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Biology

드로소필라 살리바리 땀샘의 이종로크로마티닌 관련 단백질의 시각화를 위한 면역형성 염색

Published: August 21, 2021 doi: 10.3791/62408
Automatic Translation
1, 1, 1
1Instituto de Biotecnología, Departamento de Genética del Desarrollo y Fisiología Molecular, Universidad Nacional Autónoma de México

Summary

이 프로토콜은 드로소필라 폴리텐 세포에서 이종로크로마틴 골재를 시각화하는 것을 목표로 한다.

Abstract

면역 염색에 의한 이종로크로마틴 골재의 시각화는 어려울 수 있습니다. 크로마틴의 많은 포유류 성분은 드로소필라 멜라노가스터에 보존된다. 따라서 이종로크로마티닌 형성 및 유지보수를 연구하는 우수한모델이다. 제3의 별D. 멜라노가스터 유충의 타액선에서 발견되는 것과 같은 다각화된 세포는 크로마틴을 거의 천 번 증폭시키는 것을 관찰하는 훌륭한 도구를 제공하고 연구자들은 핵에서 이종로크로마틴의 분포변화를 연구할 수 있게 하였다. 이종염색로마티신 성분의 관찰은 폴리텐 염색체 제제에서 직접 수행될 수 있지만, 일부 단백질의 국소화는 치료의 중증도에 의해 변경될 수 있다. 따라서, 세포에서 이종로크로마틴의 직접적인 시각화는 이러한 유형의 연구를 보완한다. 이 프로토콜에서, 우리는 이 조직에 사용된 면역 염색 기술, 이차 형광 항체의 사용 및 더 중대한 정밀도 및 세부사항으로 이 이 이종로막골을 관찰하기 위하여 공초점 현미경 검사법을 기술합니다.

Introduction

에밀 헤이츠1의초기 연구 이후, 이종학은 염색체의 유전자 발현, 메이오틱 및 미토틱 분리, 게놈 안정성2,3,4의 유지 와 같은 세포 과정의 중요한 레귤레이터로 간주되었다.

이종로크로마티닌은 주로 반복적인 시퀀스를 정의하는 구성이종, 텔로미어 및 원로메머와 같은 특정 염색체 부위에 존재하는 전이 가능한 요소의 두 가지 유형으로 나뉩니다. 이 종족의 이종은 주로 히스톤 H3(H3K9me3)의 리신 9의 디 또는 트라이메틸화와 헤테로크로마티틴 단백질 1a(HP1a)5,6의결합과 같은 특정 히스톤 마크에 의해 후성유전학적으로 정의된다. 한편, 이종은 염색체의 팔을 통해 국소화되며 주로 발달침묵유전자7,8로구성된다. 전상 세포에서 이종로크로마틴 블록의 면역 염색, 또는 단계 간 세포에서 이종로크로마티닌 골재의 관찰, 이종학 영역9의 형성 및기능에 대한 이해에 많은 빛을 공개했다.

드로소필라를 모델 시스템으로 사용하면 전자 현미경검사법(10)을사용하지 않고 이종로크로마티닌을 연구할 수 있는 필수 도구의 개발이 허용되었다. 위치 효과 의 설명 다양화 및 HP1a와 같은 이종로크로마틴 관련 단백질의 발견 이후, 많은 그룹은 이러한 이종 영역의 시각화를 허용하는 여러 면역 조직 화학 적 기술을개발했다 10,11.

이러한 기술은 이종로크로마틴 관련 단백질 또는 히스톤 마크를 인식하는 특정 항체의 사용에 기초한다. 모든 세포 유형 및 항체에 대해 고정 및 투과성 조건은 경험적으로 결정되어야 합니다. 또한 스쿼싱 기술과 같은 추가 기계적 공정이 사용되는 경우 조건이 다를 수 있습니다. 이 프로토콜에서, 우리는 이종적 인 포시를 공부하기 위해 Drosophila 타액 땀샘의 사용을 설명합니다. 살리보리 땀샘은 게놈의 1,000부 이상을 포함하는 다원화 세포를 가지고 있어, 따라서 위성 DNA와 복제되는 일부 이종 영역을 제외하고 대부분의 크로마틴 특징에 대한 증폭된 전망을 제공한다. 그럼에도 불구하고 이종염색체 영역은 폴리텐 염색체 제제로 쉽게 시각화되지만 스쿼시 기술은 때때로 특징적인 크로마틴 바운드 복합체 또는 크로마틴 아키텍처를 방해할 수 있습니다. 따라서 침선 조직 전체에서 단백질의 면역 지역화는 이러한 원치 않는 효과를 능가할 수 있습니다. 우리는 몇몇 크로마틴 바운드 단백질을 검출하기 위하여 이 프로토콜을 이용하고, 우리는 돌연변이 Drosophila 주식과 결합된 이 프로토콜이 이종로크로마틴 중단12를연구하기 위하여 이용될 수 있다는 것을 보여주었습니다.

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Protocol

1. 제3회 인스타 애벌레 문화

  1. 효모 100g, 정제되지 않은 통지팡이 설탕 100g, 한천 16g, 프로피오닉산 10mL, 젤라틴 14g을 추가하여 표준 미디어 1리터를 준비합니다. 효모를 제외한 모든 재료를 수돗물 800mL에 녹인 다음 효모를 녹입니다. 즉시 30분 동안 오토클레이브.
    1. 그 후, 미디어를 60°C로 식히고 최종 농도0.01%에 프로피오닉산을 첨가하게 한다. 젤라틴이 형성될 때까지 병을 방치하십시오.
  2. 3o 인스타 애벌레 문화를 최적화하기 위해 먼저 5-10일 된 성인을 모아 표준 미디어의 넓은 목 병에 50명(남성 25명, 암컷 25명)을 배치합니다.
  3. 알의 수가 50 (야생 형 변형의 경우 약 12 시간)이 될 때까지 25 °C에서 제어 온도 인큐베이터에 파리가있는 병을 놓습니다.
  4. 잠복기 시간이 끝나면 성인을 제거하고 새 병으로 옮겨 절차를 반복하십시오. 배아가 72시간 동안 18°C에서 자도록 하십시오.
    참고: 드로소필라 재고 유지 보수 조건에 대한 자세한 내용은 테네시 및 Thymmel13을참조하십시오.

2. 애벌레 컬렉션

  1. 애벌레 컬렉션을 위해 첨탑을 적발하지 않은 방황하는 애벌레를 선택하십시오. 스파이라클의 전복 후, 유충은 분석에 적합한 우수한 폴리텐 염색체를 유지하면서 예비 단계에 진입한다. 만 12 시간 후에 타액선의 세포는 프로그램 된 세포사멸을준비하기 시작14,15.
  2. 15 3° 인스타 애벌레를 넣고 시계 유리에 넣어 씻으십시오. 그런 다음 얼음 차가운 식염수 용액 또는 PBS (1x PBS : 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4,2 mM KH2PO4,조정 pH로 7.4)로 전송합니다.
  3. 입체 현미경의 밑에 protease 억제제와 감기 PBS에 있는 타액 선지의 15 30 쌍 (또는 30 분에 가능한 한 많은)를 해부합니다. 타액 땀샘을 얼음차가운 PBS로 1.5mL 튜브로 옮긴다.
  4. PBS 1mL과 프로테아제 억제제로 한 번 씻으시면 됩니다. 조직이 튜브 의 바닥에 도달 할 때까지 기다립니다.
  5. 세척 후 1000 μL 파이펫으로 PBS를 제거합니다. 조직을 만지지 않도록 주의하십시오.
    1. 대안적으로, PBS의 5mL에서 타액샘을 해부하여 이 세척 단계에 대한 필요성을 제거하고 아래 설명된 Ruvkun 고정 버퍼의 침샘을 0.5mL로 이송하여 3단계로 진행한다.

3. 침샘 조직 고정

  1. 마지막 단계에서 PBS를 제거한 후, 50% 메탄올(메탄올0.5mL 추가)과 2%의 포름알데히드로 1x Ruvkun 고정 버퍼의 0.5mL을 직접 추가합니다.
    참고: 2x Ruvkun 용액은 160mM KCl, 40mM NaCl, 20mM EGTA, pH 7.4에서 30mM PIPES입니다.
  2. 가벼운 회전으로 4 °C에서 2 시간 동안 배양하십시오.

4. 침샘 티슈 워시

  1. 트라이스/트리톤 버퍼 1mL(100m Tris pH 7.4, 트리톤 X-100 1%, 1mM EDTA)로 5분 회전 세척을 수행합니다.
    참고 : 조직이 튜브의 바닥에 도달 할 때까지 기다립니다.

5. 투과성

  1. 트리스/트리톤 X-100의 1mL에서 타액땀샘을 배양한다(위와 동일). 일부 단백질의 경우 1%β-메르카토에탄올을 추가해야 할 수도 있습니다.
  2. 가벼운 흔들림 (300 rpm)으로 37 ° C에서 2 시간 동안 배양하십시오.

6. 보존 단계 (선택 사항)

참고: 항체로 인큐베이션으로 즉시 진행하지 않을 경우, 다음과 같이 조직을 보존한다.

  1. BO3 완충제 1mL(0.01 M H3BO3 pH 9.2 + 0.01 M NaOH)로 세척한 다음 37°C에서 37°C에서 BO3/10mM MM DTT에서 15분간 배양한다.
  2. 인큐베이션 기간이 끝나면, 혼자 BO3 버퍼의 1mL로 세척을 수행한다.
    참고 : 조직이 튜브의 바닥에 도달 할 때까지 기다립니다.
  3. PBS 1mL를 추가합니다. 최대 72시간 동안 이 용액의 조직을 4°C에서 보존한 다음 다음 단계를 진행합니다. 이 단계는 지연된 수명 주기를 제시할 수 있는 다른 돌연변이 균주로 작업할 때 특히 유용하므로 면역 검출은 대조군과 함께 동시에 수행될 수 있다.

7. 조직 차단

  1. 완충 B (PBS + 0.1 % BSA + 0.5 % Triton X-100 + 1 mM EDTA)의 1 mL에서 타액 땀샘을 2 시간 동안 실온에서 2 시간 동안 배양하십시오.

8. 면역 염색

  1. 모든 완충제 B를 제거하고 완충A(PBS + 0.1% BSA)와 관심 있는 항체를 추가합니다.
    참고: 우리는 1:3000까지 Hybridoma 은행에서 HP1a C1A9c (농축 항체)를 사용합니다. C1A9s(상체)를 사용할 때 우리는 1:100에서 1:500 희석으로 시도했으며 이 등급 간의 희석은 회전과 함께 4 oC에서 하룻밤 사이에 잘 작동합니다. 이 시점에서 흔들림이 항체를 손상시킬 수 있는 거품을 일으키지 않는 것이 중요합니다.

9. 면역 염색 세척

  1. 매번 1mL를 사용하여 실온에서 교반하는 버퍼 B로 3 x 15분 세척을 수행합니다.
  2. 4 oC에서 회전 하에 2 시간 동안 형광소에 결합된 이차 항체와 함께 B를 버퍼링하기 위해 땀샘을 이송 (이차 항체 알렉사 플루서 568 Invitrogen1:3000).
    1. 알루미늄 종이 호일로 튜브를 덮어 이차 항체를 빛으로부터 보호합니다.
  3. 버퍼 B의 1mL로 회전하는 동안 실온에서 2 x 15 분 세척을 수행합니다.
  4. Sytox(5mM 스톡의 2μL를 취하고 완충 B 1mL로 용해) 또는 Hoechst(10 mg/mL 스톡의 1μL을 취하고 완충 B의 1mL로 용해)과 같은 DNA 마커로 배양하여 실온에서 10분 동안 사용합니다.
  5. 버퍼 B로 한 번 세척하고 PBS로 한 번, 각 세척은 실온에서 회전하는 동안 10 분 지속됩니다.
    참고: 빛으로부터 보호하는 것을 기억하십시오.

10. 이미징

  1. 슬라이드에 타액 땀샘을 장착하여 덮개가 달린 수영장을 만듭니다.
  2. 침샘을 수영장 중앙에 놓고 AF1 씨티플루어로 덮어 점성 액체를 끝까지 확장하는 거품의 형성을 피하십시오. 그런 다음 명확한 매니큐어로 모든 면을 밀봉합니다.
  3. 형광 또는 공초점 현미경으로 관찰하십시오. 샘플이 같은 날에 관찰되지 않을 경우 4 °C에서 빛에서 멀리 저장하십시오.
  4. 그래프 패드 프리즘 6을 사용하여 모든 그래프와 통계 분석을 생성합니다.
  5. 크루스칼-월리스 테스트를 사용하여 타액선에서 HP1a 분포의 데이터를 분석합니다. 통계적 유의성은 (p < 0.05*, < 0.01 **, < 0.001***, < 0.0001****로 설정되었습니다.

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Representative Results

드로소필라 타액선에서 HP1a 면역염색의 대표적인 결과가 도 1에도시된다. 긍정적인 결과는 하나의 초점(도1a)(이종골골재 또는 응축수)을 관찰하는 것이다. 음의 결과는 신호나 분산된 신호가 아닙니다. 때로는 이중 신호를 관찰 할 수 있습니다, 즉, 이중 점(도 1c)와함께, 그러나 일반적으로 작은 양에서 발생합니다.

데이터 분석은 다양한 돌연변이 배경 내에서 HP1a분포를 비교하여 막대 그래프로 나타낼 수 있습니다. 예를 들어, 도 2에서 우리는 야생형 핵의 98%가 하나의 초점의 분포를 제시하고 핵의 2%가 2개의 포시를 제시하는 반면, 돌연변이체에서는, 비율 변화 및 2개의 포시의 존재가 40%로 증가한다는 것을 알 수 있다.

도 3은 드로소필라 타액땀샘에서 대표적인 H3k9me3 면역염색 결과를 나타낸다. HP1a 면역스테인링(이종학 골재 또는 응축수)과 유사한 하나의초점(도 3b)을관찰할 수 있습니다. 이중 또는 삼중신호(도 3c)는야생형 균주에서 드물게 볼 수 있다.

Figure 1
그림 1. 타액선면역염색으로부터 의대표적인 공초점 현미경 이미지는 야생형(wt)으로부터 HP1a 항체를 탑재하였다. a)DNA(시안 신호), HP1a(마젠타 신호), 및 병합 스케일 바 100 μm. HP1a에 대한 면역 염색에서 초점을 맞춘 핵은 점선 상자가있는 두 개의 포시를 가진 흰색 화살표와 핵으로 표시됩니다. 오른쪽 컬럼은 5 μmb) 초점 분포의 스케일 바를 가진 단일 핵의 확대된 이미지를 나타낸다. c)두 개의 포시 분포. 두 핵 모두 흰색 파선으로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2. HP1a 면역스테인닝의 핵 포시 분포를 계산하는 데 서 예가 발생한다. 첫 번째 막대는 도 1에서와같이 야생 형 핵 (wt)의 계수를 나타냅니다. 두 번째 막대는 이 분포에 영향을 주는 돌연변이 변형을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3. 야생형(wt)으로부터 H3K9me3 항체를 가진 타액선 면역염색으로부터대표적인 공초점 현미경 영상. a)DNA(시안 신호), H3K9me3(마젠타 신호) 및 병합 스케일 바 100 μm. H3K9me3에 대한 면역염색에서 오른쪽 컬럼은 초점 분포를 가진 핵을 5 μm b)규모의 막대를 가진 단일 핵의 확대된 이미지를 나타낸다. c)세 개의 포시 분포. 두 핵 모두 흰색 파선으로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

진핵 생물의 세포 기능은 크로마티닌과 RNA를 포함한 다양한 분자와의 상호 작용에 의해 지원되는 핵 내의 3D 구조를 정의할 수 있다. 지난 3년 동안 이종로크로마틴을 포함한 관련성이 있는 생물학적 응축수들은 활성 및 억압적인 크로마틴 16,17,18의뚜렷한 핵 공간 조직을 촉진하는 위상 분리 의 결정에 근본적인 역할을수행했다.

이테로크로마틴은 세포 기능과 정체성을 보존하는 데 필수적입니다. 이전에는 이 조밀한 지역이 전사되지 않았다고 생각되었습니다. 그러나, 이제 우리는 더 강력한 기술을 가지고, 우리는 이종학이 전사뿐만 아니라 핵의 비계를 유지하는 근본적인 과정이 아니라 개발 또는 병리학 적 과정에 민감하다는 것을 알 수 있습니다12,19. 게다가, pericentric 이종학에 내장된 특정 유전자는 제대로 작동하기 위하여 이종적인 환경이 필요합니다. HP1a 돌연변이는19에서최초로 발견된 빛과 압연 유전자의 발현을 감소시다. 이 유전자는 유기체의 생존을 위해 필수적이고 이종로마틴 블록에서 있습니다. 그 결과, 침묵을 유도하는 능력에도 불구하고, 이 특이한 게놈 성분은 매우 역동적인20이될 가능성이 있다. 다양한 생물학적 맥락에 의해 조절될 수 있는 크로마틴 결합 및 확산 유형 간의 복잡한 균형에서 HP1a와 같은 이종로크로마틴 관련 단백질도 존재합니다. 또한 최근에는 이종로크로마티토 응축수21,22의조립에 의해 위상 분리 특성이 나타난다는 것을 시사했다.

저자가 다르고 때로는 간단한 프로토콜23,24를사용하여 Drosophila 침선 핵의 전체 마운트 면역 스테인링을 수행 한 논문이 많이 있습니다. 이 경우 우리는 C. elegans25에처음 설명된 프로토콜을 적용하고, 그 후 여러 그룹26,27,28,29에 의해 Drosophila 침샘에서 사용되고 공초점 현미경 검사법과 돌연변이 생물의 사용과 결합했습니다. 이 프로토콜은 또한 XPD, XPB 및 TBP27과같은 전사 인자를 포함하여 다양한 유형의 단백질을 시각화할 수 있지만, 또한 이 조직에서 광범위하게 사용하기 위한 프로토콜로 자리매김하는 H3K9me3와 같은 HP1a 및 히스톤 마크와 같은 이종로크로마틴 바운드 단백질도 시각화할 수 있습니다. 또한 조직이 폴리텐 염색체 밴딩에 영향을 주지 않고 중간 단계에서 저장할 수 있다는 장점이 있다.

이 프로토콜은 HP1a 단백질을 보기 위해 특정 항체의 사용으로 인해 신뢰할 수 있고 비용 효율적입니다. 이 프로토콜의 중요한 단계는 세차하는 동안 땀샘을 잃고 조직이 바닥으로 나올 때까지 기다리는 것입니다. 타액선사용의 장점은 세포의 기계적 중단을 요구하고 크로마틴을 손상시킬 수 있는 폴리텐 염색체 기술과 달리 핵과 그 형태의 3D 뷰를 쉽게 얻을 수 있다는 것이다. 이 프로토콜을 수행하는 동안, 특별한주의는 세척 단계 동안 수행해야합니다. 신중하게 수행하지 않으면 조직이 파손되고 고품질 이미지를 얻을 수 없습니다.

관찰되는 지역 또는 단백질에 RNA의 결합 부족의 중요성을 평가하기 위해, 버퍼 C (EDTA없이 버퍼 B)로 세척을 추가하고 RNase의 100 μM을 추가 할 필요가있다. 이 세척은 이전에 설명한 대로 37°C에서 1시간 동안 수행해야 합니다. 세척은 분자가 DNA를 관찰하기 위하여 추가되는 단계 의 앞에 행해야 합니다 (단계 9.3와 9.4 사이).

공초점 현미경 검사는이종수 25,30의문제를 해결하기 위해 매우 새로운 방법론처럼 보이지 않을 수 있지만, Drosophila 핵에서 HP1a 단백질의 탈지역화를 식별하는 것은 매우 유용했습니다, 이는 더 철저하게 다른 기술로 평가 될 수있는 크로마틴 구조의 심각한 문제를 시사. 그 한계에도 불구하고, 이종로크로마티닌 응축수 조립, 제어 및기능(31)을조절하는 생물학적 활성을 명확히 하기 위한 새로운 기술을 적용하는 첫 번째 접근법으로서 고해상도 현미경 검사법과 함께 사용할 수 있다. 이종로크로마틴, RNA, 이종로크로마틴 관련 단백질 사이의 분자 및 생물 물리학 적 상호 작용에 초점을 맞춘 이러한 새로운 방법론 중 일부는 이종로크로마틴 응축수를 테스트하는 이 방법의 집합에서 수집됩니다.

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Disclosures

저자는 그들이 경쟁 이익이 없다고 선언합니다.

Acknowledgments

우리는 공초점 이미지의 일부를 복용 마르코 안토니오 로살레스 베가와 아벨 세구라, 미디어 준비를위한 카르멘 무뇨스 박사와 박사 아르투로 피멘텔, M.C. 안드레스 사라레기, 현미경의 사용에 대한 조언을 LMNA에서 크리스 우드 박사에게 감사드립니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microcentrifuge tubes Axygen MCT-150-C 11351904 brand not critical
16% formaldehyde Thermo Scientific 28908
AF1 Citifluor Ted pella 19470 25 mL
BSA, Molecular Biology Grade Roche 10735078001 brand not critical
Complete, protease inhibitors Ultra EDTA-free
protease inhibitors		 Merck 5892953001
Coverslip Corning CLS285022-200EA 22x22, brand not critical
DTT Sigma d9779 brand not critical
EDTA Sigma E5134 brand not critical
EGTA brand not critical
Glass slide Gold seal 3011 brand not critical
H3BO3 Baker 0084-01 brand not critical
H3K9me3 Abcam 8889
HP1a Hybridoma Bank C1A9 Product Form Concentrate 0.1 mL
KCl Baker 3040-01 brand not critical
Methanol Baker 9070-03 brand not critical
NaCl Sigma 71376 brand not critical
NaOH brand not critical
PIPES brand not critical
Rotator Thermo Scientific 13-687-12Q  Labquake Tube Shaker
Thermo Mixer C Eppendorf 13527550 SmartBlock 1.5 mL
Tris Milipore 648311 brand not critical
Triton X-100 Sigma T8787 100 mL, brand not critical
β-mercaptoethanol Bio-Rad 1610710 25 mL, brand not critical

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References

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생물학 문제 174 드로소필라 멜라노가스터,이종로크로마틴 타액땀샘 크로마틴 면역염색 HP1a
<em>드로소필라</em> 살리바리 땀샘의 이종로크로마티닌 관련 단백질의 시각화를 위한 면역형성 염색
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Meyer-Nava, S., Zurita, M.,… More

Meyer-Nava, S., Zurita, M., Valadez-Graham, V. Immunofluorescent Staining for Visualization of Heterochromatin Associated Proteins in Drosophila Salivary Glands. J. Vis. Exp. (174), e62408, doi:10.3791/62408 (2021).

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