Summary
Denne protokol beskriver brugen af en forbedret ultralydsteknik til ikke-invasivt at observere og kvantificere levervævsændringer i gnavermodeller af ikke-alkoholisk fedtleversygdom.
Abstract
Nonalholic Steatohepatitis (NASH) er en tilstand inden for spektret af ikke-alkoholisk fedtlever sygdom (NAFLD), som er karakteriseret ved leverfedt ophobning (steatose) og betændelse, der fører til fibrose. Prækliniske modeller, der nøje opsummerer human NASH/NAFLD, er afgørende for lægemiddeludviklingen. Mens leverbiopsi er i øjeblikket guldstandarden til måling af NAFLD / NASH progression og diagnose i klinikken, i det prækliniske rum, enten indsamling af hele leverprøver på flere tidssteder under en undersøgelse eller biopsi af leveren er nødvendig for histologisk analyse for at vurdere sygdomsstadiet.
Gennemførelse af en leverbiopsi midt i undersøgelsen er en invasiv og arbejdskrævende procedure, og indsamling af leverprøver til at vurdere sygdomsniveauet øger antallet af forskningsdyr, der er nødvendige for en undersøgelse. Der er således behov for en pålidelig, oversættelig, ikke-invasiv billedbiomarkør til at opdage NASH / NAFLD i disse prækliniske modeller. Ikke-invasive ultralyd-baserede B-mode billeder og Shear Wave Elastography (SWE) kan bruges til at måle steatose samt leverfibrose. For at vurdere nytten af SWE i prækliniske gnavermodeller af NASH blev dyr placeret på en pro-NASH-diæt og gennemgik ikke-invasiv ultralyd B-tilstand og forskydningsbølge elastografibilleddannelse for at måle hepatorenal (HR) indeks og leverelasticitet, der målte progressionen af henholdsvis akkumulering af leverfedt og vævsstivhed på flere tidspunkter i løbet af en given NAFLD / NASH-undersøgelse.
HR-indekset og elasticitetstallene blev sammenlignet med histologiske markører for steatose og fibrose. Resultaterne viste stærk sammenhæng mellem HR-indekset og procentdelen af olierød O (ORO) farvning, samt mellem elasticitet og Picro-Sirius Red (PSR) farvning af lever. Den stærke sammenhæng mellem klassiske ex vivo-metoder og in vivobilleddannelsesresultater giver bevis for, at forskydningsbølgeelastografi/ultralydsbaseret billeddannelse kan bruges til at vurdere sygdomsfænotype og progression i en præklinisk model af NAFLD/NASH.
Introduction
Ikke-alkoholisk fedtlever sygdom (NAFLD) er en metabolisk tilstand karakteriseret ved en overdreven ophobning af fedt i leveren og er hurtigt ved at blive en førende lever lidelse på verdensplan med en nyligt rapporteret global udbredelse på 25%1. Ikke-alkoholisk steatohepatitis (NASH) er en mere udviklet fase af spektret af NAFLD, karakteriseret ved overskydende leverfedt med progressiv cellulær skade, betændelse, og fibrose. Disse lidelser er ofte tavse, uopdaget via blodprøver eller rutinemæssige undersøgelser, indtil der allerede er sket betydelig skade på en patients lever. I øjeblikket er guldstandarden til at diagnosticere NASH hos patienter gennem histologisk undersøgelse af patientafledte leverbiopsiprøver. Tilsvarende, prækliniske forskere, der arbejder for at forstå patogenesen af NASH / NAFLD samt lægemiddeludvikling industrien er afhængige af in vivo kile biopsi af leverprøver eller terminal aktiv dødshjælp af satellit kohorter til histologi til måling steatose, betændelse, og fibrose.
For eksempel har lever kilebiopsi været en standardteknik til vurdering af steatohepatitis og fibrose, mens du bruger GUBRA NASH-model2. Leverkilebiopsimetoden er invasiv og besværlig hos små dyr3. Brugen af kileleverbiopsi midt i en undersøgelse repræsenterer en ekstra eksperimentel variabel i en sygdomsmodel, hvilket ofte øger antallet af dyr, der er nødvendige. Med disse faktorer i tankerne, ikke-invasive billeddannelse teknikker, der kan bruges til pålideligt at vurdere steatose og fibrose i NASH / NAFLD dyremodeller på tidlige tidspunkter viser sig værdifulde. Shear bølge elastografi (SWE) er en ultralyd-baseret metode, der anvendes til at måle elasticiteten af blødt væv. Teknikken måler udbredelsen af forskydningsbølger skabt af supersoniske ultralydsimpulser rettet mod et vævsmål og beregner derefter en værdi kaldet E modulus4. Hastigheden af forskydningsbølgen er proportional med graden af vævsstivhed.
Figur 1 og figur 2 viser opsætningen af billedbehandlingsområdet og SWE-instrumentet. SWE-instrumentet er en enkelt, hjulet enhed med to skærme og et kontrolpanel vist i figur 2A. Den øverste skærm (Figur 2B) fungerer som computerskærm og viser billeder og patientmapper. Kontrolpanelet (Figur 2C) er en række knapper og ringer, der styrer generelle aspekter af billedoptagelse: frysning af skærm, lagring af billeder, skift fra en tilstand til en anden. Den nederste skærm (Figur 2D) er en berøringsskærm med ekstra kontrolelementer til at ændre indstillinger og fungerer som et tastatur til at indtaste data efter behov. Instrumentet er udstyret med en pen til brug på berøringsskærmen, hvis det ønskes. Ultralydsonder fastgøres til enhedens nederste frontpanel. Til B-tilstand og SWE-billeddannelse hos gnavere blev den superline lineære 6 til 20 MHz transducer brugt. Denne evne til ikke-invasivt at måle vævsstivhed gør SWE til et værdifuldt værktøj til identifikation og iscenesættelse af leverfibrose5 hos NASH-patienter, hvilket reducerer behovet for mere invasive metoder. SWE er faktisk blevet brugt til at måle leverfibrose hos patienter og er en FDA-godkendt metode til at score fibrose i klinikken6. Brug af SWE til at overvåge NASH progression i dyremodeller af sygdommen ville give et translationelt værktøj til udvikling af behandlinger og samtidig forbedre dyrevelfærden gennem reduktion af antallet af dyr og raffinement af in vivo procedurer for at minimere smerte og angst.
SWE-billeddannelse hos humane patienter bruger en lavfrekvent ultralydstransducer4, som ikke er ideel til små dyr. Især er højfrekvente SWE-teknikker blevet anvendt til at evaluere effekten af acetyl-CoA carboxylase hæmning på patogenese af NASH i en rotte model7, og nytten af denne teknik er blevet beskrevet i carbon tetrachlorid rotte modeller af leverfibrose med vellykkede resultater sammenlignet med traditionelle METAVIR histologiske scoringsmetoder8. Eksisterende litteratur mangler imidlertid detaljerede teknik- og metodeoplysninger om anvendelsen af SWE-billeddannelse i prækliniske modeller af NASH. Som beskrevet ovenfor, lever steatose er en af de vigtigste elementer i NAFLD/NASH tilstand og er et vigtigt stadium, hvor intervention kan overvejes. Således, vurdering af leverfedt ophobning ved hjælp af en billeddannelse modalitet er lige så vigtigt som at vurdere leverfibrose i prækliniske modeller af NASH/NAFLD.
En ultralydsteknik kendt som HR-indekset, et forhold mellem leverens lysstyrke i vævet i forhold til nyrebarkens, er blevet brugt som surrogatmarkør for steatose i klinikken9,10. Denne fremgangsmåde er imidlertid ikke blevet anvendt i vid udstrækning i prækliniske dyremodeller af NAFLD/NASH. Denne artikel beskriver en metode til måling af elasticitet samt HR-indekset som en surrogatmarkør for hepatisk fibrose og steatose, henholdsvis i en cholin-mangelfuld, fedtrig kost (CDAHFD) rotte model af NAFLD / NASH. Denne model fremkalder hurtig steatose, leverbetændelse og fibrose, som er målbar inden for 6 uger hos mus11. Tilsætning af kolesterol (1%) til denne diæt har vist sig at fremme fibrogenese hos rotter12, hvilket gør denne model en egnet kandidat til valideringsundersøgelser, der involverer forskydningsbølgebilleddannelse. Samlet set kan denne billedbehandlingsteknologi også anvendes på en bred vifte af NASH-modeller / diæter, hvor steatose og / eller fibrose er et endepunkt af interesse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyrerelaterede procedurer blev gennemgået og godkendt af Pfizers Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) og udført i en international akkrediteret AAALAC (Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care) International akkrediteret facilitet.
1. Sygdom induktion
- Brug mandlige Wister Han rotter (150-175 g; ~ 6-7 uger gammel; i alt 40 rotter), der er fri for kendte rotte adventitial patogener. Hus rotterne parvis i individuelt ventileret caging med papir strøelse (se tabellen over materialer) og opretholde dem på 22 ± 1 °C, 40-70% relativ luftfugtighed med en 12:12 h lys-mørke cyklus.
- Placer rotterne, der vejer 150-175 g (~6-7 uger gamle) på en cholin-mangelfuld, fedtholdig kost med 1% kolesterol (n = 20) eller en standard lab gnaver chow (n = 20) afhængigt af undersøgelsen design.
BEMÆRK: I denne undersøgelse blev i alt 40 rotter indskrevet med 20 dyr pr. Gruppe. I slutningen af den6. uge blev halvdelen af kohorten fra hver gruppe nødvendiggjort til mid-study histologisk analyse af leverprøver. Stikprøvestørrelsen var således 10 dyr pr. gruppe for9. og 12. uges tid.
2. Opsætning af instrument
- Konfigurer billeddannelsesområdet som følger: omfatter en opvarmet overflade for at holde dyret varmt under billeddannelse (c i figur 1) og en sikret anæstesinæsekegle til at levere inhalerant anæstesi for at opretholde et anæstesiplan under hele proceduren (b i figur 1).
- Brug en ultralydsondeholder til at lette flytningen af ultralydsonden til det ønskede sted og for at forhindre sonden i at hvile på dyret.
- Brug opvarmet ultralyd gel på huden, hvor ultralydsbilledet er erhvervet.
- Vedligehold følgende indstillinger under hele proceduren, som kan justeres på berøringsskærmen: Acoustic Power 0.0 dB; Vævstuner 1540 m/s; Dynamisk område 60 dB; Elasticitetsområde (for SWE-tilstand) < 30 kPa.
- Fastgør ultralydsonden til skinnesystemet i den specialiserede holder (a i figur 1).
- Tænd instrumentet, og lad det starte op. Når skærmen er tændt, skal du notere B-tilstandsbilledet med tilsluttede transducerdetaljer.
3. Forberedelse af emnet
- Sørg for, at dyrene er fastende mindst 4 timer før billeddannelsesproceduren for at forhindre tarmindhold i at forstyrre billedopsamlingen.
- Efter mindst 4 timers faste skal du placere en rotte i et isofluranske anæstesiindningskammer, indtil et passende anæstesiniveau er nået, bekræftet af intet svar på tåspids. Eksponer dyrene til 3-5% isoflurane i 3-5 min for at fremkalde anæstesi.
- For vedligeholdelse anæstesi, holde dyrene under 2-3% isoflurane under billedopsamling. Påfør oftalmisk salve for at beskytte øjet mod tørring under anæstesi.
- Når anæstesi er opnået, fjerne et dyr fra induktionskammeret og placere det på et varmt varmt vand cirkulerende tæppe. Placer en bedøvelse næse kegle over snuden, og barber dyret på sin højre side, fra brystkassen til bækkenet. Brug kemisk depilation creme til at fjerne alle de resterende hår i dette område.
- Når håret er fjernet, skal du placere et dyr i venstre sideværts liggende med øvre poter tapet over hovedet på en varm billedplatform (Figur 3A).
- Tryk på patienttasten på instrumentkontrolpanelet, og identificer emnet i henhold til undersøgelsesdesignet.
- Åbn tastaturfunktionen på instrumentet ved at trykke på ikonet på berøringsskærmen. Skriv navnene efter behov.
- Tryk på Afslut for at afslutte skærmbilledet patientnavn. Bemærk, at B-tilstand genåbner på skærmen.
4. Billedopkøb for hepato-renal (HR) indeksmåling
- Påfør en lille mængde opvarmet ultralydgel på det depilerede hudområde på dyret.
- Flyt ultralydsonden for at berøre motivets geldækkede område (Figur 3B). Når et levende B-tilstand billede af motivets indre organer vises på skærmen, flytte ultralyd sonde til området lidt over hoften, lige parallelt med lændehvirvlerne (sagittal plan).
- Ved hjælp af B-tilstandsdisplayet på skærmen skal du finde den højre nyre ved at identificere den store nyrearterie og cortex/medulla-adskillelse (Figur 4A). Derudover observere en del af leveren i et enkelt plan af billedet.
- Sørg for, at der er lidt at ingen billede artefakter såsom skygger og luftbobler.
- Mål et B-tilstandsforhold for at få FAT I HR-indekset.
- Sørg for, at både nyrebarken og leveren parenchyma er i samme fokusplan. Hvis det er nødvendigt, justere fokus og få kontrol for at få et klart billede.
- Juster fokus ved at dreje fokusknappen på kontrolpanelet. Juster gevinsten ved at trykke på knappen Automatisk TGC én gang.
- Tryk på frysetasten i kontrolpanelet. Sørg for, at dyret er mellem vejrtrækninger, når du fryser skærmen for at undgå slørede billeder.
- Når skærmen er frosset, skal du trykke på Måleværktøjer på berøringsskærmen. Vælg B-mode Ratio, et indbygget værktøj, der måler relativ lysstyrke af et væv fra et valgt område af interesse. Opret en 2 mm cirkel for at vælge et interesseområde. Juster cirkelstørrelsen ved at flytte en finger langs den ydre kant af trackballen på kontrolpanelet.
- Placer 2 mm cirkel på leveren billedet ROI, som skal være placeret til højre for nyrerne. Identificer levervæv baseret på dets homogene ekkogenicitet og glatte kontur.
- Når cirklen er på plads, skal du trykke på knappen Vælg i kontrolpanelet og observere den nye cirkel, der vises.
- Juster størrelsen af den nye cirkel til 2 mm, og læg den på billedet af nyrebarken. Sørg for at holde dybden af cirklerne på leveren og nyrebarken det samme. Når du er på plads, skal du trykke på knappen Vælg i kontrolpanelet. Overhold det indbyggede systemværktøj viser HR-indekset som et B-tilstandsforhold.
- Tryk på Gem billede for at gemme billedet, og hold øje med de gemte billeder, der vises som miniaturer i højre side af skærmen.
- Tryk på knappen Frys på kontrolpanelet for at frigøre billedet og vende tilbage til et billede i live B-tilstand.
- Sørg for, at både nyrebarken og leveren parenchyma er i samme fokusplan. Hvis det er nødvendigt, justere fokus og få kontrol for at få et klart billede.
- Gentag målingen af B-tilstandsforhold 3 gange på forskellige dybder og vævsplan. Beregn gennemsnittet af disse tre B-tilstandsforhold for hvert dyr og klokkeslæt.
5. Billede erhvervelse for Shear Wave Elastography
- Flyt sonden på tværs i højre underkostal område for at finde leveren ved hjælp af B-tilstand. Find et område af leveren, der er for det meste parenkym og fri for store blodkar såsom portalen vene og leverarterie. Når et klart område af leveren er fundet, generere en forskydning elasticitet kort over vævet ved at trykke på SWE-knappen på kontrolpanelet.
- Juster størrelsen og placeringen af SWE-boksen under leverkapslen i et område, der er fri for skygger. Identificer kapslen som en lys ekkogen linje nær toppen af leveren.
- Bemærk, at SWE-boksen skifter til et farvekort inden for 5-10 s. Når kassen er fuld og stabil, skal du trykke på knappen Frys på kontrolpanelet, når dyret er mellem vejrtrækningerne.
BEMÆRK: Den mindste mængde af boks dækning bør være 60-80% til præcist at vurdere elasticiteten af leveren. - Tryk på QBoxpå berøringsskærmen , et indbygget systemværktøj, der beregner elasticitet ud fra et investeringsafkast på forskydningsbølgeelasticitetskortet. Overhold den cirkel og databoks, der vises på skærmen. Juster QBox'ens placering ved at trykke på positionsikonet på berøringsskærmen til den ønskede opsætning.
- Juster cirklens størrelse til 3 mm ved at flytte en finger langs den ydre kant af trackballen på kontrolpanelet. Brug trackballen til at placere cirklen i et område uden skygge med ensartet farve (Figur 5A, B). Pas på at undgå kendte områder af stivhed såsom blodkar eller leverkapslen, samt bleed-down fra disse strukturer.
- Når der findes et passende område, skal du trykke på Gem billede i kontrolpanelet for at gemme billedet. Gentag denne procedure 3 gange i forskellige områder af leveren. Flyt sonden op og ned eller sidelæns på maven for at samle SWE-kortlagte billeder fra forskellige områder af leveren.
- Når alle billeder er indsamlet, skal du trykke på Afslut eksamen i kontrolpanelet og notere den skærm med patientoplysninger, der vises på skærmen.
- Fjern båndet fra dyrets poter, tør overskydende gel væk, og fjern dyret fra billeddannelsesfasen. Lad det komme sig efter anæstesi i et varmt, tørt bur af sig selv, indtil det er fuldt genoprettet. Overvåg hvert dyr for at sikre fuld genopretning fra anæstesi, angivet ved dets evne til at opretholde sternal liggende
- Gentag trin i afsnit 4-5 for hvert dyr i kohorten, der skal afbildes.
6. Hentning og analyse af billeddata
- Når billeder for alle dyr er blevet indsamlet, sluk for anæstesi.
- Hvis du vil trække billeddata fra maskinen, skal du trykke på knappen Gennemse i kontrolpanelet og observere alle de scanninger, der udføres på det pågældende instrument, der vises på skærmen. Søg efter de ønskede scanninger ved hjælp af søgefeltet i øverste hjørne af skærmen.
- Vælg alle scanninger, der er nødvendige for dataanalyse, ved at markere afkrydsningsfeltet ud for navnet på patienten via trackball- og select-knappen. Når alle nødvendige scanninger er fremhævet, skal du vælge Eksporter JPEG'er på berøringsskærmen. Eksporter data til et netværksdrev eller et bærbart USB-drev (Universal Serial Bus). Find USB-portene på bagsiden af instrumentet.
- Når filerne er blevet eksporteret, skal du åbne individuelle jpg-filer for hver scanning på en arbejdsstationscomputer. Overhold alle data i højre side af billedet: B-tilstand Ratio-indsamle B Ratio nummer; Q Box-indsamle den gennemsnitlige elasticitet (kPa) værdi.
- Indtast alle data i et regneark eller anden databasestyringssoftware, og udfør de ønskede statistiske analyser.
7. Histologisk analyse af leverprøver
- I slutningen af den6. uge skal du udføre obduktion på halvdelen af kohorten fra hver gruppe til midtundersøgelses histologiske analyse af leverprøverne. Tilsvarende aflive resten af kohorte af dyr, og indsamle leverprøver til histologisk analyse på 12th uge tid.
- Til ORO farvning, fastsætte lever sektioner i 10% neutral-buffered formalin, og kryopreserve dem med saccharose ved hjælp af en nedkølet 30% saccharose opløsning natten over på et minimum. Kryo-integrere sektionerne i optimal skæretemperaturforbindelse, og kryo-sektion dem på ladede dias for at forberede ORO farvning.
- Kryosektionerne placeres i 100% propylenglycol i 2 min efterfulgt af en inkubation natten over i 0,5% ORO-opløsning. Efter fjernelse fra ORO opløsningen, differentiere sektionerne i 85% propylenglycol i 1 min, skyl i deioniseret vand, og counterstain med Mayer's Hematoxylin-Lillie's modifikation i 1 min.
- Placer coverlips på diasene ved hjælp af et vandigt monteringsmedium, og tør dem ved stuetemperatur.
- For PSR, deparaffinize formalin-fast, paraffin-indlejret lever sektion dias, placere dem natten over i Bouin Fluid, og derefter plette dem ved hjælp af en automatiseret slide stainer som pr producentens protokol med nogle optimerede trin (1% fosfomolybdic syre i 5 min; 0,1% Sirius Rød i mættet picric syre i 90 min; 2 x 30 s vask i 0,5% eddikesyre). Dehydrer automatisk diasene, og monter dem derefter med et permanent monteringsmedium.
- Tag billeder af ORO- og PSR-farvede dias ved hjælp af den digitale mikroskopiscanner ved 20x forstørrelse, gem dem i .svs-format, og gem dem i diasstyringsbilleddatabasen.
- Analyser billederne ved hjælp af brugerdefinerede algoritmer, der er oprettet i digital patologisoftware. Ensartet anvende digitale patologi software applikationer med tærskelparametre til at identificere og kvantificere leveren sektioner område samt ORO- og PSR-farvede områder. Eksporter målingerne til et regneark for arealprocentberegninger.
8. Statistisk analyse
- Udfør statistisk analyse af billeddata med tovejs ANOVA ved hjælp af Sidaks test af flere sammenligninger for at vurdere forskellen mellem grupper på forskellige tidspunkter. Antag betydelige forskelle mellem grupper for sandsynlighedsværdier p ≤ 0,001. Derudover udføre korrelation af billeddannelse udlæsninger med histologiske analyser.
- Brug ikke-parametriske statistikker til at analysere de histologiske analyseresultater fra denne undersøgelse. Rapportér gruppeværdierne som median ± halvkvartilt interval (sIQR). Antag betydelige forskelle mellem grupper for sandsynlighedsværdier p ≤ 0,001. Brug en Mann-Whitney-test til at sammenligne mængden af PSR og ORO histokemisk plet mellem forskellige grupper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Et kendetegn for dyr fodret CDAHFD er steatose. Ophobning af fedt i leveren ændrer vævets ekkogene egenskaber, som kan kvantificeres ved at måle leverens lysstyrke og normalisere den til renal cortex's lysstyrke fra et B-tilstandsbillede taget i samme plan. Den kvantificerede værdi udtrykkes som et HR-indeks, som er et indirekte mål for steatose. I figur 4Aviser et repræsentativt leverbillede fra et kontroldyr omtrent lige eller mindre lysstyrke (ekkogenicitet) sammenlignet med nyrebarken. Hr-indekset for normale dyr er således <1. I denne undersøgelse er det gennemsnitlige HR-indeks for kontroldyr på 3-ugers tid 0,645 ± 0,03. I modsætning hertil viser et repræsentativt B-tilstandsbillede af et CDAHFD-fodret dyr (Figur 4A) øget lysstyrke i leveren sammenlignet med nyrebarken. Som følge heraf var HR-indekserne for repræsentative billeder fra CDAHFD-diætdyrene henholdsvis 1,91 og 1,79 på 6- og 12-ugers tid.
Figur 4C viser et plot af HR-indekser over tid fra kontrol og CDAHFD dyr. Kontrol-kost-fodret dyr viser ringe bevægelse i HR-indeksværdier fra baseline, mens CDAHFD dyr stiger hurtigt i løbet af de første 3-6 uger af undersøgelsen, før de når et plateau. Det gennemsnitlige HR-indeks for dyr, der var på en CDAHFD kost er 1.861 ± 0,06 sammenlignet med 0,328 ± 0,03 i kontrol dyr på 12 uger efter sygdom induktion. Som forventet viste leveren et signifikant højere positivt procentareal for ORO-farvning i CDAHFD-gruppen sammenlignet med kontroldiætgruppen ved 6- (34,81 ± 4,66 mod 0,49 ± 0,11) og 12 - (30,08 ± 2,64 mod 1,17 ± 0,44) ugepoint (Figur 4B, D). Der var også fremragende korrelation (Pearson r = 0,78) mellem procentområdet af ORO farvning med HR-indekset på 6- og 12-ugers tid punkter (Figur 4E). Disse resultater tyder på, at HR-indekset kan være en værdifuld billedbehandlingsudlæsning for at kvantificere steatose i prækliniske modeller af NAFLD / NASH.
Et af nøgleelementerne i måling af leverstivhed via SWE er korrekt placering af investeringsafkast (figur 5). Det venstre panel (Figur 5A) viser et repræsentativt billede med B-tilstand og SWE kortlægning af lever fra en kontrol kost dyr. Korrekt ROI placering bør være over et område, der er stabilt i farvekortet og repræsenterer den del af leveren, der måles, med et signal, der ikke er påvirket af tilstødende strukturer såsom leverkapsel og blodkar. Vævsstivhed rapporteres som E-modulus, som er en beregning baseret på forskydningsbølgehastighed og en bestemt konstant og udtrykkes i kilopascals (kPa). For kontroldyr falder E modulus mellem 3,5 kPa og 6 kPa. Den gennemsnitlige kPa af de roi'er, der blev rapporteret i figur 5A for kontroldyr, var henholdsvis 4,6 og 5,5 kPa på 6- og 12-ugers-tiderne, som falder inden for det forventede normale interval. Figur 5A viser et repræsentativt billede af SWE-tilstand fra et CDAHFD-dyr efter 6 og 12 uger. Her er investeringsafkastet igen blevet placeret nær midten af Q Box (forskydningsbølgekort), baseret på den farvede reference oven på billedet.
Som forventet med denne model er E-modulus meget højere i det CDAHFD-fodrede dyr. I disse repræsentative billeder var den gennemsnitlige kPa 10,5 efter 6 uger og 23,1 kPa ved 12 uger, hvilket indikerer betydelig vævsstivhed. En typisk NASH kost undersøgelse udnytte CDAHFD og kontrol chow bør afsløre en stabil progression af lever stivhed på grund af fibrose i CDAHFD-fodret dyr, mens kontroldyr forbliver den samme. Figur 5C viser en gradvis stigning i leverens elasticitet hos CDAHFD-dyr sammenlignet med stabil elasticitet hos kontroldyr over en 12-ugers periode. Kontrol kost elasticitet starter ved 5,80 ± 0,99 kPa på 3-ugers tid punkt og viser ikke meget forandring (6,14 ± 0,59) i løbet af 12-ugers undersøgelse. Den cholin-mangelfuld kost, dog, viser en betydelig stigning ganske tidligt, nåede 12,07 ± 2,37 kPa i uge 6. Tendensen i øget elasticitet fortsætter i CDAHFD kost som undersøgelsen skrider frem, nåede 24,43 ± 9,29 kPa på 12 uger efter særlige kost indledning.
Leverprøver blev plettet med PSR at lokalisere kollagen som en korrel af fibrose. Som forventet med denne model observeres der en signifikant højere procentdel af lever-PSR-positiv farvning hos CDAHFD-dyr sammenlignet med kontroldiæten ved både 6- og 12-ugers tid (Figur 5D). For at fastslå nytten af forskydningsbølgen som en surrogatmetode til ex vivo farvning blev forskydningsbølge E Modulus-numre afbildet mod det PSR-farvede område i CDAHFD-rotter i figur 5E for at bestemme korrelationen. Analyse af plottet afslørede en stram klynge med en Pearson 'r' værdi på 0,88, hvilket indikerer stærk korrelation. Det skal bemærkes, at de resultater, der rapporteres her, er repræsentative for, hvad der kunne forventes i en undersøgelse ved hjælp af en cholin-mangelfuld, fedtholdig kost til at fremkalde NASH. Denne metode kan også bruges sammen med andre prækliniske NASH-modeller. Det vil dog give forskellige resultater og afskæringsværdier afhængigt af sygdoms induktionsprotokollen. Ligesom rotte NASH model, SWE billedbehandling i CDAHFD-induceret NASH mus model viste fremragende sammenhæng mellem leveren elasticitet værdier og procentdelen af PSR-positive farvede område i leveren13. SWE kan således være et værdifuldt værktøj til at vurdere leverfibrose i prækliniske modeller af NAFLD/NASH.
Figur 1: Opsætning af billedbehandling. Ultralydtransduceren (a) holdes af den faldende arm. Billeddannelsesstadiet (b) har et område til at klemme anæstesislangen og oprette en næsekegle (c) for kontinuerlig anæstesi under billeddannelse. Scenen er også opvarmet og udstyret med sonder til at overvåge kropstemperaturen. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Shear Wave Elastography instrumentet. (A) Forskydningsbølge elastografiinstrumentet er en enkelt, hjulet enhed med fastgørelsesporte til op til 4 ultralydsonder. (B) Den øverste skærm fungerer som det visuelle output til visning af billeder i realtid samt visning af patientdata og systemoversigt. (C) Det centrale kontrolpanel indeholder de fleste knapper og knapper, der er nødvendige for at justere skærmen og hente billeder. (D) Den nederste skærm er en berøringsskærm med yderligere kontrolelementer og kommandoer til billedopsamling og justering. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Dyrepositionering og korrekt transducerplacering. (A) Når et dyr er blevet korrekt placeret på scenen og fastholdt med tape-in venstre lateral liggende liggende(B) sænkes ultralydsonden ned på rotten og rører gelen, der er placeret på maven / siden. Når sonden rører gelen i positionen i panel B, kan nyrerne og leveren ses i sammenstilling på skærmen. Dette er en optimal position til at indsamle hepato-nyreindekset, og i nogle tilfælde også forskydningsbølgenumrene. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Hepato-nyreindeksresultater. (A) Repræsentativt billede af HR-indekser fra kontrol- og CDAHFD-diætrotter på 6- og 12-ugers tid. ROI (rød) blev trukket i nyrerne (venstre cirkel) og leveren (højre cirkel), så et forhold mellem signalerne blev bestemt (B Ratio, højre datatabel). (B) Repræsentative ORO-farvede histologiske dele af leverprøver fra kontrol- og CDAHFD-diætrotter på 6- og 12-ugers tidspunkter. Skalabarer = 300 μm. (C) Grafisk repræsentation af HR-indekset over et sygdomsfremkaldende kosttidsforløb. Kontrol rotte data er repræsenteret i blå, CDAHFD rotte data med rødt. Grafen viser middelværdier med standardfejl i middelværdien (n = 20 på 3-ugers tid og n = 20 for kontrol og n= 19 for CDAHFD på 6 uger, n = 10 ved 9- og 12-ugers tid punkter (sammenligne kontrol versus CDAHFD på hvert tidspunkt *, **, ***, **** p < 0,001). (D) Lever ORO beregninger afbildet for hvert gangpunkt (n = 10). Grafen viser medianværdier med interkvilområde (*, ** p < 0,001). (E) Korrelationsgraf, der sammenligner procentlever ORO-positivt område versus HR-indekset. Forkortelser: HR = hepato-renal; CDAHFD = cholin-mangelfuld, fedtrig kost; ROI = interesseområder; ORO = Oil Red O. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Resultater af shearbølgeelastografi. (A) Repræsentativt billede af SWE-kort fra kontrol og CDAHFD kostrotter på 6- og 12-ugers tidspunkter. ROI (rød) blev trukket i nyrerne (venstre cirkel) og leveren (højre cirkel), så et forhold mellem signalerne blev bestemt (B Ratio, højre datatabel). (B) Repræsentative ORO-farvede histologiske dele af leverprøver fra kontrol- og CDAHFD-diætrotter på 6- og 12-ugers tidspunkter. Skalastangen på histologiske sektioner er 300 μm. (C) Grafisk repræsentation af levervævsstivhed i en 12-ugers diæt-induceret NASH rottemodel. Grupper blev fodret normal chow (blå) eller cholin-mangelfuld, fedtholdig kost (rød) (n = 20 på 3 og 6 uger, n = 10 på 9- og 12-ugers tid punkter). Grafen viser middelværdier med standardfejl af middelværdien (n = 20 ved 3 og 6 uger, n = 10 ved 9- og 12-ugers tidpunkter (sammenligning af kontrol versus CDAHFD på hvert tidspunkt *, **, *** p < 0,001). (D) Grafisk repræsentation af kollagenfordeling i ex vivo histologiske leverprøver ved hjælp af kollagenspecifik PSR-plet (n = 10). Grafen viser medianværdier med interkvilområde (*, ** P < 0,001) (E) Korrelationsgraf, der sammenligner procent positivt lever PSR-farvningsområde versus SWE-elasticitet. SWE = forskydningsbølgeelastografi; CDAHFD = cholin-mangelfuld, fedtrig kost; ROI = interesseområder; ORO = Olierød O; NASH = alkoholfri steatohepatitis; PSR = Picro Sirius Rød. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ultralydsbaseret billeddannelse, herunder SWE, kan være et uvurderligt værktøj til langsgående vurdering af lever steatose og stivhed i prækliniske modeller af NAFLD / NASH. Dette papir beskriver detaljerede metoder til, hvordan man erhverver B-tilstand af høj kvalitet samt SWE-billeder af lever til måling af HR-indekset og elasticitet ved hjælp af en CDAHFD-diætinduceret rottemodel af NASH. Endvidere viser resultaterne fremragende korrelation mellem HR-indekset og elasticitet med guldstandarden for evaluerings-histologisk vurdering af levervæv. Selv om selve proceduren synes at være ukompliceret, er der nogle kritiske aspekter af protokollen, der vil sikre vellykkede resultater.
Placeringen af transduceren er nøglen, især når man leder efter nyrerne til at måle HR-indekset i B-tilstand. Placering af sonden for tæt på ribbenene kan resultere i ribben skygge, hvilket skaber falske foranstaltninger af ultralyd dæmpning. Desuden er fjernelsen af alt hår ved hjælp af både barbering og depilation creme vigtig, da resterende hår kan fange luftbobler, hvilket vil kaste skygger på B-mode billeder. Endelig, da tilstedeværelsen af mad i maven og tarmene kan skjule leveren, især i normale chow-fodrede dyr, er tilstrækkelig faste af alle dyr afgørende for vellykket billeddannelse af leveren.
Selvom leverelasticitetsmålinger fra SWE og HR-indekset er værdifulde udlæsninger til vurdering af leverfibrose og steatose i prækliniske modeller af NASH, har teknikken et par begrænsninger. Faktorer som betændelse, levertrængsthed, kolestase og obstruktion af udstrømning af udstrømningsorganer påvirker leverstivheden og kan således påvirke den generelle specificitet af denne teknik til måling af leverfibrose8,14,15,16. På samme måde kan lysstyrken af leveren i B-tilstand ultralydsbilleder påvirkes af fibrose og dermed påvirke nøjagtigheden af HR-indekset ved måling af steatose. Der er behov for flere undersøgelser for at præcisere bidraget fra disse faktorer, der påvirker elasticitet og steatose, og etablere afskæringsværdier for disse udlæsninger i forskellige prækliniske modeller af NASH. Endvidere vurderede denne undersøgelse ikke HR-indeksets følsomhed som biomarkør for at vurdere lever steatose i et præklinisk effektstudie.
Måling af leverstivhed ved hjælp af SWE har potentiale til at blive et værdifuldt værktøj til at forstå patofysiologien af NASH / NAFLD samt til at udvikle nye behandlinger for denne tilstand. Ved at tillade forskeren at bestemme både lever steatose og væv stivhed uden behov for en invasiv biopsi, dyr i prækliniske undersøgelser kan overvåges langsgående, og narkotika virkninger på de enkelte forsøgspersoner kan kvantificeres over tid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle forfattere er ansatte i Pfizer, Inc.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Pfizer Comparative Medicine Operations Team for deres hårde arbejde med at passe og sikre studiedyrenes sundhed samt hjælpe med nogle af teknikkerne. Også, tak er skyldige til Danielle Crowell, Gary Seitis, og Jennifer Ashley Olson for deres hjælp med vævsbehandling for histologiske analyser. Derudover vil forfatterne gerne takke Julita Ramirez for at gennemgå og give værdifuld feedback under udarbejdelsen af dette manuskript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aixplorer | Supersonic Imagine | Shear Wave Elastography Instrument | |
| Aixplorer SuperLinear SLH20-6 Transducer | Supersonic Imagine | Transducer for Shear Wave Elastography | |
| Alpha-dri bedding | rat cages | ||
| Aperio AT2 scanner | Leica Biosystems | Digital Pathology Brightfield Scanner | |
| Compac 6 Anesthesia System | VetEquip | Anesthesia Vaporizer and Delivery System. Any anesthesia delivery system can be used, however. | |
| Manage Imager Database | Leica Biosystems | Digital Pathology | |
| Mayer's Hematoxilin | Dako/Agilent | H&E Staining/Histology | |
| Nair | Church & Dwight | Hair remover | |
| Oil Red O solution | Poly Scientific | Lipid Staining/Histology | |
| Picrosirius Red Stain (PSR) | Rowley Biochemical | F-357-2 | Collagen Stain/Histology |
| Puralube Opthalmic ointment | Dechra Veterinary Product | Lubrication to prevent eye dryness during anesthesia | |
| Tissue-Tek Prisma Plus | Sakura Finetek USA | Automated slide stainer | |
| VISIOPHARM software | Visiopharm | Digital pathology software | |
| Research Diets | A06071309i | NASH inducing diet | |
| Purina | 5053 | Control animal chow | |
| Vevo imaging station | Fujifilm VisualSonics | The Vevo imaging station is used for holding the ultrasound transducer during imaging. | |
| Wistar Han rats | Charles River Laboratories |
References
- Younossi, Z. M., et al. Global epidemiology of nonalcoholic fatty liver disease-Meta-analytic assessment of prevalence, incidence, and outcomes. Hepatology. 64 (1), 73-84 (2016).
- Boland, M. L., et al. Towards a standard diet-induced and biopsy-confirmed mouse model of non-alcoholic steatohepatitis: Impact of dietary fat source. World Journal of Gastroenterology. 25 (33), 4904-4920 (2019).
- Oldham, S., Rivera, C., Boland, M. L., Trevaskis, J. L. Incorporation of a survivable liver biopsy procedure in mice to assess non-alcoholic steatohepatitis (NASH) resolution. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (146), e59130 (2019).
- Bercoff, J., Tanter, M., Fink, M. Supersonic shear imaging: a new technique for soft tissue elasticity mapping. IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 51 (4), 396-409 (2004).
- Bavu, E., et al. Noninvasive in vivo liver fibrosis evaluation using supersonic shear imaging: a clinical study on 113 hepatitis C virus patients. Ultrasound in Medicine & Biology. 37 (9), 1361-1373 (2011).
- Ferraioli, G., et al. Accuracy of real-time shear wave elastography for assessing liver fibrosis in chronic hepatitis C: a pilot study. Hepatology. 56 (6), 2125-2133 (2012).
- Ross, T. T., et al. Acetyl-CoA carboxylase inhibition improves multiple dimensions of NASH pathogenesis in model systems. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 10 (4), 829-851 (2020).
- Gu, L. H., Gu, G. X., Wan, P., Li, F. H., Xia, Q. The utility of two-dimensional shear wave elastography and texture analysis for monitoring liver fibrosis in rat model. Hepatobiliary & Pancreatic Diseases International. 20 (1), 46-52 (2020).
- Marshall, R. H., Eissa, M., Bluth, E. I., Gulotta, P. M., Davis, N. K. Hepatorenal index as an accurate, simple, and effective tool in screening for steatosis. American Journal of Roentgenology. 199 (5), 997-1002 (2012).
- Webb, M., et al. Diagnostic value of a computerized hepatorenal index for sonographic quantification of liver steatosis. American Journal of Roentgenology. 192 (4), 909-914 (2009).
- Tous, M., Ferre, N., Camps, J., Riu, F., Joven, J. Feeding apolipoprotein E-knockout mice with cholesterol and fat enriched diets may be a model of non-alcoholic steatohepatitis. Molecular and Cellular Biochemistry. 268 (1-2), 53-58 (2005).
- Kirsch, R., et al. Rodent nutritional model of non-alcoholic steatohepatitis: species, strain and sex difference studies. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 18 (11), 1272-1282 (2003).
- Journal of Ultrasound in Medicine.
- Engelmann, G., Quader, J., Teufel, U., Schenk, J. P. Limitations and opportunities of non-invasive liver stiffness measurement in children. World Journal of Hepatology. 9 (8), 409-417 (2017).
- Piscaglia, F., Salvatore, V., Mulazzani, L., Cantisani, V., Schiavone, C. Ultrasound shear wave elastography for liver disease. a critical appraisal of the many actors on the stage. Ultraschall in der Medizin. 37 (1), 1-5 (2016).
- Singh, S., Loomba, R. Role of two-dimensional shear wave elastography in the assessment of chronic liver diseases. Hepatology. 67 (1), 13-15 (2018).
