Summary
pH'a duyarlı floresan probların işaretlediği eksosit olayları tespit etmek için otomatik bilgisayar görme yazılımı geliştirdik. Burada, füzyon olaylarını tespit etmek, füzyonun mekansal parametrelerini analiz etmek ve görüntülemek ve olayları farklı füzyon modlarında sınıflandırmak için grafiksel bir kullanıcı arayüzü ve RStudio'nun kullanımını gösteriyoruz.
Abstract
Vezikül SNARE proteinlerine bağlı pH'a duyarlı GFP (pHluorin) timelapse TIRF mikroskopisi, hücre kültüründe tek vezikül ekzosit olaylarını görselleştirmek için etkili bir yöntemdir. Bu tür olayların tarafsız, verimli bir şekilde tanımlanması ve analizini yapmak için MATLAB'da bilgisayar görüşüne dayalı bir yaklaşım geliştirilmiş ve uygulanmıştır. Analiz ardışık düzeni bir hücre segmentasyonu ve eksosit olay tanımlama algoritması oluşur. Bilgisayarla görme yaklaşımı, floresan çürümesinin yarı ömrü ve ΔF/F zirvesi de dahil olmak üzere tek olayların birden fazla parametresini araştırmak için araçlar ve eksositoz sıklığının tam hücre analizi içerir. Bu ve diğer füzyon parametreleri, farklı füzyon modlarını ayırt etmek için bir sınıflandırma yaklaşımında kullanılır. Burada yeni oluşturulan bir GUI, analiz işlem hattını baştan sona gerçekleştirir. Ripley'in R Studio'daki K işlevinin daha fazla uyarlaması, hem uzay hem de zamandaki füzyon olaylarının kümelenmiş, dağılmış veya rastgele oluşumunu ayırt etmek için kullanılır.
Introduction
VAMP-pHluorin yapıları veya transferrin reseptörü (TfR)-pHuji yapıları, bu pH'a duyarlı floroforlar veziklin ve plazma zarı arasındaki füzyon gözenek açıklığı üzerine hemen asit veziklin lümeni ve floresan içinde söndürüldüğünden, ekzosit olayların mükemmel belirteçleridir1. Füzyon gözenek açıklığını takiben, floresan katlanarak bozunur ve füzyon olayı hakkında bilgi veren bazı heterojenlikler ortaya çıkardı. Burada, eksosit olayları otomatik olarak algılayan ve analiz eden bir grafik kullanıcı arabirimi (GUI) uygulaması açıklanmıştır. Bu uygulama, kullanıcının pH hassas işaretleyiciler2 tarafından ortaya çıkan ekzositik olayları otomatik olarak algılamasına ve sınıflandırma amacıyla kullanılabilecek her olaydan özellikler oluşturmasına izin verir3 (Şekil 1A). Ek olarak, Ripley'in K işlevi kullanılarak ekzosit olay kümeleme analizi açıklanmıştır.
Ekzosit olayların farklı ekzosit modlarına otomatik sınıflandırılması yakın zamanda bildirilmiştir3. İki eksositoz modu, tam vezikül füzyonu (FVF) ve öpücük ve çalıştırma füzyonu (KNR) eksositozu daha öncetanımlanmıştır 4,5,6,7. FVF sırasında füzyon gözenekleri genişler ve vesicle plazma zarına dahil edilir. KNR sırasında, füzyon gözenekleri geçici olarak açılır ve daha sonra 4 ,5,8,9,10'u yeniden kaydırır. Gelişen nöronlarda ikisi FVF, ikisi KNR ile ilgili olmak üzere dört eksositoz modu saptandı. Bu çalışma, hem FVF hem de KNR'nin füzyon gözenek açıklığı veya floresan çürümesi başlamadan önce füzyon gözenek açılmasından sonra gecikme gösteren eksosit olaylardan sonra floresan çürümesine (FVFi ve KNRi) hemen ilerleyen füzyon olaylarına daha da bölünebileceğini göstermektedir (FVFd ve KNRd) (Şekil 1B). Sınıflandırıcı, her füzyon olayı için eksositoz modunu tanımlar. Burada bu analiz, Windows ve Mac tabanlı işletim sistemlerinde MATLAB'a yüklenebilen bir GUI'ye dahil edilmiştir. Tüm analiz dosyaları https://drive.google.com/drive/folders/1VCiO-thMEd4jz-tYEL8I4N1Rf_zjnOgB?usp=sharing veya
https://github.com/GuptonLab.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Veri kümelerini ve dizini seçin
- Analiz için veri kümelerini seçmek üzere Veri Kümelerini Bul düğmesini (Şekil 2A, kırmızı kutu 1) tıklatarak verilerin yatırıldığı klasöre (örneğin RawData klasörü) gidin. Veri Dosyaları, Veri Dosyalarını liste olarak otomatik olarak doldurur. Klasörde birden fazla veri kümesi olabilir.
- Dizin Seç düğmesini tıklatın ve analiz edilen dosyaların yatırılacağı dizini (örneğin, Test) seçin (Şekil 2A, kırmızı kutu 2) . Çözümleme düğmesine basıldığında, bu dizinde bir dizi klasör ve bitmiş çözümleme dosyasının yanı sıra ara geçici görüntüler oluşturulur. Bir dizin seçilmezse hatalar üretilir.
2. Piksel boyutunu ve kare hızını ayarlama
- Görüntülerin uygun kare hızını ve piksel boyutunu uygun "Kare Hızı" veya "piksel boyutu" kutusunda(Şekil 2A, yeşil kutu)doldurun. Hiçbir değer sağlanmazsa (varsayılan "0" olarak ayarlanır), program dosyayla ilişkili meta verileri kare hızı ve piksel boyutu için arar. Bu değerler bulunamazsa, program varsayılan olarak ölçüm için piksel başına ve zaman noktaları için kare başına olarak olur.
NOT: Sağlanan örnekte kare hızı 100 ve piksel boyutu 0,08'dir.
3. Maske seçin veya yapın
- Dosya veri kümesi listesindeki veriler için otomatik olarak hücre maskeleri oluşturmak üzere Maske Oluşturucu düğmesini kullanın (Şekil 2A, mavi kutu). Maske Oluşturucu düğmesini kullandıktan sonra, seçilen dizinde MaskFiles adlı yeni bir klasör oluşturulur. "Çalıştır göstergesi" çalışırken sararacak ve tamamlandığında yeşile dönecektir.
NOT: Veri Dosyaları listesindeki her dosya için bir maske, görüntü dosyasının ilk 10 karesinden (veya görüntü dosyasında 10'dan küçükse tüm çerçevelerden) oluşturulur ve uygun adlandırma şeması kullanılarak MaskFiles klasörüne yatırılır (aşağıda açıklanmıştır). - Maske dosyalarının Maske Dosyaları listesini otomatik olarak doldurduğundan emin olun. Kullanıcı doğrudan analize geçebilir.
NOT: Maske dosyalarını her zaman görsel olarak kontrol edin ve tüm ilgi çekici bölgeyi yakaladıklarını onaylayın. Veri dosyasının ve maske dosyasının ilk karesi seçildiğinde kullanıcı arabiriminde görüntülenir. (Şekil 2B). Maske Oluşturucu, düşük sinyalden gürültüye durumunda hatalar üretebilir, bu nedenle maske dosyalarının uygun olduğunu doğrulamak kalite kontrolü için kritik öneme sahiptir. - Maske Oluşturucu'nun kullanımına alternatif olarak, görüntülerin gürültüsüne sinyal yetersizse, ImageJ'de maskeleri el ile oluşturun.
- İlk olarak, ham görüntü dosyasını ImageJ'de açın (Şekil 3A).
- Çokgen Seçimi düğmesini tıklatın ve hücrenin etrafına maske çizmek için tıklatın. Tamamlandığında, çokgeni tamamlamak için son noktayı çift tıklatın.
- Tamamlandığında, | Düzenle'ye gidin Seçim | Maske Oluştur (Şekil 3B). Çokgen çizime göre yeni bir ters maske oluşturulacaktır. Maskeleri seçili dizinde belirlenmiş bir MaskFiles klasörüne kaydedin. Maske dosyası adlandırma düzeni, "_mask_file" tarafından izlenen ilgili tek tek veri dosyalarıyla eşleşmelidir. Örneğin, bir veri dosyası "VAMP2_488_WT_1.tif" olarak adlandırılırsa, karşılık gelen maske dosyasının "VAMP2_488_WT_1_mask_file.tif" olarak adlandırılması gerekir.
- Yatırılan özel maske dosyalarının seçilen klasörüne gitmek için Maske Dosyalarını Bul düğmesini kullanın. Maskeler, Maske Dosyalarını liste olarak doldurur.
NOT: Analizi çalıştırmadan önce her veri dosyası için bir maskeye sahip olmak önemlidir.
4. Analiz ve özellik çıkarma
- Dizin seçildikten ve Veri Dosyaları listesi ve Maske dosyaları listesi doldurulduktan sonra, Çözümleme düğmesini (Şekil 4A) tıklatın. Eksosit olayların sınıflandırılması gerekiyorsa, 5.
NOT: Analiz düğmesi tıklatıldığında, verileri analiz etmek için bir dizi otomatik görev gerçekleştirilecektir. Analiz edilen verileri yatırmak için seçilen dizinde tek tek klasörler oluşturur. Çalışırken, "çalıştırma göstergesi" yeşilden sarıya değişecektir (Şekil 4A, kırmızı kutu). Analiz bittikten sonra, bu yeşile dönecektir. - Her veri dosyasına göre adlandırılmış tam çözümleme dosyası kümesine (ayrıca daha sonra sınıflandırmada kullanılacak özellik ayıklama dosyaları) sahip bir DataFiles klasörü(Şekil 4B)bulun.
NOT: Bu analiz dosyalarının açıklaması aşağıda Temsili Sonuçlar bölümünde yer almaktadır.
5. Ekzosit olayların sınıflandırılması
- Eksosit olayların otomatik algılama ile eşzamanlı sınıflandırmasını gerçekleştirmek için Analiz düğmesine tıklamadan önce Sınıflandırma onay kutusunu işaretleyin. Her eksosit olay için, her sınıf için 0-1 arasında bir olasılık puanı atayın. Eksosit olay, bu sınıfın olasılık puanı 0,5'> ise dört sınıftan biri olarak sınıflandırılır.
NOT: Çözümleme tamamlandıktan sonra, seçilen dizinde yeni bir veri dosyası klasörü görünecektir. Klasör, her görüntü dosyasına karşılık gelen analiz dosyalarını içerir.
6. Ripley'in K değerlerini kullanarak eksositozun mekansal analizi
- Ayrı bir "neurite" ve "soma" maske dosyası oluşturun. İlk olarak, somayı neurite'den bölümlendir. Soma'yı nötroritlerden bölümlere ayırmak için tarafsız bir yöntem yoktur, bu nedenle kullanıcı şartlandırma deneyine kör edilmeli ve en iyi yargıyı kullanmalıdır; belirgin neurit uzantıları olmayan bir elipsoid önerilir.
- ImageJ/Fiji'yi açın.
- Maske dosyasını sürükleyip bırakın veya Dosya |'nı kullanın Maske dosyasını açın ve seçin.
- Renk seçici aracını kullanın ve rengi siyaha ayarlamak için maskenin arka planındaki siyah piksellerden herhangi birine tıklayın.
- Somanın etrafına bir anahat çizmek için çokgen seçim aracını veya serbest el kullanın, onu neurites'ten ayırın. Bu, manuel karar vermeyi gerektirir.
- | Düzenle'yi tıklatın Seçim | Maske Yap. Görüntünün geri kalanından daire içine alınmış soma ile yeni bir görüntü açılacaktır. Bu bir soma maske dosyası oluşturacaktır.
- Çizilen bölgeyi taşımadan, özgün maske dosyasının başlığını tıklatın.
- | Düzenle'yi tıklatın Daire içine alınmış somayı doldurmak için doldurun, böylece sadece neurites maske olarak kalır.
- Ayrı neurite ve maske dosyaları elde edildikten sonra, Her iki maske dosyasını da kaydedin.
- Matlab'da "neurite_2D_network" açın.
- MATLAB'da, tüm çözümleme verilerini içeren dizine gidin.
- "Maske adı" yolunu neurite maskesinin adıyla, yani "MaskFiles/VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_neurite.tif" olarak değiştirin
- "csv_file_name" dosyasını fluorescent_traces.csv bulunduğu yere, yani "MaskFiles/VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_neurite.csv" olarak değiştirin.
- Neurite maske dosyasını iskeletleştirmek için Çalıştır'ı tıklatın. Bu, neurite maske dosyasının iskeletleştirilmiş bir sürümünü oluşturur ve maskfiles klasörünün altına CSV dosyası olarak yatırır.
- Ardından, soma için bir CSV dosyası oluşturun. Matlab'da "CSV_mask_creator.m" açın.
- Soma maskesinin adına "maske adı" için yola koyun, yani "MaskFiles/VAMP2phLuorin_488_wt_4_mask_file_soma.tif
- Oluşturulacak "writematrix"i csv dosya adı olarak değiştirin, yani "MaskFiles/VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_soma.csv"
- Çalıştır 'ıtıklatın. Bu, yeni VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_soma.csv dosyasını oluşturur.
- Her maske dosyası için 6.14'i yineleyin.
7. RStudio kurulumu
- Rstudio'yu açın ve ripleys_k_analysis açın. R dosyası.
- Araçlar |'ne giderek RStudio'ya "spatstat" paketini yükleyin Paketleri Yükle ve "spatstat" yazarak ardından Yükle 'yitıklatın.
NOT: Bunun Rstudio Kurulumu başına yalnızca bir kez yapılması gerekir. - Her oturumun başında kitaplık spatstat çalıştırın.
- Bu durumda iki ana değişkene dikkat edin: "neuron_mask" ve "neuron_datapoints." Nöron Maskesi, çalıştıracak maske dosyaları kümesine, yani soma maske dosyalarına işaret ediyor."
NOT: Neurite maske dosyalarından ayrı olarak tüm soma maske dosyalarını birlikte çalıştırın ve bunun tersi de geçerli. - Analiz edilecek nöronların her biri için maske dosyalarının .csv okuyun.
- Ek neuron_mask_n+1 kopyalayarak aynı anda birden çok dosya çalıştırın. Bu, bölüm 8'de açıklanan komut dosyasını kullanarak Ripley'in analizini bir araya getirmek için izin verecektir.
- Şimdi ikinci değişken olan "neuron_datapoints"ı kontrol edin.
- Okuma." X_fluorescent_traces.csv" dosyası analiz programı tarafından oluşturulan (tüm extracted_R dosya özelliklerine göre) ekzosit olayların x,y, t konumları ve 2D ağ için x,y konumlarının neurite özgü dosyası ile. Bu "neuron_datapoints" pozisyonuna geçer.
- RStudio'da Kod | Seç Bölge | Çalıştır Hepsini çalıştır. Bu, gruplanmış Ripley'in K değerlerinin yanı sıra yoğunluk çizimleri de dahil olmak üzere çeşitli çizimler oluşturur.
- Dışa Aktar |'ne giderek çizimleri kaydetme Görüntüyü | Olarak Kaydet Uygun görüntü biçimini ve dizini seçin ve uygun dosya adını girin, sonra Kaydet 'itıklatın.
NOT: Isı eşlemleri için çizim işlevi komut dosyasında "plot(density(soma_data,0.4)" kullanılarak çağrılır. Buradaki "0,4" sayısı, yoğunluk işlevinin ne kadar yumuşatılmış olması gerektiğini temsil eder. Kullanıcı verilerine anlamlı bir şekilde uyacak şekilde değiştirilebilir, ancak farklı ısı eşlemleri arasında karşılaştırmalar yapılacaksa, sayı aralarında aynı olmalıdır. - Rstudio'dan görüntüyü dışa aktar veya kaydet. Isı haritası daha fazla düzenleme gerektiriyorsa, uygun bir dosya türü (SVG veya EPS) seçin.
8. Ripley'in analizi
NOT: Ripleys_k_analysis. R dosyası ayrıca Ripley'in k değer çizimlerini otomatik olarak oluşturdu. Tüm komut dosyasını çalıştırmak aşağıda belirtilen işlevleri otomatik olarak çalıştırır, ancak komut dosyasının her bölümünü ayrı ayrı çalıştırmak veya çözümlemede değişiklik yapmak isterse ayrıntılı olarak dahil edilir.
- İlk olarak, her hücre için zarf işlevini çalıştırın. Bu işlev, ekzosik olay noktası deseninin Ripley'in K değerini test etmek için tam uzamsal rastgeleliği (KSS) simüle etti.
Data_envelope_1 = zarf(soma_data_1, Kest, nsim = 19, savefuns = DOĞRU)
Data_envelope_2 = zarf(soma_data_2, Kest, nsim = 19, savefuns = DOĞRU) - Ardından, bu zarfları bir araya getirin ve grup için bir KSS tahmini oluşturun:
Pool_csr = havuz(Data_envelope_1, Data_envelop_2,...)
Ardından, tüm veri noktaları için Ripley'in K işlevini çalıştırın.
Data_ripleys_k_1 = Kest(soma_data_1, oran = DOĞRU)
Data_ripleys_k_2 = Kest(soma_data_2, oran = DOĞRU) - Tamamlandığında, Ripley'in K değerlerini bir araya toplayın ve güven aralıklarını aşağıdaki komutla önyükleyin:
Veri havuzu = havuz(Data_ripleys_k_1, Data_ripleys_k_2,...) - Bootstrap aşağıdaki komutla:
Final_Ripleys_K = varblock(eğlence = Kest, Data_pool) - Verileri çizin.
- Sabit istatistiksel bir fark gerekiyorsa, puan desenleri grupları arasındaki farkı test etmek için öğrencileştirilmiş permütasyon testi spatstat paketine dahil edilir:
Test_difference = studpermu.test(all_points_to_test, exocytic_events ~ grup, nperm = np).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada GUI (Şekil 2A) TIRF (total iç yansıma floresan) mikroskopisi kullanılarak 3 DIV'de nöronları ifade eden üç VAMP2-pHluorin ekzositik olayları analiz etmek için kullanılmıştır. E15.5 kortikal nöronlar izole edildi, ardından Winkle ve ark., 2016 ve Viesselmann ve ark., 2011 11,12'debelirtildiği gibi protokoller kullanılarak VAMP2-pHluorin ve kaplama ile transfeksiyon yapıldı. Görüntüleme parametrelerinin metodolojisi Urbina ve ark., 20182. Kısaca, nöronların bazal plazma zarını 2 dakika boyunca her 100 ms'de bir görüntülemek için TIRF mikroskopisi kullanılmıştır. Şekil 2, Şekil 3, Şekil 4 eksosit olayları analiz etmek için adım adım bir kılavuz göstermektedir. Nöron görüntülerinin bulunduğu klasör seçilir ve son analiz veri dosyalarını yatıracak bir dizin seçilir (Şekil 2A). MaskMaker işlevi kullanılarak, GUI'de incelenen nöronlar için bir maske oluşturulur (Şekil 2B). Bu durumda, hücre maskesi kalitelidir ve analiz devam edebilir. Maske yetersizse, ImageJ'de bir maske oluşturulabilir (Şekil 3). MaskMaker işlevini kullandıktan veya ImageJ'de bir maske oluşturduktan ve maske dosyalarının bulunduğu dizini seçtikten sonra, analiz gerçekleştirilir (Şekil 4A). Analiz tamamlandığında sonuçlar DataFiles klasöründe oluşturulur (sarı gösterge yeşile döner) (Şekil 4B).
Veri dosyaları otomatik olarak oluşturulur ve sağlanan ham veri dosyalarına göre adlandırılır.
Veri dosyasının X olarak adlandırıldıklarını varsayarsak:
X_tracking: Bu dosya, her olayın x,y konumunu ve çerçeve numarasını ve her olayın etrafına kutu çizmek için kullanılabilecek sınırlayıcı kutuları içerir. Yaş, bir olayın farklı bir gauss puncta olduğu ilk algılamadan sonraki kare sayısını gösterir. Sınıflandırma işaretlenirse, sınıflandırma sonuçları bu dosyada görünür, bu da dört sınıftan birine ait bir eksosit olayının olasılığını gösterir. Olasılık .5'ten büyükse ve diğer olasılıklardan büyükse, eksosit bir sınıf seçildi.
X_fluorescent izler: Bu dosya her olayın x,y konumunu ve çerçeve numarasını içerir. Buna ek olarak, her olay için en yüksek ΔF /F'den 2 saniye önce ve 10 saniye sonra (Timepoint sütunlarıyla gösterilir) her olayın ilgi çekici bir bölgesinde floresan yoğunluk önlemleri içerir.
X_cell_statistics: Bu dosya hücre alanını, toplam görüntü süresini ve her hücre için eksosit olayların otomatik olarak hesaplanan sıklığını içerir (olaylar/mm2/dakika).
Özellik ayıklama dosyaları şunlardır:
X_contrast: Karşıtlık. Tüm görüntü üzerinde bir piksel ve komşusu arasındaki yoğunluk kontrastının ölçüsü.
X_correlation: Bağıntı. Bir pikselin tüm görüntü üzerinde komşusuyla ne kadar ilişkili olduğunun ölçüsü.
X_energy Tam enerji. Piksel yoğunluğunun kare toplamı olarak tanımlanır.
X_homogeneity, yatırım getirislerindeki öğelerin roi diyagonaline dağılımının yakınlığını ölçar.
X_ring_fluorescence: kenarlık piksellerinin ortalama floresan.
X_SD: Standart sapma. Bu, yatırım getirisinin standart sapması olarak tanımlanır.
Her ekzositik sınıftan ortalama floresan izleri ± SEM örnekleri X_fluorescent izleme dosyasından çizilmiştir (Şekil 5A). Cell_statistics dosyası kullanılarak, her sınıf için eksositoz sıklığı her nöron için çizilmiştir (Şekil 5B). Sınıflandırma onay kutusu tıklatıldığında, program her dış olayı Şekil 5C'de çizilmiş bir sınıfa atar. Sınıflandırmanın ardından, Exocytic olayların uzay ve zamanda rastgele mi, kümelenmiş mi yoksa dağılmış mı olduğunu belirlemek için Ripley'in K analiz kodu kullanıldı. Ekzosit olayların lokalizasyonunun yoğunluk ısı eşlemleri (Şekil 5D) oluşturulmuştır. Bunlar, nöronun farklı bölgelerinde beklenen kümelenmiş "sıcak noktaları" ortaya koymaktadır. Daha sonra, Ripley'in K analizi zaman içinde soma, neurite ve kümeleme için yapıldı (Şekil 5E). Ripley'in K değeri ve SEM 'i (sırasıyla siyah çizgi ve mavi gölgeli bölge) tam uzamsal rastgelelik çizgisinin (kırmızı noktalı çizgi) üzerine çıkarak istatistiksel olarak anlamlı kümelenmeyi düşündürmektedir.
Şekil 1: Eksosit analizi ve sınıflandırmasının temsili. (A) GUI için analiz ardışık düzeni anahattı. Hücreler, eksosit olaylar tanımlanıp izlenmeden önce arka plandan bölümlere ayrılmıştır. ΔF/F ve t1/2 zirvesi gibi parametreler, olay öncesi ve sonrası füzyon çevresindeki bir yatırım getirisinde floresan eksositoz izlerinden hesaplanır. (B) eksositoz ve örnek görüntü montajlarının dört modunun illüstrasyonu. Füzyondan sonra, olaylar FVF veya KNR'ye (FVFi ve KNRi) anlık olarak devam edebilir veya FVF veya KNR'ye (FVFd ve KNRd) füzyon kaderinin başlangıcından önce bir gecikme olabilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Adım adım örnek analiz. (A) İlk olarak, veri kümeleri seçilir (1., kırmızı kutu) ve analiz dosyalarını yerleştirmek için bir dizin seçilir (2., kırmızı kutu). Ardından, kare hızı ve piksel boyutu belirtilir (3., yeşil kutu). Burada 0.08 μm piksel boyutu ve 100 ms kare hızı kullanıldı. MaskMaker işlev düğmesine daha sonra (4., mavi kutu) basılır. Seçilen dizinde veri kümesindeki her görüntü dosyası için bir maske dosyası içeren "MaskFiles" başlıklı bir klasör otomatik olarak oluşturulur. (B) Veri kümeleri yüklendiğinde, bir veri dosyası ve/veya maske dosyası seçildiğinde, karşılaştırma kolaylığı için görüntülerin ilk karesi görüntülenir (Yeşil kutu). Maske dosyaları tamamen doğru olmayabilir; bu maske dosyası hatalar için düzeltilebilir veya el ile yeni bir maske dosyası yapılabilir Bu şeklin daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen burayı tıklatın.
Şekil 3: ImageJ'de el ile maske dosyası oluşturma. (A) Önce maske yapmak için dosyayı açın. "Çokgen Seçimleri" düğmesi kırmızı ile özetlenmiştir. Hücrenin kenarını tıklatarak, çokgen bir anahat oluşturulur. (B) Çokgen anahattından maske nasıl oluşturulur. | Düzenle'yi seçerek Seçim | Maske Oluştur, çokgenden (sağ görüntü) siyah beyaz bir maske oluşturulacaktır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Eksosit olayların analizi. (A) Analiz düğmesinin (turuncu kutu) gösterimi ve çalışan bir analiz. Bir analiz yapılırken çalıştırma göstergesinin sarıya döndüğüne dikkat edin. (B) Çözümleme tamamlandığında seçilen dizinde oluşturulan örnek çözümleme dosyaları. DataFiles, eksosit olayın tüm çözümleme dosyalarını içerir. (C) DataFiles Klasöründe oluşturulan çözümleme dosyaları. Renk kutuları sonraki görüntülerdeki açık dosyaları temsil eder. (D) Üç açık dosya, "X_fluorescent_traces.csv" (kırmızı) ve "X_Cell_statistics"(yeşil) ve "X_tracking"(mavi). Floresan izler, her olayın x,y konumunu ve kare numarasını ve her yatırım getirislerindeki floresan yoğunluğunu içerir. Cell_statistics, eksositoz sıklığı gibi tüm hücreli ekzosit istatistiklerinin özet bilgilerini içerir. X_tracking, her eksositoz olayı için konum ve zaman bilgilerinin yanı sıra, 0-1 arasında bir sayı olarak temsil edilen her olay için her eksositoz sınıfının olasılığını içerir (>0,5, bir olayın belirli bir sınıfa ait olduğunu gösterir). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Temsili sonuçlar. (A) Her ekzosit sınıfından ortalama floresan izleri +/- SEM. (B) Her ekzosit sınıfı için üç murine kortikal nöron için çizilen olayların sıklığı. Bu veri değerleri "X_tracking" içinde atanan sınıflar kullanılarak "X_Cell_statistics" çizildi. (C) A'da kullanılan aynı üç hücre için eksositoz sınıflarının dağılımı. Burada, her modun oranı çizilir. (D) Protokolün Ripley'in K Analizi bölümünde oluşturulduğu gibi eksosit olayların meydana geldiği yerin yoğunluk grafiği. Bu, olayların meydana geldiği yerin mekansal olasılığının bir "ısı haritası" olarak yorumlanabilir. (E) Ripley'in A ve B için kullanılan üç hücrenin K analizi). Kırmızı çizgi, ekzosit olayların tamamen mekansal olarak rastgele dağılımının ne kadar değerli olacağını gösterir. Siyah çizgi, bu örnekteki üç hücre için ripley'in K değerinin toplamını gösterir ve mavi gölgeli bölge güven aralığını temsil eder. Burada, gölgeli bölge özellikle ~0.25-1 μm arasındaki tam mekansal rastgelelik çizgisinin dışına düşer, bu da eksosit olayların bu mesafelerde kümelendiğini gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Eksosit algılama ve analiz yazılımını kullanırken, lütfen programın yalnızca kayıpsız sıkıştırma .tif dosyalarını giriş olarak kabul ettiğini düşünün. .tif görüntü dosyaları 8 bit, 16 bit veya 32 bit gri tonlamalı (tek kanallı) görüntüler olabilir. Diğer görüntü biçimleri giriş öncesi bu türlerden birine dönüştürülmelidir. Başvuru için, burada kullanılan örnekler 16 bit gri tonlamalı görüntülerdir.
Otomatik algılama işleminin doğasında bulunan timelapse görüntü kümeleri, otomatik arka plan çıkarma ve fotobleaching düzeltmesi için işlenir. Arka plan çıkarma için, maske dosyasının maskelenmiş bölgesinin dışındaki pikseller görüntünün tamamının zaman dilimi boyunca ortalamalanır ve ortalama değer görüntü kümesinden çıkarılır. Fotobleaching düzeltmesi için, video boyunca maskedeki piksellerin ortalama floresanlarına tek üstel bir çürüme uyumu uygulanır ve düzeltilen yoğunluk aşağıdaki gibi ayarlanır:
Düzeltilmiş yoğunluk = (Zaman t'deki yoğunluk) ÷ exp-k×t burada k = çürüme sabiti
Bu nedenle, giriş öncesinde ön işleme gerek yoktur. Bununla birlikte, bu işlemler, hücreyi arka plandan etkili bir şekilde ayırmak için görüntü maskesine eleştirel olarak güvenir ve bu nedenle iyi sonuçlar için uygun bir hücre maskesi gereklidir.
Otomatik hücre maskesi oluşturucu, iyi performans gösteremek için yeterli sinyal-gürültü oranına (ideal olarak, ortalama arka plan sinyalinin standart sapmasının en az 2 katı) sahip düzgün bir sinyal gerektirir. Ampirik olarak, prenilasyon sırasında plazma zarına sokulan floresan bir proteinle etiketlenmiş CAAX kutusu iyi çalışır. Sıranın ilk 10 karesinde yüksek bir sinyalden uygun bir maske oluşturulabileceğinden, sinyalin ekzositozun timelapse görüntülemesi boyunca tutulabilmesine gerek yoktur. Ancak görüntüleme paradigması sırasında hücre morfolojisi önemli ölçüde değişiyorsa dikkatli olunmalıdır.
Otomatik algılama yazılımını kullanırken, doğru zamansal ve uzamsal çıkışlar için kare hızını ve piksel boyutunu ekleyin. Kare hızı veya piksel boyutu bildirilmezse, çıktı piksel başına ve kare başına olur. Başparmak kuralı olarak, gelişmekte olan nöronlardaki veziklin çapları ~ 100 nm13ölçeğindedir ve bu nedenle olayların otomatik olarak algılanmasının boyutu benzer veziküller için işe yarayabilir. Mevcut haliyle, otomatik algılama çok çeşitli Gauss genişliklerinde Gauss şeklindeki yoğunluğa dayandığından, tespit edilebilen veziklin boyutunda (piksel alanına göre) sabit bir sınır yoktur. Bir pikselin genişliğinden daha küçük veziküllerin füzyonu, olayın yoğunluğu, floresan kırınımı birden çok piksel üzerinde genişledikçe ortalama arka plan sinyalinin standart sapmasının 2 katı sinyalden gürültüye kriterleri karşılıyorsa doğru bir şekilde algılanabilir.
Bu program, gelişmekte olan nöronlarda ekzosit olayları tespit etmek için geliştirilmiştir. Ancak, yazılım başarıyla algılama algoritması olduğunu gösteren diğer hücre satırları2eksosit olayları algılamak için yararlanıldı. Yazılımı nöronal olmayan hücre tiplerinde eksosit olayları tespit etmek için kullanmış olsak da, hücre tipleri14 arasındaki eksosit olay modundaki farklılıklar sınıflandırma algoritmasının diğer hücre tipleri için uygun olmayabileceğini göstermektedir. Nöron geliştirmedeki ekzositik olaylar başlangıçta üç farklı yöntem kullanılarak sınıflandırıldı: Hiyerarşik kümeleme, Dinamik Zaman Çarpıtma ve Ana Bileşen Analizi (PCA), dört farklı sınıf ortaya çıkardı3. Burada her üç sınıflandırıcı da GUI'de eksosit olayları bu yerleşik dört sınıftan birine kategorize etmek için kullanılır. Her eksosit olay için, dört olası sınıfın her biri için 0-1 arasında bir olasılık puanı atanır. Olasılık puanı 0,5'> olan herhangi bir sınıf bu sınıftan olarak kabul edilir. Bu sınıflandırma bugüne kadar sadece nöronların geliştirilmesinde kullanılmıştır. Bu sınıfların diğer hücre tiplerinde mi yoksa nöronlarda daha sonraki gelişimsel zaman noktalarında mı var olduğu bilinmemektedir. Sınıflardan herhangi biri için olasılık puanları <0,5 olan çok sayıda olay, sınıflandırma yordamının şu anda değerlendirilen eksosit olaylar için uygun olmayabileceğini düşündürür. Farklı hücre tiplerindeki eksosit olaylara düşük olasılık puanları atanırsa, bu, yeni veya alternatif eksositoz modları olabileceğinden de novo sınıflandırmasına ihtiyaç duyulduğunu gösterir. Burada kullanılan sınıflandırma yöntemlerinin otomatik olarak algılanan eksosit olaylara uygulanması gerekir.
Ekzosit olayların mekansal ve zamansal kümelenlerini keşfetmek için Ripley'in K analizi15'i istismar edilir. Nöronlar için kümelenmenin analizi üç ayrı analiz içerir: biri soma, biri nötraller ve diğeri zaman için. Soma ve nötralizlerin bölünmesinin nedeni, genellikle 2D ağ olarak tedavi edilebilecek kadar ince olan ve Ripley'in K analizinin 2D varyantını uygulayabilecek kadar ince olan nötrerlerin aşırı morfolojisini hesaba katmaktır. Zamansal kümeleme için zamansal kümeleme için 1D Ripley's K analizi uygulanır. Ripley'in K analizi, nokta süreçlerinin kümelenmesi ve kolokalizasyonun tespiti için sağlam bir yöntemdir. Ripley'in K grafiği şöyle yorumlanabilir: Ripley'in K değeri + güven aralığı, 0.05 p değerine benzer şekilde, herhangi bir noktada tam mekansal rastgelelik çizgisinin dışına düşme şansına sahiptir. Değerin tam uzamsal rastgelelik çizgisinin dışına düştüğü durumlarda, eksosit olaylar kümelenir (KSS'nin üzerinde) veya bu mesafelerde (x ekseni) düzenli aralıklarla (KSS'nin altında) ayrılır.
Maske dosyasının oluşturulması, hücrenin yüksek bir ilk sinyalden gürültüye dayanır. pH'a duyarlı belirteçler, probun hangi proteine bağlı olduğuna bağlı olarak bir hücreyi aydınlatmada her zaman iyi performans göstermeyebilir. Ekzosit işaretleyicinin gürültüsüne yönelik sinyal hücre kenarlıkını yeterince vurgulamazsa maske dosyaları yapmak için başka bir seçenek, maske oluşturma için ikinci bir floresan kanal / görüntü sağlamaktır. Maske yapmak için farklı bir floresan işaretçisi (örneğin tagRFP-CAAX) kullanıyorsanız, bir veri kümesi seçerken, önce maskelerin izlerine sahip klasöre gidin (örneğin, tagRFP-CAAX görüntülerini içeren bir klasör). Buradaki Maske Oluşturucu düğmesini kullanın. Daha da önemlisi, yukarıdaki adlandırma düzeniyle analiz edilecek eksosit veri dosyasıyla eşleşecek şekilde maske dosyalarını yeniden adlandırmayı unutmayın (yukarıdaki örnekte, "CAAX_1_mask_file.tif" adlı maske dosyalarının analiz edilecek VAMP2 görüntüsüyle eşleşmesi için "VAMP2_488_WT_1_mask_file.tif" olarak yeniden adlandırılması gerekir). Maske dosyaları uygun şekilde adlandırıldıktan sonra, çözümlemek üzere eksosit veri kümesi dosyalarına gitmek için Veri Kümesi Seç düğmesine yeniden dönün.
Eksositoz tespiti son derece hassastır ve ekzositotik olaylar 0.01 ΔF/F kadar düşük sinyal-gürültü oranlarında doğru bir şekilde tespit edilmiştir. Algılamanın hassasiyeti kısmen arka plan floresanının varyansına bağlıdır ve arka plan sinyalinin üzerinde 4 standart sapmadan daha az olaylar algılanmaz.
Eksosit olayların tespiti geçici doğalarına dayanır. Geçici olayların analizinin bir özelliği olarak, algılama kodumuz eksosit olayın etrafındaki 20 saniyelik bir pencereyi araştırır. Bazı hücre tiplerinde, öpücük ve kal eksositozu, gelişmekte olan nöronlara göre çok daha uzun bir zamansal pencere için "kalabilir" ve otomatik algılama bu daha az geçici olayları sağlam bir şekilde yakalayamayabilir. Bu özellik MATLAB ile rahat olanlar için kolayca değiştirilebilir bir değişkendir. 20 saniyelik yatırım getirisinin sınırlamasına benzer şekilde, videonun son zaman diliminden önce görünen ancak kaybolmayan eksositoz olayları, zaman serisinin tüm uzunluğuna göre hesaplanan frekansı etkileyebilecek gerçek eksositoz olarak sayılmaz.
Dahil olan maske üreticisi tasarıma göre otomatikleştirilmiştir ve karmaşık şekilleri arka plandan segmentlere ayırırken iyi performans gösterir; ancak, tam otomatik tasarım, otomatik olarak maske oluşturmak için kullanılabilecek sinyalden gürültüye ve sinyal türü aralığını sınırlar. Kullanıcı tekdüze ve önemli bir sinyal-gürültü oranına sahip bir floresan hücre işaretçisi içeremiyorsa, hücre maskesinin manuel olarak çizilmesi gerekir.
Eksositozun kullanıcı tabanlı analizi zaman alıcı bir süreçtir ve olaylar her zaman diğer floresanlardan açıkça ayrılmadığı için kişisel önyargıya tabidir. Eksosit olayları tarafsız bir şekilde doğru bir şekilde tanımlamak ve analiz etmek için otomatik bir analiz programının kullanılması analiz verimliliğini arttırır ve tekrarlanabilirliği ve titizliği artırır.
Bu eksosit olay tespiti sadece gelişmekte olan nöronlarda değil, diğer hücre tiplerinde de pH'a duyarlı floresanların doğru bir şekilde yakalanması için çalışır (Urbina ve ark., 2018). Sınıflandırmanın diğer hücre türleri için çalışıp çalışmadığı belirleme gerektirir. Bu tekniğin gelecekteki uygulamaları sinapslarda, nöronal olmayan hücre tiplerinde veya yakın zamanda açıklanan pHmScarlet16gibi ekzosit vezikül yerleştirme ve füzyonun yeni belirteçlerinde yararlı olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar açıklayacak bir şey beyan etmezler.
Acknowledgments
Dustin Revell ve Reginald Edwards'a test kodu ve GUI için teşekkür ederiz. R01NS112326 (SLG), R35GM135160 (SLG) ve F31NS103586 (FLU) dahil olmak üzere bu araştırmayı destekleyen Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından finansman sağlanmıştır.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | |
| R | R Core Team | https://www.r-project.org/ | |
| Rstudio | Rstudio, PBC | https://rstudio.com/ |
References
- Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Urbina, F. L., Gomez, S. M., Gupton, S. L. Spatiotemporal organization of exocytosis emerges during neuronal shape change. Journal of Cell Biology. 217 (3), 1113-1128 (2018).
- Urbina, F. L., et al. TRIM67 regulates exocytic mode and neuronal morphogenesis via SNAP47. Cell Reports. 34 (6), 108743 (2021).
- Alabi, A. A., Tsien, R. W. Perspectives on kiss-and-run: Role in exocytosis, endocytosis, and neurotransmission. Annual Review of Physiology. 75, 393-422 (2013).
- Albillos, A., et al. The exocytotic event in chromaffin cells revealed by patch amperometry. Nature. 389 (6650), 509-512 (1997).
- He, L., Wu, L. G. The debate on the kiss-and-run fusion at synapses. Trends in Neuroscience. 30 (9), 447-455 (2007).
- Elhamdani, A., Azizi, F., Artalejo, C. R. Double patch clamp reveals that transient fusion (kiss-and-run) is a major mechanism of secretion in calf adrenal chromaffin cells: high calcium shifts the mechanism from kiss-and-run to complete fusion. Journal of Neuroscience. 26 (11), 3030 (2006).
- Bowser, D. N., Khakh, B. S. Two forms of single-vesicle astrocyte exocytosis imaged with total internal reflection fluorescence microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (10), 4212-4217 (2007).
- Holroyd, P., Lang, T., Wenzel, D., De Camilli, P., Jahn, R. Imaging direct, dynamin-dependent recapture of fusing secretory granules on plasma membrane lawns from PC12 cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (26), 16806-16811 (2002).
- Wang, C. T., et al. Different domains of synaptotagmin control the choice between kiss-and-run and full fusion. Nature. 424 (6951), 943-947 (2003).
- Winkle, C. C., Hanlin, C. C., Gupton, S. L. Utilizing combined methodologies to define the role of plasma membrane delivery during axon branching and neuronal morphogenesis. Journal of Visualized Experiments. (109), e53743 (2016).
- Viesselmann, C., Ballweg, J., Lumbard, D., Dent, E. W. Nucleofection and primary culture of embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. Journal of Visualized Experiments. (47), e2373 (2011).
- Plooster, M., et al. TRIM9-dependent ubiquitination of DCC constrains kinase signaling, exocytosis, and axon branching. Molecular Biology of the Cell. 28 (18), 2374-2385 (2017).
- Urbina, F. L., Gupton, S. L. SNARE-mediated exocytosis in neuronal development. Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 133 (2020).
- Ripley, B. D. The second-order analysis of stationary point processes. Journal of Applied Probability. 13 (2), 255-266 (1976).
- Liu, A., et al. pHmScarlet is a pH-sensitive red fluorescent protein to monitor exocytosis docking and fusion steps. Nature Communication. 12 (1), 1413 (2021).
