Summary
We ontwikkelden geautomatiseerde computer vision software om exocytische gebeurtenissen te detecteren die worden gekenmerkt door pH-gevoelige fluorescentiesondes. Hier demonstreren we het gebruik van een grafische gebruikersinterface en RStudio om fusiegebeurtenissen te detecteren, spatiotemporale parameters van fusie te analyseren en weer te geven en gebeurtenissen in verschillende fusiemodi te classificeren.
Abstract
Timelapse TIRF-microscopie van pH-gevoelige GFP (pHluorine) verbonden aan blaasjes SNARE-eiwitten is een effectieve methode om exocytische gebeurtenissen in het celkweek van één blaasje te visualiseren. Om een onbevooroordeete, efficiënte identificatie en analyse van dergelijke gebeurtenissen uit te voeren, werd een computervisiegebaseerde aanpak ontwikkeld en geïmplementeerd in MATLAB. De analyse pijplijn bestaat uit een algoritme voor cel segmentatie en exocytische gebeurtenis identificatie. De computervisiebenadering omvat hulpmiddelen voor het onderzoeken van meerdere parameters van afzonderlijke gebeurtenissen, waaronder de halfwaardetijd van fluorescentiebederf en piek ΔF/F, evenals analyse van de frequentie van exocytose in hele cellen. Deze en andere parameters van fusie worden gebruikt in een classificatiebenadering om verschillende fusiemodi te onderscheiden. Hier voert een nieuw gebouwde GUI de analysepijplijn van begin tot eind uit. Verdere aanpassing van Ripley's K-functie in R Studio wordt gebruikt om onderscheid te maken tussen geclusterde, verspreide of willekeurige voorkomen van fusiegebeurtenissen in zowel ruimte als tijd.
Introduction
VAMP-pHluorine constructen of transferrine receptor (TfR)-pHuji constructies zijn uitstekende markers van exocytische gebeurtenissen, omdat deze pH-gevoelige fluoroforen worden gedoofd in het zure blaasje lumen en fluoresce onmiddellijk na fusie porie opening tussen het blaasje en plasmamembraan1. Na het openen van de fusieporiën vergaat fluorescentie exponentieel, met enige heterogeniteit die informatie over de fusiegebeurtenis onthult. Hier wordt een GUI-toepassing (Graphical User Interface) beschreven die automatisch exocytische gebeurtenissen detecteert en analyseert. Met deze applicatie kan de gebruiker automatisch exocytische gebeurtenissen detecteren die worden onthuld door pH-gevoelige markers2 en functies genereren van elke gebeurtenis die kan worden gebruikt voor classificatiedoeleinden3 (Figuur 1A). Daarnaast wordt analyse van exocytische gebeurtenisclustering met behulp van ripley's K-functie beschreven.
De geautomatiseerde classificatie van exocytische gebeurtenissen in verschillende exocytische modi werd onlangs gerapporteerd3. Twee modi van exocytose, full-vesicle fusion (FVF) en kiss-and-run fusion (KNR) exocytose zijn eerder beschreven4,5,6,7. Tijdens FVF verwijdt de fusieporiën en wordt het blaasje opgenomen in het plasmamembraan. Tijdens KNR opent de fusieporiën tijdelijk en hersealen vervolgens4,5,8,9,10. Vier modi van exocytose werden geïdentificeerd in het ontwikkelen van neuronen, twee gerelateerd aan FVF en twee gerelateerd aan KNR. Dit werk toont aan dat zowel FVF als KNR verder kunnen worden onderverdeeld in fusiegebeurtenissen die onmiddellijk overgaan tot fluorescentiebederf (FVFi en KNRi) na het openen van de fusieporiën of exocytische gebeurtenissen die een vertraging vertonen na het openen van de fusieporiën voordat fluorescentieverval begint (FVFd en KNRd) (Figuur 1B). De classificatie identificeert de modus van exocytose voor elke fusiegebeurtenis. Hier is deze analyse opgenomen in een GUI die kan worden geïnstalleerd in MATLAB in Windows- en Mac-gebaseerde besturingssystemen. Alle analysebestanden zijn te vinden op https://drive.google.com/drive/folders/1VCiO-thMEd4jz-tYEL8I4N1Rf_zjnOgB?usp=sharing of
https://github.com/GuptonLab.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Kies datasets en directory
- Als u gegevenssets wilt selecteren voor analyse, klikt u op de knop Gegevenssets zoeken (afbeelding 2A, rood vak 1)om naar de map te navigeren waar gegevens worden gedeponeerd (bijvoorbeeld de map RawData). Gegevensbestanden vullen de gegevensbestanden automatisch in als een lijst. Er kan meer dan één gegevensset in de map staan.
- Klik op de knop Directory kiezen en selecteer de map (bijv. Test) waar geanalyseerde bestanden worden gedeponeerd (figuur 2A, rood vak 2) . Een set mappen en voltooide analysebestanden en tussenliggende tijdelijke afbeeldingen worden in deze map gemaakt wanneer de knop Analyse wordt ingedrukt. Er worden fouten geproduceerd als er geen map wordt gekozen.
2. Stel de pixelgrootte en framerate in
- Vul de juiste framesnelheid en pixelgrootte van de afbeeldingen in het juiste vak "Framerate" of "pixelgrootte" in (figuur 2A, groen vak). Als er geen waarden worden opgegeven (ze zijn ingesteld op de standaardwaarde "0"), wordt in het programma gezocht naar de metagegevens die aan het bestand zijn gekoppeld op framerate en pixelgrootte. Als deze waarden niet kunnen worden gevonden, wordt standaard per pixel gebruikt voor meting en per frame voor tijdspunten.
OPMERKING: In het opgegeven voorbeeld is de framerate 100 en de pixelgrootte 0,08.
3. Maskers kiezen of maken
- Gebruik de knop Mask Maker om automatisch celmaskers te maken voor de gegevens in de lijst met bestandsgegevenssets (figuur 2A, blauw vak). Na gebruik van de knop Mask Maker wordt een nieuwe map in de gekozen map gemaakt met de naam MaskFiles. De "Run indicator" wordt geel tijdens het hardlopen en keert terug naar groen wanneer deze is voltooid.
OPMERKING: Een masker voor elk bestand in de lijst Gegevensbestanden wordt gemaakt van de eerste 10 frames van het afbeeldingsbestand (of van alle frames als er minder dan 10 in het afbeeldingsbestand staan) en in de map MaskFiles gedeponeerd met behulp van het juiste naamgevingsschema (hieronder beschreven). - Zorg ervoor dat de maskerbestanden automatisch de lijst Maskerbestanden vullen. De gebruiker kan rechtstreeks overgaan tot de analyse.
OPMERKING: Controleer maskerbestanden altijd visueel en bevestig dat ze de hele interesseregio vastleggen. Het eerste frame van het gegevensbestand en het maskerbestand worden weergegeven in de gebruikersinterface wanneer deze is geselecteerd. (Figuur 2B). De Mask Maker kan fouten veroorzaken in het geval van een laag signaal naar ruis, dus het valideren dat maskerbestanden geschikt zijn, is van cruciaal belang voor kwaliteitscontrole. - Als alternatief voor het gebruik van Mask Maker, als het signaal naar ruis van afbeeldingen onvoldoende is, maakt u maskers handmatig in ImageJ.
- Open eerst het onbewerkte afbeeldingsbestand in ImageJ (figuur 3A).
- Klik op de knop Polygoonselectie en klik om een masker rond de cel te tekenen. Als u klaar bent, dubbelklikt u op het laatste punt om de veelhoek te voltooien.
- Als u klaar bent, navigeert u naar bewerken | Selectie | Masker maken (figuur 3B). Er wordt een nieuw omgekeerd masker gemaakt op basis van de polygoontekening. Sla maskers op in een aangewezen map MaskFiles in de gekozen map. Het naamgevingsschema voor maskerbestanden moet overeenkomen met de bijbehorende afzonderlijke gegevensbestanden, gevolgd door "_mask_file". Als een gegevensbestand bijvoorbeeld de naam "VAMP2_488_WT_1.tif" heeft, moet het bijbehorende maskerbestand de naam "VAMP2_488_WT_1_mask_file.tif" krijgen.
- Gebruik de knop Maskfiles zoeken om naar de gekozen map met gedeponeerde aangepaste maskerbestanden te navigeren. De maskers vullen de maskerbestanden als een lijst.
OPMERKING: Het is belangrijk om voor elk gegevensbestand een masker te hebben voordat u de analyse uitvoert.
4. Analyse en functie-extractie
- Nadat de map is gekozen en de lijst Gegevensbestanden en Maskerbestanden zijn ingevuld, klikt u op de knop Analyse (figuur 4A). Als de classificatie van exocytische gebeurtenissen vereist is, gaat u naar stap 5.
OPMERKING: De klik op de knop Analyse voert een reeks geautomatiseerde taken uit om de gegevens te analyseren. Het maakt afzonderlijke mappen in de gekozen map om geanalyseerde gegevens te deponeren. Tijdens het hardlopen verandert de "run indicator" van groen naar geel (figuur 4A, rood vak). Nadat de analyse is voltooid, verandert dit weer in groen. - Zoek een map DataFiles (Figuur 4B) met de volledige set analysebestanden (evenals functie-extractiebestanden, die later in classificatie moeten worden gebruikt) met de naam volgens elk gegevensbestand (Figuur 4C).
OPMERKING: Een beschrijving van deze analysebestanden vindt u hieronder in de sectie Representatieve resultaten.
5. Classificatie van exocytische gebeurtenissen
- Als u gelijktijdige classificatie van exocytische gebeurtenissen met geautomatiseerde detectie wilt uitvoeren, schakelt u het selectievakje Classificatie in voordat u op de knop Analyse klikt. Wijs voor elke exocytische gebeurtenis een waarschijnlijkheidsscore toe tussen 0-1 voor elke klasse. Een exocytische gebeurtenis wordt beschouwd als een van de vier klassen als de waarschijnlijkheidsscore voor die klasse > 0,5 is.
OPMERKING: Zodra de analyse is voltooid, verschijnt er een nieuwe map met gegevensbestanden in de gekozen map. De map bevat analysebestanden die overeenkomen met elk afbeeldingsbestand.
6. Spatiotemporale analyse van exocytose met behulp van Ripley's K-waarden
- Maak een apart maskerbestand "neurite" en "soma". Segmenteer eerst de soma uit de neuriet. Er is geen onpartijdige methode om de soma van de neurieten te segmenteren, dus de gebruiker moet verblind worden voor het conditioneringsexperiment en het beste oordeel gebruiken; een ellipsoïde zonder duidelijke neurietextensies wordt voorgesteld.
- Open ImageJ/Fiji.
- Sleep het maskerbestand en laat het vallen of gebruik File | Open en selecteer vervolgens het maskerbestand.
- Gebruik het gereedschap Kleurkiezer en klik op een van de zwarte pixels op de achtergrond van het masker om de kleur in te stellen op zwart.
- Gebruik het gereedschap polygoonselectie of uit de vrije hand om een omtrek rond de soma te tekenen en deze te scheiden van de neurieten. Dit vereist handmatige besluitvorming.
- Klik op Bewerken | Selectie | Masker maken. Er wordt een nieuwe afbeelding geopend met de omcirkelde soma gesegmenteerd van de rest van de afbeelding. Hiermee wordt een somamaskerbestand gemaakt.
- Zonder het getekende gebied te verplaatsen, klikt u op de koptekst van het oorspronkelijke maskerbestand.
- Klik op Bewerken | Vul in om de omcirkelde soma in te vullen, zodat alleen de neurieten het masker blijven.
- Zodra afzonderlijke neurite- en maskerbestanden zijn verkregen, slaat u beide maskerbestanden op.
- Open "neurite_2D_network" in Matlab.
- Navigeer in MATLAB naar de map met alle analysegegevens.
- Wijzig het pad "maskernaam" in de naam van het neurietmasker, d.w.z. "MaskFiles/VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_neurite.tif"
- Wijzig de "csv_file_name" naar waar fluorescent_traces.csv bestand zich bevindt, d.w.z. "MaskFiles/VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_neurite.csv".
- Klik op Uitvoeren om het neurietmaskerbestand te skeletoniseren. Hiermee wordt een geskeletiseerde versie van het neurite-maskerbestand gemaakt en wordt het als CSV-bestand onder de map maskfiles gedeponeerd.
- Genereer vervolgens een CSV-bestand voor de soma. Open "CSV_mask_creator.m" in Matlab.
- Zet in het pad voor de "maskernaam" naar de naam van het somamasker, d.w.z. "MaskFiles/VAMP2phLuorin_488_wt_4_mask_file_soma.tif
- Wijzig de "writematrix" in csv-bestandsnaam die moet worden gemaakt, d.w.z. "MaskFiles/VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_soma.csv"
- Klik op Uitvoeren. Hiermee wordt het nieuwe VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_soma.csv bestand gemaakt.
- Herhaal 6.14 voor elk maskerbestand.
7. RStudio setup
- Open Rstudio en open ripleys_k_analysis. R-bestand.
- Installeer het pakket "spatstat" in RStudio door naar Tools | Installeer pakketten en typ "spatstat" in, gevolgd door op Installerente klikken.
OPMERKING: Dit hoeft slechts één keer per Rstudio-installatie te worden uitgevoerd. - Voer de bibliotheek spatstat uit aan het begin van elke sessie.
- Let in dit geval op twee hoofdvariabelen: 'neuron_mask' en 'neuron_datapoints'. Neuron Mask verwijst naar de set maskerbestanden die moeten worden uitgevoerd, d.w.z. soma-maskerbestanden."
OPMERKING: Voer alle soma-maskerbestanden samen uit, los van Neurite-maskerbestanden en vice versa. - Lees in de .csv van de maskerbestanden voor elk van de te analyseren neuronen.
- Voer meerdere bestanden tegelijk uit door extra neuron_mask_n+1 te kopiëren. Dit maakt het mogelijk om ripley's analyse samen te voegen, met behulp van het script beschreven in sectie 8.
- Controleer nu de tweede variabele, "neuron_datapoints".
- Lees in de." X_fluorescent_traces.csv" bestand gegenereerd door het analyseprogramma (door alle extracted_R bestand) met de x,y,t posities van de exocytische gebeurtenissen, evenals het neurite-specifieke bestand van de x,y posities voor het 2D-netwerk. Dit gaat in de "neuron_datapoints" positie.
- In RStudio Code selecteren | Regio | uitvoeren Voer alles uit. Dit genereert verschillende plots, waaronder de gegroepeerde Ripley's K-waarden en dichtheidspercelen.
- Sla plots op door naar export | te gaan Afbeelding opslaan als | Selecteer de juiste afbeeldingsindeling en map en voer de juiste bestandsnaam in en klik op Opslaan.
OPMERKING: De plotfunctie voor de heatmaps wordt in het script aangeroepen met behulp van "plot(density(soma_data,0.4)". Het getal "0.4" geeft hier aan hoe glad de dichtheidsfunctie moet zijn. Het kan worden gewijzigd om gebruikersgegevens op een zinvolle manier aan te passen, maar als vergelijkingen moeten worden uitgevoerd tussen verschillende heatmaps, moet het aantal tussen hen hetzelfde zijn. - Afbeelding exporteren of opslaan vanuit Rstudio. Als een heatmap verder moet worden bewerkt, kiest u een geschikt bestandstype (SVG of EPS).
8. Ripley's analyse
OPMERKING: De Ripleys_k_analysis. R-bestand genereerde ook automatisch Ripley's k-waardeplots. Als u het volledige script uitvoert, worden automatisch de onderstaande functies uitgevoerd, maar het wordt in detail opgenomen als u elk deel van het script afzonderlijk wilt uitvoeren of wijzigingen in de analyse wilt aanbrengen.
- Voer eerst de envelopfunctie voor elke cel uit. Deze functie simuleerde volledige ruimtelijke willekeur (CSR) om de Ripley's K-waarde van het exocytische gebeurtenispuntpatroon te testen.
Data_envelope_1 = envelop(soma_data_1, Kest, nsim = 19, savefuns = WAAR)
Data_envelope_2 = envelop(soma_data_2, Kest, nsim = 19, savefuns = WAAR) - Bundel vervolgens deze enveloppen en maak één schatting van MVO voor de groep:
Pool_csr = zwembad(Data_envelope_1, Data_envelop_2,...)
Voer vervolgens de Functie Ripley's K uit voor alle gegevenspunten.
Data_ripleys_k_1 = Kest(soma_data_1, ratio = WAAR)
Data_ripleys_k_2 = Kest(soma_data_2, ratio = WAAR) - Zodra u klaar bent, bundelt u de K-waarden van de Ripley samen en start u hun betrouwbaarheidsintervallen op met de volgende opdracht:
Gegevensgroep = pool(Data_ripleys_k_1, Data_ripleys_k_2,...) - Bootstrap met de volgende opdracht:
Final_Ripleys_K = varblock(fun = Kest, Data_pool) - Plot de gegevens.
- Als een hard-statistisch verschil vereist is, wordt de studentized permutatietest opgenomen in het spatstat-pakket om te testen op een verschil tussen groepen puntpatronen:
Test_difference = studpermu.test(all_points_to_test, exocytic_events ~ groep, nperm = np).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hier werd de GUI (Figuur 2A) gebruikt om exocytische gebeurtenissen te analyseren van drie VAMP2-pHluorine die neuronen uitdrukken bij 3 DIV met behulp van TIRF (totale interne reflectie fluorescentie) microscopie. E15.5 corticale neuronen werden geïsoleerd, gevolgd door transfectie met VAMP2-pHluorine en plating met behulp van de protocollen zoals beschreven in Winkle et al., 2016 en Viesselmann et al., 201111,12. De methodologie van beeldvormingsparameters is zoals beschreven in Urbina et al., 20182. Kortom, TIRF-microscopie werd gebruikt om het basale plasmamembraan van neuronen elke 100 ms gedurende 2 minuten in beeld te houden. Figuur 2, Figuur 3, Figuur 4 toont een stapsgewijze handleiding om exocytische gebeurtenissen te analyseren. De map waarin de neuronafbeeldingen zich bevinden, wordt geselecteerd en er wordt een map gekozen om de gegevensbestanden van de uiteindelijke analyse te deponeren (figuur 2A). Met behulp van de functie MaskMaker wordt een masker gegenereerd voor de neuronen, dat wordt geïnspecteerd in de GUI (Figuur 2B). In dit geval is het celmasker van goede kwaliteit en kan de analyse doorgaan. Als een masker onvoldoende is, kan een masker worden gemaakt in Afbeelding J (figuur 3). Nadat u de functie MaskMaker hebt gebruikt of een masker hebt gemaakt in ImageJ en de map hebt geselecteerd waar de maskerbestanden zich bevinden, wordt de analyse uitgevoerd (figuur 4A). Resultaten worden gegenereerd in de map DataFiles wanneer de analyse is voltooid (de gele indicator verandert weer in groen) (Figuur 4B).
Gegevensbestanden worden automatisch gegenereerd en benoemd op basis van de verstrekte onbewerkte gegevensbestanden.
Ervan uitgaande dat het gegevensbestand de naam X heeft:
X_tracking: Dit bestand bevat x,y positie en framenummer van elke gebeurtenis, evenals omsluitende vakken die kunnen worden gebruikt om vakken rond elke gebeurtenis te tekenen. Leeftijd geeft het aantal frames voorbij de eerste detectie aan waarbij een gebeurtenis een afzonderlijke gaussiaanse puncta is. Als de classificatie is gecontroleerd, worden de classificatieresultaten in dit bestand weergegeven, wat de waarschijnlijkheid aangeeft van een exocytische gebeurtenis die tot een van de vier klassen behoort. Als de waarschijnlijkheid groter is dan .5 en groter dan andere waarschijnlijkheden, is een exocytische klasse gekozen.
X_fluorescent sporen: Dit bestand bevat x,y positie en framenummer van elke gebeurtenis. Bovendien omvat het fluorescerende intensiteitsmetingen in een interessegebied rond elke gebeurtenis 2 seconden voor en 10 seconden na de piek ΔF/F voor elke gebeurtenis (aangegeven door de Timepoint-kolommen).
X_cell_statistics: Dit bestand bevat het celgebied, de totale beeldtijd en de automatisch berekende frequentie van exocytische gebeurtenissen voor elke cel (in gebeurtenissen/mm2/minuut).
Functie extractie bestanden omvatten:
X_contrast: Tegenstelling. Een maat voor het intensiteitscontrast tussen een pixel en zijn buurman over de hele afbeelding.
X_correlation: Correlatie. Een maat voor hoe gecorreleerd een pixel is met zijn buurman over het hele beeld.
X_energy Totale energie. Gedefinieerd als de kwadraatsom van de pixelintensiteit.
X_homogeneity meet de nabijheid van de verdeling van elementen in de ROI tot de ROI-diagonaal.
X_ring_fluorescence: de gemiddelde fluorescentie van randpixels.
X_SD: Standaarddeviatie. Dit wordt gedefinieerd als de standaardafwijking van de ROI.
Voorbeelden van gemiddelde fluorescentiesporen ± SEM uit elke exocytische klasse werden uitgezet uit X_fluorescent sporenbestand (figuur 5A). Met behulp van het bestand Cell_statistics werd de frequentie van exocytose voor elke klasse uitgezet voor elk neuron (figuur 5B). Als op het selectievakje Classificatie is geklikt, wijst het programma elke exocytische gebeurtenis toe aan een klasse, uitgezet in figuur 5C. Na classificatie werd de K-analysecode van de Ripley gebruikt om te bepalen of exocytische gebeurtenissen willekeurig, geclusterd of verspreid zijn in ruimte en tijd. Dichtheidswarmtekaarten van de lokalisatie van exocytische gebeurtenissen (figuur 5D) werden gegenereerd. Deze onthullen verwachte geclusterde "hotspots" in verschillende regio's van het neuron. Vervolgens werd Ripley's K-analyse uitgevoerd voor de soma, neurite en clustering in de loop van de tijd (Figuur 5E). De K-waarde van de Ripley en SEM (respectievelijk zwarte lijn en blauw gearceerd gebied) stijgen boven de lijn van volledige ruimtelijke willekeur (rode stippellijn), wat statistisch significante clustering suggereert.
Figuur 1: Weergave van exocytische analyse en classificatie. (A) Overzicht van de analysepijplijn voor de GUI. Cellen worden gesegmenteerd vanaf de achtergrond voordat exocytische gebeurtenissen worden geïdentificeerd en bijgehouden. Parameters zoals de piek ΔF/F en t1/2 worden berekend op basis van fluorescerende sporen van exocytose in een ROI rond de gebeurtenis vóór en na de fusie. (B) illustratie van de vier modi van exocytose en voorbeeld beeldmontages. Na fusie kunnen gebeurtenissen onmiddellijk overgaan naar FVF of KNR (FVFi en KNRi), of kan er een vertraging aanwezig zijn voor het begin van het fusie-lot naar FVF of KNR (FVFd en KNRd). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: Stapsgewijze voorbeeldanalyse. (A) Eerst worden datasets gekozen (1., rood vak) en wordt een map gekozen om analysebestanden te plaatsen (2., rood vak). Vervolgens worden de framerate en pixelgrootte opgegeven (3., groen vak). Hier werden 0,08 μm pixelgrootte en 100 ms framerate gebruikt. Vervolgens wordt op de functieknop MaskMaker gedrukt (4., blauwe doos). Een map met de titel "MaskFiles" wordt automatisch gemaakt in de gekozen map met een maskerbestand voor elk afbeeldingsbestand in de gegevensset. (B) Wanneer gegevenssets worden geladen, wordt bij het selecteren van een gegevensbestand en/of maskerbestand het eerste frame van de afbeeldingen weergegeven voor het gemak van vergelijking (groen vak). Maskerbestanden zijn mogelijk niet helemaal correct; dit maskerbestand kan worden gecorrigeerd voor fouten, of een nieuw maskerbestand kan handmatig worden gemaakt Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Afbeelding 3: Handmatig een maskerbestand maken in ImageJ. (A) Open eerst het bestand voor het maken van een masker. De knop "Polygon Selections" wordt rood weergegeven. Door rond de rand van de cel te klikken, wordt een veelhoekcontour gemaakt. (B) Hoe maak je een masker van de omtrek van de veelhoek. Door | bewerken te selecteren Selectie | Masker maken, een zwart-witmasker wordt gemaakt op basis van de veelhoek (rechterafbeelding). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4: Analyse van exocytische gebeurtenissen. (A) Demonstratie van de analyseknop (oranje vak) en een lopende analyse. Let op: de runindicator wordt geel terwijl er een analyse wordt uitgevoerd. (B) Voorbeeldanalysebestanden die in de gekozen map worden gemaakt wanneer de analyse is voltooid. DataFiles bevatten alle analysebestanden van de exocytische gebeurtenis. (C) Analysebestanden gegenereerd in de map DataFiles. Kleurvakken vertegenwoordigen de geopende bestanden in volgende afbeeldingen. (D) Drie geopende bestanden, "X_fluorescent_traces.csv" (rood) en "X_Cell_statistics"(groen) en "X_tracking"(blauw). Fluorescerende sporen bevatten de x,y-positie en het framenummer van elke gebeurtenis, evenals de fluorescerende intensiteit bij elke ROI. Cell_statistics bevat beknopte informatie over exocytische statistieken van hele cellen, zoals de frequentie van exocytose. X_tracking bevat positie- en tijdinformatie voor elke exocytische gebeurtenis en de waarschijnlijkheid van elke klasse exocytose voor elke gebeurtenis, weergegeven als een getal tussen 0-1 (>0,5 geeft aan dat een gebeurtenis tot een bepaalde klasse behoort). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5: Representatieve resultaten. (A) Gemiddelde fluorescentiesporen +/- SEM van elke exocytische klasse. (B) Frequentie van gebeurtenissen uitgezet voor drie muriene corticale neuronen voor elke exocytische klasse. Deze gegevenswaarden werden uitgezet vanuit "X_Cell_statistics", met behulp van de klassen die zijn toegewezen in "X_tracking". (C) Verdeling van de klassen exocytose voor dezelfde drie cellen die in A worden gebruikt). Hier wordt de verhouding van elke modus uitgezet. (D) Dichtheidsplot van waar exocytische gebeurtenissen plaatsvinden zoals gegenereerd in het Ripley's K Analysis-gedeelte van het protocol. Dit kan worden geïnterpreteerd als een "heatmap" van de ruimtelijke waarschijnlijkheid van waar gebeurtenissen plaatsvinden. (E) Ripley's K-analyse van drie cellen die voor A) en B worden gebruikt). De rode lijn geeft aan welke waarde volledig ruimtelijk willekeurige verdeling van exocytische gebeurtenissen zou zijn. De zwarte lijn geeft de K-waarde van ripley voor de drie cellen in dit voorbeeld aan en het blauw gearceerde gebied vertegenwoordigt het betrouwbaarheidsinterval. Hier valt het gearceerde gebied met name buiten de lijn van volledige ruimtelijke willekeur tussen ~0,25-1 μm, wat suggereert dat exocytische gebeurtenissen op die afstanden worden geclusterd. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Houd er bij het gebruik van de exocytische detectie- en analysesoftware rekening mee dat het programma alleen compressie zonder verlies accepteert .tif bestanden als invoer. De .tif afbeeldingsbestanden kunnen 8-bits, 16-bits of 32-bits grijswaardenafbeeldingen (één kanaal) zijn. Andere afbeeldingsindelingen moeten vóór invoer worden geconverteerd naar een van deze typen. Ter referentie, voorbeelden die hier worden gebruikt, zijn 16-bits grijswaardenafbeeldingen.
Inherent aan het geautomatiseerde detectieproces worden de timelapse-beeldsets verwerkt voor de geautomatiseerde achtergrondaftrekking en fotobleachingcorrectie. Voor achtergrondaftrekking worden de pixels buiten het gemaskeerde gebied van het maskerbestand gemiddeld over de timelapse van de hele afbeelding en wordt de gemiddelde waarde afgetrokken van de afbeeldingsset. Voor fotobleachingcorrectie wordt een mono-exponentiële vervalsings pasvorm toegepast op de gemiddelde fluorescentie van pixels in het masker in de loop van de video, waarbij de gecorrigeerde intensiteit als volgt wordt aangepast:
Gecorrigeerde intensiteit = (Intensiteit op tijd t) ÷ exp-k×t waarbij k = vervalconstante
Daarom is er geen voorbewerking nodig voorafgaand aan invoer. Deze processen vertrouwen echter kritisch op het beeldmasker om de cel effectief van de achtergrond te scheiden, en dus is een goed celmasker nodig voor goede resultaten.
De maker van het geautomatiseerde celmasker vereist een uniform signaal met een voldoende signaal-ruisverhouding (idealiter ten minste 2x de standaardafwijking van het gemiddelde achtergrondsignaal) om goed te presteren. Empirisch gezien werkt de CAAX-box gelabeld met een fluorescerend eiwit, dat bij prenylatatie in het plasmamembraan wordt ingebracht, goed. Er is geen vereiste dat het signaal gedurende de timelapse-beeldvorming van exocytose kan worden gehandhaafd, omdat een geschikt masker kan worden gemaakt van een hoog signaal in de eerste 10 frames van de reeks. Als de celmorfologie echter aanzienlijk verandert tijdens het beeldvormingsparadigma, moet voorzichtig worden omgegaan.
Wanneer u de geautomatiseerde detectiesoftware gebruikt, moet u de framerate en pixelgrootte opnemen voor nauwkeurige tijdelijke en ruimtelijke uitgangen. Als er geen framerate of pixelgrootte wordt gedeclareerd, is de uitvoer per pixel en per frame. Als vuistregel geldt dat blaasjesdiameters in zich ontwikkelende neuronen zich op de schaal van ~ 100 nm13bevinden, en dus kan de geautomatiseerde detectie van gebeurtenissen werken voor blaasjes die qua grootte vergelijkbaar zijn. Zoals het er nu uitziet, is er geen harde limiet op de grootte van blaasjes die kunnen worden gedetecteerd (per pixelgebied), omdat geautomatiseerde detectie afhankelijk is van gaussiaanse intensiteit over een groot aantal Gaussiaanse breedten. Fusie van blaasjes kleiner dan de breedte van een pixel kan nauwkeurig worden gedetecteerd als de intensiteit van de gebeurtenis voldoet aan de signaal-ruiscriteria van 2x de standaardafwijking van het gemiddelde achtergrondsignaal naarmate de fluorescentiediffractie zich over meerdere pixels uitbreidt.
Dit programma is ontwikkeld voor het detecteren van exocytische gebeurtenissen in het ontwikkelen van neuronen. De software is echter misbruikt om exocytische gebeurtenissen in andere cellijnen2met succes te detecteren, wat aangeeft dat het detectiealgoritme robuust is. Hoewel we de software hebben gebruikt voor het detecteren van exocytische gebeurtenissen in niet-neuronale celtypen, geven verschillen in exocytische gebeurtenismodus tussen celtypen14 aan dat het classificatiealgoritme mogelijk niet geschikt is voor andere celtypen. Exocytische gebeurtenissen in het ontwikkelen van neuronen werden oorspronkelijk geclassificeerd met behulp van drie verschillende methoden: Hiërarchische clustering, Dynamic Time Warping en Principal Component Analysis (PCA), waarbij vier verschillende klassen3werden onthuld. Hier worden alle drie de classificaties in de GUI gebruikt om exocytische gebeurtenissen te categoriseren in een van deze gevestigde vier klassen. Voor elke exocytische gebeurtenis wordt een waarschijnlijkheidsscore tussen 0-1 toegekend voor elk van de vier mogelijke klassen. Elke klasse met een waarschijnlijkheidsscore > 0,5 wordt beschouwd als van die klasse. Deze classificatie is tot op heden alleen gebruikt bij het ontwikkelen van neuronen. Of deze klassen bestaan in andere celtypen of op latere ontwikkelingstijdpunten in neuronen is niet bekend. Een groot aantal voorvallen met waarschijnlijkheidsscores van <0,5 voor een van de klassen zou erop wijzen dat de classificatieprocedure mogelijk niet geschikt is voor de exocytische gebeurtenissen die momenteel worden geëvalueerd. Als lage waarschijnlijkheidsscores worden toegewezen aan exocytische gebeurtenissen van verschillende celtypen, zou dit suggereren dat de novo classificatie nodig is omdat er nieuwe of alternatieve vormen van exocytose kunnen bestaan. Dezelfde classificatiemethoden die hier worden gebruikt, moeten worden toegepast op de automatisch gedetecteerde exocytische gebeurtenissen.
Om de ruimtelijke en temporele clustering van exocytische gebeurtenissen te onderzoeken, wordt Ripley's K-analyse15 uitgebuit. Het analyseren van clustering voor neuronen omvat drie afzonderlijke analyses: een voor de soma, een voor de neurieten en een voor de tijd. De reden voor het splitsen van de soma en neurieten is om rekening te houden met de extreme morfologie van neurieten, die vaak dun genoeg zijn dat ze als een 2D-netwerk kunnen worden behandeld en een 2D-variant van Ripley's K-analyse kunnen toepassen. Voor de tijd wordt een 1D Ripley's K-analyse geïmplementeerd voor tijdelijke clustering. Ripley's K-analyse is een robuuste methode voor het detecteren van clustering van puntprocessen en colocalisatie. De grafiek van Ripley's K kan als zodanig worden geïnterpreteerd: het K-waarde + betrouwbaarheidsinterval van Ripley heeft een kans van 5% om op elk moment buiten de lijn van volledige ruimtelijke willekeur te vallen, analoog aan een p-waarde van 0,05. Wanneer de waarde buiten de lijn van volledige ruimtelijke willekeur valt, worden exocytische gebeurtenissen geclusterd (boven MVO) of worden ze met regelmatige tussenpozen (onder MVO) gescheiden op die afstanden (x-as).
Het maken van het maskerbestand is afhankelijk van een hoog eerste signaal-ruissignaal van de cel. pH-gevoelige markers presteren mogelijk niet altijd goed bij het verlichten van een cel, afhankelijk van het eiwit waaraan de sonde is bevestigd. Een andere optie voor het maken van maskerbestanden als het signaal naar ruis van de exocytische markering de celrand onvoldoende benadrukt, is om een tweede fluorescerend kanaal / afbeelding te gebruiken voor het maken van maskers. Als u een andere fluorescentiemarkering (tagRFP-CAAX bijvoorbeeld) gebruikt om maskers te maken, navigeert u bij het kiezen van een gegevensset eerst naar de map met de afbeeldingen waaruit maskers moeten worden gemaakt (bijvoorbeeld een map met de tagRFP-CAAX-afbeeldingen). Gebruik hier de knop Mask Maker. Belangrijk is dat u de naam van de maskerbestanden wijzigt in het exocytische gegevensbestand dat moet worden geanalyseerd met het bovenstaande naamgevingsschema (in navolging van het bovenstaande voorbeeld moeten de maskerbestanden met de naam "CAAX_1_mask_file.tif" worden hernoemd naar "VAMP2_488_WT_1_mask_file.tif" om overeen te komen met de VAMP2-afbeelding die moet worden geanalyseerd). Zodra maskerbestanden op de juiste manier zijn benoemd, keert u terug naar de knop Gegevensset kiezen om naar exocytische gegevenssetbestanden te navigeren om te analyseren.
De detectie van exocytose is opmerkelijk gevoelig en exocytische gebeurtenissen werden nauwkeurig gedetecteerd bij signaal-ruisverhoudingen zo laag als een ΔF/F van 0,01. De gevoeligheid van de detectie hangt gedeeltelijk af van de variantie van de achtergrondfluorescentie en gebeurtenissen met minder dan 4 standaardafwijkingen boven het achtergrondsignaal worden niet gedetecteerd.
De detectie van exocytische gebeurtenissen is afhankelijk van hun voorbijgaande aard. Als kenmerk van de analyse van voorbijgaande gebeurtenissen verkent onze detectiecode een venster van 20 seconden rond de exocytische gebeurtenis. In sommige celtypen kan kiss-and-stay exocytose veel langer "blijven" dan bij het ontwikkelen van neuronen, en de geautomatiseerde detectie kan deze minder voorbijgaande gebeurtenissen mogelijk niet robuust vastleggen. Deze functie is een gemakkelijk te wijzigen variabele voor degenen die comfortabel zijn met MATLAB. Net als bij de beperking van de ROI van 20 seconden, kunnen exocytische gebeurtenissen die verschijnen maar niet verdwijnen vóór het laatste tijdsbestek van de video niet worden geteld als echte exocytose, die de frequentie kan beïnvloeden, die wordt berekend op basis van de volledige lengte van de tijdreeks.
De meegeleverde maskermaker is geautomatiseerd door ontwerp en presteert goed bij het segmenteren van complexe vormen vanaf de achtergrond; het volledig geautomatiseerde ontwerp beperkt echter het bereik van signaal-ruis en signaaltype dat kan worden gebruikt om automatisch een masker te genereren. Als de gebruiker geen fluorescerende celmarkering kan opnemen die uniform is en een significante signaal-ruisverhouding heeft, moet het celmasker handmatig worden getekend.
Gebruikersgebaseerde analyse van exocytose is een tijdrovend proces en onderhevig aan persoonlijke vooroordelen, omdat gebeurtenissen niet altijd duidelijk gescheiden zijn van andere fluorescentie. Het gebruik van een geautomatiseerd analyseprogramma om exocytische gebeurtenissen op een onbevooroordete manier correct te identificeren en te analyseren, verhoogt de analyse-efficiëntie en verbetert de reproduceerbaarheid en strengheid.
Deze exocytische gebeurtenisdetectie werkt niet alleen voor het nauwkeurig vastleggen van pH-gevoelige fluorescentie in ontwikkelende neuronen, maar ook voor andere celtypen (Urbina et al., 2018). Of classificatie werkt voor andere celtypen, moet worden vastgesteld. Toekomstige toepassingen van deze techniek kunnen nuttig zijn bij synapsen, bij niet-neuronale celtypen, of bij nieuwe markers van exocytische blaasjes docking en fusie, zoals onlangs beschreven pHmScarlet16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren niets openbaar te maken.
Acknowledgments
We danken Dustin Revell en Reginald Edwards voor het testen van code en de GUI. De nationale instituten voor gezondheid ondersteunden dit onderzoek: waaronder R01NS112326 (SLG), R35GM135160 (SLG) en F31NS103586 (FLU).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | |
| R | R Core Team | https://www.r-project.org/ | |
| Rstudio | Rstudio, PBC | https://rstudio.com/ |
References
- Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Urbina, F. L., Gomez, S. M., Gupton, S. L. Spatiotemporal organization of exocytosis emerges during neuronal shape change. Journal of Cell Biology. 217 (3), 1113-1128 (2018).
- Urbina, F. L., et al. TRIM67 regulates exocytic mode and neuronal morphogenesis via SNAP47. Cell Reports. 34 (6), 108743 (2021).
- Alabi, A. A., Tsien, R. W. Perspectives on kiss-and-run: Role in exocytosis, endocytosis, and neurotransmission. Annual Review of Physiology. 75, 393-422 (2013).
- Albillos, A., et al. The exocytotic event in chromaffin cells revealed by patch amperometry. Nature. 389 (6650), 509-512 (1997).
- He, L., Wu, L. G. The debate on the kiss-and-run fusion at synapses. Trends in Neuroscience. 30 (9), 447-455 (2007).
- Elhamdani, A., Azizi, F., Artalejo, C. R. Double patch clamp reveals that transient fusion (kiss-and-run) is a major mechanism of secretion in calf adrenal chromaffin cells: high calcium shifts the mechanism from kiss-and-run to complete fusion. Journal of Neuroscience. 26 (11), 3030 (2006).
- Bowser, D. N., Khakh, B. S. Two forms of single-vesicle astrocyte exocytosis imaged with total internal reflection fluorescence microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (10), 4212-4217 (2007).
- Holroyd, P., Lang, T., Wenzel, D., De Camilli, P., Jahn, R. Imaging direct, dynamin-dependent recapture of fusing secretory granules on plasma membrane lawns from PC12 cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (26), 16806-16811 (2002).
- Wang, C. T., et al. Different domains of synaptotagmin control the choice between kiss-and-run and full fusion. Nature. 424 (6951), 943-947 (2003).
- Winkle, C. C., Hanlin, C. C., Gupton, S. L. Utilizing combined methodologies to define the role of plasma membrane delivery during axon branching and neuronal morphogenesis. Journal of Visualized Experiments. (109), e53743 (2016).
- Viesselmann, C., Ballweg, J., Lumbard, D., Dent, E. W. Nucleofection and primary culture of embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. Journal of Visualized Experiments. (47), e2373 (2011).
- Plooster, M., et al. TRIM9-dependent ubiquitination of DCC constrains kinase signaling, exocytosis, and axon branching. Molecular Biology of the Cell. 28 (18), 2374-2385 (2017).
- Urbina, F. L., Gupton, S. L. SNARE-mediated exocytosis in neuronal development. Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 133 (2020).
- Ripley, B. D. The second-order analysis of stationary point processes. Journal of Applied Probability. 13 (2), 255-266 (1976).
- Liu, A., et al. pHmScarlet is a pH-sensitive red fluorescent protein to monitor exocytosis docking and fusion steps. Nature Communication. 12 (1), 1413 (2021).
