Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Generering av humane nyre tubuoider fra vev og urin

Published: April 16, 2021 doi: 10.3791/62404
Automatic Translation
1,2, 1,2
1Princess Máxima Center for Pediatric Oncology, 2Oncode Institute

Summary

Menneskelige nyre tubuloid kulturer representerer en verdifull in vitro modell for å studere nyre fysiologi og sykdom. Tubuloider kan etableres fra nyrevev (sunt og sykt) samt urin, sistnevnte representerer en lett oppnåelig og mindre invasiv kilde til forskningsmateriale.

Abstract

Voksen stamcelle (ASC)-avledet humane nyre epitelial organoider, eller tubuloider, kan etableres fra sunn og syk nyre epitel med høy effektivitet. Normale nyre tubuloider recapitulate mange aspekter av deres opprinnelsesvev. De representerer distinkte nephron segmenter - spesielt av proksimal tubule, løkke av Henle, distal tubules, og samle kanal - og kan brukes til å studere normal nyrefysiologi. Videre legger tubuloidteknologi til rette for sykdomsmodellering, for eksempelfor smittsomme sykdommer så vel som for kreft. Å skaffe nyre epitelceller for tubuloid generasjon er imidlertid avhengig av rester kirurgisk materiale (for eksempel delvis) nephrectomies) eller nålebiopsier. Evnen til å vokse tubuloider fra urin ville gi en alternativ, mindre invasiv kilde til sunne nyreepitelceller. Det har tidligere vist seg at tubuloidkulturer kan genereres fra bare noen få milliliter fersk samlet urin. Denne artikkelen beskriver protokollene for å generere og forplante ASC-avledede menneskelige nyre tubuloidkulturer fra vevs- og urinprøver.

Introduction

Nyrer utfører funksjonen til systemisk styring av balansen mellom kroppsvæsker. Svekkelsen av deres fysiologiske funksjon kan skyldes forskjellige faktorer, inkludert diabetes, hypertensjon og legemiddelindusert toksisitet1. For en bedre forståelse av normal nyrefysiologi samt utvikling av nyresykdommer, er bruk av representative prekliniske modeller avgjørende. I de senere år har flere in vitro nyremodeller blitt generert basert på den såkalte organoidteknologien2. Organoider er tredimensjonale, multicellulære strukturer som ligner morfologien og fysiologien til vevet (normalt eller sykt) som de stammer fra. De kan genereres fra pluripotente (PSCer) eller voksne stamceller (ASC), hver med sine egne egenskaper og applikasjoner.

PSC-avledede nyreorganoider etterligner nefrogenese3,4,5. De kan også etableres fra pasientavledede engasjerte celler ved tvungen dedifferensiering (indusert pluripotens eller iPSC). iPSCer kan deretter differensieres i de forskjellige celletypene av nefroen, nyrenes funksjonelle enhet, ved rettidig eksponering for spesifikke vekstfaktorcocktailer. Mens de lager et ganske komplett miniorgan i en tallerken, forblir deres etablering tidkrevende, og på grunn av omprogrammeringsprotokollen kan iPSCer være utsatt for uønsket genetisk ustabilitet6. Videre er iPSC organoider ikke i stand til å modnes fullt ut til voksne nyreceller, og avslører en transkripsjonsprofil som ligner foster nyre på et tidlig utviklingsstadium7.

ASC-avledede humane nyre tubuloider har vist seg å rekapitulere fornyelsen av voksen nyre epitel. De representerer først og fremst den proksimale tubule, løkken av Henle, distale tubuli og samle kanal, som bekreftet av uttrykket av forskjellige transportørproteiner8,9,10. Tubuloidkulturprotokollen muliggjør rask utvidelse av pasientavledet nyrevev, samtidig som det beholder et stabilt genom. Forskningsapplikasjoner inkluderer å studere normal nyrefysiologi, nefrotoksisitet, legemiddeltesting, samt sykdomsmodellering8,10,11,12. En potensiell begrensning av etableringen av pasientavledede organoidkulturer, inkludert tubuoider, er tilgjengeligheten av ferskt vev. Imidlertid har flere rapporter vist at urin kan tjene som kilde for nyreepitelceller, og dermed gi en mye enklere, mindre invasiv strategi for å skaffe pasientmateriale til tubuloidkulturer8,13,14. Faktisk har det nylig blitt vist at tubuloider kan dyrkes fra urin8. Denne artikkelen beskriver etablering og vedlikehold av tubuloidkulturer fra nyrevev og urin.

Protocol

MERK: Eksperimentene beskrevet her ble godkjent av den medisinske etiske komiteen for Erasmus Medical Center (Rotterdam, Nederland) og prinsesse Máxima Center for Pediatric Oncology (Utrecht, Nederland).

1. Generering av menneskelige nyre tubuloider fra vev

  1. Materialer
    1. Prewarm multiwell vev kultur plater (6, 12 og 24 brønner) over natten ved 37 °C.
    2. Forbered basal medium (AdDF +++) ved å tilsette 1x L-alanin/L-glutamintilskudd, 1% m/v 4-(2-hydroksyetyl)-1-piperazin etanesulfonsyre (HEPES, 10 mM) og 1% Penicillin/Streptomycin antibiotika til Avansert DMEM/F12.
    3. Forbered kulturmediet ved å legge til 1,5% B27 supplement, 10% R-spondin-betinget medium, epidermal vekstfaktor (50 ng/ml), fibroblast vekstfaktor-10 (100 ng/ml), N-acetylkystein (1,25 mM), Rho-kinase hemmer Y-27632 (10 μM), bredspektret antibiotika (0,1 mg/ml) og A83-01 (5 μM) til AdDF+++. Varm til 37 °C før bruk.
    4. Forbered kjellermembranekstraktet (BME) ved å tine en aliquot over natten ved 4 °C. Hold BME på is under prosedyren.
    5. Forbered kollagenoppløsning ved å fortynne kollagenalene til en endelig konsentrasjon på 1 mg/ml i AdDF+++, med tilsetning av 10 μM Y-27632. Varm opp til 37 °C.
    6. Forbered 10 cm Petri-retter, skalpeller og pinsett. Desinfiser redskapene ved å påføre en ultrafiolett lampe i 20 minutter, etterfulgt av vask med desinfeksjonsmiddel, demi vann og 70% v / v etanol. Lufttørk redskapene.
    7. Forvarm en horisontal shaker til 37 °C.
  2. Prosedyre
    1. Samle nyrevev i et 50 ml rør fylt med 30-40 ml AdDF +++ medium. Legg vevet i ~1 ml medium i en 10 cm Petri-tallerken. Hakk vevet i biter på ~ 1 mm3 størrelse ved hjelp av skalpeller (Figur 1A).
    2. Overfør hakket vev til et 15 ml rør ved hjelp av tang og skalpeller. Tilsett 5 ml AdDF+++ i Petri-retten, vask og samle mediet med en 10 ml steril pipette. Overfør alt dette innholdet til samme rør.
    3. Sentrifuge ved 300 × g i 5 min ved romtemperatur, og fjern supernatanten. Tilsett 3-4 ml kollagenoppløsning til 15 ml-røret. Flytt røret til et horisontalt shakersett ved 37 °C og en hastighet på 250 o/min.
    4. Etter de første 15 min inkubasjon, kontroller prøven og rist røret kraftig. Gjenta til suspensjonen er homogen og de fleste vevsstykker har forsvunnet, med en maksimal inkubasjonstid på 45-60 min. (Figur 1B).
    5. Fyll opp røret med AdDF +++, og bland ved å invertere røret 5-10x. Sentrifuge ved 300 × g i 5 min ved 4 °C, og fjern supernatanten. Hvis pelletsen er rød, fortsetter du med trinn 1.2.6. Ellers går du til trinn 1.2.8.
    6. Tilsett 1 ml rød blodcellelysbuffer (se materialtabellen) på toppen av cellepelleten. Trykk forsiktig på røret for å resuspendere pelletsen (ikke resuspend med pipettespiss). Inkuber ved romtemperatur i 5 min.
    7. Fyll opp røret med AdDF +++. Sentrifuge ved 300 × g i 5 min ved 4 °C, og fjern supernatanten. Hvis blodcellene fortsatt er synlige, gjenta prosedyren igjen, fra trinn 1.2.6. Ellers fortsetter du med trinn 1.2.8.
    8. Hvis biter av vev er synlige på dette punktet av protokollen, fortsett med trinn 1.2.8. Ellers fortsetter du med målingen av pelletsvolumet i trinn 1.2.9. Tilsett 5 ml AdDF+++ i røret, og resuspend med en 10 ml steril pipette. Filtrer suspensjonen gjennom en 100 μm nyloncellesil plassert på et 50 ml rør.
    9. Overfør den filtrerte fjæringen til et nytt 15 ml rør. Sentrifuge ved 300 × g i 5 min ved 4 °C, og fjern supernatanten. Mål volumet på cellepellet ved hjelp av en p1000 pipette satt til et kjent volum. Rør forsiktig opp og ned for å gjenopplive uten å skape luftbobler. Overfør røret til is i 1 min.
    10. Tilsett 70-75% volum BME i pelletsen. Resuspend ved hjelp av en p1000 eller p200 pipette, og plate 15 μL dråper i en forhåndsvarslet, multiwell cellekulturplate (6, 12 eller 24 brønner, basert på totalt platingvolum (<100 μL, 24 brønner; 100-200 μL, 12 brønner; >200 μL, 6 brønner)).
    11. Snu platen opp ned, og la platen hvile i inkubatoren i 15-20 min ved 37 °C (figur 1C). Legg til forhåndsvarslet kulturmedium, og inspiser kulturene (Figur 1C,D).

2. Generering av humane nyre tubuloider fra urin

MERK: Urin er et fiendtlig miljø for celler. Det er viktig for en vellykket gjennomføring av denne protokollen at urinprøver behandles så snart som mulig, helst innen 4 timer fra utskillelse. I mellomtiden skal urinprøver oppbevares ved 4 °C.

  1. Materialer
    1. Prewarm multiwell vev kultur plater (6, 12 og 24 brønner) over natten ved 37 °C.
    2. Forbered vaskemediet: AdDF+++ supplert med bredspektret antibiotika (0,1 mg/ml) og 10 μM Y-27632.
    3. Forbered kulturmediet som beskrevet ovenfor. Varm opp ved 37 °C før bruk.
    4. Forbered BME-matrise. Hold på is under prosedyren.
  2. Prosedyre
    1. Samle en urinprøve, og del den likt inn i 50 ml rør (Figur 2A-I). Tilsett 10-20 ml vaskemedium til hvert av rørene. Sentrifuge ved 300 × g i 5 min ved 4 °C (figur 2A-II), og fjern supernatanten forsiktig.
    2. Tilsett 10 ml vaskemedium til hvert av rørene. Resuspender pellets forsiktig ved hjelp av en 10 ml steril pipette. Sentrifuge ved 300 x g i 5 minutter ved 4 °C (Figur 2A-III), og fjern supernatanten forsiktig.
    3. Resuspend pellets, og overfør innholdet i alle rørene til ett 15 ml rør. Fyll røret med vaskemedium. Sentrifuge ved 300 x g i 5 min ved 4 °C (Figur 2A-IV), og fjern supernatanten.
    4. Mål volumet på cellepellet ved hjelp av en p1000 pipette satt til et kjent volum. Rør forsiktig opp og ned for å gjenopplive uten å skape luftbobler. Overfør røret til is i 1 min.
    5. Tilsett 70-75% av BME-en i pelletsen. Resuspend ved hjelp av en p1000 eller p200 pipette, og plate 15 μL dråper i en forhåndsvarslet, multiwell cellekulturplate (6, 12 eller 24 brønner, basert på totalt platingvolum (<100 μL, 24 brønner; 100-200 μL, 12 brønner; >200 μL, 6 brønner)).
    6. Snu platene opp ned i inkubatoren i 15-20 min ved 37 °C. Legg til forhåndsvarslet kulturmedium, og inspiser kulturene (Figur 2B).

3. Utvidelse av tubuloidkulturer

MERK: Tubuloidkulturer kan passeres omtrent hver 1-2 uker med et delt forhold på 1:2-1:3. De kan vanligvis utvides for ca. 15 passasjer, med linjespesifikke variasjoner.

  1. Materialer
    1. Prewarm multiwell vev kultur plater (6, 12 og 24 brønner) over natten ved 37 °C.
    2. Forbered basal medium (AdDF +++), og hold det på is under prosedyren.
    3. Forbered kulturmediet som tidligere beskrevet. Varm opp til 37 °C før bruk.
    4. Forbered BME matrise, og hold på is under prosedyren.
    5. Forbered trypsinerstatningsmiddel med tilsetning av Y-27632 til en konsentrasjon på 10 μM. Varm opp til 37 °C før bruk.
    6. Autoklaver ikke-filtrerte p10-spisser.
    7. Avkjøl sentrifugen til 4 °C.
  2. Prosedyre
    1. Forstyrre dråpene som inneholder tubuloidene ved å pipettere opp og ned med en p1000 pipette ved hjelp av mediet som er tilstede i brønnen. Bruk spissen til å skrape bunnen av brønnen, og sørg for å samle alle celler festet til bunnen.
    2. Samle innholdet i et 15 ml rør. Legg til 10 ml AdDF+++. Sentrifuge ved 300 x g i 5 min ved 4 °C, og fjern supernatanten.
    3. Basert på størrelsen på pellets, legg til trypsin erstatningsmiddel supplert med 10 μM Y-27632. Bruk 1 ml trypsinerstatningsmiddel for 200 μL BME-dråper som inneholder tubuloider. Inkuber ved 37 °C i 5 minutter.
    4. Bruk en p1000 pipette med spiss, og sett inn en ikke-filtrert, steril p10-spiss over 1000 μL-spissen. Pipette opp og ned i 20-30x for å forstyrre organoidene mekanisk.
    5. Kontroller under mikroskopet for å se om mange intakte organoider fortsatt er til stede i røret (Figur 3A). Hvis mer enn 10% av intakte organoider er til stede på dette tidspunktet, gjenta fra 5 min inkubasjon i trinn 3.2.3 til mikroskopisk observasjon for intakte organoider i trinn 3.2.5 igjen. Ellers fortsetter du med trinn 3.2.6.
    6. Fyll opp røret med AdDF +++. Sentrifuge ved 300 × g i 5 min ved 4 °C, og fjern supernatanten. Mål volumet på cellepellet ved hjelp av en p1000 pipette satt til et kjent volum. Rør forsiktig opp og ned for å gjenopplive uten å skape luftbobler. Overfør røret til is i 1 min.
    7. Tilsett 70-75% volum BME i pelletsen. Resuspend ved hjelp av en p1000 eller p200 pipette, og plate 15 μL dråper i en forhåndsvarslet, multiwell cellekulturplate (6, 12 eller 24 brønner, basert på totalt platingvolum (<100 μL, 24 brønner; 100-200 μL, 12 brønner; >200 μL, 6 brønner)).
    8. Snu platene opp ned, og la platen hvile i inkubatoren i 15-20 min ved 37 °C. Legg til forhåndsvarslet kulturmedium, og inspiser kulturene (Figur 3B).

Representative Results

For nyrevev vises tubuloidstrukturer vanligvis innen 7 dager etter etablering (Figur 1D). Mangel på tilsynelatende vekst i løpet av de første 7 dagene indikerer et mislykket utfall av protokollen. Generelt må tubuloidkulturer passeres innen 1-2 uker etter første plating. For urin blir celleveksten tydelig ca. 14-21 dager etter etablering, med utseendet av kompakte tubuloidstrukturer og / eller tilhengerceller på bunnen av platen (Figur 2B). Kulturetablissementet har mest sannsynlig mislyktes hvis ingen vekst kan oppdages med et brightfield mikroskop innen 4 uker etter plating. For urinavledede kulturer forekommer den første passivingen vanligvis mellom 3 og 4 uker. Mens nyre tubuloidkulturer i de første passasjene hovedsakelig består av kompakte strukturer, øker tilstedeværelsen av cystiske epitelale tubuloider med økningen av passasjenummer (Figur 1D og figur 2B). Den vellykkede generasjonen av humane nyre tubuloid kulturer kan vurderes ved å utføre immunhiistokjemisk farging for markører uttrykt i rørformet nyre epitel, for eksempel parret boks gen 8 protein (PAX8) (Figur 4A, B).

Figure 1
Figur 1: Vevsavledede nyre tubuloidkulturer. (A) Oversikt over prosedyren for å hakke nyrevev. Vevet hakkes til en størrelse på ~ 1 mm3 ved hjelp av skalpeller. (B) Eksempel på riktig enzymatisk fordøyelse av sunt nyrevev. Vev er vist før (venstre) og etter (høyre) 45 min enzymatisk fordøyelse med kollagenase. Få vevsstykker er fortsatt synlige på bunnen av røret, og løsningen skal bli overskyet, noe som indikerer tilstedeværelsen av celler i suspensjonen. (C) Representativt bilde av cellekulturplater etter plating av BME-dråper som inneholder det bearbeidede nyrevevet. Etter å ha belegget dråpene, blir kulturplater vendt opp ned (venstre) og plassert i inkubatoren ved 37 °C. Etter 15-20 min legges forhåndsvarslet kulturmedium til brønnen (høyre). (D) Representative brightfield bilder av vev-avledede tubuloid kulturer. De første tubuloidstrukturene blir synlige 2-3 dager etter første sådd. Med økende passasjertall endrer tubuloider vanligvis morfologi til en mer cystisk fenotype. Skalastenger = 300 μm. Forkortelser: BME = kjellermembranekstrakt. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Urinavledede nyre tubuloidkulturer. (A) Oversikt over urinprøvebehandling. Så snart som mulig etter innsamling (I), urinprøver er delt inn i 50 ml rør og fortynnet i vaskemedium (II). Etter et annet vasketrinn (III), er innholdet i rørene samlet og et tredje og siste vasketrinn (IV) utføres før plating. (B) Representative brightfield bilder av urin-avledede tubuloid kulturer. De første tubuloidstrukturene og tilhengercellene skal være synlige innen 21 dager etter første plating. Skalastenger = 300 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Passering av nyre tubuloid kulturer. (A) Representativt bilde av nyre tubuloid kulturer etter enzymatisk fordøyelse. Etter å ha fullført fordøyelsen, bør ikke mer enn 10% av intakte tubuloidstrukturer forbli. Skala bar = 300μm. (B) Representativt bilde av nyre tubuloid kulturer etter plating. Inspeksjon av kulturene bekrefter at flertallet av tubuoidene har blitt forstyrret. Skalalinje = 300 μm Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Histologisk karakterisering av tubuloide kulturer. (A) H&E farging av sunt nyrevev og tubuloider. Skalastenger = 100 μm. (B) Immunhiistokjemi av PAX8 i normalt nyrevev, tubuloider, MRTK-vev og MRTK-organoider. PAX8 positivitet av organoid strukturer bekrefter deres nyre epitelial opprinnelse. Sunt nyrevev viser både positive (tubules) og negative strukturer (glomeruli). MRTK-vev og organoider ble inkludert som negativ kontroll. Skalastenger = 100 μm. Forkortelser: H&E = hematoksylin og eosin; PAX8 = paret boks gen 8; MRTK = ondartet raboid tumor i nyrene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Discussion

Organoider betraktes som avatarer av vevet de er avledet fra. De tillater rask utvidelse av pasientmaterialet samtidig som de beholder de genotypiske og fenotypiske egenskapene til opprinnelsesvevet15. Organoid teknologi har nylig åpnet dørene for utvikling av mer representative prekliniske modeller, som kan brukes som viktige verktøy for å oversette funn fra benken til sengen. Nyre tubuloider er lovende in vitro modeller for testing av legemiddelindusert nefrotoksisitet, en vanlig bivirkning av mange kjemoterapeutiske legemidler2,8,12. Som sådan ble pasientavledede tumororganoidkulturer vist å være prediktive for pasientrespons på behandling16,17,18. Testing av legemidler på en høy gjennomstrømningsmåte på tubuloider tillater derfor potensielt bedre definisjon av terapeutiske vinduer og reduserer risikoen for legemiddelindusert nefrotoksisitet hos pasienter.

Ofte brukte antibiotika har blitt beskrevet for å utøve en toksisk effekt på nyrene19. Selv om tilstedeværelsen av bredspektret antibiotika er nødvendig for vellykket etablering av kulturene ved å forhindre forurensning, er det viktig å vurdere deres potensielle nefrotoksisitet. Selv om det ikke er observert negative effekter av antibiotika ved etablering av tubuloidkulturer, er det nødvendig med ytterligere undersøkelser for å evaluere effektene grundig. Tubuloider kan utnyttes for å studere og modellere sykdommer8. Ciliopatier (patologisk dysfunksjon av cilia) samt andre genetiske syndromer som påvirker nyrene, kan studeres ved enten å generere tubuloide linjer direkte fra berørte personer, eller ved å bruke sunne kulturer der sykdomsspesifikke drivermutasjoner kan introduseres via CRISPR / Cas9 genomredigering20.

Selv om tubuloider er multicellulære nyrekulturer, mangler de flere nyrecelletyper, inkludert podocytter og endotelceller8. I motsetning til noen andre ASC-avledede organoidmodeller har tubuloider et begrenset replikeringspotensial, da de kan dyrkes i ca. 15 passasjer. Denne begrensede levetiden kan imidlertid utvides betydelig ved å legge Wnt til kulturmediet21. Ytterligere optimalisering av tubuloidkulturprotokollen er nødvendig for å gjøre dem enda mer representative for nyrene, inkludert mer differensierte celletyper. Selv om effektiviteten av tubuloid etablering fra vevsprøver er svært høy (>95%), kan det i sjeldne tilfeller mislykkes. Det kan være forskjellige årsaker, inkludert: 1) dårlig kvalitet på startmaterialet(f.eks.nekrotisk vev som følge av medikamentell behandling), 2) over fordøyelsesbesvær av vevsprøven, eller 3) forurensning av primærprøven.

For å sikre at kvaliteten på vevsprøvene som mottas er tilstrekkelig til å fortsette med protokollen, er det viktig å opprettholde nær kontakt med patologipersonalet som utfører evalueringen av vevet ved kirurgi. Hvis tilstrekkelig materiale er tilgjengelig, må levedyktigheten bekreftes ved histologisk undersøkelse(f.eks.hematoksylin og eosinfarging). Videre, for å forhindre cellelys under enzymatisk fordøyelse, er det viktig at inkubasjonsprosedyren ikke er lenger enn 1 t. Til slutt, for å forhindre forurensning, bør antibiotika og antifungale midler legges til vaske- og kulturmediene.

Urin kan inneholde eksfolierte epitelceller som ikke er avledet fra nyre22, som kan forurense tubuloidkulturene. Disse inkluderer for eksempel urotheliumceller som i motsetning til nyrerørformede celler, positive for tumorprotein P63 og negativ for PAX88. Det anbefales derfor å teste kulturene for PAX8 positivitet for å bekrefte renheten av etablerte nyre tubuloid linjer før du fortsetter med oppfølging eksperimenter (Figur 4B).

Urin representerer et fiendtlig miljø for celler på grunn av høyt osmotisk trykk og lav pH. Det er derfor avgjørende for suksessen til protokollen at prøver behandles så snart som mulig ved urinoppsamling. Som sådan skal den oppsamlede urinen fortynnes og vaskes grundig med bufret løsning så snart som mulig for å sikre tilstedeværelse av levedyktige celler på tidspunktet for såing. Suksessraten for tubuloid etablering vil reduseres betydelig hvis urinen lagres i flere timer før behandling. Til slutt, selv om den er steril, har urin en høy risiko for forurensning forbundet med innsamlingsprosessen. Det er derfor viktig å supplere vask og vekstmedium med antibiotika og antifungale midler. Når du tar hensyn til alt ovenfor, kan en suksessrate på ca. 50% oppnås.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.

Acknowledgments

Vi takker alle pasientene og deres familier for at de deltok i studien. Vi takker det kliniske teamet som la til rette for forskningen vår. Vi er takknemlige for støtten fra European Research Council (ERC) som starter stipend 850571 (J.D.), Dutch Cancer Society (KWF)/Alpe d'HuZes Bas Mulder Award (nr. 10218, J.D.), Oncode Institute og Foundation Children Cancer Free (KiKa nr. 292, C.C.)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
A83-01 Tocris 2939/10 Stock of 5 mM, final concentration of 5 µM, activin receptor-like kinase 5 inhibitor
Advanced DMEM/F12 ThermoFisher Scientific 12634010
antiPAX8 antibody LSBio LS-B13466
B27 supplement ThermoFisher Scientific 17504044 Stock of 50x, final concentration of  1x
BME Trevigen 3533-010-02
Collagenase Sigma Aldrich  C9407 Stock of 10 mg/mL, final concentration of 1 mg/mL
EGF Peprotech AF-100-15 Stock of 0.5 mg/mL, final concentration of 50 ng/mL
FGF10 Peprotech 100-26 Stock of 0.1 mg/mL, final concentration of 100 ng/mL
GlutaMAX - L-alanine/L-glutamine Gibco 35050061 Stock of 100x, final concentration of 1x
Hepes Gibco 15630106 Stock of 1 M, final concentration of 10 mM
Multiwell tissue culture plates 12 wells CELLSTAR 665180
Multiwell tissue culture plates 24 wells CELLSTAR 662160
Multiwell tissue culture plates 6 wells CELLSTAR 657160
N-acetylcysteine Sigma Aldrich A9165 Stock of 500 mM, final concentration of 1.25 mM
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140163 Stock of 10.000 U/mL, final concentration of  100 U/mL
Primocin - broad-range antibiotics Invivogen ant-pm-1 Stock of 50 mg/mL, final concentration of 0.1 mg/mL
Red blood cells lysis buffer Roche 11814389001
RhoKinase inhibitor Y-27632 Abmole Bioscience M1817 Stock of 100 mM, final concentration of 10 µM
R-spondin conditioned medium Produced in house with the use of stable cell lines generated by Calvin Kuo lab. Final concentration is 10%
TrypLe Express/ trypsin replacement agent ThermoFisher Scientific 12605010

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Romagnani, P., et al. Chronic kidney disease. Nature Reviews. Disease Primers. 3, 17088 (2017).
  2. Ooms, A. H., Calandrini, C., de Krijger, R. R., Drost, J. Organoid models of childhood kidney tumours. Nature Reviews. Urology. 17 (6), 311-313 (2020).
  3. Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
  4. Low, J. H., et al. Generation of human PSC-derived kidney organoids with patterned nephron segments and a de novo vascular network. Cell Stem Cell. 25 (3), 373-387 (2019).
  5. Little, M. H., Combes, A. N. Kidney organoids: accurate models or fortunate accidents. Genes & Development. 33 (19-20), 1319-1345 (2019).
  6. Papapetrou, E. P. Patient-derived induced pluripotent stem cells in cancer research and precision oncology. Nature Medicine. 22 (12), 1392-1401 (2016).
  7. Wu, H., et al. Comparative analysis and refinement of human PSC-derived kidney organoid differentiation with single-cell transcriptomics. Cell Stem Cell. 23 (6), 869-881 (2018).
  8. Schutgens, F., et al. Tubuloids derived from human adult kidney and urine for personalized disease modeling. Nature Biotechnology. 37 (3), 303-313 (2019).
  9. Jun, D. Y., et al. Tubular organotypic culture model of human kidney. PLoS One. 13 (10), 0206447 (2018).
  10. Grassi, L., et al. Organoids as a new model for improving regenerative medicine and cancer personalized therapy in renal diseases. Cell Death & Disease. 10 (3), 1-15 (2019).
  11. Yousef Yengej, F. A., Jansen, J., Rookmaaker, M. B., Verhaar, M. C., Clevers, H. Kidney organoids and tubuloids. Cells. 9 (6), 1326 (2020).
  12. Calandrini, C., et al. An organoid biobank for childhood kidney cancers that captures disease and tissue heterogeneity. Nature Communications. 11 (1), 1310 (2020).
  13. Jansen, J., et al. A morphological and functional comparison of proximal tubule cell lines established from human urine and kidney tissue. Experimental Cell Research. 323 (1), 87-99 (2014).
  14. Zhou, T., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from urine samples. Nature Protocols. 7 (12), 2080 (2012).
  15. Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
  16. Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359 (6378), 920-926 (2018).
  17. Ooft, S. N., et al. Patient-derived organoids can predict response to chemotherapy in metastatic colorectal cancer patients. Science Translational Medicine. 11 (513), (2019).
  18. Tiriac, H., et al. Organoid profiling identifies common responders to chemotherapy in pancreatic cancer. Cancer Discovery. 8 (9), 1112-1129 (2018).
  19. Morales-Alvarez, M. C. Nephrotoxicity of antimicrobials and antibiotics. Advances in Chronic Kidney Disease. 27 (1), 31-37 (2020).
  20. Drost, J., et al. Sequential cancer mutations in cultured human intestinal stem cells. Nature. 521 (7550), 43-47 (2015).
  21. Miao, Y., et al. Next-generation surrogate Wnts support organoid growth and deconvolute Frizzled pleiotropy in vivo. Cell Stem Cell. 27 (5), 840-851 (2020).
  22. Dörrenhaus, A., et al. Cultures of exfoliated epithelial cells from different locations of the human urinary tract and the renal tubular system. Archives of Toxicology. 74 (10), 618-626 (2000).

Tags

Biologi utgave 170
Generering av humane nyre tubuoider fra vev og urin
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Calandrini, C., Drost, J. Generation … More

Calandrini, C., Drost, J. Generation of Human Kidney Tubuloids from Tissue and Urine. J. Vis. Exp. (170), e62404, doi:10.3791/62404 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter