Summary
Bu protokol, alkolsüz yağlı karaciğer hastalığının kemirgen modellerinde karaciğer dokusu değişikliklerini invaziv olmayan bir şekilde gözlemlemek ve ölçmek için geliştirilmiş bir ultrason tekniğinin kullanımını açıklar.
Abstract
Alkolsüz Steatohepatit (NASH), karaciğer yağ birikimi (steatoz) ve fibrozise yol açan iltihaplanma ile karakterize Alkolsüz Yağlı Karaciğer Hastalığı (NAFLD) spektrumu içinde bir durumdur. İnsan NASH/NAFLD'ı yakından nükseden preklinik modeller ilaç geliştirmede esastır. Karaciğer biyopsisi şu anda klinikte NAFLD/NASH ilerlemesini ve tanısını ölçmek için altın standart olmakla birlikte, klinik öncesi alanda, bir çalışma sırasında tüm karaciğer örneklerinin birden fazla zaman noktasında toplanması veya hastalığın evresini değerlendirmek için histolojik analiz için karaciğer biyopsisi gereklidir.
Karaciğer biyopsisi çalışması yapmak invaziv ve emek yoğun bir prosedürdür ve hastalık seviyesini değerlendirmek için karaciğer örnekleri toplamak, bir çalışma için gereken araştırma hayvanlarının sayısını arttırır. Bu nedenle, bu preklinik modellerde NASH/NAFLD'yi tespit etmek için güvenilir, çevrilebilir, invaziv olmayan bir görüntüleme biyobelirteciye ihtiyaç vardır. İnvaziv olmayan ultrason tabanlı B-mode görüntüler ve Kesme Dalgası Elastografisi (SWE), karaciğer fibrozisi kadar steatozu ölçmek için de kullanılabilir. NASH'in preklinik kemirgen modellerinde SWE'nin yararını değerlendirmek için, hayvanlar NASH yanlısı bir diyete yerleştirildi ve hepatik (HR) indeksi ve karaciğer elastikiyetini ölçmek için non-invaziv ultrason B modu ve kesme dalgası elastografi görüntülemesi yapıldı, sırasıyla hem karaciğer yağ birikiminin hem de doku sertliğinin ilerlemesini ölçtü, belirli bir NAFLD / NASH çalışması boyunca birden fazla zaman noktasında.
İk indeksi ve elastikiyet sayıları steatoz ve fibrozisin histolojik belirteçleri ile karşılaştırıldı. Sonuçlar, İk indeksi ile Yağ Kırmızısı O (ORO) lekelenme yüzdesi arasında ve ayrıca elastikiyet ile karaciğerlerin Picro-Sirius Red (PSR) lekelenmesi arasında güçlü bir korelasyon olduğunu gösterdi. Klasik ex vivo yöntemleri ile in vivo görüntüleme sonuçları arasındaki güçlü korelasyon, nafld/NASH'in preklinik bir modelinde hastalık fenotipini ve ilerlemesini değerlendirmek için kesme dalgası elastografisi/ultrason tabanlı görüntülemenin kullanılabileceğinin kanıtını sağlar.
Introduction
Alkolsüz yağlı karaciğer hastalığı (NAFLD), karaciğerde aşırı yağ birikmesi ile karakterize metabolik bir durumdur ve yakın zamanda bildirilen küresel yaygınlığı ile dünya çapında önde gelen bir karaciğer rahatsızlığı haline gelmektedir% 251. Alkolsüz steatohepatit (NASH), ilerleyici hücresel hasar, inflamasyon ve fibrozis ile aşırı karaciğer yağlanması ile karakterize NAFLD spektrumunun daha ilerlemiş bir aşamasıdır. Bu rahatsızlıklar genellikle sessizdir, kan testleri veya rutin muayenelerle tespit edilemez, ta ki bir hastanın karaciğerine önemli hasarlar gelene kadar. Şu anda hastalarda NASH tanısı koymak için altın standart, hasta kaynaklı karaciğer biyopsi örneklerinin histolojik muayenesinden geçmektedir. Benzer şekilde, NASH / NAFLD patogenezini ve ilaç geliştirme endüstrisini anlamak için çalışan preklinik araştırmacılar, steatoz, inflamasyon ve fibrozisi ölçmek için karaciğer örneklerinin in vivo kama biyopsisine veya histoloji için uydu kohortlarının terminal ötanazisine güvenirler.
Örneğin, karaciğer kama biyopsisi GUBRA NASH model2kullanırken steatohepatit ve fibrozisi değerlendirmek için standart bir teknik olmuştur. Karaciğer kama biyopsisi yöntemi küçük hayvanlarda invaziv ve zahmetlidir3. Bir çalışmanın ortasında kama karaciğer biyopsisi kullanımı, genellikle ihtiyaç duyulan hayvan sayısını artıran bir hastalık modelinde eklenen deneysel bir değişkeni temsil eder. Bu faktörler göz önünde bulundurularak, nash/NAFLD hayvan modellerinde steatoz ve fibrozisi erken zaman noktalarında güvenilir bir şekilde değerlendirmek için kullanılabilecek non-invaziv görüntüleme teknikleri değerlidir. Kesme dalgası elastografisi (SWE), yumuşak dokuların elastikiyetini ölçmek için kullanılan ultrason tabanlı bir yöntemdir. Teknik, bir doku hedefine yönelik süpersonik ultrason darbeleri tarafından oluşturulan kesme dalgalarının yayılmasını ölçer ve daha sonra E modulus4adı verilen bir değeri hesaplar. Kesme dalgasının hızı doku sertliği derecesi ile orantılıdır.
Şekil 1 ve Şekil 2 görüntüleme alanı kurulumunu ve SWE cihazını göstermektedir. SWE cihazı, Şekil 2A'dagösterilen iki ekranlı ve bir kontrol paneline sahip tek tekerlekli bir ünitedir. Üst monitör (Şekil 2B) bilgisayar monitörü görevi görür ve görüntüleri ve hasta dizinlerini görüntüler. Kontrol paneli (Şekil 2C), görüntü yakalamanın genel yönlerini kontrol eden bir dizi düğme ve kadrandır: ekranı dondurma, görüntüleri kaydetme, bir moddan diğerine değiştirme. Alt ekran (Şekil 2D), ayarları değiştirmek için ek kontrollere sahip bir dokunmatik ekrandır ve gerektiğinde veri girmek için bir klavye görevi görür. Cihaz, istenirse dokunmatik ekranda kullanmak için bir ekran kalemi ile donatılmıştır. Ultrason probları cihazın alt ön paneline bağlanır. Kemirgenlerde B modu ve SWE görüntüleme için süper doğrusal 6 ila 20 MHz dönüştürücü kullanıldı. Doku sertliğini noninvaziv olarak ölçme yeteneği, SWE'yi NASH hastalarında karaciğer fibrozisi5'in tanımlanması ve evrelenmesi için değerli bir araç haline getirerek daha invaziv yöntemlere olan ihtiyacı azaltır. SWE, aslında hastalarda karaciğer fibrozisini ölçmek için kullanılmıştır ve klinikte fibrozis puanlamak için FDA onaylı bir yöntemdir6. Hastalığın hayvan modellerinde NASH ilerlemesini izlemek için SWE kullanmak, tedavilerin geliştirilmesi için çevirisel bir araç sağlayacak ve aynı zamanda hayvan konu sayılarının azaltılması ve ağrı ve sıkıntıyı en aza indirmek için in vivo prosedürlerin iyileştirilmesi yoluyla hayvan refahını artıracaktır.
İnsan hastalarda SWE görüntüleme, küçük hayvanlar için ideal olmayan düşük frekanslı ultrason dönüştürücü4kullanır. Özellikle, yüksek frekanslı SWE teknikleri, bir sıçan modelinde NASH patogenezinde asetil-CoA karboksilaz inhibisyonunun etkinliğini değerlendirmek için kullanılmıştır7ve bu tekniğin faydası, geleneksel METAVIR histolojik puanlama yöntemlerine kıyasla başarılı sonuçlarla karaciğer fibrozisinin karbon tetraklorür sıçan modellerinde tanımlanmıştır8. Bununla birlikte, mevcut literatürDE NASH'in preklinik modellerinde SWE görüntülemenin uygulanmasına ilişkin ayrıntılı teknik ve metodoloji bilgileri yoktur. Yukarıda açıklandığı gibi karaciğer steatozu NAFLD/NASH durumunun temel özelliklerinden biridir ve müdahalenin düşünülebileceği önemli bir aşamadır. Bu nedenle, karaciğer yağ birikiminin görüntüleme yöntemi kullanılarak değerlendirilmesi, NASH/NAFLD'nin preklinik modellerinde karaciğer fibrozisinin değerlendirilmesi kadar önemlidir.
İk indeksi olarak bilinen bir ultrason tekniği, karaciğerin doku parlaklığının renal korteks ile karşılaştırıldığında bir oranı, klinikte steatozun taşıyıcı belirteci olarak kullanılmıştır9,10. Ancak bu yaklaşım, NAFLD/NASH'in preklinik hayvan modellerinde yaygın olarak kullanılmamıştır. Bu makalede, NAFLD/NASH'in kolin eksikliği olan, yüksek yağlı diyet (CDAHFD) sıçan modelinde sırasıyla hepatik fibrozis ve steatozun taşıyıcı belirteci olarak hr indeksinin yanı sıra elastikiyeti ölçme yöntemi açıklanmaktadır. Bu model, farelerde 6 hafta içinde ölçülebilen hızlı steatoz, karaciğer iltihabı ve fibrozise neden olur11. Bu diyete kolesterolün (%1) eklenmesinin sıçanlarda fibrogenezini teşvik ettiği gösterilmiştir12Bu modeli kesme dalgası görüntülemeyi içeren doğrulama çalışmaları için uygun bir aday haline getirir. Genel olarak, bu görüntüleme teknolojisi steatoz ve / veya fibrozisin bir son nokta olduğu çok çeşitli NASH modellerine / diyetlerine de uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvanlarla ilgili tüm prosedürler Pfizer'in Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından gözden geçirilip onaylandı ve AAALAC (Laboratuvar Hayvan Bakımının Değerlendirilmesi ve Akreditasyonu) Uluslararası akredite bir tesiste gerçekleştirildi.
1. Hastalık indüksiyonu
- Bilinen sıçan macera patojenlerinden arınmıştır erkek Wister Han sıçanları (150-175 g; ~ 6-7 haftalık; toplam 40 sıçan) kullanın. Sıçanları kağıt yataklarla ayrı ayrı havalandırılan kafeslerde çiftler halinde barındırın (Malzeme Masasınabakın) ve 1 °C'± 22'de, 12:12 saat açık-karanlık bir döngü ile% 40-70 bağıl nemde muhafaza edin.
- 150-175 g (~6-7 haftalık) ağırlığındaki sıçanları, çalışma tasarımına bağlı olarak% 1 kolesterol (n = 20) veya standart bir laboratuvar kemirgen chow (n = 20) ile kolin eksikliği olan, yüksek yağlı bir diyete yerleştirin.
NOT: Bu çalışmada grup başına 20 hayvan ile toplam 40 sıçan kayıt edilmiştir. 6. haftanın sonunda, her gruptan kohortun yarısı karaciğer örneklerinin orta çalışma histolojik analizi için nekropsi edildi. Böylece, örneklem büyüklüğü 9 ve12.
2. Enstrüman kurulumu
- Görüntüleme alanını aşağıdaki gibi ayarlayın: görüntüleme sırasında hayvanı sıcak tutmak için ısıtılmış bir yüzey (Şekil 1'dec) ve işlem boyunca bir anestezi düzlemini korumak için inhalan anestezi sağlamak için güvenli bir anestezi burun konisi ekleyin (b Şekil 1'de).
- Ultrason probun istenen yere taşınmasını kolaylaştırmak ve probun hayvan üzerinde dinlenmesini önlemek için bir ultrason prob tutucusu kullanın.
- Ultrason görüntüsünün elde edildiği ciltte ısıtılmış ultrason jeli kullanın.
- Dokunmatik ekranda ayarlanabilen prosedür boyunca aşağıdaki ayarları koruyun: Akustik Güç 0.0 dB; Doku Tuner 1540 m/s; Dinamik Aralık 60 dB; Esneklik aralığı (SWE modu için) < 30 kPa.
- Ultrason probını özel tutucudaki raylı sisteme takın (Şekil 1'de).
- Cihazı aç ve önyüklenebilmesine izin ver. Monitör açıldıktan sonra, bağlı dönüştürücü ayrıntılarına sahip B Modu görüntüsünü not alın.
3. Konu hazırlığı
- Bağırsak içeriğinin görüntü alımını engellemesini önlemek için görüntüleme işleminden önce hayvanların en az 4 saat oruçlu olduğundan emin olun.
- En az 4 saat oruç tuttuktan sonra, uygun bir anestezi seviyesine ulaşılana kadar bir sıçanı izofluran anestezik indüksiyon odasına yerleştirin, ayak parmağı sıkışmasına yanıt yok. Anesteziyi teşvik etmek için hayvanları 3-5 dakika boyunca% 3-5 izofluran'a maruz bırakın.
- Bakım anestezisi için, görüntü alımı sırasında hayvanları% 2-3 izofluran altında tutun. Anestezi sırasında gözün kurumasını korumak için oftalmik merhem uygulayın.
- Anestezi elde edildikten sonra, bir hayvanı indüksiyon odasından çıkarın ve sıcak sıcak su sirkülasyon battaniyesine yerleştirin. Burnun üzerine anestezik bir burun konisi yerleştirin ve hayvanı göğüs kafesinden pelvise kadar sağ tarafında tıraş edin. Bu bölgedeki kalan tüm saçları çıkarmak için kimyasal epilasyon kremi kullanın.
- Saçlar çıkarıldıktan sonra, bir hayvanı başın üstüne bantlanmış üst pençeleri olan sol yanal reumbency'ye sıcak bir görüntüleme platformuna yerleştirin(Şekil 3A).
- Cihaz kontrol panelinde Hasta tuşuna basın ve konuyu çalışma tasarımına göre tanımlayın.
- Dokunmatik ekrandaki simgeye dokunarak enstrümandaki Klavye işlevini açın. Adları istediğiniz gibi yazın.
- Hasta adı ekranından çıkmak için Çıkış'a dokunun. Monitörde B modunun yeniden açıldığını gözlemleyin.
4. Hepato-renal (İk) indeks ölçümü için görüntü alımı
- Hayvan üzerindeki aldatılmış cilt bölgesine az miktarda ısıtılmış ultrason jeli uygulayın.
- Konunun jel kaplı bölgesine dokunmak için ultrason probunu hareket ettinin (Şekil 3B). Monitörde öznenin iç organlarının canlı B modu görüntüsü göründüğünde, ultrason probunu bel omurlarına (sagittal düzlem) paralel olarak kalçanın biraz üstündeki bölgeye taşıyın.
- Monitördeki B modu ekranını kullanarak, büyük böbrek arterini ve korteks / medulla ayrımını tanımlayarak sağ böbreği bulun (Şekil 4A). Ek olarak, karaciğerin bir kısmını görüntünün tek bir düzleminde gözlemleyin.
- Gölgeler ve hava kabarcıkları gibi çok az veya hiç görüntü yapıtı olmadığından emin olun.
- İk indeksini elde etmek için bir B Modu oranı ölçün.
- Hem renal korteksin hem de karaciğer parenkiminin aynı odak düzleminde olduğundan emin olun. Gerekirse, net bir görüntü elde etmek için odağı ayarlayın ve kontrolü elde edin.
- Kontrol panelinde Odak düğmesini çevirerek odağı ayarlayın. Otomatik TGC düğmesine bir kez basarak kazancı ayarlayın.
- Kontrol panelinde Dondur tuşuna basın. Bulanık görüntüleri önlemek için ekranı dondurırken hayvanın nefesler arasında olduğundan emin olun.
- Ekran dondurulduktan sonra dokunmatik ekranda Ölçüm Araçları'na dokunun. Seçili ilgi çekici bir bölgeden bir dokunun göreli parlaklığını ölçen yerleşik bir araç olan B modu Oranı'nı seçin. İlgi çekici bir bölge (yatırım getirisi) seçmek için 2 mm'lik bir daire oluşturun. Kontrol panelinde bir parmağınızı izleme topunun dış kenarı boyunca hareket ettirerek daire boyutunu ayarlayın.
- 2 mm'lik daireyi, böbreğin sağında bulunması gereken karaciğer görüntü yatırım getirisine yerleştirin. Karaciğer dokusunu homojen ekojenikliğine ve pürüzsüz konturuna göre tanımlayın.
- Daire yerleştirildikten sonra, kontrol panelinde Seç düğmesine basın ve görünen yeni daireyi gözlemleyin.
- Yeni dairenin boyutunu 2 mm'ye ayarlayın ve böbrek korteksinin görüntüsüne yerleştirin. Karaciğer ve böbrek korteks üzerindeki dairelerin derinliğini aynı tuttuğunuzdan emin olun. Yerine yerleştirildikten sonra, kontrol panelinde Seç düğmesine basın. Yerleşik sistem aracının İk indeksini B modu oranı olarak görüntülediğine dikkat edin.
- Görüntüyü kaydetmek için Görüntüyü Kaydet'e basın ve monitörün sağ tarafında küçük resim olarak görünen kaydedilmiş görüntüleri gözlemleyin.
- Görüntüyü çözme ve canlı B modu görüntüsüne dönme için kontrol panelinde Dondur düğmesine basın.
- Hem renal korteksin hem de karaciğer parenkiminin aynı odak düzleminde olduğundan emin olun. Gerekirse, net bir görüntü elde etmek için odağı ayarlayın ve kontrolü elde edin.
- B Modu oranı ölçümünü farklı derinliklerde ve doku düzlemlerinde 3 kez tekrarlayın. Her hayvan ve zaman noktası için bu üç B modu oranının ortalamasını hesaplayın.
5. Shear Wave Elastografi için görüntü alımı
- B Modu'nu kullanarak karaciğeri bulmak için probu sağ altkostal alanda enine şekilde hareket ettirin. Karaciğerin çoğunlukla parankim olan ve portal damar ve hepatik arter gibi büyük kan damarlarından arındırılmış bir bölgesini bulun. Karaciğerin net bir alanı bulunduktan sonra, kontrol panelinde SWE düğmesine basarak dokunun bir kesme elastikiyet haritasını oluşturun.
- Gölgelerden arındırılmış bir alanda karaciğer kapsülünün altındaki SWE kutusunun boyutunu ve konumunu ayarlayın. Kapsülü karaciğerin tepesine yakın parlak bir ekojenik çizgi olarak tanımlayın.
- SWE kutusunun 5-10 s içinde bir renk haritasına geçiş yaptığını gözlemleyin. Kutu dolduktan ve sabitlendiğinde, hayvan nefesler arasındayken kontrol panelinde Dondur düğmesine basın.
NOT: Karaciğerin elastikiyetini doğru bir şekilde değerlendirmek için minimum kutu kapsama alanı% 60-80 olmalıdır. - Dokunmatik ekranda, kesme dalgası elastikiyet haritasındaki bir yatırım getirisinden esnekliği hesaplayan yerleşik bir sistem aracı olan QBox'adokunun. Monitörde görünen daireyi ve veri kutusunu gözlemleyin. Dokunmatik ekrandaki konum simgesine istediğiniz kuruluma dokunarak QBox'ın konumunu ayarlayın.
- Kontrol panelinde bir parmağınızı trackball'un dış kenarı boyunca hareket ettirerek dairenin boyutunu 3 mm'ye ayarlayın. İzleme topunu kullanarak, daireyi tekdüze renklendirme ile gölgeden arındırılmış bir alana yerleştirin (Şekil 5A, B). Kan damarları veya karaciğer kapsülü gibi bilinen sertlik bölgelerinden ve bu yapılardan kanamadan kaçınmaya özen edin.
- Yeterli bir alan bulunduğunda, görüntüyü kaydetmek için kontrol panelinde Görüntüyü Kaydet'e basın. Bu işlemi karaciğerin farklı bölgelerinde 3 kez tekrarlayın. Karaciğerin farklı bölgelerinden SWE haritalı görüntüler toplamak için probu karın üzerinde yukarı ve aşağı veya yana doğru hareket ettirin.
- Tüm görüntüler toplandıktan sonra, kontrol panelinde Sınavı Sonlandır'a basın ve monitörde görünen hasta bilgi ekranını not edin.
- Bandı hayvanın pençelerinden çıkarın, fazla jeli silin ve hayvanı görüntüleme aşamasından çıkarın. Tamamen iyileşene kadar sıcak ve kuru bir kafeste anesteziden kurtulmasına izin verin. Sternal rekumbensi koruma yeteneği ile belirtilen anesteziden tam iyileşme sağlamak için her hayvanı izleyin
- Görüntülenecek kohorttaki her hayvan için 4-5 bölümlerindeki adımları tekrarlayın.
6. Görüntü veri alma ve analizi
- Tüm hayvanlar için görüntüler toplandığında anesteziyi kapatın.
- Görüntü verilerini makineden çekmek için kontrol panelinde gözden geçir düğmesine basın ve monitörde görünen bu cihaz üzerinde gerçekleştirilen tüm taramaları gözlemleyin. Ekranın üst köşesindeki arama penceresini kullanarak istediğiniz taramaları arayın.
- İzleme topu ve Seç düğmesi aracılığıyla hastanın adının yanındaki kutuyu işaretleyerek veri analizi için gerekli tüm taramaları seçin. Gerekli tüm taramalar vurgulandıktan sonra dokunmatik ekranda JPEG'leri dışa aktar'ı seçin. Verileri bir ağ sürücüsüne veya taşınabilir bir Evrensel Seri Veri Yolu (USB) sürücüsüne verin. Cihazın arkadaki USB bağlantı noktalarını bulun.
- Dosyalar dışa verildikten sonra, bir iş istasyonu bilgisayarındaki her taramanın tek tek jpg dosyalarını açın. Görüntünün sağ tarafındaki tüm verileri gözlemleyin: B Modu Oranı-B Oranı numarasını toplayın; Q Ortalama esneklik (kPa) değerini kutulayın.
- Tüm verileri bir elektronik tabloya veya başka bir veritabanı yönetim yazılımına girin ve istediğiniz istatistiksel analizleri yapın.
7. Karaciğer örneklerinin histolojik analizi
- 6. haftanın sonunda, karaciğer örneklerinin orta çalışma histolojik analizi için her gruptan kohortların yarısına nekropsi yapın. Benzer şekilde, hayvanların kohortunun geri kalanını ötenazi yapın ve12.
- ORO boyama için, karaciğer bölümlerini% 10 nötr tamponlu formalin içinde sabitlayın ve en azından bir gecede soğutulmuş% 30 sakkaroz çözeltisi kullanarak sakkaroz ile kriyoprezer. Bölümleri en uygun kesme sıcaklığı bileşiğine kriyo-gömün ve ORO boyamaya hazırlanmak için kriyo-bölümlenmiş slaytlara ekleyin.
- Kriyo bölümlerini 2 dakika boyunca% 100 propilen glikol içine yerleştirin ve ardından% 0.5 ORO çözeltisinde bir gecelik inkübasyon yapın. ORO çözeltisinden çıkarıldıktan sonra, bölümleri 1 dakika boyunca% 85 propilen glikolde ayırt edin, deiyonize suda durulayın ve Mayer'in Hematoxylin-Lillie modifikasyonu ile 1 dakika boyunca karşıt çizgi yapın.
- Kapakları sulu bir montaj ortamı kullanarak slaytlara yerleştirin ve oda sıcaklığında kurutun.
- PSR için, deparaffinize formalin-fixed, parafin gömülü karaciğer bölümü slaytlar, bouin sıvı bir gecede yerleştirin ve sonra bazı optimize adımları ile üretici protokolüne göre otomatik bir slayt lekeleyici kullanarak lekeleyin (5 dakika için% 1 fosfogipidik asit; 90 dakika doymuş picrik asit% 0.1 Sirius Kırmızı; 2 x 30 s yıkama 0.5% asetik asit). Slaytları otomatik olarak susuz bırak ve ardından kalıcı bir montaj ortamıyla monte edin.
- 20x büyütmede dijital mikroskopi tarayıcısını kullanarak ORO ve PSR lekeli slaytların görüntülerini yakalayın, .svs biçiminde kaydedin ve slayt yöneticisi görüntü veritabanında depolayın.
- Dijital patoloji yazılımında oluşturulan özel algoritmaları kullanarak görüntüleri analiz edin. Karaciğer bölümleri alanının yanı sıra ORO ve PSR lekeli alanları tanımlamak ve ölçmek için eşik parametrelerine sahip dijital patoloji yazılım uygulamalarını düzgün bir şekilde uygulayın. Alan yüzdesi hesaplamaları için ölçümleri bir elektronik tabloya dışa aktar.
8. İstatistiksel analiz
- Farklı zaman noktalarındaki gruplar arasındaki farkı değerlendirmek için Sidak'ın çoklu karşılaştırma testini kullanarak görüntüleme verilerinin istatistiksel analizini iki yönlü ANOVA ile gerçekleştirin. P ≤ 0.001 olasılık değerleri için gruplar arasında önemli farklar varsayalım. Ayrıca görüntüleme okumalarının histolojik analizlerle korelasyonunu gerçekleştirin.
- Bu çalışmanın histolojik analiz sonuçlarını analiz etmek için parametrik olmayan istatistikler kullanın. Grup değerlerini ortanca ± yarı interquartile aralığı (sIQR) olarak bildirin. P ≤ 0.001 olasılık değerleri için gruplar arasında önemli farklar varsayalım. Farklı gruplar arasındaki PSR ve ORO histokimyasal leke miktarını karşılaştırmak için bir Mann-Whitney testi kullanın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
CDAHFD ile beslenen hayvanların ayırt edici özelliklerinden biri steatozdur. Karaciğerde yağ birikmesi, karaciğerin parlaklığını ölçerek ve aynı düzlemde çekilen B modunda bir görüntüden böbrek korteksinin parlaklığına normalleştirerek ölçülebilen dokunun ekojenik özelliklerini değiştirir. Nicel değer, dolaylı bir steatoz ölçüsü olan İk indeksi olarak ifade edilir. Şekil 4A'da, bir kontrol hayvanından gelen temsili bir karaciğer görüntüsü, böbrek korteksine kıyasla yaklaşık eşit veya daha az parlaklık (ekojeniklik) gösterir. Böylece normal hayvanların İk indeksi <1'dir. Bu çalışmada, 3 haftalık zaman noktasında kontrol hayvanlarının ortalama İk endeksi 0,645 ± 0,03'tür. Buna karşılık, CDAHFD ile beslenen bir hayvanın temsili B modu görüntüsü (Şekil 4A) böbrek korteksine kıyasla karaciğerin parlaklığının arttığını göstermektedir. Sonuç olarak, CDAHFD diyet hayvanlarından gelen temsili görüntülerin İk endeksleri sırasıyla 6 ve 12 haftalık zaman noktalarında 1.91 ve 1.79 olarak gerçekleşti.
Şekil 4C, kontrol ve CDAHFD hayvanlarından zaman içinde İk endekslerinin bir grafiğini göstermektedir. Kontrol-diyetle beslenen hayvanlar hr indeks değerlerinde taban çizgisine göre çok az hareket gösterirken, CDAHFD hayvanları bir platoya ulaşmadan önce çalışmanın ilk 3-6 haftası boyunca hızlı bir şekilde yükselir. CDAHFD diyetinde olan hayvanların ortalama İk indeksi 1.861 ± 0.06 iken, kontrol hayvanlarında 0.328 ± 0.03'tür. Beklendiği gibi, karaciğer CDAHFD grubunda ORO lekeleme için 6- (34.81 ± 4.66 vs. kontrol diyet grubuna kıyasla önemli ölçüde daha yüksek pozitif yüzde alanı gösterdi. 0,49 ± 0,11) ve 12- (30,08 ± 2,64 ile 1,17 ± 0,44) hafta içi zaman puanı (Şekil 4B,D). Oro boyama yüzde alanı ile İk indeksi arasında 6 ve 12 haftalık zaman noktalarında(Şekil 4E)mükemmel korelasyon (Pearson r = 0.78) da vardı. Bu sonuçlar, İk indeksinin NAFLD/NASH'in preklinik modellerinde steatozu ölçmek için değerli bir görüntüleme okuması olabileceğini göstermektedir.
Karaciğer sertliğini SWE ile ölçmenin temel unsurlarından biri yatırım getirisinin uygun şekilde yerleştirilmesidir (Şekil 5). Sol panel (Şekil 5A) bir kontrol diyet hayvanından karaciğerin B modu ve SWE haritalaması ile temsili bir görüntü gösterir. Uygun yatırım getirisi yerleşimi, renk haritasında kararlı olan ve karaciğer kapsülü ve kan damarları gibi bitişik yapılardan etkilenmeyen bir sinyalle karaciğerin ölçülen bölümünü temsil eden bir alan üzerinde olmalıdır. Doku sertliği, kesme dalgası hızına ve belirlenen bir sabite dayalı bir hesaplama olan ve kilopaskal (kPa) ile ifade edilen E modülü olarak bildirilmektedir. Kontrol hayvanları için, E modülü 3,5 kPa ile 6 kPa arasında düşer. Kontrol hayvanları için Şekil 5A'da bildirilen ROI'lerin ortalama kPa'sı, beklenen normal aralıkta kalan 6 ve 12 haftalık zaman noktalarında sırasıyla 4.6 ve 5.5 kPa'ydı. Şekil 5A, 6 ve 12 haftalık bir CDAHFD hayvanından SWE modunun temsili bir görüntüsünü göstermektedir. Burada, yatırım getirisi, görüntünün üstündeki renkli referansa dayanarak Q Kutusunun merkezine (kesme dalgası haritası) tekrar yerleştirilmiştir.
Bu modelde beklendiği gibi, E modülü CDAHFD ile beslenen hayvanda çok daha yüksektir. Bu temsili görüntülerde, ortalama kPa 6 haftada 10.5 ve 12 haftada 23.1 kPa idi ve bu da önemli doku sertliğini gösteriyordu. CDAHFD ve kontrol chow kullanan tipik bir NASH diyet çalışması, CDAHFD ile beslenen hayvanlarda fibrozis nedeniyle karaciğer sertliğinin istikrarlı bir şekilde ilerlediğini ortaya koymaktadır, kontrol hayvanları ise aynı kalmaktadır. Şekil 5C, CDAHFD hayvanlarında karaciğerin elastikiyetinde, 12 haftalık bir süre boyunca kontrol hayvanlarında kararlı elastikiyete kıyasla kademeli bir artış olduğunu göstermektedir. Kontrol diyeti esnekliği 3 haftalık zaman noktasında 5.80 ± 0.99 kPa'dan başlar ve 12 haftalık çalışma boyunca çok fazla değişiklik göstermez (6.14 ± 0.59). Bununla birlikte, kolin eksikliği olan diyet, 6. haftaya kadar 12.07 ± 2.37 kPa'ya ulaşarak oldukça erken önemli bir artış göstermektedir. Çalışma ilerledikçe CDAHFD diyetinde artan elastikiyet eğilimi devam eder ve özel diyet sonrası 12 haftada 24.43 ± 9.29 kPa'ya ulaşır.
Karaciğer örnekleri FIBROZ korelasyon olarak kollajeni lokalize etmek için PSR ile boyandı. Bu modelde beklendiği gibi, CDAHFD hayvanlarında hem 6 hem de 12 haftalık zaman noktalarında kontrol diyetine kıyasla önemli ölçüde daha yüksek bir karaciğer PSR pozitif lekelenme yüzdesi vardır (Şekil 5D). Kesme dalgasının ek vivo boyamaya yardımcı bir yöntem olarak oluşturulması için, şekil 5E'deki CDAHFD sıçanlarında PSR lekeli bölgeye karşı kesme dalgası E Modulus sayıları çizilerek korelasyonun belirlenmesi sağlanmıştır. Arsanın analizi, pearson 'r' değeri 0.88 olan sıkı bir küme ortaya çıkardı ve bu da güçlü korelasyona işaret ediyor. Burada bildirilen sonuçların NASH'i teşvik etmek için kolin eksikliği olan, yüksek yağlı bir diyet kullanan bir çalışmada beklenebilecekleri temsil ettiği belirtilmelidir. Bu yöntem diğer preklinik NASH modellerinde de kullanılabilir; ancak hastalık indüksiyon protokolüne bağlı olarak farklı sonuçlar ve kesme değerleri üretecektir. Sıçan NASH modeli gibi, CDAHFD kaynaklı NASH fare modelinde SWE görüntüleme karaciğer elastikiyet değerleri ile karaciğerde PSR pozitif lekeli bölge yüzdesi arasında mükemmel korelasyon gösterdi13. Bu nedenle, SWE NAFLD / NASH'in preklinik modellerinde karaciğer fibrozisini değerlendirmek için değerli bir araç olabilir.
Şekil 1: Görüntüleme kurulumu. Ultrason dönüştürücü (a) alçalan kol tarafından tutulur. Görüntüleme aşaması (b) anestezi hortumu kelepçelenecek ve görüntüleme sırasında sürekli anestezi için bir burun konisi (c) kuracak bir alana sahiptir. Aşama ayrıca ısıtılır ve vücut sıcaklığını izlemek için problarla donatılmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Kesme Dalgası Elastografi aleti. (A) Kesme dalgası elastografi cihazı, 4 adede kadar ultrason probu için bağlantı portlarına sahip tek tekerlekli bir ünitedir. (B) Üst monitör, görüntülerin gerçek zamanlı görüntülenmesinin yanı sıra hasta verilerini ve sistem envanterini görüntülemek için görsel çıktı görevi görür. (C) Merkezi kontrol paneli, ekranı ayarlamak ve görüntü almak için gereken düğmelerin ve düğmelerin çoğunu içerir. (D) Alt monitör, görüntü alma ve ayarlama için ek kontrollere ve komutlara sahip bir dokunmatik ekrandır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Hayvan konumlandırma ve uygun dönüştürücü yerleşimi. (A) Bir hayvan sahneye düzgün bir şekilde yerleştirildikten ve bantlı sol yanal rekumbens(B)ile kısıtlandıktan sonra ultrason probu, karın / yana yerleştirilen jellere dokunarak sıçanın üzerine indirilür. Prob Bpanelinde bulunan jele dokunduğunda, böbrek ve karaciğer monitörde yan yana görülebilir. Bu, hepato-renal indeksini ve bazı durumlarda kesme dalga sayılarını toplamak için en uygun konumdur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Hepato-renal indeks sonuçları. (A) Kontrol ve CDAHFD diyet sıçanlarından İk endekslerinin temsili görüntüsü 6 ve 12 haftalık zaman noktalarında. Böbreği (sol daire) ve karaciğerde (sağ daire) ROI'ler (kırmızı) çekildi, daha sonra sinyallerin bir oranı belirlendi (B Oranı, sağ veri tablosu). (B) Kontrol ve CDAHFD diyet sıçanlarından alınan karaciğer örneklerinin 6 ve 12 haftalık zaman noktalarındaki temsili ORO lekeli histolojik bölümleri. Ölçek çubukları = 300 μm. (C) hr indeksinin hastalık indükleyen bir diyet süresi seyri üzerinde grafiksel gösterimi. Kontrol faresi verileri mavi, CDAHFD sıçan verileri kırmızı ile temsil edilir. Grafikte ortalamanın standart hatası olan ortalama değerler göstermektedir (3 haftalık zaman noktasında n = 20 ve kontrol için n = 20 ve CDAHFD için 6 haftada n= 19, n = 9 ve 12 haftalık zaman noktalarında 10 (kontrolü her zaman noktasında CDAHFD ile karşılaştırma *, **, ***, ****p < 0,001). (D) Her zaman noktası için çizilen karaciğer ORO hesaplamaları (n = 10). Grafik, interquartile aralığına sahip ortanca değerleri gösterir (*, ** p < 0,001). (E) Yüzde karaciğer ORO pozitif alanı İk indeksi ile karşılaştıran korelasyon grafiği. Kısaltmalar: hr = hepato-renal; CDAHFD = kolin eksikliği, yüksek yağlı diyet; ROI'ler = ilgi çekici bölgeler; ORO = Oil Red O. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Kesme dalgası elastografi sonuçları. (A) Kontrol ve CDAHFD diyet sıçanlarından SWE haritalarının 6 ve 12 haftalık zaman noktalarında temsili görüntüsü. Böbreği (sol daire) ve karaciğerde (sağ daire) ROI'ler (kırmızı) çekildi, daha sonra sinyallerin bir oranı belirlendi (B Oranı, sağ veri tablosu). (B) Kontrol ve CDAHFD diyet sıçanlarından alınan karaciğer örneklerinin 6 ve 12 haftalık zaman noktalarındaki temsili ORO lekeli histolojik bölümleri. Histolojik bölümlerdeki ölçek çubuğu 300 μm'dir. (C) 12 haftalık diyet kaynaklı NASH sıçan modelinde karaciğer dokusu sertliğinin grafiksel gösterimi. Gruplar normal chow (mavi) veya kolin eksikliği, yüksek yağlı diyet (kırmızı) (n = 20 3 ve 6 haftada, n = 10 9 ve 12 haftalık zaman noktalarında) beslendi. Grafik, ortalamanın standart hatası olan ortalama değerleri gösterir (n = 3 ve 6 haftada 20, 9 ve 12 haftalık zaman noktalarında n = 10 (kontrolü her zaman noktasında CDAHFD ile karşılaştırma *, **, *** p < 0.001). (D) Kollajene özgü PSR lekesi kullanılarak ex vivo histolojik karaciğer örneklerinde kollajen dağılımının grafiksel gösterimi (n = 10). Grafik, interquartile aralığına sahip ortanca değerleri gösterir (*, ** P < 0.001) (E) SWE esnekliği ile pozitif karaciğer PSR boyama alanını karşılaştıran korelasyon grafiği. SWE = kesme dalgası elastografisi; CDAHFD = kolin eksikliği, yüksek yağlı diyet; ROI'ler = ilgi çekici bölgeler; ORO = Yağ Kırmızı O; NASH = alkolsüz steatohepatit; PSR = Picro Sirius Kırmızı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
SWE de dahil olmak üzere ultrason tabanlı görüntüleme, NAFLD / NASH'in preklinik modellerinde karaciğer steatozu ve sertliğinin boyuna değerlendirilmesi için paha biçilmez bir araç olabilir. Bu makalede, NASH'in CDAHFD diyet kaynaklı sıçan modeli kullanılarak İk indeksinin ve esnekliğinin ölçümü için karaciğerlerin SWE görüntülerinin yanı sıra yüksek kaliteli B modunun nasıl eldeılacağına dair ayrıntılı metodolojiler açıklanmaktadır. Ayrıca, sonuçlar İk indeksinin mükemmel korelasyonunu ve elastikiyetin karaciğer dokusunun altın değerlendirme-histolojik değerlendirme standardı ile ilişkili olduğunu göstermektedir. Yordamın kendisi karmaşık görünmese de, protokolün başarılı sonuçlar sağlayacak bazı kritik yönleri vardır.
Dönüştürücünün yerleştirilmesi, özellikle B modunda İk indeksini ölçmek için böbreği ararken anahtardır. Probu kaburgalara çok yakın yerleştirmek kaburga gölgesine neden olabilir, bu da ultrason zayıflamasının yanlış önlemlerini oluşturur. Ayrıca, hem tıraş hem de epilasyon kremi kullanılarak tüm tüylerin çıkarılması önemlidir, çünkü kalan saçlar B modu görüntülere gölge düşürecek hava kabarcıklarını hapsedebilir. Son olarak, mide ve bağırsaklardaki yiyeceklerin varlığı karaciğeri gizleyebildiğinden, özellikle normal chow ile beslenen hayvanlarda, tüm hayvanların yeterli oruç tutması karaciğerin başarılı bir şekilde görüntülenmesi için kritik öneme sahiptir.
NASH'in preklinik modellerinde karaciğer fibrozisi ve steatozu değerlendirmek için SWE ve İk indeksinden karaciğer elastikiyet ölçümleri değerli okumalar olsa da, tekniğin birkaç sınırlaması vardır. İnflamasyon, hepatik tıkanıklık, kolestaz ve çıkış yolu tıkanıklığı gibi faktörler karaciğer sertliğini etkiler ve bu nedenle karaciğer fibrozisi 8 , 14,15,16'nınölçülmesinde bu tekniğin genel özgüllüğünü etkileyebilir. Benzer şekilde, B-mod ultrason görüntülerinde karaciğerin parlaklığı fibrozis etkilenebilir ve böylece steatozun ölçümünde İk indeksinin doğruluğunu etkileyebilir. Bu etkileyen faktörlerin elastikiyet ve steatoz üzerindeki katkısını netleştirmek ve NASH'in farklı preklinik modellerinde bu okumalar için kesme değerleri oluşturmak için daha fazla çalışmaya ihtiyaç vardır. Ayrıca, bu çalışma preklinik bir etkinlik çalışmasında karaciğer steatozunun değerlendirilmesi için İk indeksinin biyobelirteç olarak hassasiyetini değerlendirmedi.
SWE kullanılarak karaciğer sertliğinin ölçülebilirliği NASH/NAFLD patofizyolojisini anlamak ve bu durum için yeni tedaviler geliştirmek için değerli bir araç olma potansiyeline sahiptir. Araştırmacının invaziv biyopsiye gerek kalmadan hem karaciğer steatozu hem de doku sertliğini belirlemesine izin vererek, klinik öncesi çalışmalardaki hayvanlar uzunlamasına izlenebilir ve bireysel denekler üzerindeki ilaç etkileri zamanla ölçülebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Tüm yazarlar Pfizer, Inc.
Acknowledgments
Yazarlar, Pfizer Karşılaştırmalı Tıp Operasyonları Ekibi'ne, çalışma hayvanlarının sağlığını önemsemek ve sağlamak ve bazı tekniklere yardımcı olmak için sıkı çalışmaları için teşekkür eder. Ayrıca, histolojik analizler için doku işleme konusundaki yardımları için Danielle Crowell, Gary Seitis ve Jennifer Ashley Olson'a teşekkür eder. Buna ek olarak, yazarlar julita Ramirez'e bu makalenin hazırlanması sırasında gözden geçirdiği ve değerli geri bildirim sağladığı için teşekkür eder.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aixplorer | Supersonic Imagine | Shear Wave Elastography Instrument | |
| Aixplorer SuperLinear SLH20-6 Transducer | Supersonic Imagine | Transducer for Shear Wave Elastography | |
| Alpha-dri bedding | rat cages | ||
| Aperio AT2 scanner | Leica Biosystems | Digital Pathology Brightfield Scanner | |
| Compac 6 Anesthesia System | VetEquip | Anesthesia Vaporizer and Delivery System. Any anesthesia delivery system can be used, however. | |
| Manage Imager Database | Leica Biosystems | Digital Pathology | |
| Mayer's Hematoxilin | Dako/Agilent | H&E Staining/Histology | |
| Nair | Church & Dwight | Hair remover | |
| Oil Red O solution | Poly Scientific | Lipid Staining/Histology | |
| Picrosirius Red Stain (PSR) | Rowley Biochemical | F-357-2 | Collagen Stain/Histology |
| Puralube Opthalmic ointment | Dechra Veterinary Product | Lubrication to prevent eye dryness during anesthesia | |
| Tissue-Tek Prisma Plus | Sakura Finetek USA | Automated slide stainer | |
| VISIOPHARM software | Visiopharm | Digital pathology software | |
| Research Diets | A06071309i | NASH inducing diet | |
| Purina | 5053 | Control animal chow | |
| Vevo imaging station | Fujifilm VisualSonics | The Vevo imaging station is used for holding the ultrasound transducer during imaging. | |
| Wistar Han rats | Charles River Laboratories |
References
- Younossi, Z. M., et al. Global epidemiology of nonalcoholic fatty liver disease-Meta-analytic assessment of prevalence, incidence, and outcomes. Hepatology. 64 (1), 73-84 (2016).
- Boland, M. L., et al. Towards a standard diet-induced and biopsy-confirmed mouse model of non-alcoholic steatohepatitis: Impact of dietary fat source. World Journal of Gastroenterology. 25 (33), 4904-4920 (2019).
- Oldham, S., Rivera, C., Boland, M. L., Trevaskis, J. L. Incorporation of a survivable liver biopsy procedure in mice to assess non-alcoholic steatohepatitis (NASH) resolution. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (146), e59130 (2019).
- Bercoff, J., Tanter, M., Fink, M. Supersonic shear imaging: a new technique for soft tissue elasticity mapping. IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 51 (4), 396-409 (2004).
- Bavu, E., et al. Noninvasive in vivo liver fibrosis evaluation using supersonic shear imaging: a clinical study on 113 hepatitis C virus patients. Ultrasound in Medicine & Biology. 37 (9), 1361-1373 (2011).
- Ferraioli, G., et al. Accuracy of real-time shear wave elastography for assessing liver fibrosis in chronic hepatitis C: a pilot study. Hepatology. 56 (6), 2125-2133 (2012).
- Ross, T. T., et al. Acetyl-CoA carboxylase inhibition improves multiple dimensions of NASH pathogenesis in model systems. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 10 (4), 829-851 (2020).
- Gu, L. H., Gu, G. X., Wan, P., Li, F. H., Xia, Q. The utility of two-dimensional shear wave elastography and texture analysis for monitoring liver fibrosis in rat model. Hepatobiliary & Pancreatic Diseases International. 20 (1), 46-52 (2020).
- Marshall, R. H., Eissa, M., Bluth, E. I., Gulotta, P. M., Davis, N. K. Hepatorenal index as an accurate, simple, and effective tool in screening for steatosis. American Journal of Roentgenology. 199 (5), 997-1002 (2012).
- Webb, M., et al. Diagnostic value of a computerized hepatorenal index for sonographic quantification of liver steatosis. American Journal of Roentgenology. 192 (4), 909-914 (2009).
- Tous, M., Ferre, N., Camps, J., Riu, F., Joven, J. Feeding apolipoprotein E-knockout mice with cholesterol and fat enriched diets may be a model of non-alcoholic steatohepatitis. Molecular and Cellular Biochemistry. 268 (1-2), 53-58 (2005).
- Kirsch, R., et al. Rodent nutritional model of non-alcoholic steatohepatitis: species, strain and sex difference studies. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 18 (11), 1272-1282 (2003).
- Journal of Ultrasound in Medicine.
- Engelmann, G., Quader, J., Teufel, U., Schenk, J. P. Limitations and opportunities of non-invasive liver stiffness measurement in children. World Journal of Hepatology. 9 (8), 409-417 (2017).
- Piscaglia, F., Salvatore, V., Mulazzani, L., Cantisani, V., Schiavone, C. Ultrasound shear wave elastography for liver disease. a critical appraisal of the many actors on the stage. Ultraschall in der Medizin. 37 (1), 1-5 (2016).
- Singh, S., Loomba, R. Role of two-dimensional shear wave elastography in the assessment of chronic liver diseases. Hepatology. 67 (1), 13-15 (2018).
