Summary
Este protocolo describe el uso de una técnica de ultrasonido mejorada para observar y cuantificar de manera no invasiva los cambios en el tejido hepático en modelos de roedores de enfermedad del hígado graso no alcohólico.
Abstract
La esteatohepatitis no alcohólica (EHNA) es una afección dentro del espectro de la enfermedad del hígado graso no alcohólico (EHGNA), que se caracteriza por la acumulación de grasa hepática (esteatosis) y la inflamación que conduce a la fibrosis. Los modelos preclínicos que recapitulan de cerca la EHNA/EHGNA humana son esenciales en el desarrollo de fármacos. Si bien la biopsia hepática es actualmente el estándar de oro para medir la progresión y el diagnóstico de NAFLD / NASH en la clínica, en el espacio preclínico, se necesita la recolección de muestras de hígado completo en múltiples puntos de tiempo durante un estudio o la biopsia de hígado para el análisis histológico para evaluar la etapa de la enfermedad.
La realización de una biopsia hepática a mitad del estudio es un procedimiento invasivo y laborioso, y la recolección de muestras de hígado para evaluar el nivel de enfermedad aumenta el número de animales de investigación necesarios para un estudio. Por lo tanto, existe la necesidad de un biomarcador de imágenes confiable, traducible y no invasivo para detectar NASH / NAFLD en estos modelos preclínicos. Las imágenes no invasivas en modo B basadas en ultrasonido y la elastografía de onda de cizallamiento (SWE) se pueden usar para medir la esteatosis y la fibrosis hepática. Para evaluar la utilidad de SWE en modelos preclínicos de roedores de NASH, los animales se colocaron en una dieta pro-NASH y se sometieron a imágenes de ultrasonido no invasivas en modo B y elastografía de onda de corte para medir el índice hepatorrenal (HR) y la elasticidad hepática, midiendo la progresión de la acumulación de grasa hepática y la rigidez del tejido, respectivamente, en múltiples puntos de tiempo en el transcurso de un estudio NAFLD / NASH dado.
El índice de HR y los números de elasticidad se compararon con los marcadores histológicos de esteatosis y fibrosis. Los resultados mostraron una fuerte correlación entre el índice HR y el porcentaje de tinción oil red O (ORO), así como entre la elasticidad y la tinción Picro-Sirius Red (PSR) de los hígados. La fuerte correlación entre los métodos ex vivo clásicos y los resultados de las imágenes in vivo proporciona evidencia de que la elastografía de onda de corte / imágenes basadas en ultrasonido se pueden usar para evaluar el fenotipo y la progresión de la enfermedad en un modelo preclínico de NAFLD / NASH.
Introduction
La enfermedad del hígado graso no alcohólico (EHGNA) es una condición metabólica caracterizada por una acumulación excesiva de grasa en el hígado y se está convirtiendo rápidamente en una dolencia hepática líder en todo el mundo con una prevalencia global recientemente reportada del 25%1. La esteatohepatitis no alcohólica (EHNA) es una etapa más progresiva del espectro de la EHGNA, caracterizada por un exceso de grasa hepática con daño celular progresivo, inflamación y fibrosis. Estas dolencias a menudo son silenciosas, no se detectan a través de análisis de sangre o exámenes de rutina, hasta que ya se ha producido un daño considerable en el hígado de un paciente. Actualmente, el estándar de oro para diagnosticar la EHNA en pacientes es a través del examen histológico de muestras de biopsia hepática derivadas del paciente. Del mismo modo, los investigadores preclínicos que trabajan para comprender la patogénesis de NASH / NAFLD, así como la industria del desarrollo de medicamentos, se basan en la biopsia en cuña in vivo de muestras de hígado o la eutanasia terminal de cohortes satélites para la histología para medir la esteatosis, la inflamación y la fibrosis.
Por ejemplo, la biopsia en cuña hepática ha sido una técnica estándar para evaluar la esteatohepatitis y la fibrosis utilizando el modelo GUBRA NASH2. El método de biopsia en cuña hepática es invasivo y laborioso en animales pequeños3. El uso de la biopsia hepática en cuña en medio de un estudio representa una variable experimental adicional en un modelo de enfermedad, que a menudo aumenta el número de animales que se necesitan. Con estos factores en mente, las técnicas de imagen no invasivas que se pueden utilizar para evaluar de manera confiable la esteatosis y la fibrosis en modelos animales NASH / NAFLD en puntos de tiempo tempranos resultan valiosas. La elastografía de onda de cizalla (SWE) es un método basado en ultrasonido utilizado para medir la elasticidad de los tejidos blandos. La técnica mide la propagación de las ondas de cizallamiento creadas por pulsos de ultrasonido supersónico dirigidos a un objetivo tisular, y luego calcula un valor llamado módulo E4. La velocidad de la onda de cizallamiento es proporcional al grado de rigidez del tejido.
La Figura 1 y la Figura 2 muestran la configuración del área de imágenes y el instrumento SWE. El instrumento SWE es una unidad única con ruedas con dos pantallas y un panel de control que se muestra en la Figura 2A. El monitor superior(Figura 2B)actúa como monitor de ordenador y muestra imágenes y directorios de pacientes. El panel de control(Figura 2C)es una serie de botones y diales que controlan aspectos generales de la captura de imágenes: congelar la pantalla, guardar imágenes, cambiar de un modo a otro. La pantalla inferior(Figura 2D)es una pantalla táctil con controles adicionales para cambiar la configuración y actúa como un teclado para ingresar datos según sea necesario. El instrumento está equipado con un lápiz óptico para usar en la pantalla táctil si lo desea. Las sondas de ultrasonido se conectan al panel frontal inferior del dispositivo. Para las imágenes en modo B y SWE en roedores, se utilizó el transductor superlineal de 6 a 20 MHz. Esta capacidad de medir de forma no invasiva la rigidez tisular hace de SWE una herramienta valiosa para la identificación y estadificación de la fibrosis hepática5 en pacientes con EHNA, disminuyendo la necesidad de métodos más invasivos. SWE, de hecho, se ha utilizado para medir la fibrosis hepática en pacientes y es un método aprobado por la FDA para puntuar la fibrosis en la clínica6. El uso de SWE para monitorear la progresión de la EHNA en modelos animales de la enfermedad proporcionaría una herramienta de traducción para el desarrollo de tratamientos y, al mismo tiempo, mejoraría el bienestar animal a través de la reducción del número de sujetos animales y el refinamiento de los procedimientos in vivo para minimizar el dolor y la angustia.
Las imágenes SWE en pacientes humanos utilizan un transductor de ultrasonido de baja frecuencia4,que no es ideal para animales pequeños. En particular, se han utilizado técnicas de SWE de alta frecuencia para evaluar la eficacia de la inhibición de la acetil-CoA carboxilasa en la patogénesis de NASH en un modelode rata 7,y la utilidad de esta técnica se ha descrito en modelos de ratas con tetracloruro de carbono de fibrosis hepática con resultados exitosos en comparación con los métodos tradicionales de puntuación histológica METAVIR8. Sin embargo, la literatura existente carece de información detallada sobre la técnica y la metodología sobre la aplicación de imágenes deWE en modelos preclínicos de NASH. Como se describió anteriormente, la esteatosis hepática es una de las características clave de la afección NAFLD / NASH y es una etapa importante en la que se puede considerar la intervención. Por lo tanto, evaluar la acumulación de grasa hepática utilizando una modalidad de imagen es tan importante como evaluar la fibrosis hepática en modelos preclínicos de NASH / NAFLD.
Una técnica ecográfico conocida como índice HR, una relación del brillo tisular del hígado en comparación con la de la corteza renal, se ha utilizado como marcador sustituto de esteatosis en la clínica9,10. Este enfoque, sin embargo, no se ha utilizado ampliamente en modelos animales preclínicos de NAFLD/NASH. Este artículo describe un método para medir la elasticidad, así como el índice hr como un marcador sustituto de fibrosis hepática y esteatosis, respectivamente, en un modelo de rata de dieta alta en grasas y deficiente en colina (CDAHFD) de NAFLD / NASH. Este modelo induce esteatosis rápida, inflamación hepática y fibrosis, que es medible dentro de las 6 semanas en ratones11. Se ha demostrado que la adición de colesterol (1%) a esta dieta promueve la fibrogénesis enratas 12,lo que convierte a este modelo en un candidato adecuado para estudios de validación que involucran imágenes de ondas de cizalla. En general, esta tecnología de imágenes también se puede aplicar a una amplia gama de modelos / dietas NASH donde la esteatosis y / o fibrosis es un punto final de interés.
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Protocol
Todos los procedimientos relacionados con animales fueron revisados y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de Pfizer y se llevaron a cabo en una instalación acreditada internacionalmente por AAALAC (Evaluación y Acreditación del Cuidado de Animales de Laboratorio).
1. Inducción de la enfermedad
- Use ratas Wister Han macho (150-175 g; ~ 6-7 semanas de edad; total de 40 ratas) que estén libres de patógenos adventiciales de ratas conocidos. Aloje a las ratas en parejas en una enjamedadera ventilada individualmente con ropa de cama de papel (consulte la Tabla de materiales)y manténgalas a 22 ± 1 ° C, 40-70% de humedad relativa con un ciclo de luz-oscuridad de 12:12 h.
- Coloque a las ratas que pesan 150-175 g (~ 6-7 semanas de edad) en una dieta alta en grasas y deficiente en colina con 1% de colesterol (n = 20) o un chow de roedor de laboratorio estándar (n = 20) dependiendo del diseño del estudio.
NOTA: En este estudio, se inscribieron un total de 40 ratas con 20 animales por grupo. Al final de la6ª semana, la mitad de la cohorte de cada grupo fue necropsiada para el análisis histológico de mitad de estudio de muestras de hígado. Por lo tanto, el tamaño de la muestra fue de 10 animales por grupo para los puntos de tiempo de la9ª y12ª semana.
2. Configuración del instrumento
- Configure el área de imágenes de la siguiente manera: incluya una superficie calentada para mantener al animal caliente durante la obtención de imágenes (c en la Figura 1),y un cono nasal de anestesia asegurado para administrar anestesia inhalante para mantener un plano de anestesia durante todo el procedimiento (b en la Figura 1).
- Use un soporte de sonda de ultrasonido para facilitar el movimiento de la sonda de ultrasonido a la ubicación deseada y para evitar que la sonda descanse sobre el animal.
- Use gel de ultrasonido calentado en la piel donde se adquiere la imagen de ultrasonido.
- Mantenga los siguientes ajustes durante todo el procedimiento, que se pueden ajustar en la pantalla táctil: Potencia acústica 0,0 dB; Sintonizador de tejidos 1540 m/s; Rango dinámico 60 dB; Rango de elasticidad (para modo SWE) < 30 kPa.
- Conecte la sonda de ultrasonido al sistema de rieles en el soporte especializado (a en la Figura 1).
- Encienda el instrumento y permita que se inicie. Una vez que el monitor esté encendido, anote la imagen del modo B con los detalles del transductor conectado.
3. Preparación de la asignatura
- Asegúrese de que los animales estén en ayunas al menos 4 h antes del procedimiento de obtención de imágenes para evitar que el contenido intestinal interfiera con la adquisición de imágenes.
- Después de al menos 4 h de ayuno, coloque una rata en una cámara de inducción anestésica isoflurano hasta que se alcance un nivel adecuado de anestesia, confirmado por ninguna respuesta al pellizco del dedo del dedo del día. Exponer a los animales al 3-5% de isoflurano durante 3-5 min para inducir la anestesia.
- Para la anestesia de mantenimiento, mantenga a los animales bajo 2-3% de isoflurano durante la adquisición de la imagen. Aplique ungüento oftálmico para proteger el ojo del secado durante la anestesia.
- Una vez que se haya logrado la anestesia, retire a un animal de la cámara de inducción y colóquelo sobre una manta circulante de agua caliente tibia. Coloque un cono nasal anestésico sobre el hocico y afeite al animal en su lado derecho, desde la caja torácica hasta la pelvis. Use crema depilación química para eliminar todo el vello restante en esta área.
- Una vez que se haya eliminado el pelo, coloque a un animal en recosto lateral izquierdo con las patas superiores pegadas con cinta adhesiva sobre la cabeza en una plataforma de imágenes cálida(Figura 3A).
- Presione la tecla Paciente en el panel de control del instrumento e identifique al sujeto de acuerdo con el diseño del estudio.
- Abra la función Teclado en el instrumento tocando el icono en la pantalla táctil. Escriba los nombres como desee.
- Toque Salir para salir de la pantalla de nombre de paciente. Observe que el modo B se vuelve a abrir en el monitor.
4. Adquisición de imágenes para la medición del índice hepato-renal (HR)
- Aplique una pequeña cantidad de gel de ultrasonido calentado en la región de la piel depilada en el animal.
- Mueva la sonda de ultrasonido para tocar el área cubierta de gel del sujeto(Figura 3B). Una vez que aparezca una imagen en vivo en modo B de los órganos internos del sujeto en el monitor, mueva la sonda de ultrasonido al área ligeramente por encima de la cadera, justo paralela a las vértebras lumbares (plano sagital).
- Usando la pantalla de modo B en el monitor, localice el riñón derecho identificando la arteria renal grande y la separación corteza/médula(Figura 4A). Además, observe parte del hígado en un solo plano de la imagen.
- Asegúrese de que haya poco o ningún artefacto de imagen, como sombras y burbujas de aire.
- Mida una relación de modo B para obtener el índice HR.
- Asegúrese de que tanto la corteza renal como el parénquima hepático estén en el mismo plano de enfoque. Si es necesario, ajuste el enfoque y obtenga control para obtener una imagen clara.
- Ajuste el enfoque girando la perilla de enfoque en el panel de control. Ajuste la ganancia presionando el botón Auto TGC una vez.
- Presione la tecla Congelar en el panel de control. Asegúrese de que el animal esté entre respiraciones al congelar la pantalla para evitar imágenes borrosas.
- Una vez que la pantalla esté congelada, toque Herramientas de medición en la pantalla táctil. Seleccione Relación de modo B,una herramienta integrada que mide el brillo relativo de un tejido de una región de interés seleccionada. Cree un círculo de 2 mm para seleccionar una región de interés (ROI). Ajuste el tamaño del círculo moviendo un dedo a lo largo del borde exterior de la bola de seguimiento en el panel de control.
- Coloque el círculo de 2 mm en la imagen hepática ROI, que debe ubicarse a la derecha del riñón. Identificar el tejido hepático en función de su ecogenicidad homogénea y contorno liso.
- Una vez que el círculo esté en su lugar, presione el botón Seleccionar en el panel de control y observe el nuevo círculo que aparece.
- Ajuste el tamaño del nuevo círculo a 2 mm y colóquelo en la imagen de la corteza renal. Asegúrese de mantener la misma profundidad de los círculos en el hígado y la corteza renal. Una vez en su lugar, presione el botón Seleccionar en el panel de control. Observe que la herramienta del sistema incorporada muestra el índice HR como una relación de modo B.
- Presione Guardar imagen para guardar la imagen y observe las imágenes guardadas que aparecen como miniaturas en el lado derecho del monitor.
- Presione el botón Congelar en el panel de control para descongelar la imagen y volver a una imagen en modo B en vivo.
- Asegúrese de que tanto la corteza renal como el parénquima hepático estén en el mismo plano de enfoque. Si es necesario, ajuste el enfoque y obtenga control para obtener una imagen clara.
- Repita la medición de la relación de modo B 3 veces a diferentes profundidades y planos de tejido. Calcule el promedio de estas tres relaciones de modo B para cada animal y punto de tiempo.
5. Adquisición de imágenes para la elastografía de onda de cizalla
- Mueva la sonda transversalmente en el área subcostal derecha para localizar el hígado usando el modo B. Localice un área del hígado que sea principalmente parénquima y libre de vasos sanguíneos grandes como la vena porta y la arteria hepática. Una vez que se haya encontrado un área clara del hígado, genere un mapa de elasticidad de cizalla del tejido presionando el botón SWE en el panel de control.
- Ajuste el tamaño y la posición de la caja SWE debajo de la cápsula hepática en un área libre de sombras. Identifique la cápsula como una línea ecogénica brillante cerca de la parte superior del hígado.
- Observe que el cuadro SWE pasa a un mapa de color dentro de 5-10 s. Una vez que la caja esté llena y estable, presione el botón Congelar en el panel de control cuando el animal esté entre respiraciones.
NOTA: La cantidad mínima de cobertura de la caja debe ser del 60-80% para evaluar con precisión la elasticidad del hígado. - En la pantalla táctil, toque QBox,una herramienta de sistema integrada que calcula la elasticidad a partir de un ROI en el mapa de elasticidad de onda de cizalla. Observe el círculo y el cuadro de datos que aparecen en el monitor. Ajuste la posición del QBox tocando el icono de posición en la pantalla táctil a la configuración deseada.
- Ajuste el tamaño del círculo a 3 mm moviendo un dedo a lo largo del borde exterior de la bola de seguimiento en el panel de control. Usando la bola de pista, coloque el círculo en un área libre de sombras con coloración uniforme(Figura 5A,B). Tenga cuidado de evitar áreas conocidas de rigidez, como los vasos sanguíneos o la cápsula hepática, así como la hemorragia de estas estructuras.
- Cuando se encuentre un área adecuada, presione Guardar imagen en el panel de control para guardar la imagen. Repita este procedimiento 3 veces en diferentes áreas del hígado. Mueva la sonda hacia arriba y hacia abajo o hacia los lados en el abdomen para recopilar imágenes mapeadas por SWE de diferentes áreas del hígado.
- Una vez que se hayan recopilado todas las imágenes, presione Finalizar examen en el panel de control y tome nota de la pantalla de información del paciente que aparece en el monitor.
- Retire la cinta de las patas del animal, limpie el exceso de gel y retire al animal de la etapa de imágenes. Permita que se recupere de la anestesia en una jaula cálida y seca por sí mismo hasta que se recupere por completo. Monitorear a cada animal para asegurar la recuperación completa de la anestesia, indicada por su capacidad para mantener la reclinación esternal
- Repita los pasos de las secciones 4-5 para cada animal de la cohorte que se le imagine.
6. Recuperación y análisis de datos de imágenes
- Cuando se hayan recogido imágenes de todos los animales, apague la anestesia.
- Para extraer datos de imagen de la máquina, presione el botón Revisar en el panel de control y observe todos los escaneos realizados en ese instrumento que aparecen en el monitor. Busque los escaneos deseados utilizando la ventana de búsqueda en la esquina superior de la pantalla.
- Seleccione todos los escaneos necesarios para el análisis de datos marcando la casilla junto al nombre del paciente a través del trackball y el botón Seleccionar. Una vez que se resalten todos los escaneos necesarios, seleccione Exportar JPEG en la pantalla táctil. Exporte datos a una unidad de red o a una unidad de bus serie universal (USB) portátil. Localice los puertos USB en la parte posterior del instrumento.
- Una vez que los archivos se hayan exportado, abra archivos jpg individuales de cada escaneo en una computadora de estación de trabajo. Observe todos los datos en el lado derecho de la imagen: Relación de modo B: recopile el número de relación B; Q Box-recoge el valor de elasticidad media (kPa).
- Ingrese todos los datos en una hoja de cálculo u otro software de administración de bases de datos y realice los análisis estadísticos deseados.
7. Análisis histológico de muestras hepáticas
- Al final de la6ª semana, realizar necropsia en la mitad de la cohorte de cada grupo para el análisis histológico a mitad del estudio de las muestras de hígado. Del mismo modo, sacrificar al resto de la cohorte de animales y recolectar muestras de hígado para su análisis histológico en el punto de tiempode la semana 12.
- Para la tinción ORO, fije las secciones hepáticas en formalina tamponada neutra al 10% y criopreservarlas con sacarosa utilizando una solución refrigerada de sacarosa al 30% durante la noche como mínimo. Crio-incrustar las secciones en un compuesto de temperatura de corte óptima, y crio-sección en portaobjetos cargados para prepararse para la tinción ORO.
- Coloque las criosección en 100% propilenglicol durante 2 minutos, seguido de una incubación durante la noche en una solución ORO al 0,5%. Después de retirar la solución ORO, diferencie las secciones en propilenglicol al 85% durante 1 min, enjuague en agua desionizada y contratinúe con la modificación de Hematoxilina-Lillie de Mayer durante 1 min.
- Coloque las fundas en las diapositivas utilizando un medio de montaje acuoso y séquelas a temperatura ambiente.
- Para PSR, desparafinar las diapositivas de sección hepática fijadas con formalina e incrustadas en parafina, colocarlas durante la noche en Bouin Fluid y luego teñirlas con un tinter de diapositivas automatizado según el protocolo del fabricante con algunos pasos optimizados (1% de ácido fosfomolíbdico durante 5 min; 0.1% sirius red en ácido pícrico saturado durante 90 min; lavado de 2 x 30 s en ácido acético al 0.5%). Deshidrate automáticamente las diapositivas y luego móntelas con un medio de montaje permanente.
- Capture imágenes de las diapositivas teñidas de ORO y PSR utilizando el escáner de microscopía digital con un aumento de 20x, guárdelas en formato .svs y guárdelas en la base de datos de imágenes del administrador de diapositivas.
- Analice las imágenes utilizando algoritmos personalizados creados en software de patología digital. Aplique uniformemente aplicaciones de software de patología digital con parámetros de umbral para identificar y cuantificar el área de las secciones hepáticas, así como las áreas teñidas con ORO y PSR. Exporte las mediciones a una hoja de cálculo para calcular el porcentaje de área.
8. Análisis estadístico
- Realice un análisis estadístico de los datos de imágenes con ANOVA bidireccional utilizando la prueba de comparaciones múltiples de Sidak para evaluar la diferencia entre grupos en diferentes puntos de tiempo. Supongamos diferencias significativas entre grupos para valores de probabilidad p ≤ 0,001. Además, realizar la correlación de las lecturas de imágenes con los análisis histológicos.
- Utilice estadísticas no paramétricas para analizar los resultados del análisis histológico de este estudio. Informe los valores del grupo como mediana ± rango semi intercuartílico (sIQR). Supongamos diferencias significativas entre grupos para valores de probabilidad p ≤ 0,001. Utilice una prueba de Mann-Whitney para comparar la cantidad de tinción histoquímica PSR y ORO entre diferentes grupos.
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Representative Results
Un sello distintivo de los animales alimentados con CDAHFD es la esteatosis. La acumulación de grasa en el hígado cambia las propiedades ecogénicas del tejido, que se pueden cuantificar midiendo el brillo del hígado y normalizándolo al brillo de la corteza renal a partir de una imagen en modo B tomada en el mismo plano. El valor cuantificado se expresa como un índice de HR, que es una medida indirecta de la esteatosis. En la Figura 4A,una imagen hepática representativa de un animal de control muestra aproximadamente igual o menor brillo (ecogenicidad) en comparación con la corteza renal. Por lo tanto, el índice HR de los animales normales es <1. En este estudio, el índice de FC promedio de los animales de control en el punto de tiempo de 3 semanas es de 0.645 ± 0.03. En contraste, una imagen representativa en modo B de un animal alimentado con CDAHFD(Figura 4A)muestra un mayor brillo del hígado en comparación con la corteza renal. Como resultado, los índices de HR de imágenes representativas de los animales de la dieta CDAHFD fueron de 1,91 y 1,79 en los puntos de tiempo de 6 y 12 semanas, respectivamente.
La Figura 4C muestra una gráfica de los índices de HR a lo largo del tiempo de los animales de control y CDAHFD. Los animales alimentados con dieta de control muestran poco movimiento en los valores del índice de FC desde el inicio, mientras que los animales con CDAHFD aumentan rápidamente en el transcurso de las primeras 3-6 semanas del estudio antes de alcanzar una meseta. El índice promedio de HR de los animales que estaban en una dieta CDAHFD es de 1.861 ± 0.06 en comparación con 0.328 ± 0.03 en animales de control a las 12 semanas después de la inducción de la enfermedad. Como se esperaba, el hígado mostró un área porcentual positiva significativamente mayor para la tinción de ORO en el grupo CDAHFD en comparación con el grupo de dieta de control en 6- (34.81 ± 4.66 vs. 0.49 ± 0.11) y 12- (30.08 ± 2.64 vs. 1.17 ± 0.44) puntos de tiempo de la semana(Figura 4B,D). También hubo una excelente correlación (Pearson r = 0,78) entre el área porcentual de tinción ORO con el índice HR en los puntos de tiempo de 6 y 12 semanas(Figura 4E). Estos resultados sugieren que el índice de FC puede ser una valiosa lectura de imágenes para cuantificar la esteatosis en modelos preclínicos de NAFLD /NASH.
Uno de los elementos clave para medir la rigidez hepática a través de SWE es la colocación adecuada del ROI(Figura 5). El panel izquierdo(Figura 5A)muestra una imagen representativa con el modo B y el mapeo SWE del hígado de un animal de dieta de control. La colocación adecuada del ROI debe ser sobre un área que sea estable en el mapa de colores y represente la sección del hígado que se está midiendo, con una señal que no esté influenciada por estructuras adyacentes como la cápsula hepática y los vasos sanguíneos. La rigidez tisular se informa como el módulo E, que es un cálculo basado en la velocidad de la onda de cizallamiento y una constante determinada y se expresa en kilopascales (kPa). Para los animales de control, el módulo E se encuentra entre 3,5 kPa y 6 kPa. La media de kPa de los ROI notificados en la Figura 5A para los animales de control fue de 4,6 y 5,5 kPa en los puntos temporales de 6 y 12 semanas, respectivamente, lo que se encuentra dentro del rango normal esperado. La Figura 5A muestra una imagen representativa del modo SWE de un animal CDAHFD a las 6 y 12 semanas. Aquí, el ROI se ha colocado nuevamente cerca del centro de la Q Box (mapa de ondas de cizalla), basado en la referencia de color en la parte superior de la imagen.
Como era de esperar con este modelo, el módulo E es mucho mayor en el animal alimentado con CDAHFD. En estas imágenes representativas, la media de kPa fue de 10,5 a las 6 semanas y de 23,1 kPa a las 12 semanas, lo que indica una rigidez tisular significativa. Un estudio típico de la dieta NASH que utiliza CDAHFD y chow de control debe revelar una progresión constante de la rigidez hepática debido a la fibrosis en los animales alimentados con CDAHFD, mientras que los animales de control siguen siendo los mismos. La Figura 5C muestra un aumento gradual de la elasticidad del hígado en animales CDAHFD en comparación con la elasticidad estable en animales de control durante un período de 12 semanas. La elasticidad de la dieta de control comienza en 5.80 ± 0.99 kPa en el punto de tiempo de 3 semanas y no muestra muchos cambios (6.14 ± 0.59) en el transcurso del estudio de 12 semanas. La dieta deficiente en colina, sin embargo, muestra un aumento significativo bastante temprano, alcanzando 12.07 ± 2.37 kPa en la semana 6. La tendencia en el aumento de la elasticidad continúa en la dieta CDAHFD a medida que avanza el estudio, alcanzando 24.43 ± 9.29 kPa a las 12 semanas después del inicio de la dieta especial.
Las muestras de hígado se tiñeron con PSR para localizar colágeno como un correlato de fibrosis. Como se esperaba con este modelo, hay un porcentaje significativamente mayor de tinción hepática PSR positiva observada en animales CDAHFD en comparación con la dieta de control en puntos de tiempo de 6 y 12 semanas(Figura 5D). Para establecer la utilidad de la onda de cizallamiento como método sustituto para la tinción ex vivo, los números del módulo E de la onda de cizallamiento se trazaron contra el área teñida con PSR en ratas CDAHFD en la Figura 5E para determinar la correlación. El análisis de la gráfica reveló un cúmulo apretado con un valor de Pearson 'r' de 0,88, lo que indica una fuerte correlación. Cabe señalar que los resultados reportados aquí son representativos de lo que se esperaría en un estudio que utiliza una dieta alta en grasas y deficiente en colina para inducir NASH. Este método también se puede utilizar con otros modelos preclínicos de NASH; sin embargo, producirá diferentes resultados y valores de corte dependiendo del protocolo de inducción de la enfermedad. Al igual que el modelo NASH de rata, las imágenes SWE en el modelo de ratón NASH inducido por CDAHFD mostraron una excelente correlación entre los valores de elasticidad hepática y el porcentaje de área teñida PSR positiva en el hígado13. Por lo tanto, SWE puede ser una herramienta valiosa para evaluar la fibrosis hepática en modelos preclínicos de NAFLD / NASH.
Figura 1:Configuración de imágenes. El transductor de ultrasonido (a) es sostenido por el brazo descendente. La etapa de imágenes (b) tiene un área para sujetar la manguera de anestesia y configurar un cono nasal (c) para la anestesia continua durante la obtención de imágenes. El escenario también se calienta y está equipado con sondas para controlar la temperatura corporal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: El instrumento de elastografía de onda de cizalla. (A) El instrumento de elastografía de onda de cizalla es una sola unidad con ruedas con puertos de conexión para hasta 4 sondas de ultrasonido. (B)El monitor superior sirve como salida visual para la visualización en tiempo real de imágenes, así como para mostrar los datos del paciente y el inventario del sistema. (C) El panel de control central contiene la mayoría de los botones y perillas necesarios para ajustar la pantalla y adquirir imágenes. (D) El monitor inferior es una pantalla táctil con controles y comandos adicionales para la adquisición y el ajuste de la imagen. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3:Posicionamiento del animal y colocación adecuada del transductor. (A) Una vez que un animal ha sido colocado correctamente en el escenario y restringido con cinta adhesiva lateral izquierda (B) la sonda de ultrasonido se baja sobre la rata, tocando el gel colocado en el abdomen / lado. Cuando la sonda está tocando el gel en la posición en el panel B,el riñón y el hígado se pueden ver en yuxtaposición en el monitor. Esta es una posición óptima para recoger el índice hepato-renal y, en algunos casos, también los números de onda de cizallamiento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Resultados del índice hepatorrenales. (A) Imagen representativa de los índices de FC de ratas de control y de dieta CDAHFD en puntos de tiempo de 6 y 12 semanas. Los ROI (rojo) se dibujaron en el riñón (círculo izquierdo) y el hígado (círculo derecho), luego se determinó una relación de las señales (Relación B, tabla de datos derecha). (B) Secciones histológicas representativas teñidas con ORO de muestras de hígado de ratas de control y de dieta CDAHFD en puntos de tiempo de 6 y 12 semanas. Barras de escala = 300 μm. (C) Representación gráfica del índice de FC durante un curso de tiempo de dieta inductora de enfermedades. Los datos de ratas de control se representan en azul, los datos de ratas CDAHFD en rojo. El gráfico muestra valores medios con error estándar de la media (n = 20 en el punto temporal de 3 semanas y n = 20 para el control y n = 19 para CDAHFD a las 6 semanas, n = 10 en los puntos de tiempo de 9 y 12 semanas (comparando el control versus CDAHFD en cada punto de tiempo *, **, ***, ****p < 0,001). (D) Cálculos oro hepáticos trazados para cada punto de tiempo (n = 10). El gráfico muestra valores medios con rango intercuartílico (*, ** p < 0,001). (E) Gráfico de correlación que compara el porcentaje de área ORO positiva para el hígado versus el índice de HR. Abreviaturas: HR = hepato-renal; CDAHFD = dieta alta en grasas con deficiencia de colina; ROI = regiones de interés; ORO = Oil Red O. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Resultados de la elastografía de ondas de cizalla. (A) Imagen representativa de mapas SWE de ratas de control y dieta CDAHFD en puntos de tiempo de 6 y 12 semanas. Los ROI (rojo) se dibujaron en el riñón (círculo izquierdo) y el hígado (círculo derecho), luego se determinó una relación de las señales (Relación B, tabla de datos derecha). (B) Secciones histológicas representativas teñidas con ORO de muestras de hígado de ratas de control y de dieta CDAHFD en puntos de tiempo de 6 y 12 semanas. La barra de escala en las secciones histológicas es de 300 μm. (C) Representación gráfica de la rigidez del tejido hepático en un modelo de rata NASH inducida por la dieta de 12 semanas. Los grupos fueron alimentados con chow normal (azul) o dieta alta en grasas deficiente en colina (rojo) (n = 20 a las 3 y 6 semanas, n = 10 en los puntos de tiempo de 9 y 12 semanas). El gráfico muestra valores medios con error estándar de la media (n = 20 a las 3 y 6 semanas, n = 10 a los puntos de tiempo de 9 y 12 semanas (comparando el control versus CDAHFD en cada punto de tiempo *, **, *** p < 0,001). (D) Representación gráfica de la distribución del colágeno en muestras histológicas hepáticas ex vivo utilizando tinción PSR específica de colágeno (n = 10). El gráfico muestra valores medios con rango intercuartílico (*, ** P < 0,001) (E) Gráfico de correlación que compara el porcentaje de área de tinción PSR hepática positiva versus elasticidad SWE. SWE = elastografía de onda de cizalla; CDAHFD = dieta alta en grasas con deficiencia de colina; ROI = regiones de interés; ORO = Aceite Rojo O; NASH = esteatohepatitis no alcohólica; PSR = Picro Sirius Rojo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Las imágenes basadas en ultrasonido, incluido SWE, pueden ser una herramienta invaluable para la evaluación longitudinal de la esteatosis hepática y la rigidez en modelos preclínicos de NAFLD / NASH. Este artículo describe metodologías detalladas sobre cómo adquirir el modo B de alta calidad, así como imágenes SWE de hígados para la medición del índice de FC y la elasticidad utilizando un modelo de rata de NASH inducido por la dieta CDAHFD. Además, los resultados muestran una excelente correlación del índice de FC y la elasticidad con el estándar de oro de la evaluación-evaluación histológica del tejido hepático. Si bien el procedimiento en sí parece no ser complicado, hay algunos aspectos críticos del protocolo que garantizarán resultados exitosos.
La colocación del transductor es clave, sobre todo cuando se busca el riñón para medir el índice hr en modo B. Colocar la sonda demasiado cerca de las costillas puede resultar en sombra de costillas, lo que crea falsas medidas de atenuación por ultrasonido. Además, la eliminación de todo el vello con crema de afeitar y depilación es importante, ya que el cabello restante puede atrapar burbujas de aire, lo que proyectará sombras en las imágenes en modo B. Finalmente, como la presencia de alimentos en el estómago y los intestinos puede oscurecer el hígado, especialmente en animales normales alimentados con chow, el ayuno adecuado de todos los animales es fundamental para obtener imágenes exitosas del hígado.
Aunque las mediciones de elasticidad hepática de SWE y el índice HR son lecturas valiosas para evaluar la fibrosis hepática y la esteatosis en modelos preclínicos de NASH, la técnica tiene algunas limitaciones. Factores como la inflamación, la congestión hepática, la colestasis y la obstrucción del tracto de salida influyen en la rigidez hepática y, por lo tanto, pueden influir en la especificidad general de esta técnica en la medición de la fibrosis hepática8,14,15,16. Del mismo modo, el brillo del hígado en las imágenes de ultrasonido en modo B puede verse influenciado por la fibrosis y, por lo tanto, puede afectar la precisión del índice HR en la medición de la esteatosis. Se necesitan más estudios para aclarar la contribución de estos factores influyentes en la elasticidad y la esteatosis y establecer valores de corte para estas lecturas en diferentes modelos preclínicos de EHNA. Además, este estudio no evaluó la sensibilidad del índice de FC como biomarcador para evaluar la esteatosis hepática en un estudio de eficacia preclínica.
La medición de la rigidez hepática utilizando SWE tiene el potencial de convertirse en una herramienta valiosa para comprender la fisiopatología de NASH / NAFLD, así como para desarrollar nuevos tratamientos para esta afección. Al permitir que el investigador determine tanto la esteatosis hepática como la rigidez de los tejidos sin la necesidad de una biopsia invasiva, los animales en estudios preclínicos pueden ser monitoreados longitudinalmente, y los efectos de los medicamentos en sujetos individuales se pueden cuantificar con el tiempo.
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Disclosures
Todos los autores son empleados de Pfizer, Inc.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer al Equipo de Operaciones de Medicina Comparativa de Pfizer por su arduo trabajo cuidando y asegurando la salud de los animales del estudio, así como ayudando con algunas de las técnicas. Además, se debe agradecer a Danielle Crowell, Gary Seitis y Jennifer Ashley Olson por su ayuda con el procesamiento de tejidos para análisis histológicos. Además, los autores desean agradecer a Julita Ramírez por revisar y proporcionar comentarios valiosos durante la preparación de este manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aixplorer | Supersonic Imagine | Shear Wave Elastography Instrument | |
| Aixplorer SuperLinear SLH20-6 Transducer | Supersonic Imagine | Transducer for Shear Wave Elastography | |
| Alpha-dri bedding | rat cages | ||
| Aperio AT2 scanner | Leica Biosystems | Digital Pathology Brightfield Scanner | |
| Compac 6 Anesthesia System | VetEquip | Anesthesia Vaporizer and Delivery System. Any anesthesia delivery system can be used, however. | |
| Manage Imager Database | Leica Biosystems | Digital Pathology | |
| Mayer's Hematoxilin | Dako/Agilent | H&E Staining/Histology | |
| Nair | Church & Dwight | Hair remover | |
| Oil Red O solution | Poly Scientific | Lipid Staining/Histology | |
| Picrosirius Red Stain (PSR) | Rowley Biochemical | F-357-2 | Collagen Stain/Histology |
| Puralube Opthalmic ointment | Dechra Veterinary Product | Lubrication to prevent eye dryness during anesthesia | |
| Tissue-Tek Prisma Plus | Sakura Finetek USA | Automated slide stainer | |
| VISIOPHARM software | Visiopharm | Digital pathology software | |
| Research Diets | A06071309i | NASH inducing diet | |
| Purina | 5053 | Control animal chow | |
| Vevo imaging station | Fujifilm VisualSonics | The Vevo imaging station is used for holding the ultrasound transducer during imaging. | |
| Wistar Han rats | Charles River Laboratories |
References
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