Summary
हमने पीएच-संवेदनशील फ्लोरोसेंट जांच द्वारा चिह्नित एक्सोसाइटिक घटनाओं का पता लगाने के लिए स्वचालित कंप्यूटर विजन सॉफ्टवेयर विकसित किया है। यहां, हम संलयन घटनाओं का पता लगाने, संलयन के स्थानिक मापदंडों का विश्लेषण और प्रदर्शन करने और घटनाओं को अलग-अलग संलयन मोड में वर्गीकृत करने के लिए एक ग्राफिकल यूजर इंटरफेस और आरएसट्यूडियो के उपयोग को प्रदर्शित करते हैं।
Abstract
वेसिकल स्नेक प्रोटीन से जुड़े पीएच-सेंसिटिव जीएफपी (पीएचलूरिन) की टाइमलैप्स टीआईआरएफ माइक्रोस्कोपी सेल कल्चर में सिंगल वेसिकल एक्सोसाइटिक घटनाओं की कल्पना करने के लिए एक प्रभावी तरीका है। ऐसी घटनाओं के निष्पक्ष, कुशल पहचान और विश्लेषण करने के लिए, मैटलैब में कंप्यूटर-दृष्टि आधारित दृष्टिकोण विकसित और लागू किया गया था। विश्लेषण पाइपलाइन में सेल सेगमेंटेशन और एक्सोसाइटिक-इवेंट आइडेंटिफिकेशन एल्गोरिदम होता है। कंप्यूटर-दृष्टि दृष्टिकोण में एकल घटनाओं के कई मापदंडों की जांच करने के लिए उपकरण शामिल हैं, जिनमें फ्लोरेसेंस क्षय और पीक बीएफ/एफ के आधे जीवन के साथ-साथ एक्सोसाइटोसिस की आवृत्ति का संपूर्ण-कोशिका विश्लेषण शामिल है। इन और संलयन के अन्य मापदंडों का उपयोग अलग-अलग संलयन मोड को अलग करने के लिए वर्गीकरण दृष्टिकोण में किया जाता है। यहां एक नवनिर्मित जीयूआई शुरू से खत्म करने के लिए विश्लेषण पाइपलाइन करता है । आर स्टूडियो में रिप्ले के कश्मीर फ़ंक्शन के आगे अनुकूलन का उपयोग अंतरिक्ष और समय दोनों में संलयन घटनाओं के क्लस्टर, फैलाया, या यादृच्छिक घटना के बीच अंतर करने के लिए किया जाता है।
Introduction
VAMP-pHluorin निर्माण या ट्रांसफरिन रिसेप्टर (TfR)- pHuji निर्माण एक्सोसाइटिक घटनाओं के उत्कृष्ट मार्कर हैं, क्योंकि इन पीएच-संवेदनशील फ्लोरोफोरस को एसिड वेसिकल ल्यूमेन के भीतर बुझाया जाता है और वेसिकल और प्लाज्मा झिल्ली1के बीच संलयन ताकना खोलने पर तुरंत फ्लोरोरेस होता है। संलयन ताकना खोलने के बाद, फ्लोरेसेंस तेजी से क्षय, कुछ विषमता है कि संलयन घटना के बारे में जानकारी का पता चलता है के साथ । यहां, एक ग्राफिकल यूजर इंटरफेस (जीयूआई) एप्लिकेशन का वर्णन किया गया है जो स्वचालित रूप से एक्सोसाइटिक घटनाओं का पता लगाता है और विश्लेषण करता है। यह एप्लिकेशन उपयोगकर्ता को पीएच संवेदनशील मार्कर2 द्वारा प्रकट एक्सोसाइटिक घटनाओं का स्वचालित रूप से पता लगाने और प्रत्येक घटना से सुविधाओं को उत्पन्न करने की अनुमति देता है जिसका उपयोग वर्गीकरण उद्देश्यों के लिए किया जा सकता है3 (चित्रा 1A)। इसके अलावा, रिप्ले के के फ़ंक्शन का उपयोग करके एक्सोसाइटिक इवेंट क्लस्टरिंग का विश्लेषण वर्णित किया गया है।
एक्सोसाइटिक घटनाओं के विभिन्न एक्सोसाइटिक मोड में स्वचालित वर्गीकरण हाल ही में3बताया गया था । एक्सोसाइटोसिस के दो तरीके, फुल वेसिकल फ्यूजन (एफवीएफ) और चुंबन-एंड-रन फ्यूजन (केएनआर) एक्सोसाइटोसिस को पहले4,5,6,7बताया गया है । एफवीएफ के दौरान, फ्यूजन पोर फैलता है, और वेसिकल को प्लाज्मा झिल्ली में शामिल किया जाता है। केएनआर के दौरान, संलयन पोर क्षणिक रूप से खुलता है और फिर4,5,8,9,10को फिर से खोलता है। न्यूरॉन्स के विकास में एक्सोसाइटोसिस के चार तरीकों की पहचान की गई, दो एफवीएफ से संबंधित और दो केएनआर से संबंधित थे । यह काम दर्शाता है कि एफवीएफ और केएनआर दोनों को संलयन घटनाओं में आगे बढ़ाया जा सकता है जो फ्यूजन पोर खोलने या एक्सोसाइटिक घटनाओं के बाद फ्लोरेसेंस क्षय (एफवीएफआई और केएनआरआई) के लिए तुरंत आगे बढ़ते हैं जो फ्लोरेसेंस क्षय शुरू होने से पहले फ्यूजन पोर खोलने के बाद देरी का प्रदर्शन करते हैं (एफवीएफडी और केएनआरडी)(चित्रा 1 बी)। क्लासिफायर प्रत्येक संलयन घटना के लिए एक्सोसाइटोसिस की विधा की पहचान करता है। यहां इस विश्लेषण को एक जीयूआई में शामिल किया गया है जिसे विंडोज और मैक आधारित ऑपरेटिंग सिस्टम में मैटलैब में स्थापित किया जा सकता है। सभी विश्लेषण फ़ाइलें https://drive.google.com/drive/folders/1VCiO-thMEd4jz-tYEL8I4N1Rf_zjnOgB?usp=sharing पर पाई जा सकती हैं या
https://github.com/GuptonLab।
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Protocol
1. डेटासेट और निर्देशिका चुनें
- विश्लेषण के लिए डेटासेट का चयन करने के लिए, फ़ोल्डर पर नेविगेट करने के लिए फाइंड डेटासेट बटन(चित्रा 2A,लाल बॉक्स 1)पर क्लिक करें जहां डेटा जमा किया जाता है (जैसे, RawData फ़ोल्डर)। डेटाफाइल अपने आप डेटा फ़ाइलों को सूची के रूप में पॉप्युलेट कर देंगे. फोल्डर में एक से ज्यादा डाटासेट हो सकते हैं।
- चुनें निर्देशिका बटन पर क्लिक करें और निर्देशिका (जैसे, परीक्षण) का चयन करें जहां विश्लेषण फ़ाइलें जमा की जाएंगी(चित्रा 2A,लाल बॉक्स 2)। विश्लेषण बटन को धक्का दिए जाने पर इस निर्देशिका में फ़ोल्डर्स और समाप्त विश्लेषण फ़ाइलों के साथ-साथ मध्यवर्ती अस्थायी छवियों का एक सेट बनाया जाएगा। यदि कोई निर्देशिका नहीं चुनी जाती है तो त्रुटियों का उत्पादन किया जाएगा।
2. पिक्सेल का आकार और फ्रेमरेट सेट करें
- उपयुक्त फ्रेम दर और उपयुक्त "Framerate" या "पिक्सेल आकार" बॉक्स(चित्रा 2A,ग्रीन बॉक्स)में छवियों के पिक्सेल आकार में भरें । यदि कोई मान प्रदान नहीं किया जाता है (वे डिफ़ॉल्ट "0" के लिए सेट कर रहे हैं), तो कार्यक्रम फ्रेमरेट और पिक्सेल आकार के लिए फ़ाइल के साथ जुड़े मेटाडेटा खोज करेंगे । यदि ये मान नहीं मिल सकते हैं, तो प्रोग्राम माप के लिए प्रति-पिक्सेल और समय अंक के लिए प्रति-फ्रेम तक डिफ़ॉल्ट होगा।
नोट: दिए गए उदाहरण में, फ़्रेमरेट 100 है, और पिक्सेल का आकार 0.08 है।
3. मास्क चुनें या बनाएं
- फाइल डेटासेट सूची(चित्रा 2A,ब्लू बॉक्स)में डेटा के लिए स्वचालित रूप से सेल मास्क बनाने के लिए मास्क मेकर बटन का उपयोग करें। मास्क मेकर बटन का उपयोग करने पर, चुनी गई निर्देशिका में एक नया फ़ोल्डर मास्कफाइल्स कहा जाएगा। "भागो संकेतक" पीला हो जाएगा, जबकि चल रहा है और हरे रंग में लौटने जब पूरा हो गया ।
नोट: डेटा फ़ाइल सूची में प्रत्येक फ़ाइल के लिए एक मुखौटा छवि फ़ाइल के पहले 10 फ्रेम से बनाया जाएगा (या यदि 10 से कम छवि फ़ाइल में हैं तो सभी फ्रेम से) और उचित नामकरण योजना (नीचे वर्णित) का उपयोग करके मास्कफाइल्स फ़ोल्डर में जमा किया जाएगा। - सुनिश्चित करें कि मुखौटा फ़ाइलें स्वचालित रूप से मुखौटा फ़ाइलें सूची को पॉप्युलेट करें। उपयोगकर्ता सीधे विश्लेषण के लिए आगे बढ़ सकता है।
नोट: हमेशा नेत्रहीन मुखौटा फ़ाइलों की जांच करें और पुष्टि करें कि वे ब्याज के पूरे क्षेत्र पर कब्जा करते हैं। चयनित होने पर डेटा फ़ाइल और मास्क फ़ाइल का पहला फ्रेम यूआई पर प्रदर्शित किया जाता है। (चित्रा 2B)। मास्क मेकर कम सिग्नल-टू-शोर के मामले में त्रुटियों का उत्पादन कर सकता है, इसलिए यह मान्य करना कि मुखौटा फाइलें गुणवत्ता नियंत्रण के लिए महत्वपूर्ण हैं। - मास्क मेकर का उपयोग करने के विकल्प के रूप में, यदि छवियों के शोर का संकेत अपर्याप्त है, तो इमेजजे में मैन्युअल रूप से मास्क बनाएं।
- सबसे पहले, इमेजजे(चित्रा 3A)में कच्ची छवि फ़ाइल खोलें।
- बहुभुज चयन बटन पर क्लिक करें और सेल के चारों ओर एक मुखौटा आकर्षित करने के लिए क्लिक करें। एक बार समाप्त होने के बाद, बहुभुज को पूरा करने के लिए अंतिम बिंदु पर डबल क्लिक करें।
- एक बार समाप्त हो जाने के बाद, | संपादित करने के लिए नेविगेट करें चयन | मास्क (चित्रा 3B)बनाएं। पॉलीगॉन ड्राइंग के आधार पर एक नया उलटा मुखौटा बनाया जाएगा। चुनी हुई निर्देशिका में एक नामित मास्कफाइल्स फ़ोल्डर में मास्क बचाएं। मुखौटा फ़ाइल नामकरण योजना को "_mask_file" के बाद संबंधित व्यक्तिगत डेटा फ़ाइलों से मेल मिलान करना चाहिए। उदाहरण के लिए, यदि किसी डेटा फ़ाइल का नाम "VAMP2_488_WT_1.tif" है, तो संबंधित मुखौटा फ़ाइल का नाम "VAMP2_488_WT_1_mask_file.tif" होना चाहिए।
- जमा कस्टम मास्क फ़ाइलों के चुने हुए फ़ोल्डर पर नेविगेट करने के लिए खोजें मास्कफाइल बटन का उपयोग करें। मास्क एक सूची के रूप में मुखौटा फ़ाइलों को आबाद करेगा।
नोट: विश्लेषण चलाने से पहले हर डेटा फ़ाइल के लिए एक मुखौटा होना महत्वपूर्ण है।
4. विश्लेषण और सुविधा निष्कर्षण
- निर्देशिका चुने जाने और डेटा फाइल्स सूची और मास्क फाइल्स सूची के आबाद होने के बाद, विश्लेषण बटन(चित्रा 4A)पर क्लिक करें। यदि एक्सोसाइटिक घटनाओं के वर्गीकरण की आवश्यकता है, तो चरण 5 पर जाएं।
नोट: विश्लेषण बटन क्लिक डेटा का विश्लेषण करने के लिए स्वचालित कार्यों की एक श्रृंखला का प्रदर्शन करेगा। यह विश्लेषण डेटा जमा करने के लिए चुना निर्देशिका में व्यक्तिगत फ़ोल्डर पैदा करेगा। दौड़ते समय, "रन इंडिकेटर" हरे से पीले रंग में बदल जाएगा(चित्रा 4A,लाल बॉक्स)। विश्लेषण समाप्त होने के बाद, यह वापस हरे रंग में बदल जाएगा। - प्रत्येक डेटाफाइल(चित्रा 4C)के अनुसार नामित विश्लेषण फ़ाइलों के पूर्ण सेट (साथ ही सुविधा निष्कर्षण फ़ाइलों, वर्गीकरण में उपयोग की जाने वाली सुविधा निष्कर्षण फ़ाइलों) के साथ एक डेटाफाइल फ़ोल्डर(चित्रा 4B)का पता लगाएं।
नोट: इन विश्लेषण फ़ाइलों का विवरण प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग में नीचे शामिल किया गया है।
5. एक्सोसाइटिक घटनाओं का वर्गीकरण
- स्वचालित पता लगाने के साथ एक्सोसाइटिक घटनाओं का एक साथ वर्गीकरण करने के लिए, विश्लेषण बटन पर क्लिक करने से पहले वर्गीकरण चेकबॉक्स की जांच करें। प्रत्येक एक्सोसाइटिक इवेंट के लिए, प्रत्येक कक्षा के लिए 0-1 के बीच एक संभावना स्कोर आवंटित करें। एक एक्सोसाइटिक घटना को चार वर्गों में से एक के रूप में वर्गीकृत माना जाता है यदि उस वर्ग के लिए संभावना स्कोर ०.५ > है ।
नोट: एक बार विश्लेषण पूरा हो जाने के बाद, चुना गई निर्देशिका के भीतर एक नया डेटा फ़ाइल फ़ोल्डर दिखाई देगा। फ़ोल्डर में प्रत्येक छवि फ़ाइल के अनुरूप विश्लेषण फ़ाइलें होंगी।
6. रिप्ले के के मूल्यों का उपयोग करके एक्सोसाइटोसिस का स्थानिकतापूर्ण विश्लेषण
- एक अलग "न्यूराइट" और "सोमा" मुखौटा फ़ाइल बनाएं। सबसे पहले सोमा को न्यूट्रिशन से सेगमेंट करें। न्यूराइट्स से सोमा को खंडित करने के लिए कोई निष्पक्ष तरीका नहीं है, इसलिए उपयोगकर्ता को कंडीशनिंग प्रयोग के लिए अंधा किया जाना चाहिए और सबसे अच्छा निर्णय का उपयोग करना चाहिए; कोई स्पष्ट न्यूराइट एक्सटेंशन के साथ एक अंडाकार का सुझाव दिया जाता है।
- ओपन इमेजजे/फिजी ।
- मास्क फ़ाइल को खींचें-और छोड़ें या फ़ाइल | का उपयोग करें खोलें और फिर मास्क फाइल का चयन करें।
- रंग बीनने वाले उपकरण का उपयोग करें और रंग को काले रंग में सेट करने के लिए मुखौटा की पृष्ठभूमि में किसी भी काले पिक्सेल पर क्लिक करें।
- सोमा के चारों ओर एक रूपरेखा आकर्षित करने के लिए बहुभुज-चयन उपकरण या फ्रीहैंड का उपयोग करें, इसे न्यूराइट्स से अलग करें। इसके लिए मैन्युअल निर्णय लेने की आवश्यकता होती है।
- क्लिक करें एडिट | चयन | मास्क बनाओ। एक नई छवि छवि के बाकी हिस्सों से खंडित परिक्रमा सोमा के साथ खुलेगा। इससे सोमा मास्क फाइल बनाई जाएगी।
- तैयार क्षेत्र को स्थानांतरित किए बिना, मूल मुखौटा फ़ाइल के हेडर पर क्लिक करें।
- क्लिक करें एडिट | परिक्रमा करने वाले सोमा को भरने के लिए भरें ताकि केवल न्यूराइट्स ही मास्क बने रहें।
- एक बार अलग-अलग न्यूराइट और मास्क फ़ाइलें प्राप्त होने के बाद, दोनों मुखौटा फ़ाइलों को सहेजें।
- मतलैब में "neurite_2D_network" खोलें।
- MATLAB में, सभी विश्लेषण डेटा के साथ निर्देशिका के लिए नेविगेट।
- रास्ता बदलें "मुखौटा नाम" न्यूराइट मास्क के नाम पर, यानी, "MaskFiles/VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_neurite.tif"
- "csv_file_name" को बदलें जहां fluorescent_traces.csv फ़ाइल स्थित है, यानी, "MaskFiles/VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_neurite.csv"।
- न्यूराइट मास्क फ़ाइल को कंकालित करने के लिए रन पर क्लिक करें। यह न्यूराइट मास्क फ़ाइल का एक कंकाल संस्करण बनाता है और इसे मास्कफाइल्स फ़ोल्डर के नीचे सीएसवी फ़ाइल के रूप में जमा करता है।
- इसके बाद, सोमा के लिए सीएसवी फाइल जेनरेट करें। मतलैब में "CSV_mask_creator.m" खोलें।
- सोमा मुखौटा के नाम के लिए "मुखौटा नाम" के लिए रास्ते में रखो, यानी, "MaskFiles/VAMP2phLuorin_488_wt_4_mask_file_soma.tif
- "लेखनमैट्रिक्स" को सीएसवी फाइलनेम में बदलें, यानी "मास्कफाइल्स/VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_soma.csv"
- रन परक्लिक करें । इससे नई VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_soma.csv फाइल बनती है।
- हर मुखौटा फ़ाइल के लिए 6.14 दोहराएं।
7. ̈स्टूडियो सेटअप
- आरएसट्यूडियो खोलें और ripleys_k_analysis खोलें। आर फाइल।
- टूल्स | पर जाकर आरएफटीयूडियो में पैकेज "स्पैटैट" स्थापित करें स्थापित करने के बाद "स्पैटस्टेट" में संकुल और टाइपिंग स्थापित करें।
नोट: यह केवल एक बार प्रति Rstudio स्थापना प्रदर्शन की जरूरत है । - प्रत्येक सत्र की शुरुआत में पुस्तकालय को चलाएं।
- इस मामले में दो मुख्य चर पर ध्यान दें: "neuron_mask" और "neuron_datapoints." न्यूरॉन मास्क मुखौटा फ़ाइलों को चलाने के लिए मुखौटा फ़ाइलों के सेट करने के लिए अंक, यानी, सोमा मुखौटा फ़ाइलें।
नोट: सभी सोमा मुखौटा फ़ाइलों को एक साथ चलाएं, न्यूराइट मास्क फ़ाइलों से अलग, और इसके विपरीत। - प्रत्येक न्यूरॉन्स का विश्लेषण करने के लिए मुखौटा फ़ाइलों के .csv में पढ़ें।
- अतिरिक्त neuron_mask_n + 1 की नकल करके एक बार में कई फाइलें चलाएं। यह धारा 8 में वर्णित स्क्रिप्ट का उपयोग करके रिप्ले के विश्लेषण को एक साथ इकट्ठा करने की अनुमति देगा।
- अब दूसरे चर की जांच करें, "neuron_datapoints"।
- में पढ़ें । X_fluorescent_traces.csv"विश्लेषण कार्यक्रम द्वारा उत्पन्न फ़ाइल (सभी extracted_R फ़ाइल की सुविधाओं द्वारा) एक्स, वाई, एक्सोसाइटिक घटनाओं की स्थिति के साथ-साथ 2डी नेटवर्क के लिए एक्स, वाई पदों की न्यूट्रिट-विशिष्ट फ़ाइल भी। यह "neuron_datapoints" स्थिति में चला जाता है ।
- RStudio में कोड | का चयन करें भागो क्षेत्र | सभी चलातेहैं । यह समूहित रिप्ले के कश्मीर मूल्यों के साथ-साथ घनत्व भूखंडों सहित कई भूखंडों को उत्पन्न करता है।
- एक्सपोर्ट | जाकर प्लॉट बचाएं | के रूप में छवि बचाओ उपयुक्त छवि प्रारूप और निर्देशिका का चयन करें, और इनपुट उपयुक्त फ़ाइल नाम, तो सेवपर क्लिक करें ।
नोट: हीटमैप्स के लिए प्लॉटिंग फ़ंक्शन को स्क्रिप्ट में "प्लॉट (घनत्व (soma_data,0.4)) का उपयोग करके कहा जाता है। संख्या "0.4" यहां का प्रतिनिधित्व करता है कि कैसे चिकना-बाहर घनत्व समारोह होना चाहिए । इसे सार्थक तरीके से उपयोगकर्ता डेटा को फिट करने के लिए बदला जा सकता है, लेकिन यदि विभिन्न हीटमैप्स के बीच तुलना की जानी है, तो संख्या उनके बीच समान होनी चाहिए। - आरएसट्यूडियो से निर्यात या सहेजें छवि। यदि हीटमैप को और संपादन की आवश्यकता होती है, तो एक उपयुक्त फ़ाइल प्रकार (एसवीजी या ईपीएस) चुनें।
8. रिप्ले का विश्लेषण
नोट: Ripleys_k_analysis । आर फ़ाइल भी स्वचालित रूप से रिप्ले के कश्मीर मूल्य भूखंडों उत्पन्न। पूरी स्क्रिप्ट को चलाने से नीचे दिए गए कार्य स्वत ही चलेंगे, लेकिन यदि कोई स्क्रिप्ट के प्रत्येक भाग को व्यक्तिगत रूप से चलाना चाहता है या विश्लेषण में परिवर्तन करना चाहता है तो इसे विस्तार से शामिल किया गया है।
- सबसे पहले, प्रत्येक सेल के लिए लिफाफा समारोह चलाएं। इस फ़ंक्शन ने एक्सोसाइटिक इवेंट पॉइंट पैटर्न के रिप्ले के K मूल्य का परीक्षण करने के लिए पूर्ण स्थानिक यादृच्छिकता (सीएसआर) का अनुकरण किया।
Data_envelope_1 = लिफाफा (soma_data_1, Kest, nsim = 19, savefuns = सच)
Data_envelope_2 = लिफाफा (soma_data_2, Kest, nsim = 19, savefuns = सच) - इसके बाद, इन लिफाफों को एक साथ पूल करें और समूह के लिए सीएसआर का एक अनुमान बनाएं:
Pool_csr = पूल (Data_envelope_1, Data_envelop_2,...)
इसके बाद, सभी डेटा बिंदुओं के लिए रिप्ले के फ़ंक्शन चलाएं।
Data_ripleys_k_1 = Kest (soma_data_1, अनुपात = सच)
Data_ripleys_k_2 = Kest (soma_data_2, अनुपात = सच) - एक बार पूरा होने के बाद, रिप्ले के कश्मीर मूल्यों को एक साथ पूल करें और निम्नलिखित कमांड के साथ अपने आत्मविश्वास के अंतराल को बूटस्ट्रैप करें:
डेटा पूल = पूल (Data_ripleys_k_1, Data_ripleys_k_2,...) - निम्नलिखित आदेश के साथ बूटस्ट्रैप:
Final_Ripleys_K = varblock (मज़ा = Kest, Data_pool) - डेटा प्लॉट करें।
- यदि एक कठिन सांख्यिकीय अंतर की आवश्यकता है, तो पॉइंट पैटर्न के समूहों के बीच अंतर के लिए परीक्षण करने के लिए छात्रीकृत क्रमपरिवर्तन को स्पैटैट पैकेज में शामिल किया गया है:
Test_difference = studpermu.test (all_points_to_test, exocytic_events ~ समूह, nperm = np) ।
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Representative Results
यहां जीयूआई(चित्रा 2 ए)का उपयोग तीन VAMP2-pHluorin से एक्सोसाइटिक घटनाओं का विश्लेषण करने के लिए किया गया था, जो टीआईआरएफ (कुल आंतरिक प्रतिबिंब फ्लोरेसेंस) माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके 3 DIV पर न्यूरॉन्स व्यक्त करते हैं। E15.5 कॉर्टिकल न्यूरॉन्स को अलग-थलग कर दिया गया था, जिसके बाद VAMP2-pHluorin के साथ ट्रांसफैक्शन और विंकल एट अल, 2016और Viesselmann एट अल में उल्लिखित प्रोटोकॉल का उपयोग करकेचढ़ाना। इमेजिंग मापदंडों की पद्धति के रूप में Urbina एट अल में उल्लिखित है, 20182. संक्षेप में, टीआईआरएफ माइक्रोस्कोपी का उपयोग न्यूरॉन्स की बेसल प्लाज्मा झिल्ली को 2 मिनट के लिए हर 100 एमएस की छवि के लिए किया गया था। चित्रा 2, चित्रा 3, चित्रा 4 एक्सोसाइटिक घटनाओं का विश्लेषण करने के लिए एक कदम-दर-कदम गाइड दिखाता है। जिस फ़ोल्डर में न्यूरॉन छवियां स्थित हैं, उनका चयन किया जाता है, और अंतिम विश्लेषण डेटाफाइल जमा करने के लिए एक निर्देशिका(चित्रा 2 ए)चुना जाता है। मास्कमेकर फ़ंक्शन का उपयोग करके, न्यूरॉन्स के लिए एक मास्क उत्पन्न होता है, जिसका जीयूआई(चित्रा 2 B)में निरीक्षण किया जाता है। इस उदाहरण में, सेल मास्क अच्छी गुणवत्ता का है, और विश्लेषण आगे बढ़ सकता है। एक मुखौटा अपर्याप्त होना चाहिए, एक मुखौटा ImageJ(चित्रा 3)में बनाया जा सकता है । मास्कमेकर फ़ंक्शन का उपयोग करने या इमेजजे में मास्क बनाने और निर्देशिका का चयन करने के बाद जहां मुखौटा फाइलें स्थित हैं, विश्लेषण किया जाता है(चित्र 4 ए)। विश्लेषण समाप्त होने पर डेटाफाइल फ़ोल्डर में परिणाम उत्पन्न होते हैं (पीला संकेतक हरे रंग में वापस बदलता है)(चित्र 4बी)।
उपलब्ध कराए गए कच्चे डेटा फाइलों के अनुसार डेटाफाइल स्वचालित रूप से उत्पन्न और नामित किए जाते हैं।
यह मानते हुए कि डेटाफाइल का नाम X है:
X_tracking: इस फ़ाइल में प्रत्येक ईवेंट की एक्स, वाई स्थिति और फ्रेम नंबर के साथ-साथ बाउंडिंग बॉक्स शामिल हैं जिनका उपयोग प्रत्येक ईवेंट के आसपास बक्से खींचने के लिए किया जा सकता है। आयु प्रारंभिक पता लगाने से पहले फ्रेम की संख्या को इंगित करती है जहां एक घटना एक अलग गॉसियन समय तक है। यदि वर्गीकरण की जांच की जाती है, तो वर्गीकरण परिणाम इस फ़ाइल में दिखाई देंगे, जो चार वर्गों में से एक से संबंधित एक्सोसाइटिक घटना की संभावना को इंगित करता है। यदि संभावना .5 से अधिक है, और अन्य संभावनाओं की तुलना में अधिक है, तो एक एक्सोसाइटिक वर्ग चुना गया था।
X_fluorescent निशान: इस फ़ाइल में प्रत्येक ईवेंट की एक्स, वाई स्थिति और फ्रेम नंबर शामिल हैं। इसके अलावा, इसमें प्रत्येक घटना के आसपास रुचि के क्षेत्र में फ्लोरोसेंट तीव्रता के उपाय शामिल हैं, जो प्रत्येक घटना के लिए पीक 2 सेकंड से पहले और 10 सेकंड के बाद (टाइमपॉइंट कॉलम द्वारा इंगित) हैं।
X_cell_statistics: इस फ़ाइल में सेल क्षेत्र, कुल छवि समय, और प्रत्येक सेल (ईवेंट/मिमी2/मिनटमें) के लिए एक्सोसाइटिक घटनाओं की स्वचालित रूप से गणना की गई आवृत्ति शामिल है।
सुविधा निष्कर्षण फ़ाइलों में शामिल हैं:
X_contrast: वैषम्य। पूरी छवि पर एक पिक्सेल और उसके पड़ोसी के बीच तीव्रता विपरीत का एक उपाय।
X_correlation: सहसंबंध। कैसे सहसंबद्ध एक पिक्सेल का एक उपाय पूरी छवि पर अपने पड़ोसी के लिए है ।
X_energy कुल ऊर्जा। पिक्सेल तीव्रता के चुकता राशि के रूप में परिभाषित किया गया।
X_homogeneity आरओआई तिरछे को आरओआई में तत्वों के वितरण की निकटता को मापता है।
X_ring_fluorescence: सीमा पिक्सल का औसत फ्लोरेसेंस।
X_SD: मानक विचलन। इसे आरओआई के मानक विचलन के रूप में परिभाषित किया गया है।
प्रत्येक एक्सोसाइटिक वर्ग से एसईएम ± औसत फ्लोरेसेंस निशान के उदाहरणों को X_fluorescent ट्रेस फ़ाइल(चित्रा 5A)से प्लॉट किया गया था। Cell_statistics फ़ाइल का उपयोग करते हुए, प्रत्येक कक्षा के लिए एक्सोसाइटोसिस की आवृत्ति प्रत्येक न्यूरॉन(चित्रा 5B)के लिए प्लॉट की गई थी। क्लासिफिकेशन चेकबॉक्स क्लिक करने के साथ, कार्यक्रम प्रत्येक एक्सोसाइटिक इवेंट को एक वर्ग को असाइन करता है, जिसे चित्र 5सीमें प्लॉट किया गया था। वर्गीकरण के बाद, रिप्ले के कश्मीर विश्लेषण कोड का उपयोग यह निर्धारित करने के लिए किया गया था कि क्या एक्सोसाइटिक घटनाएं यादृच्छिक, क्लस्टर या अंतरिक्ष और समय में फैलाई गई हैं। एक्सोसाइटिक घटनाओं(चित्रा 5 डी)के स्थानीयकरण के घनत्व हीटमैप उत्पन्न किए गए थे। ये न्यूरॉन के अलग-अलग क्षेत्रों में अपेक्षित संकुल "हॉटस्पॉट" का पता चलता है। इसके बाद, रिप्ले का कश्मीर विश्लेषण सोमा, न्यूराइट और क्लस्टरिंग के लिए समय के साथ किया गया था(चित्रा 5E)। रिप्ले के कश्मीर मूल्य और एसईएम (ब्लैक लाइन और ब्लू छायांकित क्षेत्र, क्रमशः) पूर्ण स्थानिक यादृच्छिकता (लाल बिंदीदार रेखा) की रेखा से ऊपर उठते हैं, जो सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण क्लस्टरिंग का सुझाव देते हैं।
चित्र 1:एक्सोसाइटिक विश्लेषण और वर्गीकरण का प्रतिनिधित्व। (ए)जीयूआई के लिए विश्लेषण पाइपलाइन की रूपरेखा। एक्सोसाइटिक घटनाओं की पहचान और ट्रैक करने से पहले कोशिकाओं को पृष्ठभूमि से खंडित किया जाता है। चोटी एएफएफ/एफ और टी1/2 जैसे मापदंडों की गणना इवेंट प्री और पोस्ट-फ्यूजन के आसपास एक आरओआई में एक्सोसाइटोसिस के फ्लोरोसेंट निशान से की जाती है। (ख)एक्सोसाइटोसिस के चार तरीकों का चित्रण और उदाहरण छवि असेंबल। संलयन के बाद, घटनाओं FVF या KNR (FVFi और KNRi) के लिए तात्कालिक आगे बढ़ सकते हैं, या एक देरी FVF या KNR (FVFd और KNRd) के लिए संलयन भाग्य की शुरुआत से पहले मौजूद हो सकता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2:कदम से कदम उदाहरण विश्लेषण। (A)पहले, डेटासेट (1., लाल बॉक्स) चुना जाता है, और एक निर्देशिका को विश्लेषण फ़ाइलों (2., लाल बॉक्स) को रखने के लिए चुना जाता है। इसके बाद, फ्रेमरेट और पिक्सेल का आकार निर्दिष्ट (3., ग्रीन बॉक्स) है। यहां 0.08 माइक्रोमीटर पिक्सल साइज और 100 एमएस फ्रेमरेट का इस्तेमाल किया गया। मास्कमेकर फ़ंक्शन बटन को फिर धक्का दिया जाता है (4., नीला बॉक्स)। डेटासेट में प्रत्येक छवि फ़ाइल के लिए एक मुखौटा फ़ाइल युक्त चुने हुए निर्देशिका में "मास्कफाइल्स" नामक एक फ़ोल्डर स्वचालित रूप से बनाया जाता है। (ख)जब डेटासेट लोड किए जाते हैं, तो डेटा फ़ाइल का चयन करना और/या मुखौटा फ़ाइल तुलना में आसानी (ग्रीन बॉक्स) के लिए छवियों का पहला फ्रेम प्रदर्शित करेगा । मुखौटा फ़ाइलें पूरी तरह से सही नहीं हो सकती हैं; इस मुखौटा फ़ाइल को त्रुटियों के लिए ठीक किया जा सकता है, या एक नई मुखौटा फ़ाइल मैन्युअल रूप से बनाई जा सकती है कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3:ImageJ में मैन्युअल रूप से एक मुखौटा फ़ाइल बनाना। (A)सबसे पहले, एक मुखौटा बनाने के लिए फ़ाइल खोलें। "बहुभुज चयन" बटन लाल रंग में उल्लिखित है। सेल के किनारे के चारों ओर क्लिक करके, एक बहुभुज रूपरेखा बनाई जाती है। (ख)पॉलीगॉन आउटलाइन से मास्क कैसे बनाएं। संपादित | का चयन करके चयन | मुखौटा बनाएं,बहुभुज (सही छवि) से एक काला और सफेद मुखौटा बनाया जाएगा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 4:एक्सोसाइटिक घटनाओं का विश्लेषण। (ए)विश्लेषण बटन का प्रदर्शन (ऑरेंज बॉक्स) और एक चल रहे विश्लेषण। ध्यान दें कि रन इंडिकेटर पीला हो जाता है जबकि एक विश्लेषण किया जा रहा है। (ख)उदाहरण विश्लेषण फाइलें जो विश्लेषण पूरा होने पर चुनी गई निर्देशिका में बनाई जाती हैं। डेटाफाइल में एक्सोसाइटिक इवेंट की सभी विश्लेषण फाइलें होती हैं। (ग)डेटाफाइल्स फोल्डर में उत्पन्न विश्लेषण फाइलें। रंग बक्से बाद की छवियों में खुली फाइलों का प्रतिनिधित्व करते हैं। (घ)तीन खुली फाइलें, "X_fluorescent_traces.csv" (लाल) और "X_Cell_statistics" (हरा), और "X_tracking" (नीला)। फ्लोरोसेंट निशान में प्रत्येक घटना की एक्स, वाई स्थिति और फ्रेम संख्या, साथ ही प्रत्येक आरओआई पर फ्लोरोसेंट तीव्रता होती है। Cell_statistics में पूरे सेल एक्सोसाइटिक आंकड़ों की सारांश जानकारी होती है जैसे एक्सोसाइटोसिस की आवृत्ति। X_tracking में प्रत्येक एक्सोसाइटिक घटना के लिए स्थिति और समय की जानकारी के साथ-साथ प्रत्येक घटना के लिए एक्सोसाइटोसिस के प्रत्येक वर्ग की संभावना होती है, जो 0-1 के बीच एक संख्या के रूप में दर्शाया जाता है (>0.5 इंगित करता है कि एक घटना एक विशेष वर्ग से संबंधित है)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 5:प्रतिनिधि परिणाम। (A)प्रत्येक एक्सोसाइटिक क्लास से औसत फ्लोरेसेंस निशान +/-एसईएम ।(B)प्रत्येक एक्सोसाइटिक क्लास के लिए तीन मुरीन कॉर्टिकल न्यूरॉन्स के लिए प्लॉट की गई घटनाओं की आवृत्ति । इन डेटा मूल्यों को "X_tracking" में सौंपे गए वर्गों का उपयोग करके "X_Cell_statistics" से प्लॉट किया गया था। (ग)ए में उपयोग की जाने वाली तीन कोशिकाओं के लिए एक्सोसाइटोसिस की कक्षाओं का वितरण)। यहां, प्रत्येक मोड का अनुपात प्लॉट किया जाता है। (घ)प्रोटोकॉल के रिप्ले के विश्लेषण भाग में उत्पन्न होने वाली एक्सोसाइटिक घटनाओं की घनत्व साजिश। यह जहां घटनाओं होने वाली है की स्थानिक संभावना के एक "गर्मी नक्शा" के रूप में व्याख्या की जा सकती है । (ई)रिप्ले के तीन कोशिकाओं का विश्लेषण ए के लिए इस्तेमाल किया) और बी) । लाल रेखा इंगित करती है कि एक्सोसाइटिक घटनाओं का पूरी तरह से स्थानिक रूप से यादृच्छिक वितरण क्या मूल्य होगा। काली रेखा इस उदाहरण में तीन कोशिकाओं के लिए कुल रिप्ले के कश्मीर मूल्य को इंगित करती है, और नीले रंग का छायांकित क्षेत्र आत्मविश्वास अंतराल का प्रतिनिधित्व करता है। यहां, छायांकित क्षेत्र विशेष रूप से ~ 0.25-1 माइक्रोन के बीच पूर्ण स्थानिक यादृच्छिकता की रेखा से बाहर हो जाता है, जो सुझाव देता है कि बाहरी घटनाओं को उन दूरियों पर संकुलित किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
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Discussion
एक्सोसाइटिक डिटेक्शन और एनालिसिस सॉफ्टवेयर का उपयोग करते समय, कृपया विचार करें कि कार्यक्रम केवल इनपुट के रूप में हानिरहित संपीड़न .tif फ़ाइलों को स्वीकार करता है। .tif इमेज फ़ाइलें 8-बिट, 16-बिट, या 32-बिट ग्रेस्केल (एकल चैनल) छवियां हो सकती हैं। इनपुट से पहले अन्य छवि प्रारूपों को इन प्रकारों में से एक में परिवर्तित किया जाना चाहिए। संदर्भ के लिए, यहां उपयोग किए जाने वाले उदाहरण 16-बिट ग्रेस्केल छवियां हैं।
स्वचालित पहचान प्रक्रिया में निहित, टाइमलैप्स छवि सेट स्वचालित पृष्ठभूमि घटाव और फोटोब्लैचिंग सुधार के लिए संसाधित किए जाते हैं। पृष्ठभूमि घटाव के लिए, मुखौटा फ़ाइल के नकाबपोश क्षेत्र के बाहर पिक्सल पूरी छवि के टाइमलैप्स पर औसत होते हैं, और औसत मूल्य छवि सेट से घटाया जाता है। फोटोब्लेचिंग सुधार के लिए, वीडियो के दौरान मुखौटा में पिक्सेल के औसत फ्लोरेसेंस पर मोनो-एक्सपोनेन्शियल क्षय फिट लागू किया जाता है, जिसमें सही तीव्रता को इस प्रकार समायोजित किया जाता है:
सही तीव्रता = (समय पर तीव्रता टी) ÷ exp-k× नहीं जहां कश्मीर = क्षय स्थिर
इसलिए, इनपुट से पहले कोई प्री-प्रोसेसिंग आवश्यक नहीं है। हालांकि, ये प्रक्रियाएं पृष्ठभूमि से सेल को प्रभावी ढंग से अलग करने के लिए छवि मास्क पर गंभीर रूप से भरोसा करती हैं, और इस प्रकार अच्छे परिणामों के लिए एक उचित सेल मास्क आवश्यक है।
स्वचालित सेल मास्क निर्माता को अच्छा प्रदर्शन करने के लिए पर्याप्त सिग्नल-टू-शोर अनुपात (आदर्श रूप से, औसत पृष्ठभूमि सिग्नल के मानक विचलन को कम से कम 2x) के साथ एक समान संकेत की आवश्यकता होती है। अनुभवजन्य रूप से, सीएएक्स बॉक्स को फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ टैग किया गया है, जो प्रीनिलेशन पर प्लाज्मा झिल्ली में सम्मिलित करता है, अच्छी तरह से काम करता है। इस बात की कोई आवश्यकता नहीं है कि सिग्नल को एक्सोसाइटोसिस के टाइमलैप्स इमेजिंग में बनाए रखा जा सकता है, क्योंकि अनुक्रम के पहले 10 फ्रेम में उच्च संकेत से एक उपयुक्त मुखौटा बनाया जा सकता है। हालांकि, यदि इमेजिंग प्रतिमान के दौरान सेल आकृति विज्ञान में काफी परिवर्तन होता है, तो देखभाल की जानी चाहिए।
स्वचालित डिटेक्शन सॉफ्टवेयर का उपयोग करते समय, सटीक अस्थायी और स्थानिक आउटपुट के लिए फ्रेमरेट और पिक्सेल आकार शामिल करें। यदि कोई फ्रेमरेट या पिक्सेल आकार घोषित नहीं किया जाता है, तो आउटपुट प्रति-पिक्सेल और प्रति-फ्रेम होगा। एक नियम के अंगूठे के रूप में, न्यूरॉन्स के विकास में वेसिकल व्यास ~ 100 एनएम13के पैमाने पर हैं, और इस प्रकार घटनाओं का स्वचालित पता लगाने के आकार में इसी तरह के वेसिकल्स के लिए काम कर सकते हैं। जैसा कि यह खड़ा है, वेसिकल्स के आकार पर कोई कठिन सीमा नहीं है जिसका पता लगाया जा सकता है (पिक्सेल क्षेत्र द्वारा), क्योंकि स्वचालित पता लगाने गॉसियन चौड़ाई की एक बड़ी श्रृंखला पर गॉसियन के आकार की तीव्रता पर निर्भर करता है। पिक्सेल की चौड़ाई से छोटे वेसिकल्स के फ्यूजन का सही पता लगाया जा सकता है अगर घटना की तीव्रता 2x के सिग्नल-टू-शोर मापदंड को पूरा करती है तो औसत पृष्ठभूमि सिग्नल का मानक विचलन होता है क्योंकि फ्लोरेसेंस विवर्तन कई पिक्सेल पर फैलता है।
यह कार्यक्रम न्यूरॉन्स के विकास में एक्सोसाइटिक घटनाओं का पता लगाने के लिए विकसित किया गया था। हालांकि, सॉफ्टवेयर का फायदा अन्य सेल लाइनों2में एक्सोसाइटिक घटनाओं का सफलतापूर्वक पता लगाने के लिए किया गया है, जो यह दर्शाता है कि डिटेक्शन एल्गोरिदम मजबूत है। यद्यपि हमने गैर-न्यूरोनल सेल प्रकारों में एक्सोसाइटिक घटनाओं का पता लगाने के लिए सॉफ़्टवेयर का उपयोग किया है, सेल प्रकार14 के बीच एक्सोसाइटिक इवेंट मोड में अंतर से संकेत मिलता है कि वर्गीकरण एल्गोरिदम अन्य सेल प्रकारों के लिए उपयुक्त नहीं हो सकता है। न्यूरॉन्स के विकास में एक्सोसाइटिक घटनाओं को मूल रूप से तीन अलग-अलग तरीकों का उपयोग करके वर्गीकृत किया गया था: पदानुक्रमित क्लस्टरिंग, डायनेमिक टाइम वारिंग, और प्रिंसिपल कंपोनेंट एनालिसिस (पीसीए), चार अलग-अलग वर्गों का खुलासा3। यहां सभी तीन वर्गीकृत जीयूआई में नियोजित हैं ताकि एक्सोसाइटिक घटनाओं को इन स्थापित चार वर्गों में से एक में वर्गीकृत किया जा सके। प्रत्येक एक्सोसाइटिक घटना के लिए, चार संभावित कक्षाओं में से प्रत्येक के लिए 0-1 के बीच एक संभावना स्कोर सौंपा जाता है। 0.5 > संभावना स्कोर वाले किसी भी वर्ग को उस वर्ग का माना जाता है। इस वर्गीकरण का उपयोग केवल आज तक न्यूरॉन्स विकसित करने में किया गया है। क्या ये कक्षाएं अन्य सेल प्रकारों में मौजूद हैं या बाद में न्यूरॉन्स में विकास के समय बिंदुओं का पता नहीं है। किसी भी वर्ग के लिए <0.5 की संभावना स्कोर के साथ बड़ी संख्या में घटनाओं का सुझाव होगा कि वर्गीकरण प्रक्रिया वर्तमान में मूल्यांकन की जा रही एक्सोसाइटिक घटनाओं के लिए उपयुक्त नहीं हो सकती है। यदि विभिन्न सेल प्रकारों की एक्सोसाइटिक घटनाओं को कम संभावना स्कोर सौंपे जाते हैं, तो यह सुझाव देगा कि एक्सोसाइटोसिस के नए या वैकल्पिक तरीकों के रूप में डी नोवो वर्गीकरण की आवश्यकता है। यहां उपयोग किए जाने वाले समान वर्गीकरण विधियों को स्वचालित रूप से पता लगाए गए एक्सोसाइटिक घटनाओं पर लागू करने की आवश्यकता होगी।
एक्सोसाइटिक घटनाओं के स्थानिक और लौकिक क्लस्टरिंग का पता लगाने के लिए, रिप्ले के कश्मीर विश्लेषण15 का शोषण किया जाता है। न्यूरॉन्स के लिए क्लस्टरिंग का विश्लेषण तीन अलग विश्लेषण शामिल है: सोमा के लिए एक, न्यूराइट्स के लिए एक, और एक समय के लिए । सोमा और न्यूराइट्स को विभाजित करने का कारण न्यूराइट्स की चरम आकृति विज्ञान के लिए खाता है, जो अक्सर काफी पतले होते हैं कि उन्हें 2D नेटवर्क के रूप में माना जा सकता है और रिप्ले के कश्मीर विश्लेषण का 2D संस्करण लागू किया जा सकता है। अबकी बार, अस्थायी क्लस्टरिंग के लिए 1D रिप्ले का कश्मीर विश्लेषण लागू किया जाता है। रिप्ले का कश्मीर विश्लेषण बिंदु प्रक्रियाओं और कोलोकैलाइजेशन के क्लस्टरिंग का पता लगाने के लिए एक मजबूत तरीका है। रिप्ले के कश्मीर के ग्राफ की व्याख्या इस तरह से की जा सकती है: रिप्ले के कश्मीर मूल्य + आत्मविश्वास अंतराल में किसी भी बिंदु पर पूर्ण स्थानिक यादृच्छिकता की रेखा के बाहर गिरने का 5% मौका होता है, जो 0.05 के पी-वैल्यू के अनुरूप होता है। जहां मूल्य पूर्ण स्थानिक यादृच्छिकता की रेखा के बाहर गिर जाता है, एक्सोसाइटिक घटनाओं को क्लस्टर (सीएसआर से ऊपर) किया जाता है या उन दूरी (एक्स-एक्सिस) पर नियमित अंतराल (सीएसआर से नीचे) पर अलग किया जाता है।
मुखौटा फ़ाइल का निर्माण सेल के उच्च प्रारंभिक सिग्नल-टू-शोर पर निर्भर करता है। पीएच संवेदनशील मार्कर हमेशा एक सेल रोशन में अच्छा प्रदर्शन नहीं कर सकते हैं, क्या प्रोटीन जांच से जुड़ा हुआ है पर निर्भर करता है । मुखौटा फ़ाइलें बनाने के लिए एक और विकल्प अगर एक्सोसाइटिक मार्कर के शोर के लिए संकेत अपर्याप्त सेल सीमा पर प्रकाश डाला गया है मुखौटा निर्माण के लिए एक दूसरे फ्लोरोसेंट चैनल/ डेटासेट चुनते समय मास्क बनाने के लिए मास्क बनाने के लिए एक अलग फ्लोरेसेंस मार्कर (टैगआरएफपी-सीएएएक्स) का उपयोग करते समय, सबसे पहले मास्क बनाने के लिए छवियों के साथ फ़ोल्डर पर नेविगेट करें (उदाहरण के लिए, टैगआरएफपी-सीएएएक्स छवियों वाला एक फ़ोल्डर)। यहां मास्क मेकर बटन का इस्तेमाल करें । महत्वपूर्ण बात, ऊपर नामकरण योजना के साथ विश्लेषण करने के लिए एक्सोसाइटिक डेटा फ़ाइल से मेल खाने के लिए मुखौटा फ़ाइलों का नाम बदलना याद रखें (ऊपर दिए गए उदाहरण के बाद, "CAAX_1_mask_file.tif" नाम की मुखौटा फ़ाइलों को विश्लेषण करने के लिए VAMP2 छवि सेट से मेल खाने के लिए "VAMP2_488_WT_1_mask_file.tif" का नाम दिया जाना चाहिए)। एक बार जब मुखौटा फ़ाइलों का उचित नाम हो जाता है, तो विश्लेषण करने के लिए एक्सोसाइटिक डेटासेट फ़ाइलों पर नेविगेट करने के लिए फिर से चुनें डेटासेट बटन पर लौटें।
एक्सोसाइटोसिस का पता लगाना उल्लेखनीय रूप से संवेदनशील है, और एक्सोसाइटिक घटनाओं को सिग्नल-टू-शोर अनुपात में 0.01 के एक ΤF/F के रूप में कम के रूप में सटीक रूप से पता लगाया गया था। पता लगाने की संवेदनशीलता पृष्ठभूमि फ्लोरेसेंस के विचरण पर आंशिक रूप से निर्भर करती है, और पृष्ठभूमि संकेत के ऊपर 4 मानक विचलन से कम घटनाओं का पता नहीं लगाया जाएगा।
एक्सोसाइटिक घटनाओं का पता लगाना उनके क्षणिक स्वभाव पर निर्भर करता है। क्षणिक घटनाओं के विश्लेषण की एक विशेषता के रूप में, हमारा डिटेक्शन कोड एक्सोसाइटिक घटना के चारों ओर 20 सेकंड की खिड़की की पड़ताल करता है। कुछ सेल प्रकारों में, चुंबन और रहने वाले एक्सोसाइटोसिस न्यूरॉन्स के विकास की तुलना में बहुत लंबी लौकिक खिड़की के लिए "रह" सकते हैं, और स्वचालित पता लगाने से इन कम क्षणिक घटनाओं को मजबूती से कैप्चर नहीं किया जा सकता है। यह सुविधा MATLAB के साथ आराम करने वालों के लिए एक आसानी से संशोधित चर है। 20 सेकंड आरओआई की सीमा के समान, एक्सोसाइटिक घटनाएं जो दिखाई देती हैं लेकिन वीडियो की अंतिम समय सीमा से पहले गायब नहीं होती हैं, उन्हें सच्चे एक्सोसाइटोसिस के रूप में नहीं गिना जा सकता है, जो आवृत्ति को प्रभावित कर सकता है, जिसकी गणना समय श्रृंखला की पूरी लंबाई के आधार पर की जाती है।
मुखौटा निर्माता शामिल डिजाइन द्वारा स्वचालित है और पृष्ठभूमि से जटिल आकार खंडित पर अच्छा प्रदर्शन करता है; हालांकि, पूरी तरह से स्वचालित डिजाइन सिग्नल-टू-शोर और सिग्नल प्रकार की सीमा को सीमित करता है जिसका उपयोग स्वचालित रूप से मास्क उत्पन्न करने के लिए किया जा सकता है। यदि उपयोगकर्ता एक फ्लोरोसेंट सेल मार्कर शामिल नहीं कर सकता है जो एक समान और एक महत्वपूर्ण सिग्नल-टू-शोर अनुपात है, तो सेल मास्क को मैन्युअल रूप से तैयार करने की आवश्यकता होगी।
एक्सोसाइटोसिस का उपयोगकर्ता आधारित विश्लेषण एक समय लेने वाली प्रक्रिया है और व्यक्तिगत पूर्वाग्रह के अधीन है, क्योंकि घटनाओं को हमेशा अन्य फ्लोरेसेंस से स्पष्ट रूप से अलग नहीं किया जाता है। निष्पक्ष तरीके से एक्सोसाइटिक घटनाओं की सही पहचान और विश्लेषण करने के लिए एक स्वचालित विश्लेषण कार्यक्रम का उपयोग विश्लेषण दक्षता को बढ़ाता है और प्रजनन क्षमता और कठोरता में सुधार करता है।
न केवल इस एक्सोसाइटिक घटना का पता लगाने के लिए सही न्यूरॉन्स के विकास में पीएच संवेदनशील फ्लोरेसेंस पर कब्जा करने के लिए काम करता है, लेकिन अंय सेल प्रकार के रूप में अच्छी तरह से (Urbina एट अल,, २०१८) । क्या वर्गीकरण अन्य सेल प्रकारों के लिए काम करता है दृढ़ संकल्प की आवश्यकता होगी। इस तकनीक के भविष्य के अनुप्रयोग सिनेप्स में, गैर-न्यूरोनल सेल प्रकारों में, या एक्सोसाइटिक वेसिकल डॉकिंग और फ्यूजन के उपन्यास मार्कर के साथ उपयोगी हो सकते हैं, जैसे कि हाल ही में वर्णित pHmScarlet16।
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Disclosures
लेखक खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं घोषित करते हैं ।
Acknowledgments
हम परीक्षण कोड और जीयूआई के लिए डस्टिन रेवेल और रेजिनाल्ड एडवर्ड्स का शुक्रिया अदा करते हैं। वित्त पोषण स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों द्वारा प्रदान की गई थी इस अनुसंधान का समर्थन: R01NS112326 (SLG), R35GM135160 (SLG), और F31NS103586 (फ्लू) सहित ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | |
| R | R Core Team | https://www.r-project.org/ | |
| Rstudio | Rstudio, PBC | https://rstudio.com/ |
References
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