Summary
Detta protokoll beskriver användningen av en förbättrad ultraljud teknik att icke-invasivt observera och kvantifiera levervävnad förändringar i gnagare modeller av alkoholfri fettlever sjukdom.
Abstract
Alkoholfri Steatohepatitis (NASH) är ett tillstånd inom spektrumet av alkoholfri fettleversjukdom (NAFLD), som kännetecknas av ackumulering av leverfett (steatos) och inflammation som leder till fibros. Prekliniska modeller som nära rekapitlar mänskliga NASH/NAFLD är viktiga i läkemedelsutveckling. Medan leverbiopsi för närvarande är guldstandarden för att mäta NAFLD/ NASH progression och diagnos i kliniken, i det prekliniska utrymmet, antingen insamling av hela leverprover vid flera tidpunkter under en studie eller biopsi av lever behövs för histologisk analys för att bedöma sjukdomsstadiet.
Att genomföra en leverbiopsi mitt i studien är ett invasivt och arbetsintensivt förfarande, och insamling av leverprover för att bedöma sjukdomsnivå ökar antalet forskningsdjur som behövs för en studie. Således finns det ett behov av en tillförlitlig, översättbar, icke-invasiv bildåtergivning biomarkör för att upptäcka NASH/NAFLD i dessa prekliniska modeller. Icke-invasiva ultraljudsbaserade B-lägesbilder och Shear Wave Elastography (SWE) kan användas för att mäta steatos samt leverfibros. För att bedöma nyttan av SWE i prekliniska gnagaremodeller av NASH placerades djur på en pro-NASH-diet och genomgick icke-invasiv ultraljud B-läge och shear wave elastography imaging för att mäta hepatorenal (HR) index och leverelasticitet, mäta progression av både leverfett ackumulering respektive vävnad styvhet, vid flera tidpunkter under loppet av en given NAFLD /NASH studie.
HR index och elasticitet siffror jämfördes med histologiska markörer av steatosis och fibros. Resultaten visade en stark korrelation mellan HR-indexet och procentandelen oil red o (ORO) färgning, liksom mellan elasticitet och Picro-Sirius Red (PSR) färgning av lever. Den starka korrelationen mellan klassiska ex vivo-metoder och in vivo-bildbehandlingsresultat ger bevis för att shear wave elastography/ultraljud-baserad avbildning kan användas för att bedöma sjukdomen fenotyp och progression i en preklinisk modell av NAFLD/NASH.
Introduction
Alkoholfri fettleversjukdom (NAFLD) är ett metaboliskt tillstånd som kännetecknas av en överdriven uppbyggnad av fett i levern och blir snabbt en ledande leversjukdom över hela världen med en nyligen rapporterad global prevalens på 25%1. Alkoholfri steatohepatit (NASH) är ett mer avancerat stadium av spektrumet av NAFLD, kännetecknas av överskott av leverfett med progressiv cellulär skada, inflammation och fibros. Dessa sjukdomar är ofta tysta, oupptäckta via blodprov eller rutinundersökningar, tills betydande skador redan har uppstått på en patients lever. För närvarande är guldstandarden för att diagnostisera NASH hos patienter genom histologisk undersökning av patientbaserade leverbiopsiprover. På samma sätt förlitar sig prekliniska forskare som arbetar för att förstå patogenesen vid NASH/ NAFLD samt läkemedelsutvecklingsindustrin på in vivo wedge biopsi av leverprover eller terminal dödshjälp av satellitkohorter för histologi för att mäta steatos, inflammation och fibros.
Till exempel har leverkilbiopsi varit en standardteknik för att bedöma steatohepatit och fibros när du använder GUBRA NASH-modellen2. Leverkilens biopsimetod är invasiv och mödosam hos små djur3. Användningen av wedge leverbiopsi i mitten av en studie representerar en extra experimentell variabel i en sjukdomsmodell, vilket ofta ökar antalet djur som behövs. Med dessa faktorer i åtanke visar sig icke-invasiva bildframställningstekniker som kan användas för att tillförlitligt bedöma steatos och fibros i NASH/ NAFLD djurmodeller vid tidiga tidpunkter vara värdefulla. Shear wave elastography (SWE) är en ultraljudsbaserad metod som används för att mäta elasticiteten hos mjuka vävnader. Tekniken mäter förökningen av saxvågor skapade av överljuds ultraljudspulser riktade mot ett vävnadsmål och beräknar sedan ett värde som kallas E modulus4. Snjuvvågens hastighet står i proportion till graden av vävnadsstelhet.
Figur 1 och figur 2 visar bildområdesinställningen och SWE-instrumentet. SWE-instrumentet är en enda hjulenhet med två skärmar och en kontrollpanel som visas i figur 2A. Den övre bildskärmen( figur 2B) fungerar som datorskärm och visar bilder och patientkataloger. Kontrollpanelen (Figur 2C) är en matris med knappar och rattar som styr allmänna aspekter av bildinspelning: frysskärm, spara bilder, ändra från ett läge till ett annat. Den nedre skärmen (Figur 2D) är en pekskärm med ytterligare kontroller för att ändra inställningar och fungerar som ett tangentbord för att mata in data efter behov. Instrumentet är utrustat med en penna att använda på pekskärmen om så önskas. Ultraljudssonder fästs på enhetens nedre frontpanel. För B-läge och SWE-avbildning hos gnagare användes den superlinjesnära 6 till 20 MHz-givaren. Denna förmåga att icke-invasivt mäta vävnadsstelhet gör SWE till ett värdefullt verktyg för identifiering och iscensättning av leverfibros5 hos NASH-patienter, vilket minskar behovet av mer invasiva metoder. SWE har i själva verket använts för att mäta leverfibros hos patienter och är en FDA-godkänd metod för att få fibros på kliniken6. Att använda SWE för att övervaka NASH-utvecklingen i djurmodeller av sjukdomen skulle vara ett översättningsverktyg för utveckling av behandlingar och samtidigt förbättra djurens välbefinnande genom att minska antalet djurförsök och förfining av in vivo-procedurer för att minimera smärta och ångest.
SWE imaging hos mänskliga patienter använder en lågfrekvent ultraljudsgivare4, som inte är idealisk för små djur. Särskilt högfrekventa SWE-tekniker har använts för att utvärdera effekten av acetyl-CoA karboxylashämning på patogenes av NASH i en råttamodell 7, och nyttan av denna teknik har beskrivits i koltetraklorid råtta modeller av leverfibros med framgångsrika resultat jämfört med traditionella METAVIR histologiska poängmetoder8. Den befintliga litteraturen saknar dock detaljerad teknik- och metodinformation om tillämpningen av SWE imaging i prekliniska modeller av NASH. Som beskrivits ovan, lever steatosis är en av de viktigaste funktionerna i NAFLD/NASH villkoret och är ett viktigt steg där ingripande kan övervägas. Således, bedöma lever fett ackumulering med hjälp av en imaging modalitet är lika viktigt som att bedöma lever fibros i prekliniska modeller av NASH/NAFLD.
En ultraljudsteknik som kallas HR-indexet, ett förhållande av leverns vävnadsljushet jämfört med njurbarkens, har använts som surrogatmarkör av steatos ikliniken 9,10. Detta tillvägagångssätt har dock inte använts i någon större utsträckning i prekliniska djurmodeller av NAFLD/NASH. Denna artikel beskriver en metod för att mäta elasticitet samt HR-indexet som en surrogatmarkör av leverfibros respektive steatos, i en kolin-bristfällig, fettrik diet (CDAHFD) råtta modell av NAFLD/NASH. Denna modell inducerar snabb steatos, leverinflammation och fibros, vilket är mätbart inom 6 veckor hos möss11. Tillsats av kolesterol (1%) till denna diet har visat sig främja fibrogenes hos råttor12, vilket gör denna modell till en lämplig kandidat för valideringsstudier som involverar skjuvvågsavbildning. Sammantaget kan denna bildteknik också tillämpas på ett brett spektrum av NASH-modeller/dieter där steatos och/eller fibros är en slutpunkt av intresse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurinblandade förfaranden granskades och godkändes av Pfizers institutional animal care and use committee (IACUC) och genomfördes i en AAALAC (Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care) International ackrediterad anläggning.
1. Induktion av sjukdomar
- Använd hane Wister Han råttor (150-175 g; ~ 6-7 veckor gamla; totalt 40 råttor) som är fria från kända råtta adventitial patogener. Hus råttorna i par i individuellt ventilerad bäddning med papperssängkläder (se materialtabellen)och behåll dem vid 22 ± 1 °C, 40-70% relativ fuktighet med en 12:12 h ljus-mörk cykel.
- Placera råttorna som väger 150-175 g (~ 6-7 veckor gamla) på en kolinbrist, fettrik kost med 1% kolesterol (n = 20) eller en vanlig labbgnagare chow (n = 20) beroende på studiens design.
OBS: I denna studie var totalt 40 råttor inskrivna med 20 djur per grupp. I slutet av den6: e veckan var hälften av kohorten från varje grupp obduktion för mid-study histologiska analys av leverprover. Provstorleken var således 10 djur per grupp för9: e och 12:e veckans tidpunkter.
2. Instrumentinställning
- Ställ in avbildningsområdet på följande sätt: inkludera en uppvärmd yta för att hålla djuret varmt under avbildning (c i figur 1)och en säkrad anestesinäskon för att leverera inhalatoranestesi för att upprätthålla ett anestesiplan under hela proceduren (b i figur 1).
- Använd en ultraljudssondhållare för att underlätta förflyttning av ultraljudssonden till önskad plats och för att förhindra att sonden vilar på djuret.
- Använd uppvärmd ultraljudsgel på huden där ultraljudsbilden förvärvas.
- Underhåll följande inställningar under hela proceduren, som kan justeras på pekskärmen: Akustisk effekt 0,0 dB; Mjukpapper tuner 1540 m/s; Dynamiskt intervall 60 dB; Elasticitetsintervall (för SWE-läge) < 30 kPa.
- Fäst ultraljudssonden på skensystemet i den specialiserade hållaren (a i figur 1).
- Slå på instrumentet och låt det starta upp. När bildskärmen är påkopplad bör du notera B-lägesbilden med information om anslutna givare.
3. Ämnesförberedelser
- Se till att djuren är fastade minst 4 timmar före avbildningsproceduren för att förhindra att tarminnehållet stör bildförvärvet.
- Efter minst 4 timmar fasta, placera en råtta i en isofluranbedövningskammare tills en lämplig nivå av anestesi uppnås, bekräftad av inget svar på tånypa. Exponera djuren för 3-5% isofluran i 3-5 min för att inducera anestesi.
- För underhållsbedövning, håll djuren under 2-3% isofluran under bildförvärv. Applicera oftalmisk salva för att skydda ögat från torkning under anestesi.
- När anestesi har uppnåtts, ta bort ett djur från induktionskammaren och placera det på en varmvattencirkulationsfilt. Placera en bedövningsnäskon över nosen och raka djuret på höger sida, från bröstkorgen till bäckenet. Använd kemisk depilationskräm för att ta bort allt återstående hår i detta område.
- När håret har avlägsnats, placera ett djur i vänster lateral kumbency med övre tassar tejpade ovanför huvudet på en varm bildplattform (Figur 3A).
- Tryck på patientknappen på instrumentkontrollpanelen och identifiera motivet enligt studiens utformning.
- Öppna tangentbordsfunktionen på instrumentet genom att trycka på ikonen på pekskärmen. Skriv namnen efter önskemål.
- Tryck på Avsluta för att avsluta patientnamnskärmen. Observera att B-läge öppnas igen på bildskärmen.
4. Bildförvärv för indexmätning av hepato-renal (HR)
- Applicera en liten mängd uppvärmd ultraljudsgel på den depilerade hudregionen på djuret.
- Flytta ultraljudssonden för att vidröra motivets geltäckta område (figur 3B). När en levande B-lägesbild av motivets inre organ visas på monitorn, flytta ultraljudssonden till området något ovanför höften, precis parallellt med ländkotorna (sagittalplan).
- Använd B-lägesdisplayen på monitorn och lokalisera rätt njure genom att identifiera den stora njurartären och cortex/medulla-separationen(figur 4A). Observera dessutom en del av levern i ett enda plan av bilden.
- Se till att det finns små eller inga bildartefakter som skuggor och luftbubblor.
- Mät ett B-lägesförhållande för att erhålla HR-indexet.
- Se till att både njurbarken och leverparenkym är i samma fokusplan. Om det behövs justerar du fokus och får kontroll för att få en tydlig bild.
- Justera fokus genom att vrida fokusratten på kontrollpanelen. Justera förstärkningen genom att trycka på knappen Automatisk TGC en gång.
- Tryck på Frys på kontrollpanelen. Se till att djuret är mellan andetagen när du fryser skärmen för att undvika suddiga bilder.
- När skärmen är frusen trycker du på Mätverktyg på pekskärmen. Välj B-lägesförhållande, ett inbyggt verktyg som mäter relativ ljusstyrka för en vävnad från en vald intresseregion. Skapa en cirkel på 2 mm för att välja en intresseregion (ROI). Justera cirkelstorleken genom att flytta ett finger längs styrkulans ytterkant på kontrollpanelen.
- Placera 2 mm cirkeln på leverbilden ROI, som ska placeras till höger om njuren. Identifiera levervävnad baserad på dess homogena ekogenicitet och släta kontur.
- När cirkeln är på plats trycker du på knappen Välj på kontrollpanelen och observerar den nya cirkeln som visas.
- Justera storleken på den nya cirkeln till 2 mm och placera den på bilden av njurbarken. Var noga med att hålla djupet på cirklarna på lever- och njurbarken detsamma. När du är på plats trycker du på knappen Välj på kontrollpanelen. Observera att det inbyggda systemverktyget visar HR-indexet som ett B-lägesförhållande.
- Tryck på Spara bild för att spara bilden och observera de sparade bilderna som visas som miniatyrer till höger på bildskärmen.
- Tryck på knappen Frys på kontrollpanelen för att låsa upp bilden och återgå till en live B-lägesbild.
- Se till att både njurbarken och leverparenkym är i samma fokusplan. Om det behövs justerar du fokus och får kontroll för att få en tydlig bild.
- Upprepa B-lägesmätningen 3 gånger på olika djup och plan för vävnad. Beräkna genomsnittet av dessa tre B-lägesförhållanden för varje djur och tidpunkt.
5. Bildförvärv för Shear Wave Elastography
- Flytta sonden tvärgående i rätt delkostalområde för att hitta levern med B-läge. Lokalisera ett område i levern som mestadels är parenkym och fritt från stora blodkärl som portal ven och leverartären. När ett tydligt område av levern har hittats, generera en savelasticitetskarta över vävnaden genom att trycka på SWE-knappen på kontrollpanelen.
- Justera storleken och positionen på SWE-lådan under leverkapseln i ett område som är fritt från skuggor. Identifiera kapseln som en ljus ekogen linje nära toppen av levern.
- Observera att SWE-rutan övergår till en färgkarta inom 5-10 s. När lådan är full och stabil trycker du på frysknappen på kontrollpanelen när djuret är mellan andetagen.
OBS: Minsta mängd boxtäckning bör vara 60-80% för att noggrant bedöma leverns elasticitet. - På pekskärmen trycker du på QBox, ett inbyggt systemverktyg som beräknar elasticitet från en ROI på sxvågens elasticitetskarta. Observera cirkeln och datarutan som visas på bildskärmen. Justera QBox position genom att trycka på positionsikonen på pekskärmen till önskad inställning.
- Justera cirkelns storlek till 3 mm genom att flytta ett finger längs styrkulens ytterkant på kontrollpanelen. Placera cirkeln i ett område fritt från skugga med enhetlig färgning (Bild 5A, B ) med hjälpav styrkulan. Var noga med att undvika kända områden av styvhet som blodkärl eller leverkapseln, samt blöda ner från dessa strukturer.
- När ett lämpligt område hittas trycker du på Spara bild på kontrollpanelen för att spara bilden. Upprepa denna procedur 3 gånger i olika delar av levern. Flytta sonden upp och ner eller i sidled på buken för att samla swe-kartlagda bilder från olika delar av levern.
- När alla bilder har samlats in trycker du på Slutprov på kontrollpanelen och noterar patientinformationsskärmen som visas på bildskärmen.
- Ta bort tejpen från djurets tassar, torka bort överskottsgel och ta bort djuret från bildstadiet. Låt den återhämta sig från anestesi i en varm, torr bur av sig själv tills den är helt återställd. Övervaka varje djur för att säkerställa fullständig återhämtning från anestesi, vilket indikeras av dess förmåga att upprätthålla sternal kapacitet
- Upprepa steg i avsnitt 4-5 för varje djur i kohorten som ska avbildas.
6. Hämtning och analys av bilddata
- När bilder för alla djur har samlats in, stäng av anestesin.
- Om du vill hämta bilddata från datorn trycker du på knappen Granska på kontrollpanelen och observerar alla skanningar som utförs på instrumentet som visas på bildskärmen. Sök efter önskade skanningar med hjälp av sökfönstret i det övre hörnet av skärmen.
- Markera alla skanningar som behövs för dataanalys genom att markera rutan bredvid patientens namn via knappen trackball och Select. När alla nödvändiga skanningar har markerats väljer du Exportera JPEG:er på pekskärmen. Exportera data till en nätverksenhet eller en bärbar USB-enhet (Universal Serial Bus). Leta reda på USB-portarna på baksidan av instrumentet.
- När filerna har exporterats öppnar du enskilda jpg-filer för varje skanning på en arbetsstationsdator. Observera alla data på bildens högra sida: B Mode Ratio-collect B Ratio-numret; Q Box-samla in det genomsnittliga elasticitetsvärdet (kPa).
- Ange alla data i ett kalkylblad eller annan databashanteringsprogramvara och utför önskade statistiska analyser.
7. Histologisk analys av leverprover
- I slutet av den6: e veckan, utför obduktion på hälften av kohorten från varje grupp för mid-study histologisk analys av leverproverna. På samma sätt avliva resten av djurens kohort och samla in leverprover för histologisk analys vid den 12:e veckans tidpunkt.
- För ORO-färgning, fixa leversektioner i 10% neutralbuffrad formalin och kryopreservera dem med sackaros med en kyld 30% sackaroslösning över natten åtminstone. Cryo-bädda in sektionerna i optimal skärtemperaturförening och kryosektionera dem på laddade bilder för att förbereda för ORO-färgning.
- Placera kryosektionerna i 100% propylenglykol i 2 min följt av en inkubation över natten i 0,5% ORO-lösning. Efter borttagning från ORO-lösningen, differentiera sektionerna i 85% propylenglykol i 1 min, skölj i avjoniserat vatten och kontrahålla med Mayers Hematoxylin-Lillies modifiering i 1 min.
- Placera täcken på diabilderna med hjälp av ett vattenhaltigt monteringsmedium och torka dem vid rumstemperatur.
- För PSR, deparaffinisera formalin-fasta, paraffin-inbäddade leversektionsbilder, placera dem över natten i Bouin Fluid och sedan färga dem med en automatiserad glidfärg enligt tillverkarens protokoll med några optimerade steg (1% fosfomolybinsyra i 5 min; 0,1% Sirius Röd i mättad bildsyra i 90 min; 2 x 30 s tvätt i 0,5% ättiksyra). Torka bilderna automatiskt och montera dem sedan med ett permanent monteringsmedium.
- Ta bilder av de ORO- och PSR-färgade bilderna med den digitala mikroskopiskannern vid 20x förstoring, spara dem i SVS-format och lagra i bildhanterarens bilddatabas.
- Analysera bilderna med hjälp av anpassade algoritmer som skapats i programvara för digital patologi. Tillämpa program för digitala patologiprogram på ett enhetligt sätt med tröskelparametrar för att identifiera och kvantifiera leversektionsområdet samt oro- och PSR-färgade områden. Exportera måtten till ett kalkylblad för beräkningar av areaprocent.
8. Statistisk analys
- Gör statistisk analys av bilddata med tvåvägs ANOVA med Sidaks multipla jämförelsetest för att bedöma skillnaden mellan grupper vid olika tidpunkter. Anta betydande skillnader mellan grupper för sannolikhetsvärden ≤ 0,001. Dessutom, utföra korrelation av imaging avläsningar med histologiska analyser.
- Använd icke-parametrisk statistik för att analysera de histologiska analysresultaten från denna studie. Rapportera gruppvärdena som median ± halvkvartstilintervall (sIQR). Anta betydande skillnader mellan grupper för sannolikhetsvärden ≤ 0,001. Använd ett Mann-Whitney-test för att jämföra mängden PSR- och ORO histokemisk fläck mellan olika grupper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ett kännetecken för djur som utfodras med CDAHFD är steatos. Ackumulering av fett i levern förändrar vävnadens ekogena egenskaper, vilket kan kvantifieras genom att mäta leverns ljusstyrka och normalisera den till njurbarkens ljusstyrka från en B-lägesbild tagen i samma plan. Det kvantifierade värdet uttrycks som ett HR-index, vilket är ett indirekt mått på steatos. I figur 4Avisar en representativ leverbild från ett kontrolldjur ungefär lika eller mindre ljusstyrka (ekogenicitet) jämfört med njurbarken. Hr-indexet för normala djur är således <1. I denna studie är det genomsnittliga HR-indexet för kontrolldjur vid 3-veckorspunkten 0,645 ± 0,03. Däremot visar en representativ B-lägesbild av ett CDAHFD-matat djur (Figur 4A) ökad ljusstyrka i levern jämfört med njurbarken. Som ett resultat var HR-indexen för representativa bilder från CDAHFD-dietdjuren 1,91 respektive 1,79 vid tidpunkterna 6 respektive 12 veckor.
Figur 4C visar en lista över HR-index över tid från kontroll- och CDAHFD-djur. Kontrolldietmatade djur visar liten rörelse i HR-indexvärden från baslinjen, medan CDAHFD-djur stiger snabbt under de första 3-6 veckorna av studien innan de når en platå. Det genomsnittliga HR-indexet för djur som hade en CDAHFD-diet är 1 861 ± 0,06 jämfört med 0,328 ± 0,03 hos kontrolldjur vid 12 veckors induktion efter sjukdomen. Som förväntat visade levern ett betydligt högre positivt procentområde för ORO-färgning i CDAHFD-gruppen jämfört med kontrolldietgruppen vid 6- (34,81 ± 4,66 jämfört med. 0,49 ± 0,11) och 12- (30,08 ± 2,64 jämfört med 1,17 ± 0,44) veckotidspunkter(figur 4B,D). Det fanns också utmärkt korrelation (Pearson r = 0,78) mellan procentområdet oro färgning med HR-indexet vid 6- och 12-veckors tidpunkter(figur 4E). Dessa resultat tyder på att HR index kan vara en värdefull imaging avläsning för att kvantifiera steatosis i prekliniska modeller av NAFLD/NASH.
Ett av de viktigaste inslagen i att mäta leverstelhet via SWE är korrekt placering av AVKASTNINGEN (Figur 5). Den vänstra panelen (Figur 5A) visar en representativ bild med B-läge och SWE-kartläggning av lever från ett kontrolldietdjur. Korrekt ROI-placering bör vara över ett område som är stabilt i färgkartan och representerar den del av levern som mäts, med en signal som inte påverkas av angränsande strukturer som leverkapseln och blodkärlen. Vävnadsstelhet rapporteras som E-modulus, vilket är en beräkning baserad på saxvågshastighet och en bestämd konstant och uttrycks i kilopascals (kPa). För kontrolldjur faller E-modulusen mellan 3,5 kPa och 6 kPa. Den genomsnittliga kPa för de rois som rapporterades i figur 5A för kontrolldjur var 4, 6 respektive 5,5 kPa vid 6- respektive 12-veckors tidpunkterna, vilket faller inom det förväntade normala intervallet. Figur 5A visar en representativ bild av SWE-läget från ett CDAHFD-djur vid 6 och 12 veckor. Här har ROI återigen placerats nära mitten av Q Box (shear wave map), baserat på den färgade referensen ovanpå bilden.
Som förväntat med denna modell är E-modulus mycket högre i det CDAHFD-utfodrade djuret. I dessa representativa bilder var medelvärdet kPa 10, 5 vid 6 veckor och 23, 1 kPa vid 12 veckor, vilket indikerar betydande vävnadsstelhet. En typisk NASH dietstudie som använder CDAHFD och kontroll chow bör avslöja en stadig progression av leverstelhet på grund av fibros i cdahfd-utfodrade djur, medan kontrolldjur förblir desamma. Figur 5C visar en gradvis ökning av leverns elasticitet hos CDAHFD- djur jämfört med stabil elasticitet hos kontrolldjur under en 12-veckorsperiod. Kontrolldietelasticiteten börjar vid 5,80 ± 0,99 kPa vid 3-veckorspunkten och visar inte mycket förändring (6,14 ± 0,59) under loppet av 12-veckorsstudien. Den kolinbristande kosten visar dock en betydande ökning ganska tidigt och når 12,07 ± 2,37 kPa vid vecka 6. Trenden med ökad elasticitet fortsätter i CDAHFD-kosten när studien fortskrider och når 24,43 ± 9,29 kPa vid 12 veckor efter specialkostinitiering.
Lever prover var färgas med PSR att lokalisera kollagen som en korrelera av fibros. Som förväntat med denna modell observeras en betydligt högre andel lever PSR-positiv färgning hos CDAHFD-djur jämfört med kontrolldieten vid både 6- och 12-veckors tidpunkter (Figur 5D). För att fastställa nyttan av skjuvvågen som en surrogatmetod för ex vivo-färgning ritades skjuvvåg E Modulus-nummer mot det PSR-färgade området hos CDAHFD-råttor i figur 5E för att bestämma korrelationen. Analys av tomten visade ett tätt kluster med ett Pearson "r" värde på 0,88, vilket indikerar stark korrelation. Det bör noteras att de resultat som rapporteras här är representativa för vad som kan förväntas i en studie med en kolinbrist, fettrik kost för att inducera NASH. Denna metod kan också användas med andra prekliniska NASH-modeller; Det kommer dock att ge olika resultat och brytvärden beroende på sjukdomsinduktionsprotokollet. Liksom råtta NASH-modellen visade SWE-avbildningen i den CDAHFD-inducerade NASH-musmodellen utmärkt korrelation mellan leverelasticitetsvärden och andelen PSR-positivt färgat område i lever13. Swe kan därför vara ett värdefullt verktyg för att bedöma leverfibros i prekliniska modeller av NAFLD/NASH.
Bild 1: Bildinställning. Ultraljudsgivaren (a) hålls av den fallande armen. Bildspelet (b) har ett område för att spänna fast anestesislangen och sätta upp en noskon (c) för kontinuerlig anestesi under avbildning. Scenen är också uppvärmd och utrustad med sonder för att övervaka kroppstemperaturen. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2: Elastografiinstrumentet för savvåg. (A) Shear wave elastography instrumentet är en enda, hjulförsedd enhet med tillbehörsportar för upp till 4 ultraljudssonder. (B) Den övre bildskärmen fungerar som visuell utgång för realtidsvisning av bilder, samt visar patientdata och systeminventering. (C) Den centrala kontrollpanelen innehåller de flesta knappar och rattar som behövs för att justera visning och hämta bilder. (D) Den nedre bildskärmen är en pekskärm med ytterligare kontroller och kommandon för bildförvärv och justering. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3:Djurpositionering och korrekt givarens placering. (A) När ett djur har placerats ordentligt på scenen och hållits fast med tejp-in vänster lateral återskumning (B) sänks ultraljudssonden på råttan och vidrör den gel som placeras på buken/sidan. När sonden vidrör gelén i positionen i panel Bkan njuren och levern ses i juxtaposition på monitorn. Detta är en optimal position för att samla hepato-njurindex, och i vissa fall även saxvågsnumren. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 4: Hepato-njurindexresultat. (A) Representativ bild av HR-index från kontroll- och CDAHFD-dietråttor vid 6- och 12-veckors tidpunkter. ROIs (röd) drogs i njuren (vänster cirkel) och lever (höger cirkel), sedan fastställdes ett förhållande mellan signalerna (B Ratio, höger datatabell). B)Representativa ORO-färgade histologiska delar av leverprover från kontroll- och CDAHFD-dietråttor vid 6- och 12-veckors tidpunkter. Skalstänger = 300 μm. (C) Grafisk representation av HR-indexet över en sjukdomsframkallande diettidskurs. Kontrollråttadata representeras i blå, CDAHFD råttdata i rött. Diagrammet visar medelvärden med standardfel av medelvärdet (n = 20 vid 3-veckors tidpunkt och n = 20 för kontroll och n= 19 för CDAHFD vid 6 veckor, n = 10 vid 9- och 12-veckors tidspunkter (jämföra kontroll kontra CDAHFD vid varje tidpunkt *, **, ***, ****p < 0,001). (D) Lever ORO beräkningar ritade för varje tidpunkt (n = 10). Diagrammet visar medianvärden med interkvartilt intervall (*, ** p < 0,001). (E) Korrelationsgraf som jämför procentlever ORO-positivt område jämfört med HR-indexet. Förkortningar: HR = hepato-renal; CDAHFD = kolinbrist, fettrik kost; ROI = intresseregioner. ORO = Oil Red O. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Elastografiresultat för shearvåg. (A) Representativ bild av SWE-kartor från kontroll- och CDAHFD-dietråttor vid 6- och 12-veckors tidpunkter. ROIs (röd) drogs i njuren (vänster cirkel) och lever (höger cirkel), sedan fastställdes ett förhållande mellan signalerna (B Ratio, höger datatabell). B)Representativa ORO-färgade histologiska delar av leverprover från kontroll- och CDAHFD-dietråttor vid 6- och 12-veckors tidpunkter. Skala ribban på histologiska avsnitt är 300 μm. (C) Grafisk representation av levervävnad styvhet i en 12-veckors diet-inducerad NASH råtta modell. Grupper matades normal kola (blå) eller kolin-bristfällig, fettrik kost (röd) (n = 20 vid 3 och 6 veckor, n = 10 vid 9- och 12-veckors tidpunkter). Diagrammet visar medelvärden med standardfel av medelvärdet (n = 20 vid 3 och 6 veckor, n = 10 vid 9- och 12-veckors tidpunkter (jämföra kontroll kontra CDAHFD vid varje tidpunkt *, **, *** p < 0,001). (D) Grafisk representation av kollagenfördelning i ex vivo histologic leverprover med kollagen-specifika PSR fläck (n = 10). Diagrammet visar medianvärden med interkvartilt intervall (*, ** P < 0,001) (E) Korrelationsgraf som jämför procent positiv lever PSR färgningsområde jämfört med SWE elasticitet. SWE = savvågselastografi; CDAHFD = kolinbrist, fettrik kost; ROI = intresseregioner. ORO = Olja Röd O; NASH = alkoholfri steatohepatit; PSR = Picro Sirius Röd. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ultraljudsbaserad avbildning, inklusive SWE, kan vara ett ovärderligt verktyg för longitudinell bedömning av leversteatos och styvhet i prekliniska modeller av NAFLD/NASH. Detta dokument beskriver detaljerade metoder för hur man förvärvar högkvalitativa B-läge samt SWE-bilder av lever för mätning av HR-index och elasticitet med hjälp av en CDAHFD diet-inducerad råtta modell av NASH. Vidare visar resultaten utmärkt korrelation mellan HR-indexet och elasticitet med guldstandarden för utvärdering-histologisk bedömning av levervävnad. Även om själva proceduren verkar vara okomplicerad finns det några kritiska aspekter av protokollet som kommer att säkerställa framgångsrika resultat.
Placeringen av givaren är nyckeln, särskilt när du letar efter njuren för att mäta HR-indexet i B-läge. Att placera sonden för nära revbenen kan resultera i revbenskugga, vilket skapar falska mått på ultraljudsdämpning. Vidare är avlägsnandet av allt hår med både rakning och depilationskräm viktigt, eftersom återstående hår kan fånga luftbubblor, vilket kommer att kasta skuggor på B-lägesbilder. Slutligen, eftersom närvaron av mat i magen och tarmarna kan skymma levern, särskilt hos normala chow-matade djur, är adekvat fasta av alla djur avgörande för framgångsrik avbildning av levern.
Även om leverelasticitetsmätningar från SWE och HR-indexet är värdefulla avläsningar för att bedöma leverfibros och steatos i prekliniska modeller av NASH, har tekniken några begränsningar. Faktorer som inflammation, leverstockning, kolestas och utflöde av tarminnehåll obstruktion påverkar leverstelhet och därmed kan påverka den övergripande specificiteten hos denna teknik vid mätning av leverfibros8,14,15,16. På samma sätt kan leverns ljusstyrka i ultraljudsbilder i B-läge påverkas av fibros och kan därmed påverka noggrannheten hos HR-indexet vid mätning av steatos. Fler studier behövs för att klargöra bidraget från dessa påverkansfaktorer på elasticitet och steatos och fastställa brytvärden för dessa avläsningar i olika prekliniska modeller av NASH. Vidare utvärderade denna studie inte hr-indexets känslighet som biomarkör för att bedöma leversteatos i en preklinisk effektstudie.
Mätning av leverstelhet med SWE har potential att bli ett värdefullt verktyg för att förstå nash/NAFLD:s patofysiologi samt för att utveckla nya behandlingar för detta tillstånd. Genom att låta forskaren bestämma både leversteatos och vävnadsstelhet utan behov av en invasiv biopsi kan djur i prekliniska studier övervakas längsgående och läkemedelseffekter på enskilda försökspersoner kan kvantifieras över tid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alla författare är anställda på Pfizer, Inc.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Pfizer Comparative Medicine Operations Team för deras hårda arbete med att ta hand om och säkerställa studiedjurens hälsa samt hjälpa till med några av teknikerna. Tack också till Danielle Crowell, Gary Seitis och Jennifer Ashley Olson för deras hjälp med vävnadsbehandling för histologiska analyser. Dessutom vill författarna tacka Julita Ramirez för att ha granskat och gett värdefull feedback under utarbetandet av detta manuskript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aixplorer | Supersonic Imagine | Shear Wave Elastography Instrument | |
| Aixplorer SuperLinear SLH20-6 Transducer | Supersonic Imagine | Transducer for Shear Wave Elastography | |
| Alpha-dri bedding | rat cages | ||
| Aperio AT2 scanner | Leica Biosystems | Digital Pathology Brightfield Scanner | |
| Compac 6 Anesthesia System | VetEquip | Anesthesia Vaporizer and Delivery System. Any anesthesia delivery system can be used, however. | |
| Manage Imager Database | Leica Biosystems | Digital Pathology | |
| Mayer's Hematoxilin | Dako/Agilent | H&E Staining/Histology | |
| Nair | Church & Dwight | Hair remover | |
| Oil Red O solution | Poly Scientific | Lipid Staining/Histology | |
| Picrosirius Red Stain (PSR) | Rowley Biochemical | F-357-2 | Collagen Stain/Histology |
| Puralube Opthalmic ointment | Dechra Veterinary Product | Lubrication to prevent eye dryness during anesthesia | |
| Tissue-Tek Prisma Plus | Sakura Finetek USA | Automated slide stainer | |
| VISIOPHARM software | Visiopharm | Digital pathology software | |
| Research Diets | A06071309i | NASH inducing diet | |
| Purina | 5053 | Control animal chow | |
| Vevo imaging station | Fujifilm VisualSonics | The Vevo imaging station is used for holding the ultrasound transducer during imaging. | |
| Wistar Han rats | Charles River Laboratories |
References
- Younossi, Z. M., et al. Global epidemiology of nonalcoholic fatty liver disease-Meta-analytic assessment of prevalence, incidence, and outcomes. Hepatology. 64 (1), 73-84 (2016).
- Boland, M. L., et al. Towards a standard diet-induced and biopsy-confirmed mouse model of non-alcoholic steatohepatitis: Impact of dietary fat source. World Journal of Gastroenterology. 25 (33), 4904-4920 (2019).
- Oldham, S., Rivera, C., Boland, M. L., Trevaskis, J. L. Incorporation of a survivable liver biopsy procedure in mice to assess non-alcoholic steatohepatitis (NASH) resolution. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (146), e59130 (2019).
- Bercoff, J., Tanter, M., Fink, M. Supersonic shear imaging: a new technique for soft tissue elasticity mapping. IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 51 (4), 396-409 (2004).
- Bavu, E., et al. Noninvasive in vivo liver fibrosis evaluation using supersonic shear imaging: a clinical study on 113 hepatitis C virus patients. Ultrasound in Medicine & Biology. 37 (9), 1361-1373 (2011).
- Ferraioli, G., et al. Accuracy of real-time shear wave elastography for assessing liver fibrosis in chronic hepatitis C: a pilot study. Hepatology. 56 (6), 2125-2133 (2012).
- Ross, T. T., et al. Acetyl-CoA carboxylase inhibition improves multiple dimensions of NASH pathogenesis in model systems. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 10 (4), 829-851 (2020).
- Gu, L. H., Gu, G. X., Wan, P., Li, F. H., Xia, Q. The utility of two-dimensional shear wave elastography and texture analysis for monitoring liver fibrosis in rat model. Hepatobiliary & Pancreatic Diseases International. 20 (1), 46-52 (2020).
- Marshall, R. H., Eissa, M., Bluth, E. I., Gulotta, P. M., Davis, N. K. Hepatorenal index as an accurate, simple, and effective tool in screening for steatosis. American Journal of Roentgenology. 199 (5), 997-1002 (2012).
- Webb, M., et al. Diagnostic value of a computerized hepatorenal index for sonographic quantification of liver steatosis. American Journal of Roentgenology. 192 (4), 909-914 (2009).
- Tous, M., Ferre, N., Camps, J., Riu, F., Joven, J. Feeding apolipoprotein E-knockout mice with cholesterol and fat enriched diets may be a model of non-alcoholic steatohepatitis. Molecular and Cellular Biochemistry. 268 (1-2), 53-58 (2005).
- Kirsch, R., et al. Rodent nutritional model of non-alcoholic steatohepatitis: species, strain and sex difference studies. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 18 (11), 1272-1282 (2003).
- Journal of Ultrasound in Medicine.
- Engelmann, G., Quader, J., Teufel, U., Schenk, J. P. Limitations and opportunities of non-invasive liver stiffness measurement in children. World Journal of Hepatology. 9 (8), 409-417 (2017).
- Piscaglia, F., Salvatore, V., Mulazzani, L., Cantisani, V., Schiavone, C. Ultrasound shear wave elastography for liver disease. a critical appraisal of the many actors on the stage. Ultraschall in der Medizin. 37 (1), 1-5 (2016).
- Singh, S., Loomba, R. Role of two-dimensional shear wave elastography in the assessment of chronic liver diseases. Hepatology. 67 (1), 13-15 (2018).
