Summary
Abbiamo sviluppato un software automatizzato di visione artificiale per rilevare eventi esocitici contrassegnati da sonde fluorescenti sensibili al pH. Qui, dimostriamo l'uso di un'interfaccia utente grafica e RStudio per rilevare eventi di fusione, analizzare e visualizzare i parametri spaziotemporali di fusione e classificare gli eventi in modalità di fusione distinte.
Abstract
La microscopia TIRF timelapse di GFP pH-sensibile (pHluorin) attaccata alle proteine SNARE delle vescicole è un metodo efficace per visualizzare gli eventi esocitici delle singole vescicole in coltura cellulare. Per eseguire un'identificazione e un'analisi imparziali ed efficienti di tali eventi, è stato sviluppato e implementato in MATLAB un approccio basato sulla visione artificiale. La pipeline di analisi è costituita da una segmentazione cellulare e da un algoritmo di identificazione degli eventi esocitici. L'approccio di visione artificiale include strumenti per lo studio di più parametri di singoli eventi, tra cui l'emivita del decadimento di fluorescenza e il picco ΔF / F, nonché l'analisi a cellule intere della frequenza dell'esocitosi. Questi e altri parametri di fusione sono utilizzati in un approccio di classificazione per distinguere modalità di fusione distinte. Qui una GUI di nuova costruzione esegue la pipeline di analisi dall'inizio alla fine. Un ulteriore adattamento della funzione K di Ripley in R Studio viene utilizzato per distinguere tra evento di fusione raggruppato, disperso o casuale sia nello spazio che nel tempo.
Introduction
I costrutti VAMP-pHluorin o i costrutti del recettore della transferrina (TfR)-pHuji sono eccellenti marcatori di eventi esocitici, poiché questi fluorofori sensibili al pH vengono spenti all'interno del lume della vescicola acida e fluoresceno immediatamente dopo l'apertura del poro di fusione tra la vescicola e la membrana plasmatica1. Dopo l'apertura dei pori di fusione, la fluorescenza decade in modo esponenziale, con una certa eterogeneità che rivela informazioni sull'evento di fusione. Qui viene descritta un'applicazione di interfaccia utente grafica (GUI) che rileva e analizza automaticamente gli eventi esocitici. Questa applicazione consente all'utente di rilevare automaticamente gli eventi esocitici rivelati dai marcatori sensibili al pH2 e generare caratteristiche da ciascun evento che possono essere utilizzate ai fini della classificazione3 (Figura 1A). Inoltre, viene descritta l'analisi del clustering di eventi esocitici utilizzando la funzione K di Ripley.
La classificazione automatizzata degli eventi esocitici in diverse modalità esocitiche è stata recentemente riportata3. Due modi di esocitosi, fusione completa vescicolare (FVF) ed esocitosi da fusione kiss-and-run (KNR) sono stati precedentemente descritti4,5,6,7. Durante la fecondazione in vitro, il poro di fusione si dilata e la vescicola viene incorporata nella membrana plasmatica. Durante KNR, il poro di fusione si apre transitoriamente e poi risigilla4,5,8,9,10. Sono state identificate quattro modalità di esocitosi nello sviluppo dei neuroni, due relative alla FVF e due correlate alla KNR. Questo lavoro dimostra che sia FVF che KNR possono essere ulteriormente suddivisi in eventi di fusione che procedono immediatamente al decadimento della fluorescenza (FVFi e KNRi) dopo l'apertura dei pori di fusione o eventi esocitici che mostrano un ritardo dopo l'apertura dei pori di fusione prima dell'inizio del decadimento della fluorescenza (FVFd e KNRd) (Figura 1B). Il classificatore identifica la modalità di esocitosi per ogni evento di fusione. Qui questa analisi è stata incorporata in una GUI che può essere installata in MATLAB in sistemi operativi basati su Windows e Mac. Tutti i file di analisi sono disponibili all'https://drive.google.com/drive/folders/1VCiO-thMEd4jz-tYEL8I4N1Rf_zjnOgB?usp=sharing o
https://github.com/GuptonLab.
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Protocol
1. Scegli set di dati e directory
- Per selezionare i set di dati da eseguire per l'analisi, fare clic sul pulsante Trova set di dati (Figura 2A, casella rossa 1) per passare alla cartella in cui sono depositati i dati (ad esempio, cartella RawData). I file di dati popoleranno automaticamente i file di dati come elenco. Nella cartella possono essere presenti più set di dati.
- Fare clic sul pulsante Scegli directory e selezionare la directory (ad esempio, Test) in cui verranno depositati i file analizzati (Figura 2A, casella rossa 2) . Un insieme di cartelle e file di analisi finiti, nonché immagini temporanee intermedie, verranno creati in questa directory quando si preme il pulsante Analisi. Gli errori verranno prodotti se non viene scelta una directory.
2. Imposta la dimensione dei pixel e il framerate
- Inserisci la frequenza fotogrammi e la dimensione dei pixel appropriate delle immagini nell'apposita casella "Framerate" o "pixel size"(Figura 2A,casella verde). Se non vengono forniti valori (sono impostati su "0" predefinito), il programma cercherà i metadati associati al file per il framerate e la dimensione dei pixel. Se questi valori non vengono trovati, il programma verrà impostato per impostazione predefinita su per-pixel per la misurazione e per fotogramma per i punti temporali.
NOTA: nell'esempio fornito, il framerate è 100 e la dimensione dei pixel è 0,08.
3. Scegli o crea maschere
- Utilizzare il pulsante Mask Maker per creare automaticamente maschere di cella per i dati nell'elenco dei set di dati di file (Figura 2A, casella blu). Dopo aver utilizzato il pulsante Mask Maker, verrà creata una nuova cartella nella directory scelta chiamata MaskFiles. L'"Indicatore di esecuzione" diventerà giallo durante l'esecuzione e tornerà in verde al termine.
NOTA: una maschera per ogni file nell'elenco File di dati verrà creata dai primi 10 fotogrammi del file di immagine (o da tutti i fotogrammi se sono presenti meno di 10 nel file di immagine) e depositata nella cartella MaskFiles utilizzando lo schema di denominazione appropriato (descritto di seguito). - Assicurarsi che i file maschera popolano automaticamente l'elenco File maschera. L'utente può procedere direttamente all'analisi.
NOTA: controllare sempre visivamente i file maschera e confermare che acquisiscano l'intera regione di interesse. Il primo fotogramma del file di dati e il file maschera vengono visualizzati nell'interfaccia utente quando selezionata. (Figura 2B). Mask Maker può produrre errori in caso di basso rapporto segnale-rumore, quindi la convalida che i file maschera siano appropriati è fondamentale per il controllo di qualità. - In alternativa all'utilizzo di Mask Maker, se il segnale al rumore delle immagini è insufficiente, creare manualmente le maschere in ImageJ.
- Innanzitutto, aprire il file di immagine raw in ImageJ (Figura 3A).
- Fare clic sul pulsante Selezione poligono e fare clic per disegnare una maschera attorno alla cella. Una volta terminato, fare doppio clic sull'ultimo punto per completare il poligono.
- Una volta terminato, vai a Modifica | | di selezione Crea maschera (Figura 3B). Verrà creata una nuova maschera invertita in base al disegno poligonale. Salvare le maschere in una cartella MaskFiles designata nella directory scelta. Lo schema di denominazione dei file maschera deve corrispondere ai singoli file di dati corrispondenti seguiti da "_mask_file". Ad esempio, se un file di dati è denominato "VAMP2_488_WT_1.tif", il file maschera corrispondente deve essere denominato "VAMP2_488_WT_1_mask_file.tif".
- Utilizzare il pulsante Trova maskfiles per passare alla cartella scelta dei file maschera personalizzati depositati. Le maschere popoleranno i file maschera come elenco.
NOTA: è importante disporre di una maschera per ogni file di dati prima di eseguire l'analisi.
4. Analisi ed estrazione delle feature
- Dopo aver scelto la directory e popolato l'elenco File di dati e l'elenco File maschera, fare clic sul pulsante Analisi (Figura 4A). Se è richiesta la classificazione degli eventi esocitici, passare al passaggio 5.
NOTA: il clic sul pulsante Analisi eseguirà una serie di attività automatizzate per analizzare i dati. Creerà singole cartelle nella directory scelta per depositare i dati analizzati. Durante l'esecuzione, l'"indicatore di corsa" cambierà da verde a giallo (Figura 4A, casella rossa). Al termine dell'analisi, questo tornerà in verde. - Trovare una cartella DataFiles (Figura 4B) con il set completo di file di analisi (nonché i file di estrazione delle feature, da utilizzare nella classificazione successiva) denominati in base a ciascun file di dati (Figura 4C).
NOTA: una descrizione di questi file di analisi è inclusa di seguito nella sezione Risultati rappresentativi.
5. Classificazione degli eventi esocitici
- Per eseguire la classificazione simultanea degli eventi esocitici con rilevamento automatico, selezionare la casella di controllo Classificazione prima di fare clic sul pulsante Analisi. Per ogni evento esocitico, assegna un punteggio di probabilità compreso tra 0-1 per ogni classe. Un evento esocitico è considerato classificato come una delle quattro classi se il punteggio di probabilità per quella classe è > 0,5.
NOTA: una volta completata l'analisi, verrà visualizzata una nuova cartella di file di dati all'interno della directory scelta. La cartella conterrà i file di analisi corrispondenti a ciascun file di immagine.
6. Analisi spaziotemporale dell'esocitosi utilizzando i valori K di Ripley
- Creare un file maschera "neurite" e "soma" separato. In primo luogo, segmentare il soma dal neurite. Non esiste un metodo imparziale per segmentare il soma dai neuriti, quindi l'utente dovrebbe essere accecato dall'esperimento di condizionamento e usare il miglior giudizio; si suggerisce un ellissoide senza estensioni evidenti di neurite.
- Apri ImageJ/Fiji.
- Trascinare e rilasciare il file maschera o utilizzare File | Aprire e quindi selezionare il file maschera.
- Utilizzate lo strumento di selezione colore e fate clic su uno qualsiasi dei pixel neri sullo sfondo della maschera per impostare il colore su nero.
- Usa lo strumento di selezione dei poligoni o a mano libera per disegnare un contorno attorno al soma, separandolo dai neuriti. Ciò richiede un processo decisionale manuale.
- Fai clic su Modifica | | di selezione Crea maschera. Si aprirà una nuova immagine con il soma cerchiato segmentato dal resto dell'immagine. Questo creerà un file di maschera soma.
- Senza spostare la regione disegnata, fare clic sull'intestazione del file maschera originale.
- Fai clic su Modifica | Riempire per riempire il soma cerchiato in modo che solo i neuriti rimangano la maschera.
- Una volta ottenuti i file di neurite e maschera separati, salvare entrambi i file maschera.
- Apri "neurite_2D_network" in Matlab.
- In MATLAB, vai alla directory con tutti i dati di analisi.
- Modificare il percorso "nome maschera" con il nome della maschera neurite, ad es. "MaskFiles/VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_neurite.tif"
- Modificare il "csv_file_name" in cui si trova fluorescent_traces.csv file, ad es. "MaskFiles/VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_neurite.csv".
- Fare clic su Esegui per scheletrare il file della maschera di neurite. Questo crea una versione scheletrata del file maschera neurite e lo deposita come file CSV nella cartella maskfiles.
- Quindi, genera un file CSV per il soma. Apri "CSV_mask_creator.m" in Matlab.
- Inserisci il percorso per il "nome maschera" al nome della maschera soma, ad es. "MaskFiles/VAMP2phLuorin_488_wt_4_mask_file_soma.tif
- Cambia il "writematrix" in nome file csv da creare, ad es. "MaskFiles/VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_soma.csv"
- Fare clic su Esegui. In questo modo viene creato il nuovo file VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_soma.csv.
- Ripetere la 6.14 per ogni file maschera.
7. Configurazione di RStudio
- Apri Rstudio e apri ripleys_k_analysis. R.
- Installa il pacchetto "spatstat" in RStudio andando su Strumenti | Installa pacchetti e digita "spatstat" seguito da Installa.
NOTA: questo deve essere eseguito solo una volta per l'installazione di Rstudio. - Eseguire lo spatstat della libreria all'inizio di ogni sessione.
- Presta attenzione a due variabili principali in questo caso: "neuron_mask" e "neuron_datapoints". Neuron Mask punta al set di file maschera da eseguire, cioè file maschera soma.
NOTA: eseguire tutti i file della maschera soma insieme, separatamente dai file maschera neurite e viceversa. - Leggi nella .csv dei file della maschera per ciascuno dei neuroni da analizzare.
- Esegui più file contemporaneamente copiando neuron_mask_n+1 aggiuntivi. Ciò consentirà di aggregare insieme l'analisi di Ripley, utilizzando lo script descritto nella sezione 8.
- Ora controlla la seconda variabile, "neuron_datapoints".
- Leggi nella." X_fluorescent_traces.csv" generato dal programma di analisi (dalle caratteristiche di tutti i extracted_R file) con le posizioni x,y,t degli eventi esocitici, nonché il file specifico del neurite delle posizioni x,y per la rete 2D. Questo va nella posizione "neuron_datapoints".
- In RStudio selezionare il codice | | dell'area di esecuzione Esegui tutto. Questo genera diversi grafici, inclusi i valori K di Ripley raggruppati e i grafici di densità.
- Salva i grafici andando su Esporta | Salva immagine con nome | Selezionare il formato immagine e la directory appropriati e immettere il nome file appropriato, quindi fare clic su Salva.
NOTA: la funzione di plottaggio per le mappe di calore viene chiamata nello script usando "plot(density(soma_data,0.4))". Il numero "0.4" qui rappresenta quanto dovrebbe essere appianata la funzione di densità. Può essere modificato per adattarsi ai dati dell'utente in modo significativo, ma se devono essere eseguiti confronti tra diverse mappe di calore, il numero deve essere lo stesso tra di loro. - Esporta o salva l'immagine da Rstudio. Se una mappa di calore richiede ulteriori modifiche, scegli un tipo di file appropriato (SVG o EPS).
8. L'analisi di Ripley
NOTA: il Ripleys_k_analysis. Il file R generava automaticamente anche i grafici del valore k di Ripley. L'esecuzione dell'intero script eseguirà automaticamente le funzioni menzionate di seguito, ma è incluso in dettaglio se si desidera eseguire ogni parte dello script individualmente o apportare modifiche all'analisi.
- Innanzitutto, eseguire la funzione di inviluppo per ogni cella. Questa funzione ha simulato la randomità spaziale completa (CSR) per testare il valore K di Ripley del modello del punto di evento esocitico rispetto a.
Data_envelope_1 = envelope(soma_data_1, Kest, nsim = 19, savefuns = TRUE)
Data_envelope_2 = envelope(soma_data_2, Kest, nsim = 19, savefuns = TRUE) - Quindi, raggruppa queste buste e crea una stima della CSR per il gruppo:
Pool_csr = pool(Data_envelope_1, Data_envelop_2,...)
Quindi, eseguire la funzione K di Ripley per tutti i punti dati.
Data_ripleys_k_1 = Kest(soma_data_1, rapporto = VERO)
Data_ripleys_k_2 = Kest(soma_data_2, ratio = TRUE) - Una volta completato, raggruppare i valori K di Ripley e avviare i relativi intervalli di confidenza con il seguente comando:
Pool di dati = pool(Data_ripleys_k_1, Data_ripleys_k_2,...) - Bootstrap con il seguente comando:
Final_Ripleys_K = varblock(fun = Kest, Data_pool) - Traccia i dati.
- Se è richiesta una differenza statistica difficile, Studentised Permutation Test è incluso nel pacchetto spatstat per testare una differenza tra gruppi di modelli di punti:
Test_difference = studpermu.test(all_points_to_test, exocytic_events ~ group, nperm = np).
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Representative Results
Qui la GUI (Figura 2A) è stata utilizzata per analizzare gli eventi esocitici di tre neuroni che esprimono VAMP2-pHluorina a 3 DIV utilizzando la microscopia TIRF (total internal reflection fluorescence). I neuroni corticali E15.5 sono stati isolati, seguiti da trasfezione con VAMP2-pHluorin e placcatura utilizzando i protocolli come delineato in Winkle et al., 2016 e Viesselmann et al., 201111,12. La metodologia dei parametri di imaging è come delineato in Urbina et al., 20182. In breve, la microscopia TIRF è stata utilizzata per visualizzare la membrana plasmatica basale dei neuroni ogni 100 ms per 2 min. Figura 2, Figura 3, Figura 4 mostrano una guida passo-passo per analizzare gli eventi esocitici. Viene selezionata la cartella in cui si trovano le immagini dei neuroni e viene scelta una directory per depositare i file di dati dell'analisi finale (Figura 2A). Utilizzando la funzione MaskMaker, viene generata una maschera per i neuroni, che viene ispezionata nella GUI (Figura 2B). In questo caso, la maschera cellulare è di buona qualità e l'analisi può procedere. Se una maschera è insufficiente, è possibile crearsi una maschera in ImageJ (Figura 3). Dopo aver utilizzato la funzione MaskMaker o aver creato una maschera in ImageJ e aver selezionato la directory in cui si trovano i file maschera, viene eseguita l'analisi (Figura 4A). I risultati vengono generati nella cartella DataFiles al termine dell'analisi (l'indicatore giallo torna in verde) (Figura 4B).
I file di dati vengono generati automaticamente e denominati in base ai file di dati grezzi forniti.
Supponendo che il file di dati sia denominato X:
X_tracking: Questo file include la posizione x,y e il numero di fotogramma di ogni evento, nonché i riquadri di delimitazione che possono essere utilizzati per disegnare caselle attorno a ciascun evento. L'età indica il numero di fotogrammi oltre il rilevamento iniziale in cui un evento è un puncta gaussiano distinto. Se la classificazione è selezionata, i risultati della classificazione appariranno in questo file, che indica la probabilità di un evento esocitico appartenente a una delle quattro classi. Se la probabilità è maggiore di 0,5 e maggiore di altre probabilità, è stata scelta una classe esocitica.
X_fluorescent tracce: Questo file include la posizione x,y e il numero di fotogramma di ogni evento. Inoltre, include misure di intensità fluorescente in una regione di interesse intorno a ciascun evento 2 secondi prima e 10 secondi dopo il picco ΔF/F per ogni evento (indicato dalle colonne Timepoint).
X_cell_statistics: Questo file include l'area della cella, il tempo totale dell'immagine e la frequenza calcolata automaticamente degli eventi esocitici per ogni cella (in eventi/mm2/minuto).
I file di estrazione delle funzionalità includono:
X_contrast: Contrasto. Misura del contrasto di intensità tra un pixel e il suo vicino sull'intera immagine.
X_correlation: Correlazione. Una misura di quanto un pixel sia correlato al suo vicino sull'intera immagine.
X_energy Energia totale. Definito come la somma quadrata dell'intensità dei pixel.
X_homogeneity misura la vicinanza della distribuzione degli elementi nel ROI alla diagonale del ROI.
X_ring_fluorescence: la fluorescenza media dei pixel di confine.
X_SD: Deviazione standard. Questo è definito come la deviazione standard del ROI.
Esempi di tracce di fluorescenza media ± SEM di ciascuna classe esocitica sono stati tracciati da X_fluorescent file di tracce (Figura 5A). Utilizzando il file Cell_statistics, la frequenza di esocitosi per ogni classe è stata tracciata per ciascun neurone (Figura 5B). Con la casella di controllo Classificazione selezionata, il programma assegna ogni evento esocitico a una classe, tracciata nella Figura 5C. Dopo la classificazione, il codice di analisi K di Ripley è stato utilizzato per determinare se gli eventi esocitici sono casuali, raggruppati o dispersi nello spazio e nel tempo. Sono state generate mappe di calore di densità della localizzazione di eventi esocitici (Figura 5D). Questi rivelano "hotspot" raggruppati attesi in regioni distinte del neurone. Successivamente, l'analisi K di Ripley è stata eseguita per il soma, la neurite e il clustering nel tempo (Figura 5E). Il valore K di Ripley e SEM (linea nera e regione ombreggiata blu, rispettivamente) superano la linea di completa casualità spaziale (linea tratteggiata rossa), suggerendo un clustering statisticamente significativo.
Figura 1: Rappresentazione dell'analisi e della classificazione esocitica. (A) Cenni sulla pipeline di analisi per la GUI. Le cellule vengono segmentate dallo sfondo prima che gli eventi esocitici vengano identificati e tracciati. Parametri come il picco ΔF/F e t1/2 sono calcolati da tracce fluorescenti di esocitosi in un ROI intorno all'evento pre e post-fusione. (B) illustrazione delle quattro modalità di esocitosi ed esempi di montaggi di immagini. Dopo la fusione, gli eventi possono procedere istantaneamente a FVF o KNR (FVFi e KNRi), oppure può essere presente un ritardo prima dell'inizio del destino di fusione a FVF o KNR (FVFd e KNRd). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Analisi di esempio passo passo. (A) In primo luogo, vengono scelti i set di dati (1., casella rossa) e viene scelta una directory per posizionare i file di analisi (2., casella rossa). Successivamente, vengono specificati il framerate e la dimensione dei pixel (3., casella verde). Qui sono state utilizzate dimensioni di pixel di 0,08 μm e framerate di 100 ms. Il pulsante funzione MaskMaker viene quindi premuto (4., casella blu). Una cartella denominata "MaskFiles" viene creata automaticamente nella directory scelta contenente un file maschera per ogni file di immagine nel set di dati. (B) Quando i set di dati vengono caricati, selezionando un file di dati e/o un file maschera verrà visualizzato il primo fotogramma delle immagini per facilitare il confronto (riquadro verde). I file maschera potrebbero non essere completamente corretti; questo file maschera può essere corretto per gli errori, o un nuovo file maschera può essere fatto manualmente Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Creazione manuale di un file maschera in ImageJ. (A) Innanzitutto, aprire il file per la creazione di una maschera. Il pulsante "Selezioni poligonali" è delineato in rosso. Facendo clic attorno al bordo della cella, viene creato un contorno poligonale. (B) Come creare una maschera dal contorno del poligono. Selezionando Modifica | | di selezione Crea maschera, una maschera in bianco e nero verrà creata dal poligono (immagine a destra). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Analisi degli eventi esocitici. (A) Dimostrazione del pulsante di analisi (casella arancione) e analisi in esecuzione. Si noti che l'indicatore di esecuzione diventa giallo durante l'esecuzione di un'analisi. (B) File di analisi di esempio che vengono creati nella directory scelta al termine dell'analisi. DataFiles contiene tutti i file di analisi dell'evento esocitico. (C) File di analisi generati nella cartella DataFiles. Le caselle di colore rappresentano i file aperti nelle immagini successive. (D) Tre file aperti, "X_fluorescent_traces.csv" (rosso) e "X_Cell_statistics" (verde) e "X_tracking" (blu). Le tracce fluorescenti contengono la posizione x,y e il numero di fotogrammi di ciascun evento, nonché l'intensità fluorescente a ciascun ROI. Cell_statistics contiene informazioni riassuntive delle statistiche esocitiche a cellule intere come la frequenza dell'esocitosi. X_tracking contiene informazioni sulla posizione e sul tempo per ogni evento esocitico, nonché la probabilità di ogni classe di esocitosi per ogni evento, rappresentata come un numero compreso tra 0-1 (>0,5 indica che un evento appartiene a una particolare classe). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Risultati rappresentativi. (A) Tracce di fluorescenza media +/- SEM di ciascuna classe esocitica. (B) Frequenza degli eventi tracciati per tre neuroni corticali murini per ogni classe esocitica. Questi valori di dati sono stati tracciati da "X_Cell_statistics", utilizzando le classi assegnate in "X_tracking". (C) Distribuzione delle classi di esocitosi per le stesse tre cellule utilizzate in A). Qui, viene tracciato il rapporto di ciascuna modalità. (D) Grafico di densità di dove si verificano eventi esocitici generati nella parte di analisi K di Ripley del protocollo. Questo può essere interpretato come una "mappa di calore" della probabilità spaziale di dove si verificano gli eventi. (E) Analisi K di Ripley di tre celle utilizzate per A) e B). La linea rossa indica quale valore sarebbe la distribuzione completamente casuale spazialmente degli eventi esocitici. La linea nera indica il valore K aggregato di Ripley per le tre celle in questo esempio e l'area ombreggiata blu rappresenta l'intervallo di confidenza. Qui, la regione ombreggiata cade in particolare al di fuori della linea di completa casualità spaziale tra ~ 0,25-1 μm, suggerendo che gli eventi esocitici sono raggruppati a quelle distanze. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Quando si utilizza il software di rilevamento e analisi esocitica, si prega di considerare che il programma accetta solo la compressione senza perdita di dati .tif file come input. I file di immagine .tif possono essere immagini in scala di grigi (canale singolo) a 8 bit, 16 bit o a 32 bit. Altri formati di immagine devono essere convertiti in uno di questi tipi prima dell'input. Per riferimento, gli esempi utilizzati qui sono immagini in scala di grigi a 16 bit.
Inerenti al processo di rilevamento automatizzato, i set di immagini timelapse vengono elaborati per la sottrazione automatica dello sfondo e la correzione del fotosciviazione. Per la sottrazione dello sfondo, i pixel al di fuori dell'area mascherata del file maschera vengono mediati sul timelapse dell'intera immagine e il valore medio viene sottratto dal set di immagini. Per la correzione del fotosableching, un adattamento di decadimento monoemi esponenziale viene applicato alla fluorescenza media dei pixel nella maschera nel corso del video, con l'intensità corretta regolata come segue:
Intensità corretta = (Intensità al tempo t) ÷ exp-k×t dove k = costante di decadimento
Pertanto, non è necessaria alcuna pre-elaborazione prima dell'input. Questi processi, tuttavia, si basano in modo critico sulla maschera dell'immagine per separare efficacemente la cella dallo sfondo, e quindi è necessaria una maschera cellulare adeguata per buoni risultati.
Il creatore automatico della maschera cellulare richiede un segnale uniforme con un rapporto segnale-rumore sufficiente (idealmente, almeno 2 volte la deviazione standard del segnale di fondo medio) per funzionare bene. Empiricamente, la scatola CAAX etichettata con una proteina fluorescente, che si inserisce nella membrana plasmatica dopo la prenilazione, funziona bene. Non è necessario che il segnale possa essere mantenuto per tutta la durata dell'imaging timelapse dell'esocitosi, poiché una maschera adatta può essere creata da un segnale elevato nei primi 10 fotogrammi della sequenza. Tuttavia, se la morfologia cellulare cambia in modo significativo durante il paradigma di imaging, è necessario prestare attenzione.
Quando si utilizza il software di rilevamento automatico, includere il framerate e la dimensione dei pixel per output temporali e spaziali accurati. Se non viene dichiarata alcuna frequenza fotogrammi o dimensione in pixel, l'output sarà per pixel e per fotogramma. Come regola generale, i diametri delle vescicole nei neuroni in via di sviluppo sono sulla scala di ~ 100 nm13e quindi il rilevamento automatico degli eventi può funzionare per vescicole di dimensioni simili. Allo stato attuale, non esiste un limite rigido alla dimensione delle vescicole che possono essere rilevate (dall'area dei pixel), poiché il rilevamento automatico si basa sull'intensità a forma gaussiana su una vasta gamma di larghezze gaussiane. La fusione di vescicole più piccole della larghezza di un pixel può essere rilevata con precisione se l'intensità dell'evento soddisfa i criteri segnale-rumore di 2 volte la deviazione standard del segnale di fondo medio mentre la diffrazione di fluorescenza si espande su più pixel.
Questo programma è stato sviluppato per rilevare eventi esocitici nello sviluppo di neuroni. Tuttavia, il software è stato sfruttato per rilevare con successo eventi esocitici in altre linee cellulari2, indicando che l'algoritmo di rilevamento è robusto. Sebbene abbiamo utilizzato il software per rilevare eventi esocitici in tipi di cellule non neuronali, le differenze nella modalità di evento esocitico tra i tipi di cellule14 indicano che l'algoritmo di classificazione potrebbe non essere adatto ad altri tipi di cellule. Gli eventi esocitici nei neuroni in via di sviluppo sono stati originariamente classificati utilizzando tre diversi metodi: clustering gerarchico, deformazione dinamica del tempo e analisi dei componenti principali (PCA), rivelando quattro diverse classi3. Qui tutti e tre i classificatori sono impiegati nella GUI per classificare gli eventi esocitici in una di queste quattro classi stabilite. Per ogni evento esocitico, viene assegnato un punteggio di probabilità compreso tra 0-1 per ciascuna delle quattro classi possibili. Qualsiasi classe con un punteggio di probabilità > 0,5 è considerata di quella classe. Questa classificazione è stata utilizzata solo nello sviluppo di neuroni fino ad oggi. Non è noto se queste classi esistano in altri tipi di cellule o in momenti di sviluppo successivi nei neuroni. Un gran numero di eventi con punteggi di probabilità di < 0,5 per una qualsiasi delle classi suggerirebbe che la procedura di classificazione potrebbe non essere appropriata per gli eventi esocitici attualmente in fase di valutazione. Se i punteggi di bassa probabilità sono assegnati a eventi esocitici di diversi tipi di cellule, ciò suggerirebbe che è necessaria una classificazione de novo in quanto possono esistere modalità nuove o alternative di esocitosi. Gli stessi metodi di classificazione utilizzati qui dovrebbero essere applicati agli eventi esocitici rilevati automaticamente.
Per esplorare il clustering spaziale e temporale degli eventi esocitici, viene sfruttata l'analisi K15 di Ripley. L'analisi del clustering per i neuroni comporta tre analisi separate: una per il soma, una per i neuriti e una per il tempo. La ragione per dividere il soma e i neuriti è per tenere conto dell'estrema morfologia dei neuriti, che sono spesso abbastanza sottili da poter essere trattati come una rete 2D e applicare una variante 2D dell'analisi K di Ripley. Per il tempo, viene implementata un'analisi K di Ripley 1D per il clustering temporale. L'analisi K di Ripley è un metodo robusto per rilevare il clustering dei processi puntiali e la colocalizzazione. Il grafico del K di Ripley può essere interpretato come tale: il valore K di Ripley + intervallo di confidenza ha una probabilità del 5% di cadere al di fuori della linea di casualità spaziale completa in qualsiasi punto, analogamente a un valore p di 0,05. Dove il valore cade al di fuori della linea di completa casualità spaziale, gli eventi esocitici sono raggruppati (sopra CSR) o sono separati a intervalli regolari (sotto CSR) a quelle distanze (asse x).
La creazione del file maschera si basa su un elevato segnale iniziale di rumore della cella. I marcatori sensibili al pH potrebbero non sempre funzionare bene nell'illuminare una cellula, a seconda della proteina a cui è attaccata la sonda. Un'altra opzione per creare file maschera se il segnale al rumore del marcatore esocitico evidenzia in modo insufficiente il bordo della cella è quella di utilizzare un secondo canale / immagine fluorescente per la creazione della maschera. Se si utilizza un marcatore di fluorescenza diverso (tagRFP-CAAX, ad esempio) per creare maschere, quando si sceglie un set di dati, passare prima alla cartella con le immagini da cui creare maschere (ad esempio, una cartella contenente le immagini tagRFP-CAAX). Usa il pulsante Mask Maker qui. È importante ricordare di rinominare i file maschera in modo che corrispondano al file di dati esocitici da analizzare con lo schema di denominazione sopra riportato (seguendo l'esempio sopra, i file maschera denominati "CAAX_1_mask_file.tif" dovranno essere rinominati in "VAMP2_488_WT_1_mask_file.tif" per corrispondere al set di immagini VAMP2 da analizzare). Una volta che i file maschera sono stati denominati in modo appropriato, tornare nuovamente al pulsante Scegli set di dati per passare ai file dataset esocitici da analizzare.
Il rilevamento dell'esocitosi è notevolmente sensibile e gli eventi esocitici sono stati rilevati con precisione a rapporti segnale-rumore a partire da un ΔF / F di 0,01. La sensibilità del rilevamento dipende in parte dalla varianza della fluorescenza di fondo e non verranno rilevati eventi inferiori a 4 deviazioni standard sopra il segnale di fondo.
Il rilevamento di eventi esocitici si basa sulla loro natura transitoria. Come caratteristica dell'analisi degli eventi transitori, il nostro codice di rilevamento esplora una finestra di 20 secondi attorno all'evento esocitico. In alcuni tipi di cellule, l'esocitosi kiss-and-stay può "rimanere" per una finestra temporale molto più lunga rispetto ai neuroni in via di sviluppo, e il rilevamento automatico potrebbe non catturare in modo robusto questi eventi meno transitori. Questa funzione è una variabile facilmente modificabile per chi ha di agio con MATLAB. Analogamente alla limitazione del ROI di 20 secondi, gli eventi esocitici che appaiono ma non scompaiono prima dell'ultimo intervallo di tempo del video potrebbero non essere conteggiati come vera esocitosi, che può influenzare la frequenza, che viene calcolata in base all'intera lunghezza della serie temporale.
Il creatore di maschere incluso è automatizzato dal design e si comporta bene nel segmentare forme complesse dallo sfondo; tuttavia, il design completamente automatizzato limita la gamma di segnale-rumore e il tipo di segnale che possono essere utilizzati per generare automaticamente una maschera. Se l'utente non può includere un marcatore di cella fluorescente uniforme e con un rapporto segnale-rumore significativo, la maschera cellulare dovrà essere disegnata manualmente.
L'analisi dell'esocitosi basata sull'utente è un processo che richiede tempo ed è soggetto a pregiudizi personali, poiché gli eventi non sono sempre chiaramente separati dalle altre fluorescenze. L'uso di un programma di analisi automatizzato per identificare e analizzare correttamente gli eventi esocitici in modo imparziale aumenta l'efficienza dell'analisi e migliora la riproducibilità e il rigore.
Non solo questo rilevamento di eventi esocitici funziona per catturare con precisione la fluorescenza sensibile al pH nei neuroni in via di sviluppo, ma anche altri tipi di cellule (Urbina et al., 2018). Se la classificazione funziona per altri tipi di cellule richiederà determinazione. Le future applicazioni di questa tecnica potrebbero essere utili nelle sinapsi, in tipi di cellule non neuronali o con nuovi marcatori di aggancio e fusione delle vescicole esocitiche, come pHmScarlet16recentemente descritto.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano nulla da divulgare.
Acknowledgments
Ringraziamo Dustin Revell e Reginald Edwards per aver testato il codice e la GUI. Il finanziamento è stato fornito dal National Institutes of Health ha sostenuto questa ricerca: tra cui R01NS112326 (SLG), R35GM135160 (SLG) e F31NS103586 (FLU).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | |
| R | R Core Team | https://www.r-project.org/ | |
| Rstudio | Rstudio, PBC | https://rstudio.com/ |
References
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