya que la detección automatizada se basa en la intensidad en forma de gaussiano en un amplio rango de anchos gaussianos. La fusión de vesículas más pequeñas que el ancho de un píxel se puede detectar con precisión si la intensidad del evento cumple con los criterios de señal a ruido de 2 veces la desviación estándar de la señal de fondo promedio a medida que la difracción de fluorescencia se expande sobre múltiples píxeles.
Este programa fue desarrollado para detectar eventos exocióticos en neuronas en desarrollo. Sin embargo, el software ha sido explotado para detectar con éxito eventos exocióticos en otras líneas celulares2,lo que indica que el algoritmo de detección es robusto. Aunque hemos utilizado el software para detectar eventos exocióticos en tipos de células no neuronales, las diferencias en el modo de eventos exocíticos entre los tipos decélulas 14 indican que el algoritmo de clasificación puede no ser adecuado para otros tipos de células. Los eventos exocióticos en neuronas en desarrollo se clasificaron originalmente utilizando tres métodos diferentes: agrupación jerárquica, deformación dinámica del tiempo y análisis de componentes principales (PCA), revelando cuatro clases diferentes3. Aquí los tres clasificadores se emplean en la GUI para categorizar los eventos exocióticos en una de estas cuatro clases establecidas. Para cada evento exocítico, se asigna una puntuación de probabilidad entre 0-1 para cada una de las cuatro clases posibles. Cualquier clase con una puntuación de probabilidad > 0,5 se considera de esa clase. Esta clasificación solo se ha utilizado en neuronas en desarrollo hasta la fecha. No se sabe si estas clases existen en otros tipos de células o en puntos de tiempo de desarrollo posteriores en las neuronas. Un gran número de eventos con puntuaciones de probabilidad de <0,5 para cualquiera de las clases sugeriría que el procedimiento de clasificación puede no ser apropiado para los eventos exocíticos que se están evaluando actualmente. Si se asignan puntuaciones de baja probabilidad a eventos exocióticos de diferentes tipos de células, esto sugeriría que se necesita una clasificación de novo ya que pueden existir modos nuevos o alternativos de exocitosis. Los mismos métodos de clasificación utilizados aquí tendrían que aplicarse a los eventos exocióticos detectados automáticamente.
Para explorar la agrupación espacial y temporal de eventos exocióticos, se explota el análisis K15 de Ripley. El análisis de la agrupación de neuronas implica tres análisis separados: uno para el soma, uno para las neuritas y otro para el tiempo. La razón para dividir el soma y las neuritas es explicar la morfología extrema de las neuritas, que a menudo son lo suficientemente delgadas como para que puedan tratarse como una red 2D y aplicar una variante 2D del análisis K de Ripley. Durante el tiempo, se implementa un análisis K de Ripley 1D para la agrupación temporal. El análisis K de Ripley es un método robusto para detectar la agrupación de procesos puntuales y la colocalización. El gráfico de K de Ripley se puede interpretar como tal: el valor K de Ripley + intervalo de confianza tiene una probabilidad del 5% de caer fuera de la línea de aleatoriedad espacial completa en cualquier punto, análogo a un valor p de 0,05. Cuando el valor cae fuera de la línea de aleatoriedad espacial completa, los eventos exocióticos se agrupan (por encima de CSR) o se separan a intervalos regulares (por debajo de CSR) a esas distancias (eje x).
La creación del archivo de máscara se basa en una alta señal inicial a ruido de la celda. Es posible que los marcadores sensibles al pH no siempre funcionen bien para iluminar una célula, dependiendo de la proteína a la que esté unida la sonda. Otra opción para hacer archivos de máscara si la señal al ruido del marcador exocítico no resalta lo suficiente el borde de la celda es emplear un segundo canal fluorescente / imagen para la creación de máscaras. Si utiliza un marcador de fluorescencia diferente (tagRFP-CAAX, por ejemplo) para crear máscaras, al elegir un conjunto de datos, primero navegue a la carpeta con las imágenes para crear máscaras (por ejemplo, una carpeta que contenga las imágenes tagRFP-CAAX). Usa el botón Mask Maker aquí. Es importante destacar que recuerde cambiar el nombre de los archivos de máscara para que coincidan con el archivo de datos exocitarios que se analizarán con el esquema de nomenclatura anterior (siguiendo el ejemplo anterior, los archivos de máscara llamados "CAAX_1_mask_file.tif" deberán cambiarse de nombre a "VAMP2_488_WT_1_mask_file.tif" para que coincidan con el conjunto de imágenes VAMP2 que se analizará). Una vez que los archivos de máscara estén correctamente nombrados, vuelva al botón Elegir conjunto de datos de nuevo para navegar a los archivos de conjunto de datos exocitarios que se van a analizar.
La detección de exocitosis es notablemente sensible, y los eventos exocíticos se detectaron con precisión en relaciones señal-ruido tan bajas como un ΔF / F de 0.01. La sensibilidad de la detección depende parcialmente de la varianza de la fluorescencia de fondo, y no se detectarán eventos inferiores a 4 desviaciones estándar por encima de la señal de fondo.
La detección de eventos exocióticos se basa en su naturaleza transitoria. Como característica del análisis de eventos transitorios, nuestro código de detección explora una ventana de 20 segundos alrededor del evento exocítico. En algunos tipos de células, la exocitosis de beso y estancia puede "permanecer" durante una ventana temporal mucho más larga que en las neuronas en desarrollo, y la detección automatizada puede no capturar de manera robusta estos eventos menos transitorios. Esta característica es una variable fácilmente modificable para aquellos que se sienten cómodos con MATLAB. Similar a la limitación del ROI de 20 segundos, los eventos exocíticos que aparecen pero no desaparecen antes del último fotograma de tiempo del video pueden no contarse como exocitosis verdadera, lo que puede influir en la frecuencia, que se calcula en función de toda la duración de la serie de tiempo.
El fabricante de máscaras incluido está automatizado por diseño y funciona bien al segmentar formas complejas desde el fondo; sin embargo, el diseño totalmente automatizado limita el rango de señal a ruido y tipo de señal que se puede utilizar para generar una máscara automáticamente. Si el usuario no puede incluir un marcador de célula fluorescente que sea uniforme y de una relación señal-ruido significativa, la máscara celular deberá dibujarse manualmente.
El análisis de la exocitosis basado en el usuario es un proceso que consume mucho tiempo y está sujeto a sesgos personales, ya que los eventos no siempre están claramente separados de otras fluorescencias. El uso de un programa de análisis automatizado para identificar y analizar correctamente los eventos exocióticos de manera imparcial aumenta la eficiencia del análisis y mejora la reproducibilidad y el rigor.
Esta detección de eventos exocióticos no solo funciona para capturar con precisión la fluorescencia sensible al pH en neuronas en desarrollo, sino también otros tipos de células (Urbina et al., 2018). Si la clasificación funciona para otros tipos de células requerirá determinación. Las aplicaciones futuras de esta técnica pueden ser útiles en sinapsis, en tipos de células no neuronales o con nuevos marcadores de acoplamiento y fusión de vesículas exocíticas, como el recientemente descrito pHmScarlet16.
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Disclosures
Los autores no declaran nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a Dustin Revell y Reginald Edwards por probar el código y la GUI. Los Institutos Nacionales de Salud proporcionaron fondos para apoyar esta investigación: incluidos R01NS112326 (SLG), R35GM135160 (SLG) y F31NS103586 (FLU).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | |
| R | R Core Team | https://www.r-project.org/ | |
| Rstudio | Rstudio, PBC | https://rstudio.com/ |
References
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