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NAFLD/नैश के चूहे मॉडल में अल्ट्रासाउंड और कतरनी वेव इलास्टोग्राफी इमेजिंग का आवेदन

Published: April 20, 2021 doi: 10.3791/62403
Automatic Translation
*1, *2, 3, 4, 3, 1
1Comparative Medicine, Pfizer Inc., 2Digital Medicine & Translational Imaging, Pfizer Inc., 3Internal Medicine Research Unit, Pfizer Inc., 4Drug Safety Research & Development, Pfizer Inc.
* These authors contributed equally

Summary

यह प्रोटोकॉल गैर-आक्रामक रूप से निरीक्षण करने और गैर-मादक फैटी जिगर की बीमारी के कृंतक मॉडल में यकृत ऊतक परिवर्तनों की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक उन्नत अल्ट्रासाउंड तकनीक के उपयोग का वर्णन करता है।

Abstract

नॉनएल्कोहॉलिक स्टीटोहेपेटाइटिस (नैश) गैर-अल्कोहल फैटी लिवर डिजीज (एनएएफएफडी) के स्पेक्ट्रम के भीतर एक शर्त है, जो लिवर फैट संचय (स्टीटोसिस) और फाइब्रोसिस के लिए अग्रणी सूजन की विशेषता है। दवा के विकास में मानव नैश/NAFLD को बारीकी से पुनः निर्धारित करने वाले प्रीक्लिनिकल मॉडल आवश्यक हैं । जबकि जिगर बायोप्सी वर्तमान में NAFLD/नैश प्रगति और क्लिनिक में निदान को मापने के लिए सोने के मानक है, पूर्व नैदानिक अंतरिक्ष में, या तो एक अध्ययन या जिगर की बायोप्सी के दौरान कई समय बिंदुओं पर पूरे जिगर के नमूनों का संग्रह रोग चरण का आकलन करने के लिए हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण के लिए आवश्यक है ।

एक जिगर बायोप्सी मध्य अध्ययन का आयोजन एक आक्रामक और श्रम गहन प्रक्रिया है, और जिगर के नमूनों का संग्रह रोग के स्तर का आकलन करने के लिए एक अध्ययन के लिए आवश्यक अनुसंधान जानवरों की संख्या बढ़ जाती है । इस प्रकार, इन प्रीक्लीनिकल मॉडलों में नैश/NAFLD का पता लगाने के लिए एक विश्वसनीय, अनुवादयोग्य, गैर-इनवेसिव इमेजिंग बायोमार्कर की आवश्यकता है । नॉन-इनवेसिव अल्ट्रासाउंड बेस्ड बी-मोड इमेजेज और शेअर वेव इलास्टोग्राफी (एसडब्ल्यूई) का इस्तेमाल स्टेटोसिस के साथ-साथ लिवर फाइब्रोसिस को मापने के लिए किया जा सकता है । नैश के पूर्व नैदानिक कृंतक मॉडल में एसडब्ल्यूई की उपयोगिता का आकलन करने के लिए, जानवरों को एक समर्थक नैश आहार पर रखा गया था और हेपेटोरल (एचआर) इंडेक्स और यकृत लोच को मापने के लिए गैर-इनवेसिव अल्ट्रासाउंड बी-मोड और कतरनी तरंग इलास्टोग्राफी इमेजिंग से गुजरना पड़ा, क्रमशः जिगर वसा संचय और ऊतक कठोरता दोनों की प्रगति को मापने, एक दिए गए NAFLD/NASH अध्ययन के पाठ्यक्रम पर कई समय अंक पर ।

एचआर इंडेक्स और लोच संख्या की तुलना स्टीटोसिस और फाइब्रोसिस के हिस्टोलॉजिकल मार्कर से की गई । परिणामों ने एचआर इंडेक्स और तेल रेड ओ (ओआरओ) धुंधला के प्रतिशत के साथ-साथ लोच और पिरो-सीरियस रेड (पीएसआर) के बीच यकृत के धुंधला के बीच मजबूत संबंध दिखाया । क्लासिक पूर्व वीवो विधियों और वीवो इमेजिंग परिणामों के बीच मजबूत सहसंबंध इस बात का सबूत प्रदान करता है कि नैफल्ड/नैश के प्रीक्लिनिकल मॉडल में रोग फेनोटाइप और प्रगति का आकलन करने के लिए कतरनी तरंग इलास्टोग्राफी/अल्ट्रासाउंड आधारित इमेजिंग का उपयोग किया जा सकता है ।

Introduction

गैर-अल्कोहलिक फैटी लिवर डिजीज (NAFLD) एक मेटाबोलिक स्थिति है जो यकृत में वसा के अत्यधिक बिल्डअप की विशेषता है और जल्दी से दुनिया भर में एक अग्रणी यकृत बीमारी बन रही है जिसमें हाल ही में 25%1की वैश्विक व्यापकता की सूचना दी गई है। गैर-अल्कोहलिक स्टीटोहेपेटाइटिस (नैश) एनएएफएलडी के स्पेक्ट्रम का एक अधिक प्रगति वाला चरण है, जो प्रगतिशील सेलुलर क्षति, सूजन और फाइब्रोसिस के साथ अतिरिक्त यकृत वसा की विशेषता है। इन बीमारियों अक्सर चुप हैं, रक्त परीक्षण या नियमित परीक्षाओं के माध्यम से पता नहीं चला, जब तक काफी नुकसान पहले से ही एक मरीज के जिगर के लिए हुई है । वर्तमान में, रोगियों में नैश का निदान करने के लिए सोने के मानक रोगी व्युत्पन्न जिगर बायोप्सी नमूनों की हिस्टोलॉजिकल परीक्षा के माध्यम से है । इसी तरह, पूर्व नैदानिक शोधकर्ताओं जो नैश के रोगजनन को समझने के लिए काम/

उदाहरण के लिए, लिवर वेज बायोप्सी गुबरा नैश मॉडल2का उपयोग करते समय स्टीटोहेपेटाइटिस और फाइब्रोसिस का आकलन करने के लिए एक मानक तकनीक रही है। जिगर कील बायोप्सी विधि छोटे जानवरों में आक्रामक और श्रमसाध्य है3. एक अध्ययन के बीच में कील जिगर बायोप्सी का उपयोग एक रोग मॉडल में एक अतिरिक्त प्रयोगात्मक चर का प्रतिनिधित्व करता है, जो अक्सर जानवरों की संख्या बढ़ जाती है कि जरूरत है । इन कारकों को ध्यान में रखते हुए, गैर-इनवेसिव इमेजिंग तकनीकों का उपयोग शुरुआती समय के बिंदुओं पर नैश/NAFLD पशु मॉडल में स्टेटोसिस और फाइब्रोसिस का मज़बूती से आकलन करने के लिए किया जा सकता है । कतरनी तरंग इलास्टोग्राफी (एसडब्ल्यूई) एक अल्ट्रासाउंड-आधारित विधि है जो नरम ऊतकों की लोच को मापने के लिए उपयोग की जाती है। यह तकनीक एक ऊतक लक्ष्य पर निर्देशित सुपरसोनिक अल्ट्रासाउंड दालों द्वारा बनाई गई कतरनी तरंगों के प्रचार को मापता है, और फिर ई मोडुलस4नामक मूल्य की गणना करता है। कतरनी तरंग का वेग ऊतक कठोरता की डिग्री के आनुपातिक है।

चित्रा 1 और चित्रा 2 इमेजिंग क्षेत्र सेटअप और SWE साधन दिखाते हैं। एसडब्ल्यूई इंस्ट्रूमेंट एक सिंगल, व्हील्ड यूनिट है, जिसमें दो स्क्रीन और एक कंट्रोल पैनल है जो फिगर 2एमें दिखाया गया है । ऊपरी मॉनिटर(चित्रा 2B)कंप्यूटर मॉनिटर के रूप में कार्य करता है और छवियों और रोगी निर्देशिका प्रदर्शित करता है। नियंत्रण कक्ष(चित्रा 2C)बटन और डायल की एक सरणी है जो छवि कैप्चर के सामान्य पहलुओं को नियंत्रित करती है: फ्रीजिंग स्क्रीन, छवियों को सहेजना, एक मोड से दूसरे मोड में बदलना। लोअर स्क्रीन(चित्रा 2डी)एक टच स्क्रीन है जिसमें सेटिंग्स को बदलने के लिए अतिरिक्त नियंत्रण हैं और आवश्यकतानुसार इनपुट डेटा के लिए कीबोर्ड के रूप में कार्य करता है। उपकरण एक लेखनी से लैस करने के लिए टच स्क्रीन पर उपयोग करने के लिए यदि वांछित है । अल्ट्रासाउंड जांच डिवाइस के निचले मोर्चे के पैनल को देते हैं। कृंतक में बी-मोड और एसडब्ल्यूई इमेजिंग के लिए सुपर-रैखिक 6 से 20 मेगाहर्ट्ज ट्रांसड्यूसर का इस्तेमाल किया गया। ऊतक कठोरता को मापने की यह क्षमता एसडब्ल्यूई को नैश रोगियों में यकृत फाइब्रोसिस5 की पहचान और मंचन के लिए एक मूल्यवान उपकरण बनाती है, जिससे अधिक आक्रामक तरीकों की आवश्यकता कम हो जाती है। SWE, वास्तव में, रोगियों में जिगर फाइब्रोसिस को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया है और क्लिनिक6में फाइब्रोसिस स्कोर करने के लिए एक एफडीए अनुमोदित विधि है । रोग के पशु मॉडल में नैश प्रगति की निगरानी के लिए SWE का उपयोग उपचार के विकास के लिए एक अनुवाद उपकरण प्रदान करेगा और साथ ही पशु विषय संख्या में कमी और वीवो प्रक्रियाओं में शोधन के माध्यम से पशु कल्याण में सुधार करने के लिए दर्द और संकट को कम करेगा ।

मानव रोगियों में एसडब्ल्यूई इमेजिंग कम आवृत्ति अल्ट्रासाउंड ट्रांसड्यूसर4का उपयोग करता है, जो छोटे जानवरों के लिए आदर्श नहीं है। विशेष रूप से, एक चूहा मॉडल7में नैश के रोगजनन पर एसीटिल-सीओए कार्बोक्सिलेज अवरोध की प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने के लिए उच्च आवृत्ति एसडब्ल्यूई तकनीकों का उपयोग किया गया है, और इस तकनीक की उपयोगिता को पारंपरिक मेटावीर हिस्टोलॉजिकल स्कोरिंग विधियों की तुलना में सफल परिणामों के साथ यकृत फाइब्रोसिस के कार्बन टेट्राक्लोराइड चूहा मॉडल में वर्णित किया गया है8। हालांकि, मौजूदा साहित्य नैश के पूर्व नैदानिक मॉडल में SWE इमेजिंग के आवेदन पर विस्तृत तकनीक और कार्यप्रणाली जानकारी का अभाव है। जैसा कि ऊपर वर्णित है, लिवर स्टेटोसिस NAFLD/नैश स्थिति की प्रमुख विशेषताओं में से एक है और यह एक महत्वपूर्ण चरण है जहां हस्तक्षेप पर विचार किया जा सकता है । इस प्रकार, इमेजिंग मोडलि का उपयोग करके यकृत वसा संचय का आकलन करना उतना ही महत्वपूर्ण है जितना कि नैश/NAFLD के प्रीक्लिनिकल मॉडल में यकृत फाइब्रोसिस का आकलन करना ।

एक अल्ट्रासाउंड तकनीक जिसे एचआर इंडेक्स के रूप में जाना जाता है, गुर्दे के कॉर्टेक्स की तुलना में यकृत की ऊतक चमक का अनुपात, क्लिनिक9,10में स्टीटोसिस के सरोगेट मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया गया है। हालांकि, इस दृष्टिकोण का बड़े पैमाने पर NAFLD/नैश के पूर्व नैदानिक पशु मॉडलों में उपयोग नहीं किया गया है । यह लेख लोच को मापने की एक विधि के साथ-साथ एचआर इंडेक्स को हेपेटिक फाइब्रोसिस और स्टेटोसिस के सरोगेट मार्कर के रूप में क्रमशः कोलीन-कमी, उच्च वसा वाले आहार (सीडीएडीएफडी) एनएएफएलडी/नैश के चूहे मॉडल में वर्णन करता है । यह मॉडल तेजी से स्टेटोसिस, यकृत सूजन और फाइब्रोसिस को प्रेरित करता है, जो चूहों11में 6 सप्ताह के भीतर औसत दर्जे का होता है। इस आहार में कोलेस्ट्रॉल (1%) के अलावा चूहों में फाइब्रोजेनेसिस को बढ़ावा देने के लिए दिखाया गया है12,इस मॉडल को कतरनी तरंग इमेजिंग से जुड़े सत्यापन अध्ययनों के लिए एक उपयुक्त उम्मीदवार बनाता है। कुल मिलाकर, इस इमेजिंग प्रौद्योगिकी को नैश मॉडल/आहार की एक विस्तृत श्रृंखला पर भी लागू किया जा सकता है जहां स्टेटोसिस और/या फाइब्रोसिस ब्याज का एक अंत बिंदु है ।

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Protocol

सभी पशु-शामिल प्रक्रियाओं की समीक्षा की गई और फाइजर की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया और एक AAALAC (प्रयोगशाला पशु देखभाल का मूल्यांकन और प्रत्यायन) अंतरराष्ट्रीय मान्यता प्राप्त सुविधा में आयोजित किया गया ।

1. रोग प्रेरण

  1. पुरुष विस्स्टर हान चूहों (150-175 ग्राम; ~ 6-7 सप्ताह पुराने; कुल 40 चूहों) का उपयोग करें जो ज्ञात चूहे साहसी रोगजनकों से मुक्त हैं। कागज बिस्तर के साथ व्यक्तिगत रूप से हवादार caging में जोड़े में चूहों घर (सामग्री की मेजदेखें) और उन्हें 1 डिग्री सेल्सियस, 40-70% सापेक्ष आर्द्रता के साथ 12:12 घंटे प्रकाश अंधेरे चक्र के साथ 22 ± बनाए रखने।
  2. अध्ययन डिजाइन के आधार पर 1% कोलेस्ट्रॉल (एन = 20) या एक मानक प्रयोगशाला कृंतक चाउ (एन = 20) के साथ उच्च वसा वाले आहार पर 150-175 ग्राम (~ 6-7 सप्ताह पुराना) वजन वाले चूहों को रखें।
    नोट: इस अध्ययन में, प्रति समूह 20 जानवरों के साथ कुल ४० चूहों का पंजीकरण किया गया था । 6सप्ताह के अंत में, प्रत्येक समूह से पलटन के आधे जिगर के नमूनों के मध्य अध्ययन हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण के लिए necropsied था । इस प्रकार, नमूना आकार 9 और 12 सप्ताह के समय अंक के लिए प्रति समूह10 जानवरों था ।

2. इंस्ट्रूमेंट सेटअप

  1. इमेजिंग क्षेत्र को इस प्रकार स्थापित करें: इमेजिंग (चित्रा 1में सी) के दौरान जानवरों को गर्म रखने के लिए एक गर्म सतह शामिल करें, और प्रक्रिया के दौरान संज्ञाहरण के एक विमान को बनाए रखने के लिए इन्हेलेंट संज्ञाहरण देने के लिए एक सुरक्षित संज्ञाहरण शंकु (चित्रा 1में बी)।
  2. अल्ट्रासाउंड जांच को वांछित स्थान पर ले जाने और जांच को जानवर पर आराम करने से रोकने की सुविधा के लिए अल्ट्रासाउंड जांच धारक का उपयोग करें।
    1. त्वचा पर गर्म अल्ट्रासाउंड जेल का उपयोग करें जहां अल्ट्रासाउंड छवि का अधिग्रहण किया जाता है।
    2. प्रक्रिया के दौरान निम्नलिखित सेटिंग्स बनाए रखें, जिन्हें टच स्क्रीन पर समायोजित किया जा सकता है: ध्वनिक पावर 0.0 डीबी; टिशू ट्यूनर 1540 मीटर/ डायनेमिक रेंज 60 डीबी; लोच रेंज (एसडब्ल्यूई मोड के लिए) 30 किलो <।
  3. विशेष धारक (चित्रा 1में एक) में रेल प्रणाली के लिए अल्ट्रासाउंड जांच संलग्न करें ।
  4. उपकरण को स्विच ऑन करें और इसे बूट करने की अनुमति दें। एक बार मॉनिटर चालू होने के बाद, कनेक्टेड ट्रांसड्यूसर विवरण के साथ बी मोड इमेज पर ध्यान दें।

3. विषय की तैयारी

  1. सुनिश्चित करें कि जानवरों को इमेजिंग प्रक्रिया से कम से कम 4 घंटे पहले उपवास किया जाता है ताकि आंत की सामग्री को छवि अधिग्रहण में हस्तक्षेप करने से रोका जा सके।
    1. उपवास के कम से कम 4 घंटे के बाद, एक चूहे को आइसोफ्लुरेन एनेस्थेटिक इंडक्शन कक्ष में रखें जब तक कि संज्ञाहरण का उपयुक्त स्तर न पहुंच जाए, तो अंगुली चुटकी के लिए कोई प्रतिक्रिया न हो। संज्ञाहरण को प्रेरित करने के लिए 3-5 मिनट के लिए 3-5% आइसोफ्लुनाणे जानवरों का पर्दाफाश करें।
    2. रखरखाव संज्ञाहरण के लिए, छवि अधिग्रहण के दौरान जानवरों को 2-3% आइसोफ्लुन के तहत रखें। संज्ञाहरण के दौरान आंख को सूखने से बचाने के लिए नेत्र मरहम लगाएं।
  2. एक बार संज्ञाहरण प्राप्त हो जाने के बाद, एक जानवर को इंडक्शन कक्ष से हटा दें और इसे गर्म गर्म पानी पर कंबल परिसंचारी दें। स्नाउट के ऊपर एक संवेदनाहारी नाक शंकु रखें, और रिबकेज से श्रोणि तक जानवर को अपनी दाईं ओर दाढ़ी रखें। इस क्षेत्र में बचे हुए सभी बालों को हटाने के लिए केमिकल डेपिलेशन क्रीम का इस्तेमाल करें।
  3. एक बार बाल हटा दिया गया है, ऊपरी पंजे के साथ बाएं पार्श्व अनुनाद में एक जानवर एक गर्म इमेजिंग मंच(चित्रा 3A)पर सिर के ऊपर टेप जगह है ।
  4. उपकरण नियंत्रण कक्ष पर रोगी कुंजी दबाता है, और अध्ययन डिजाइन के अनुसार विषय की पहचान।
    1. टच स्क्रीन पर आइकन को टैप करके इंस्ट्रूमेंट पर कीबोर्ड फंक्शन खोलें। मनचाजा के रूप में नाम टाइप करें।
    2. रोगी की नाम स्क्रीन से बाहर निकलने के लिए बाहर निकलें टैप करें। निरीक्षण करें कि बी-मोड मॉनिटर पर फिर से खुलता है।

4. हेपेटो-गुर्दे (एचआर) सूचकांक माप के लिए छवि अधिग्रहण

  1. जानवर पर डिपिलेटेड त्वचा क्षेत्र में गर्म अल्ट्रासाउंड जेल की थोड़ी मात्रा लागू करें।
  2. विषय(चित्रा 3B)के जेल-कवर क्षेत्र को छूने के लिए अल्ट्रासाउंड जांच को स्थानांतरित करें। एक बार जब विषय के आंतरिक अंगों की लाइव बी-मोड छवि मॉनिटर पर दिखाई देती है, तो अल्ट्रासाउंड जांच को कूल्हे से थोड़ा ऊपर के क्षेत्र में ले जाएं, बस काठ के कशेरुकी (sagittal विमान) के समानांतर।
  3. मॉनिटर पर बी-मोड डिस्प्ले का उपयोग करके, बड़ी गुर्दे की धमनी और कॉर्टेक्स/मेडुला सेपरेशन(चित्रा 4A)की पहचान करके सही किडनी का पता लगाएं । इसके अलावा, छवि के एक विमान में जिगर के हिस्से का निरीक्षण करें।
    1. सुनिश्चित करें कि छाया और हवा के बुलबुले जैसे कोई छवि कलाकृतियों के लिए थोड़ा नहीं हैं।
  4. एचआर इंडेक्स प्राप्त करने के लिए बी मोड अनुपात को मापें।
    1. सुनिश्चित करें कि गुर्दे प्रांतस्था और जिगर परेंचिमा दोनों ध्यान के एक ही विमान में हैं। यदि आवश्यक हो, तो स्पष्ट छवि प्राप्त करने के लिए फोकस समायोजित करें और नियंत्रण प्राप्त करें।
      1. कंट्रोल पैनल पर फोकस नॉब को बदलकर फोकस को एडजस्ट करें। एक बार ऑटो टीजीसी बटन दबाकर लाभ को समायोजित करें।
    2. कंट्रोल पैनल पर फ्रीज की चाबी दबा दें। सुनिश्चित करें कि धुंधला छवियों से बचने के लिए स्क्रीन को ठंडा करते समय जानवर सांस के बीच है।
    3. एक बार स्क्रीन जम जाने के बाद, टच स्क्रीन पर माप उपकरण टैप करें। बी-मोड अनुपातका चयन करें, एक अंतर्निहित उपकरण जो ब्याज के चयनित क्षेत्र से ऊतक की सापेक्ष चमक को मापता है। ब्याज के क्षेत्र (आरओआई) का चयन करने के लिए 2 मिमी सर्कल बनाएं। नियंत्रण कक्ष पर ट्रैकबॉल के बाहरी किनारे के साथ एक उंगली ले जाकर सर्कल आकार को समायोजित करें।
    4. लिवर इमेज आरओआई पर 2 एमएम सर्कल रखें, जो किडनी के दाईं ओर स्थित होना चाहिए। इसकी सजातीय इकोजेनिसिटी और चिकनी समोच्च के आधार पर जिगर के ऊतकों की पहचान करें।
    5. एक बार सर्कल जगह में है, नियंत्रण कक्ष पर चुनें बटन दबाएं, और नए सर्कल है कि प्रकट होता है निरीक्षण ।
    6. नए सर्कल के आकार को 2 मिमी तक समायोजित करें, और इसे गुर्दे के प्रांतस्था की छवि पर रखें। लिवर और किडनी कॉर्टेक्स पर सर्कल्स की गहराई को एक जैसा रखना सुनिश्चित करें। एक बार जगह में, नियंत्रण कक्ष पर चुनें बटन दबाएं। बिल्ट-इन सिस्टम टूल का निरीक्षण करें एचआर इंडेक्स को बी-मोड अनुपात के रूप में प्रदर्शित करता है।
    7. छवि को बचाने के लिए प्रेस सेव इमेज, और मॉनिटर के दाईं ओर थंबनेल के रूप में दिखाई देने वाली सहेजी गई छवियों का निरीक्षण करें।
    8. छवि को अनफ्रीज करने और लाइव बी मोड इमेज पर लौटने के लिए कंट्रोल पैनल पर फ्रीज बटन दबाएं।
  5. ऊतक के विभिन्न गहराई और विमानों पर 3 बार बी मोड अनुपात माप दोहराएं। प्रत्येक पशु और समय बिंदु के लिए इन तीन बी-मोड अनुपात के औसत की गणना करें।

5. कतरनी वेव इलास्टोग्राफी के लिए छवि अधिग्रहण

  1. बी मोड का उपयोग कर जिगर का पता लगाने के लिए सही उपकोस्टल क्षेत्र में जांच को विपरीत रूप से ले जाएं। जिगर के एक क्षेत्र का पता लगाएं जो ज्यादातर परेंचिमा है और पोर्टल नस और हेपेटिक धमनी जैसे बड़े रक्त वाहिकाओं से मुक्त है। एक बार जिगर का एक स्पष्ट क्षेत्र पाया गया है, नियंत्रण कक्ष पर SWE बटन दबाकर ऊतक की एक कतरनी लोच नक्शा उत्पन्न करें।
  2. छाया से मुक्त क्षेत्र में जिगर कैप्सूल के नीचे SWE बॉक्स के आकार और स्थिति को समायोजित करें। कैप्सूल को जिगर के शीर्ष के पास एक उज्ज्वल इकोजेनिक लाइन के रूप में पहचानें।
  3. निरीक्षण करें कि SWE बॉक्स 5-10 एस के भीतर एक रंग के नक्शे में संक्रमण करता है। एक बार बॉक्स भरा हुआ और स्थिर हो जाने के बाद, जब जानवर सांस के बीच हो तो कंट्रोल पैनल पर फ्रीज बटन दबाएं।
    नोट: यकृत की लोच का सही आकलन करने के लिए बॉक्स कवरेज की न्यूनतम राशि 60-80% होनी चाहिए।
  4. टच स्क्रीन पर, क्यूबॉक्सपर टैप करें, एक अंतर्निहित सिस्टम टूल जो कतरनी तरंग लोच मानचित्र पर आरओआई से लोच की गणना करता है। मॉनिटर पर दिखाई देने वाले सर्कल और डेटा बॉक्स का निरीक्षण करें। टच स्क्रीन पर स्थिति आइकन को वांछित सेटअप में टैप करके क्यूबॉक्स की स्थिति को समायोजित करें।
  5. नियंत्रण कक्ष पर ट्रैकबॉल के बाहरी किनारे के साथ एक उंगली ले जाकर सर्कल के आकार को 3 मिमी तक समायोजित करें। ट्रैकबॉल का उपयोग करना, एक समान रंग(चित्रा 5A,बी)के साथ छाया से मुक्त क्षेत्र में सर्कल की स्थिति । रक्त वाहिकाओं या यकृत कैप्सूल जैसे कठोरता के ज्ञात क्षेत्रों से बचने के साथ-साथ इन संरचनाओं से खून-नीचे होने का ध्यान रखें।
  6. जब कोई पर्याप्त क्षेत्र पाया जाता है, तो छवि को बचाने के लिए नियंत्रण कक्ष पर सेव इमेज दबाएं। इस प्रक्रिया को जिगर के विभिन्न क्षेत्रों में 3 बार दोहराएं। जिगर के विभिन्न क्षेत्रों से SWE-मैप छवियों को इकट्ठा करने के लिए पेट पर जांच को ऊपर और नीचे या बग़ल में ले जाएं।
  7. एक बार सभी छवियों को एकत्र कर लिया गया है, नियंत्रण कक्ष पर अंत परीक्षा प्रेस, और रोगी जानकारी स्क्रीन है कि मॉनिटर पर दिखाई देता है की नोट करते हैं ।
  8. जानवर के पंजे से टेप निकालें, अतिरिक्त जेल को मिटा दें, और इमेजिंग चरण से जानवर को हटा दें। यह पूरी तरह से बरामद होने तक अपने आप में एक गर्म, सूखे पिंजरे में संज्ञाहरण से उबरने के लिए अनुमति दें । संज्ञाहरण से पूर्ण वसूली सुनिश्चित करने के लिए प्रत्येक जानवर की निगरानी करें, जो स्टर्नल रेक्यूम्बेंसी बनाए रखने की क्षमता से संकेत मिलता है
  9. पलटन में प्रत्येक जानवर के लिए वर्ग 4-5 में दोहराने के कदम छवि हो ।

6. छवि डेटा पुनः प्राप्ति और विश्लेषण

  1. जब सभी जानवरों के लिए छवियां एकत्र की गई हैं, तो संज्ञाहरण को बंद कर दें।
  2. मशीन से छवि डेटा खींचने के लिए, नियंत्रण कक्ष पर समीक्षा बटन दबाएं, और मॉनिटर पर दिखाई देने वाले उस उपकरण पर किए गए सभी स्कैन का निरीक्षण करें। स्क्रीन के ऊपरी कोने में खोज खिड़की का उपयोग कर वांछित स्कैन के लिए खोजें।
  3. ट्रैकबॉल और चुनें बटन के माध्यम से रोगी के नाम के बगल में बॉक्स की जांच करके डेटा विश्लेषण के लिए आवश्यक सभी स्कैन का चयन करें। एक बार सभी आवश्यक स्कैन हाइलाइट हो जाने के बाद, टच स्क्रीन पर निर्यात जेपीईजी का चयन करें। नेटवर्क ड्राइव या पोर्टेबल यूनिवर्सल सीरियल बस (यूएसबी) ड्राइव पर डेटा निर्यात करें। साधन के पीछे यूएसबी बंदरगाहों का पता लगाएं।
  4. एक बार फाइलों का निर्यात हो जाने के बाद, वर्कस्टेशन कंप्यूटर पर प्रत्येक स्कैन की व्यक्तिगत जेपीजी फाइलें खोलें। छवि के दाईं ओर सभी डेटा का निरीक्षण करें: बी मोड अनुपात-बी अनुपात संख्या एकत्र करें; क्यू बॉक्स- मतलब लोच (kPa) मूल्य इकट्ठा करें।
  5. सभी डेटा को स्प्रेडशीट या अन्य डेटाबेस प्रबंधन सॉफ्टवेयर में दर्ज करें, और वांछित सांख्यिकीय विश्लेषण करें।

7. जिगर के नमूनों का हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण

  1. 6सप्ताह के अंत में, यकृत के नमूनों के मध्य अध्ययन हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण के लिए प्रत्येक समूह से पलटन के आधे पर नेक्रॉप्सी करें। इसी तरह, जानवरों के बाकी पलटन को इच्छामृत्यु दें, और 12वें सप्ताह के समय बिंदु पर हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण के लिए यकृत के नमूने एकत्र करें।
  2. ओआरओ धुंधला करने के लिए, 10% तटस्थ-बफर फॉर्मेलिन में यकृत वर्गों को ठीक करें, और उन्हें कम से कम रात में रेफ्रिजरेटेड 30% सुक्रोज समाधान का उपयोग करके सुक्रोज के साथ पेश करें। क्रायो-इष्टतम काटने तापमान यौगिक में वर्गों एम्बेड, और क्रायो-सेक्शन उन्हें ORO धुंधला करने के लिए तैयार करने के लिए चार्ज स्लाइड पर अनुभाग ।
  3. क्रायो-सेक्शन को 100% प्रोपलीन ग्लाइकोल में 2 मिनट के लिए रखें और इसके बाद 0.5% ORO समाधान में रात भर इनक्यूबेशन करें। ओआरओ समाधान से हटाने के बाद, 1 मिनट के लिए 85% प्रोपलीन ग्लाइकोल में वर्गों में अंतर करें, डिओनाइज्ड पानी में कुल्ला करें, और 1 मिनट के लिए मेयर के हेमटॉक्सीलिन-लिली के संशोधन के साथ काउंटरटाइन करें।
    1. स्लाइड्स पर कवरस्लिप रखें जलीय बढ़ते मीडियम का इस्तेमाल करते हुए उन्हें कमरे के तापमान पर सुखाएं।
  4. पीएसआर के लिए, फॉर्मेलिन-फिक्स्ड, पैराफिन एम्बेडेड लिवर सेक्शन स्लाइड्स को डिपैराफिनाइज करें, उन्हें बोन फ्लूइड में रात भर रखें, और फिर उन्हें कुछ अनुकूलित चरणों के साथ निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार एक स्वचालित स्लाइड स्टेनर का उपयोग करके दाग दें (5 मिनट के लिए 1% फॉस्फोमोलिब्डिक एसिड; 0.1% सीरियस रेड में संतृप्त पिरिक एसिड में 90 मिनट; 2 x 30 एस वॉश में 0.5% एस स्वचालित रूप से स्लाइड निर्जलित और फिर उन्हें एक स्थायी बढ़ते माध्यम के साथ माउंट।
  5. 20x आवर्धन पर डिजिटल माइक्रोस्कोपी स्कैनर का उपयोग करके ओआरओ-और पीएसआर-दाग वाली स्लाइड्स की छवियों को कैप्चर करें, उन्हें .svs प्रारूप में सहेजें, और स्लाइड मैनेजर इमेज डेटाबेस में स्टोर करें।
  6. डिजिटल पैथोलॉजी सॉफ्टवेयर में बनाए गए कस्टम एल्गोरिदम का उपयोग करके छवियों का विश्लेषण करें। समान रूप से यकृत वर्गों के क्षेत्र के साथ-साथ ओआरओ-और पीएसआर-दाग वाले क्षेत्रों की पहचान करने और निर्धारित करने के लिए दहलीज मापदंडों के साथ डिजिटल पैथोलॉजी सॉफ्टवेयर अनुप्रयोगों को समान रूप से लागू करें। क्षेत्र प्रतिशत गणना के लिए एक स्प्रेडशीट के लिए माप निर्यात।

8. सांख्यिकीय विश्लेषण

  1. विभिन्न समय बिंदुओं पर समूहों के बीच अंतर का आकलन करने के लिए सिडक के कई तुलना परीक्षण का उपयोग करके दो तरह के एनोवा के साथ इमेजिंग डेटा का सांख्यिकीय विश्लेषण करें। संभावना मूल्यों पी ≤ 0.001 के लिए समूहों के बीच महत्वपूर्ण अंतर मान लें। इसके अलावा, हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण के साथ इमेजिंग रीडआउट का सहसंबंध करें।
  2. इस अध्ययन से हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण परिणामों का विश्लेषण करने के लिए गैर-पैरामेट्रिक आंकड़ों का उपयोग करें। समूह मूल्यों को अर्ध-अंतरवर्गीय रेंज (sIQR) ± औसत के रूप में रिपोर्ट करें। संभावना मूल्यों पी ≤ 0.001 के लिए समूहों के बीच महत्वपूर्ण अंतर मान लें। विभिन्न समूहों के बीच पीएसआर और ओआरओ हिस्टोकेमिकल दाग की मात्रा की तुलना करने के लिए मान-व्हिटनी परीक्षण का उपयोग करें।

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Representative Results

सीडीएएफडी खिलाए गए जानवरों की एक बानगी स्टेटोसिस है। लिवर में फैट का जमाव टिश्यू के इकोजेनिक गुणों को बदलता है, जिसे लिवर की चमक को मापकर और एक ही प्लेन में ली गई बी-मोड इमेज से र्नल कॉर्टेक्स की चमक को सामान्य करके मात्रा निर्धारित किया जा सकता है । मात्रात्मक मूल्य मानव संसाधन सूचकांक के रूप में व्यक्त किया जाता है, जो स्टीटोसिस का एक अप्रत्यक्ष उपाय है। चित्रा 4Aमें, एक नियंत्रण जानवर से एक प्रतिनिधि जिगर की छवि गुर्दे प्रांतस्था की तुलना में लगभग बराबर या कम चमक (इकोजेनिकिटी) दिखाती है। इस प्रकार सामान्य पशुओं का एचआर इंडेक्स <1 है। इस अध्ययन में, 3 सप्ताह के समय बिंदु पर नियंत्रण जानवरों का औसत एचआर सूचकांक 0.645 ± 0.03 है। इसके विपरीत, सीडीएचएफडी-फेड पशु(चित्रा 4 ए)की एक प्रतिनिधि बी-मोड छवि गुर्दे के प्रांतस्था की तुलना में जिगर की बढ़ी हुई चमक दिखाती है। नतीजतन, सीडीएएफडी आहार जानवरों से प्रतिनिधि छवियों के मानव संसाधन सूचकांक क्रमशः 6 और 12 सप्ताह के समय अंक पर १.९१ और १.७९ थे ।

चित्रा 4C नियंत्रण और CDAHFD जानवरों से समय के साथ मानव संसाधन सूचकांक की एक साजिश से पता चलता है । नियंत्रण-आहार-खिलाया जानवरों बेसलाइन से मानव संसाधन सूचकांक मूल्यों में थोड़ा आंदोलन दिखाते हैं, जबकि CDAHFD जानवरों के एक पठार तक पहुंचने से पहले अध्ययन के पहले 3-6 सप्ताह के पाठ्यक्रम पर जल्दी से वृद्धि । सीडीएएफडी आहार पर होने वाले जानवरों का औसत एचआर इंडेक्स 12 सप्ताह बाद रोग प्रेरण में नियंत्रण जानवरों में 0.328 ± 0.03 की तुलना में 0.06 ± 1.861 है। जैसा कि उम्मीद थी, जिगर ने 6-(३४.८१ ± ४.६६ बनाम) पर नियंत्रण आहार समूह की तुलना में सीडीएए एफीज़िंग में ORO धुंधला करने के लिए काफी अधिक सकारात्मक प्रतिशत क्षेत्र दिखाया । 0.49 ± 0.11) और 12- (30.08 ± 2.64 बनाम 1.17 ± 0.44) सप्ताह के समय अंक(चित्रा 4B,D)। 6-और 12 सप्ताह के समय अंक(चित्रा 4E)पर एचआर इंडेक्स के साथ ORO धुंधला के प्रतिशत क्षेत्र के बीच उत्कृष्ट सहसंबंध (पियर्सन आर = 0.78) भी था। इन परिणामों का सुझाव है कि एचआर इंडेक्स NAFLD/नैश के प्रीक्लिनिकल मॉडल में स्टेटोसिस की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक मूल्यवान इमेजिंग रीडआउट हो सकता है ।

SWE के माध्यम से जिगर की कठोरता को मापने के प्रमुख तत्वों में से एक आरओआई(चित्रा 5)का उचित स्थान है। बाएं पैनल(चित्रा 5A)एक नियंत्रण आहार जानवर से बी मोड और जिगर के SWE मानचित्रण के साथ एक प्रतिनिधि छवि से पता चलता है । उचित आरओआई प्लेसमेंट एक ऐसे क्षेत्र पर होना चाहिए जो रंग मानचित्र में स्थिर हो और जिगर के उस खंड का प्रतिनिधित्व करता है जिसे मापा जा रहा है, एक संकेत के साथ जो यकृत कैप्सूल और रक्त वाहिकाओं जैसे आसन्न संरचनाओं से प्रभावित नहीं होता है। ऊतक कठोरता ई मॉड्यूलस के रूप में सूचित किया जाता है, जो कतरनी तरंग गति और एक निर्धारित निरंतर पर आधारित गणना है और किलोपास्कल्स (kPa) में व्यक्त किया जाता है। नियंत्रण जानवरों के लिए, ई मॉड्यूलस 3.5 केपीए और 6 केपीए के बीच पड़ता है। नियंत्रण जानवरों के लिए चित्रा 5A में रिपोर्ट किए गए आरओआई का मतलब केपीए क्रमशः 6 और 12 सप्ताह के समय अंक पर ४.६ और ५.५ kPa था, जो अपेक्षित सामान्य सीमा के भीतर आता है । चित्रा 5A 6 और 12 सप्ताह में एक CDAHFD जानवर से SWE मोड की एक प्रतिनिधि छवि से पता चलता है । यहां, आरओआई को फिर से क्यू बॉक्स (कतरनी तरंग मानचित्र) के केंद्र के पास रखा गया है, जो छवि के शीर्ष पर रंगीन संदर्भ के आधार पर है।

जैसा कि इस मॉडल के साथ उम्मीद थी, सीDAHएफडी-फेड जानवर में ई मॉड्यूलस बहुत अधिक है। इन प्रतिनिधि छवियों में, मतलब kPa 6 सप्ताह में १०.५ और 12 सप्ताह में २३.१ kPa था, महत्वपूर्ण ऊतक कठोरता का संकेत है । सीडीएएफडी और नियंत्रण चाउ का उपयोग करने वाले एक विशिष्ट नैश आहार अध्ययन को सीडीएएफडी-फेड जानवरों में फाइब्रोसिस के कारण यकृत कठोरता की निरंतर प्रगति का पता लगाना चाहिए, जबकि नियंत्रण जानवर समान रहते हैं। चित्रा 5C एक 12 सप्ताह की अवधि में नियंत्रण जानवरों में स्थिर लोच की तुलना में CDAHFD जानवरों में जिगर की लोच में क्रमिक वृद्धि से पता चलता है । नियंत्रण आहार लोच 3 सप्ताह के समय बिंदु पर 0.99 kPa ± 5.80 से शुरू होता है और 12 सप्ताह के अध्ययन के दौरान बहुत परिवर्तन (6.14 ± 0.59) प्रदर्शित नहीं करता है। हालांकि, कोलिन की कमी वाले आहार में काफी जल्दी वृद्धि का पता चलता है, जो 6 सप्ताह तक 12.07 ± 2.37 kPa तक पहुंच गया है। अध्ययन की प्रगति के रूप में सीडीएचएफडी आहार में बढ़ी हुई लोच में प्रवृत्ति जारी है, विशेष आहार दीक्षा के बाद 12 सप्ताह में 9.29 किलोमीटरपीए ± 24.43 तक पहुंच गया है।

फाइब्रोसिस के सहसंबद्ध के रूप में कोलेजन को स्थानीयकृत करने के लिए यकृत के नमूनों को पीएसआर के साथ दाग दिया गया था। जैसा कि इस मॉडल के साथ उम्मीद थी, 6-और 12 सप्ताह के समय अंक(चित्रा 5D)पर नियंत्रण आहार की तुलना में सीडीएएफडी जानवरों में लिवर पीएसआर-पॉजिटिव धुंधला का काफी अधिक प्रतिशत है। पूर्व वीवो धुंधला करने के लिए एक किराए की विधि के रूप में कतरनी लहर की उपयोगिता स्थापित करने के लिए, कतरनी लहर ई Modulus संख्या PSR के खिलाफ साजिश रची गई थी CDAHFD चूहों में दाग क्षेत्र चित्रा 5E में सहसंबंध निर्धारित करने के लिए । साजिश के विश्लेषण से 0.88 के पियर्सन 'आर' मूल्य के साथ एक तंग क्लस्टर का पता चला, जो मजबूत सहसंबंध का संकेत है। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि यहां रिपोर्ट किए गए परिणाम नैश को प्रेरित करने के लिए कोलीन-कमी, उच्च वसा वाले आहार का उपयोग करके एक अध्ययन में क्या उम्मीद की जाएगी, के प्रतिनिधि हैं। इस विधि का उपयोग अन्य प्रीक्लीनिकल नैश मॉडल के साथ भी किया जा सकता है; हालांकि, यह रोग प्रेरण प्रोटोकॉल के आधार पर विभिन्न परिणामों और कट-ऑफ मूल्यों का उत्पादन करेगा। चूहा नैश मॉडल की तरह, सीडीएएफडी-प्रेरित नैश माउस मॉडल में एसडब्ल्यूई इमेजिंग ने यकृत लोच मूल्यों और जिगर13में पीएसआर-सकारात्मक दाग क्षेत्र के प्रतिशत के बीच उत्कृष्ट संबंध दिखाया। इस प्रकार, SWE NAFLD/नैश के पूर्व नैदानिक मॉडल में जिगर फाइब्रोसिस का आकलन करने के लिए एक मूल्यवान उपकरण हो सकता है ।

Figure 1
चित्रा 1:इमेजिंग सेटअप। अल्ट्रासाउंड ट्रांसड्यूसर (ए) उतरते हाथ से आयोजित किया जाता है। इमेजिंग चरण (ख) में संज्ञाहरण नली को दबाने और इमेजिंग के दौरान निरंतर संज्ञाहरण के लिए नाक शंकु (सी) स्थापित करने के लिए एक क्षेत्र है। मंच भी गर्म और शरीर के तापमान की निगरानी के लिए जांच से सुसज्जित है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्र 2:कतरनी तरंग इलास्टोग्राफी उपकरण। (क)कतरनी तरंग इलास्टोग्राफी उपकरण 4 अल्ट्रासाउंड जांच के लिए लगाव बंदरगाहों के साथ एक एकल, पहिएदार इकाई है । (ख)ऊपरी मॉनिटर छवियों के वास्तविक समय को देखने के लिए दृश्य उत्पादन के रूप में कार्य करता है, साथ ही रोगी डेटा और सिस्टम इन्वेंट्री प्रदर्शित करता है। (ग)केंद्रीय नियंत्रण कक्ष में अधिकांश बटन और घुंडी होते हैं जो प्रदर्शन को समायोजित करने और छवियों को प्राप्त करने के लिए आवश्यक होते हैं। (घ)लोअर मॉनिटर एक टच स्क्रीन है जिसमें छवि अधिग्रहण और समायोजन के लिए अतिरिक्त नियंत्रण और आदेश हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3:पशु स्थिति और उचित ट्रांसड्यूसर प्लेसमेंट । (A)एक बार एक जानवर को ठीक से मंच पर रखा गया है और टेप-इन लेफ्ट पार्श्व प्रतिनम्बेंसी(ख)के साथ रोका गया है अल्ट्रासाउंड जांच चूहे पर कम हो जाती है, जो पेट/साइड पर रखे जेल को छूती है । जब जांच पैनल बीमें स्थिति में जेल को छू रहा है, गुर्दे और जिगर मॉनिटर पर मुक़ाबला में देखा जा सकता है । यह हेपेटो-गुर्दे सूचकांक को इकट्ठा करने के लिए एक इष्टतम स्थिति है, और कुछ मामलों में, कतरनी तरंग संख्या भी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्र 4:हेपेटो-गुर्दे सूचकांक परिणाम। (A)नियंत्रण और CDAHFD आहार चूहों से मानव संसाधन सूचकांकों की प्रतिनिधि छवि 6 और 12 सप्ताह के समय अंक पर । आरओआई (लाल) गुर्दे (बाएं सर्कल) और यकृत (दाएं सर्कल) में तैयार किए गए थे, फिर संकेतों का अनुपात निर्धारित किया गया था (बी अनुपात, सही डेटा तालिका)। (ख)नियंत्रण और सीडीएचएफडी आहार चूहों से जिगर के नमूनों के प्रतिनिधि ORO-दाग हिस्टोलॉजिकल सेक्शन 6 और 12 सप्ताह के समय अंक पर । स्केल बार = 300 माइक्रोन (C)एक रोग उत्प्रेरण आहार समय पाठ्यक्रम पर मानव संसाधन सूचकांक का चित्रमय प्रतिनिधित्व। नियंत्रण चूहा डेटा नीले रंग में प्रतिनिधित्व कर रहे हैं, लाल रंग में CDAHFD चूहा डेटा। ग्राफ मतलब की मानक त्रुटि के साथ मतलब मूल्यों से पता चलता है (n = 20 3 सप्ताह के समय बिंदु पर और एन = 20 नियंत्रण के लिए और n = 19 CDAHFD के लिए 6 सप्ताह में, n = 10 पर 9-और 12 सप्ताह के समय अंक (हर समय बिंदु पर नियंत्रण बनाम CDAHFD की तुलना *, **,**,*****p < 0.001)। (घ)जिगर ORO गणना हर बार बिंदु के लिए प्लॉट (n = 10) । ग्राफ इंटरक्वार्टिकल रेंज (*, ** पी < 0.001) के साथ औसत मूल्यों को दर्शाता है। (ई)सहसंबंध ग्राफ की तुलना प्रतिशत जिगर ORO-सकारात्मक क्षेत्र बनाम मानव संसाधन सूचकांक । संक्षिप्त: मानव संसाधन = हेपेटो-गुर्दे; CDAHFD = कोलीन की कमी, उच्च वसा वाले आहार; ROIs = ब्याज के क्षेत्र; ORO = तेल लाल O. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5:कतरनी तरंग इलास्टोग्राफी परिणाम। (A)नियंत्रण और सीडीएएफडी आहार चूहों से 6 और 12 सप्ताह के समय बिंदुओं पर एसडब्ल्यूई मानचित्रों की प्रतिनिधि छवि । आरओआई (लाल) गुर्दे (बाएं सर्कल) और यकृत (दाएं सर्कल) में तैयार किए गए थे, फिर संकेतों का अनुपात निर्धारित किया गया था (बी अनुपात, सही डेटा तालिका)। (ख)नियंत्रण और सीडीएचएफडी आहार चूहों से जिगर के नमूनों के प्रतिनिधि ORO-दाग हिस्टोलॉजिकल सेक्शन 6 और 12 सप्ताह के समय अंक पर । हिस्टोलॉजिकल सेक्शन पर स्केल बार 12 सप्ताहकेआहार-प्रेरित नैश चूहा मॉडल में लिवर टिश्यू कठोरता का ग्राफिकल प्रतिनिधित्व 300 माइक्रोन है। समूहों को सामान्य चाउ (नीला) या कोलीन की कमी, उच्च वसा वाले आहार (लाल) (एन = 20 3 और 6 सप्ताह में, एन = 10 को 9-और 12 सप्ताह के समय अंक पर खिलाया गया था)। ग्राफ मतलब के मानक त्रुटि के साथ मतलब मूल्यों से पता चलता है (n = 20 3 और 6 सप्ताह में, n = 10 पर 9-और 12 सप्ताह के समय अंक (हर समय बिंदु पर नियंत्रण बनाम CDAHFD की तुलना *, **, *** पी < ०.००१) । (घ)कोलेजन-विशिष्ट पीएसआर दाग (एन = 10) का उपयोग करके पूर्व वीवो हिस्टोलॉजिक लिवर नमूनों में कोलेजन वितरण का ग्राफिकल प्रतिनिधित्व। ग्राफ अंतरवर्गीय रेंज (*, ** पी < 0.001)(ई)सहसंबंध ग्राफ की तुलना प्रतिशत सकारात्मक जिगर PSR धुंधला क्षेत्र बनाम SWE लोच के साथ औसत मूल्यों को दर्शाता है। SWE = कतरनी तरंग इलास्टोग्राफी; CDAHFD = कोलीन की कमी, उच्च वसा वाले आहार; ROIs = ब्याज के क्षेत्र; ORO = तेल लाल ओ; नैश = नॉनल्कोहलिक स्टीटोहेपेटाइटिस; पीएसआर = पिरो सीरियस रेड। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

एसडब्ल्यूई सहित अल्ट्रासाउंड आधारित इमेजिंग, एनएएफएलडी/नैश के प्रीक्लिनिकल मॉडलों में लिवर स्टेटोसिस और अकड़न के देशांतर मूल्यांकन के लिए एक अमूल्य उपकरण हो सकता है । यह पत्र नैश के सीडीएएचएफडी आहार-प्रेरित चूहा मॉडल का उपयोग करके एचआर इंडेक्स और लोच के मापन के लिए उच्च गुणवत्ता वाले बी-मोड के साथ-साथ यकृत की एसडब्ल्यूई छवियों को प्राप्त करने के तरीकों के बारे में विस्तृत तरीकों का वर्णन करता है। इसके अलावा, परिणाम एचआर इंडेक्स और लोच के उत्कृष्ट संबंध को मूल्यांकन के स्वर्ण मानक के साथ दिखाते हैं- जिगर के ऊतकों का हिस्टोलॉजिकल मूल्यांकन। हालांकि प्रक्रिया ही सीधी प्रतीत होती है, प्रोटोकॉल के कुछ महत्वपूर्ण पहलू हैं जो सफल परिणाम सुनिश्चित करेंगे ।

ट्रांसड्यूसर का प्लेसमेंट महत्वपूर्ण है, खासकर जब बी-मोड में एचआर इंडेक्स को मापने के लिए किडनी की तलाश की जाती है। जांच को पसलियों के बहुत करीब रखने से रिब छाया हो सकती है, जो अल्ट्रासाउंड क्षीणन के झूठे उपाय बनाता है। इसके अलावा, शेविंग और डेपिलेशन क्रीम दोनों का उपयोग करके सभी बालों को हटाना महत्वपूर्ण है, क्योंकि शेष बाल हवा के बुलबुले को ट्रैप कर सकते हैं, जो बी-मोड छवियों पर छाया डाल देंगे। अंत में, पेट और आंतों में भोजन की उपस्थिति के रूप में जिगर अस्पष्ट कर सकते हैं, विशेष रूप से सामान्य चाउ खिलाया जानवरों में, सभी जानवरों के पर्याप्त उपवास जिगर की सफल इमेजिंग के लिए महत्वपूर्ण है।

हालांकि एसडब्ल्यूई और एचआर इंडेक्स से लिवर लोच माप नैश के प्रीक्लिनिकल मॉडल में लिवर फाइब्रोसिस और स्टेटोसिस का आकलन करने के लिए मूल्यवान readouts हैं, तकनीक की कुछ सीमाएं हैं। सूजन, हेपेटिक भीड़, कोलेस्टेसिस और बहिर्वाह पथ बाधा जैसे कारक यकृत कठोरता को प्रभावित करते हैं और इस प्रकार, यकृत फाइब्रोसिस8,14,15, 16को मापने में इस तकनीक की समग्र विशिष्टता को प्रभावित कर सकते हैं। इसी तरह, बी-मोड अल्ट्रासाउंड छवियों में जिगर की चमक फाइब्रोसिस से प्रभावित हो सकती है और इस प्रकार, स्टीटोसिस को मापने में एचआर इंडेक्स की सटीकता को प्रभावित कर सकती है। लोच और स्टेटोसिस पर इन प्रभावित कारकों के योगदान को स्पष्ट करने और नैश के विभिन्न प्रीक्लिनिकल मॉडलों में इन readouts के लिए कट-ऑफ मूल्यों की स्थापना करने के लिए अधिक अध्ययनों की आवश्यकता है। इसके अलावा, इस अध्ययन ने प्रीक्लिनिकल प्रभावकारिता अध्ययन में लिवर स्टेटोसिस का आकलन करने के लिए एक बायोमार्कर के रूप में एचआर इंडेक्स की संवेदनशीलता का मूल्यांकन नहीं किया।

SWE का उपयोग कर जिगर कठोरता की माप नैश/NAFLD के रोगविज्ञान को समझने के साथ ही इस हालत के लिए उपंयास उपचार के विकास के लिए एक मूल्यवान उपकरण बनने की क्षमता है । शोधकर्ता को एक आक्रामक बायोप्सी की आवश्यकता के बिना यकृत स्टेटोसिस और ऊतक कठोरता दोनों को निर्धारित करने की अनुमति देकर, प्रीक्लिनिकल अध्ययनों में जानवरों को देशांतर की निगरानी की जा सकती है, और व्यक्तिगत विषयों पर दवा प्रभाव समय के साथ मात्रा निर्धारित की जा सकती है।

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Disclosures

सभी लेखक फाइजर, इंक के कर्मचारी हैं ।

Acknowledgments

लेखकों के लिए उनकी कड़ी मेहनत की देखभाल और अध्ययन जानवरों के स्वास्थ्य को सुनिश्चित करने के साथ ही तकनीकों में से कुछ के साथ सहायता के लिए फाइजर तुलनात्मक चिकित्सा संचालन टीम का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । इसके अलावा, हस्टोलॉजिकल विश्लेषणों के लिए ऊतक प्रसंस्करण के साथ उनकी मदद के लिए डेनिएल क्रोवेल, गैरी सेटिस और जेनिफर एशले ओल्सन पर धन्यवाद बकाया है। इसके अलावा, लेखक इस पांडुलिपि की तैयारी के दौरान मूल्यवान प्रतिक्रिया की समीक्षा करने और प्रदान करने के लिए जुलिता रामिरेज का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aixplorer Supersonic Imagine Shear Wave Elastography Instrument
Aixplorer SuperLinear SLH20-6 Transducer Supersonic Imagine Transducer for Shear Wave Elastography
Alpha-dri bedding rat cages
Aperio AT2 scanner Leica Biosystems Digital Pathology Brightfield Scanner
Compac 6 Anesthesia System VetEquip Anesthesia Vaporizer and Delivery System. Any anesthesia delivery system can be used, however.
Manage Imager Database Leica Biosystems Digital Pathology
Mayer's Hematoxilin Dako/Agilent H&E Staining/Histology
Nair Church & Dwight Hair remover
Oil Red O solution Poly Scientific Lipid Staining/Histology
Picrosirius Red Stain (PSR) Rowley Biochemical F-357-2 Collagen Stain/Histology
Puralube Opthalmic ointment Dechra Veterinary Product Lubrication to prevent eye dryness during anesthesia
Tissue-Tek Prisma Plus Sakura Finetek USA Automated slide stainer
VISIOPHARM software Visiopharm Digital pathology software
Research Diets A06071309i NASH inducing diet
Purina 5053 Control animal chow
Vevo imaging station Fujifilm VisualSonics The Vevo imaging station is used for holding the ultrasound transducer during imaging.
Wistar Han rats Charles River Laboratories

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References

  1. Younossi, Z. M., et al. Global epidemiology of nonalcoholic fatty liver disease-Meta-analytic assessment of prevalence, incidence, and outcomes. Hepatology. 64 (1), 73-84 (2016).
  2. Boland, M. L., et al. Towards a standard diet-induced and biopsy-confirmed mouse model of non-alcoholic steatohepatitis: Impact of dietary fat source. World Journal of Gastroenterology. 25 (33), 4904-4920 (2019).
  3. Oldham, S., Rivera, C., Boland, M. L., Trevaskis, J. L. Incorporation of a survivable liver biopsy procedure in mice to assess non-alcoholic steatohepatitis (NASH) resolution. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (146), e59130 (2019).
  4. Bercoff, J., Tanter, M., Fink, M. Supersonic shear imaging: a new technique for soft tissue elasticity mapping. IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 51 (4), 396-409 (2004).
  5. Bavu, E., et al. Noninvasive in vivo liver fibrosis evaluation using supersonic shear imaging: a clinical study on 113 hepatitis C virus patients. Ultrasound in Medicine & Biology. 37 (9), 1361-1373 (2011).
  6. Ferraioli, G., et al. Accuracy of real-time shear wave elastography for assessing liver fibrosis in chronic hepatitis C: a pilot study. Hepatology. 56 (6), 2125-2133 (2012).
  7. Ross, T. T., et al. Acetyl-CoA carboxylase inhibition improves multiple dimensions of NASH pathogenesis in model systems. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 10 (4), 829-851 (2020).
  8. Gu, L. H., Gu, G. X., Wan, P., Li, F. H., Xia, Q. The utility of two-dimensional shear wave elastography and texture analysis for monitoring liver fibrosis in rat model. Hepatobiliary & Pancreatic Diseases International. 20 (1), 46-52 (2020).
  9. Marshall, R. H., Eissa, M., Bluth, E. I., Gulotta, P. M., Davis, N. K. Hepatorenal index as an accurate, simple, and effective tool in screening for steatosis. American Journal of Roentgenology. 199 (5), 997-1002 (2012).
  10. Webb, M., et al. Diagnostic value of a computerized hepatorenal index for sonographic quantification of liver steatosis. American Journal of Roentgenology. 192 (4), 909-914 (2009).
  11. Tous, M., Ferre, N., Camps, J., Riu, F., Joven, J. Feeding apolipoprotein E-knockout mice with cholesterol and fat enriched diets may be a model of non-alcoholic steatohepatitis. Molecular and Cellular Biochemistry. 268 (1-2), 53-58 (2005).
  12. Kirsch, R., et al. Rodent nutritional model of non-alcoholic steatohepatitis: species, strain and sex difference studies. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 18 (11), 1272-1282 (2003).
  13. Journal of Ultrasound in Medicine. 2018 Scientific Program. Journal of Ultrasound in Medicine. 37 (1), 1 (2018).
  14. Engelmann, G., Quader, J., Teufel, U., Schenk, J. P. Limitations and opportunities of non-invasive liver stiffness measurement in children. World Journal of Hepatology. 9 (8), 409-417 (2017).
  15. Piscaglia, F., Salvatore, V., Mulazzani, L., Cantisani, V., Schiavone, C. Ultrasound shear wave elastography for liver disease. a critical appraisal of the many actors on the stage. Ultraschall in der Medizin. 37 (1), 1-5 (2016).
  16. Singh, S., Loomba, R. Role of two-dimensional shear wave elastography in the assessment of chronic liver diseases. Hepatology. 67 (1), 13-15 (2018).

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NAFLD/नैश के चूहे मॉडल में अल्ट्रासाउंड और कतरनी वेव इलास्टोग्राफी इमेजिंग का आवेदन
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Morin, J., Swanson, T. A., Rinaldi, A., Boucher, M., Ross, T., Hirenallur-Shanthappa, D. Application of Ultrasound and Shear Wave Elastography Imaging in a Rat Model of NAFLD/NASH. J. Vis. Exp. (170), e62403, doi:10.3791/62403 (2021).

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